Biologija in kemija
Nina Brudar
ODZIV MALE VODNE LEČE (Lemna minor L.) NA RAZLIČNE OBLIKE IN KONCENTRACIJE SELENA
Magistrsko delo
Ljubljana, 2017
Biologija in kemija
Nina Brudar
ODZIV MALE VODNE LEČE (Lemna minor L.) NA RAZLIČNE OBLIKE IN KONCENTRACIJE SELENA
Magistrsko delo
Mentorica: izr. prof. dr. Mateja Germ
Ljubljana, 2017
i
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študija na Pedagoški fakulteti, smer Biologija in kemija. Delo je bilo opravljeno v prostorih Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani, na Oddelku za biologijo na katedri za ekologijo in varstvo okolja.
Študijska komisija Pedagoške fakultete je 9.3.2017 odobrila predlagano temo magistrske naloge z naslovom Odziv male vodne leče (Lemna minor L.) na različne oblike in koncentracije selena. Za mentorico magistrskega dela je imenovala izr. prof. dr. Matejo Germ.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: izr. prof. Katarina VOGEL MIKUŠ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Mentorica: izr. prof. dr. Mateja GERM
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Članica: prof. dr. Alenka GABERŠČIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Datum zagovora: 19.9.2017
Podpisana izjavljam, da je naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela. Izjavljam, da je elektronska oblika identična tiskani. Na univerzo prenašam pravico objave svoje magistrske naloge v polnem tekstu na svetovnem spletu prek Digitalne knjižnice Pedagoške fakultete.
Nina Brudar
ii
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Mn
DK UDK
KG selenit /selenat /mala vodna leča /Lemna minor L.
AV BRUDAR, Nina
SA GERM, Mateja (mentorica)
KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta LI 2017
IN ODZIV MALE VODNE LEČE (Lemna minor L.) NA RAZLIČNE OBLIKE IN KONCENTRACIJE SELENA
TD Magistrsko delo
OP X, 80 str., 5 pregl., 28 sl., 4 pril., 224 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Selen je kemijski element v sledovih in esencialen mikroelement za ljudi, živali in mikroorganizme, medtem ko za rastline to še ni dokazano. Je široko razširjen v zemeljski skorji, pojavlja pa se tudi v tleh, morski ter sladki vodi, rudninah in sedimentih. Na prisotnost selena v okolju vplivajo klimatske razmere, geološka sestava tal in številni antropogeni dejavniki. Pojavlja se v štirih oksidacijskih stanjih. Selenit je najpomembnejša oblika selena v tleh. Ta se lahko zaradi mikrobiološke aktivnosti pretvori v selenat.
Selenit in selenat sta najbolj topni anorganski obliki selena in sta zaradi tega za rastline najbolj dostopni.
Učinek selena je odvisen predvsem od tega, v kateri obliki in v kakšni koncentraciji je selen prisoten v rastlini. Preučevali smo vpliv različnih koncentracij in oblik selena na biokemijske in morfološke lastnosti male vodne leče. Rastline smo izpostavljali različnim koncentracijam (1 mg/L, 2 mg/L in 5 mg/L) raztopin natrijevega selenita (Na2SeO3) ter različnim koncentracijam (1 mg/L, 2 mg/L in 5 mg/L) raztopin natrijevega selenata (Na2SeO4). Rastline smo izpostavljali tudi kombinaciji selenita in selenata, s koncentracijo 2 mg/L selenata in 2 mg/L selenita. Uporabili smo tudi kontrolno skupino, ki je rasla v rastnem gojišču brez dodanega Se. Med poskusom smo merili fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II) s fluorometrom PAM 2500, aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS), s prostim očesom pa smo opazovali morfološke spremembe (sprememba barve stebelnih členkov, štetje stebelnih členkov in propadanje korenin) ter pripravili vzorce za merjenje fotosinteznih barvil (klorofil a, klorofil b, karotenoidi) in antocianov. Na koncu poskusa smo stehtali svežo in suho maso vseh rastlin in opravili meritve fotosinteznih barvil. Ugotovili smo, da so rastline, ki so bile izpostavljene koncentracijam (1 mg/L, 2 mg/L in 5 mg/L) natrijevega selenata, (1 mg/L, 2 mg/L in 5 mg/L) natrijevega selenita ter kombinaciji natrijevega selenita in natrijevega selenata, slabše rasle ter so imele posledično nižjo fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II), nižjo aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS) in nižje koncentracije fotosinteznih barvil. Študija bo pripomogla k razumevanju vpliva različnih oblik in koncentracij selena na malo vodno lečo.
iii KEY WORDS DOCUMENTATION
ŠD Dn
DC UDK
CX selenite /selenate /duckweed / Lemna minor L.
AU BRUDAR, Nina
AA GERM, Mateja (supervizor)
PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
PB Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta PY 2017
TI THE RESPONSE OF DUCKWEED (Lemna minor L.) TO DIFFERENT CONCENTRATIONS AND COMPOUNDS OF SELENIUM
DT Graduation Thesis
NO X, 80 p., 5 tab., 28 fig., 4 ann., 224 ref.
LA sl AL sl/en
AB Selenium is a trace element and an essential microelement for humans, animals and microorganisms, whereas this has not been established for plants yet. It is widespread in the earth's crust and occurs in soil, seawater and freshwater as well as minerals and sediments. Climatic conditions, geological composition of the soil and numerous anthropogenic factors affect the presence of selenium in the environment. It can exist in four oxidation states. Selenite is the most important form of selenium in soil. It can convert into selenate due to microbiological activity. Being the most soluble inorganic forms of selenium, selenite and selenate are the most accessible to plants. The effect of selenium depends mainly on its form and concentration in plants. We studied the influence of different concentrations and forms of selenium on biochemical and morphological characteristics of common duckweed. Plants were exposed to various concentrations (1 mg/L, 2 mg/L and 5 mg/L) of sodium selenite solutions (Na2SeO3), various concentrations (1 mg/L, 2 mg/L and 5 mg/L) of sodium selenate solutions (Na2SeO4) and to a combination of selenite and selenate with a 2 mg/L concentration. Furthermore, we used a control group cultured in growth medium with no Se added. During the experiment, we measured the photochemical effect of photosystem II (FS II) with the PAM 2500 fluorometer, the activity of the electron transport system (ETS) and observed with the naked eye the morphological changes (changes in frond colour, counting fronds and root degradation) as well as prepared the samples for the measurement of photosynthetic pigments (chlorophyll a and b, carotenoids) and anthocyanins. We have established that plants that have been exposed to concentrations (1 mg/L, 2 mg/L and 5 mg/L) of sodium selenate, (1 mg/L, 2 mg/L and 5 mg/L) of sodium selenite and the combination of selenite and selenate, grew and developed poorly under stress conditions. Consequently, their photochemical effect of photosystem II (FS II), activity of the electron transport system (ETS) and concentrations of photosynthetic pigments were lower. This study will improve the understanding of how different forms and concentrations of selenium affect the common duckweed.
iv KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... ii
KEY WORDS DOCUMENTATION ... iii
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... x
1 UVOD ... 1
1.1 OPREDELITEV RAZISKOVALNEGA PROBLEMA ... 1
1.2 CILJI RAZISKAVE IN HIPOTEZE ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 SELEN ... 3
2.1.1 Fizikalne, kemijske in biološke lastnosti selena ... 3
2.2 SELEN V OKOLJU ... 4
2.2.1 Prisotnost selena v tleh ... 4
2.2.2 Prisotnost selena v vodi in zraku ... 6
2.2.3 Absorpcija selena v rastlinah in transport ... 7
2.2.4 Onesnaževanje okolja s selenom ... 8
2.3 VPLIV SELENA ... 10
2.3.1 Vpliv selena na rastline ... 10
2.3.2 Vpliv selena na živali ... 12
2.3.3 Vpliv selena na človeka ... 12
2.4 POSKUSNI ORGANIZMI - MAKROFITI... 13
2.4.1 Mala vodna leča (Lemna minor L.) ... 13
3 MATERIALI IN METODE DELA ... 15
3.1 RASTLINSKI MATERIAL IN RASTNE RAZMERE ... 15
3.1.1 Priprava poskusa ... 15
3.1.2 Prvi poskus z raztopino natrijevega selenita, natrijevega selenata ter njuno kombinacijo ... 17
3.1.3 Drugi, tretji ter četrti poskus z raztopino natrijevega selenita, natrijevega selenata ter njuno kombinacijo ... 17
3.2 MERITVE ... 18
3.2.1 Merjenje aktivnosti elektronskega transportnega sistema (ETS) ... 18
3.2.2 Merjenje fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) ... 20
3.2.3 Biokemijske analize ... 21
3.2.3.1 Vsebnost fotosinteznih barvil (klorofil a, klorofil b, karotenoidi) ... 21
v
3.2.4 Morfološke lastnosti ... 23
3.3 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV ... 23
4 REZULTATI ... 24
4.1 FIZIOLOŠKE MERITVE ... 24
4.1.1 Aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS) ... 24
4.1.2 Fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) ... 25
4.2 BIOKEMIJSKE MERITVE ... 26
4.2.1 Vsebnost fotosinteznih barvil (klorofil a, klorofil b, karotenoidi) ... 26
4.2.2 Vsebnost antocianov ... 29
4.2.3 Vsebnost UV absorbirajočih snovi ... 30
4.3 ANALIZA MORFOLOŠKIH LASTNOSTI ... 32
4.3.1 Število členkov ... 32
4.3.1 Barva členkov ... 37
5 RAZPRAVA ... 40
5.1 AKTIVNOST ELEKTRONSKEGA TRANSPORTNEGA SISTEMA (ETS) ... 40
5.2 FOTOKEMIČNA UČINKOVITOST FOTOSISTEMA II (FS II) ... 41
5.3 VSEBNOST FOTOSINTEZNIH BARVIL ... 43
5.3.1 Klorofil a, klorofil b ... 43
5.3.2 Karotenoidi ... 44
5.4 VSEBNOST ANTOCIANOV ... 45
5.5 VSEBNOST UV ABSORBIRAJOČIH SNOVI ... 46
5.6 MORFOLOŠKE LASTNOSTI ... 47
6 SKLEPI ... 48
7 LITERATURA ... 49
ZAHVALA ... 66
vi KAZALO SLIK
Slika 1:Kroženje selena v tleh (vir: Terry idr., 2000). ... 6
Slika 2:Prikaz transporta in metabolne poti selena v rastlinah (vir: Pilon-Smits in Quinn, 2010). ... 9
Slika 3: Mala vodna leča (Lemna minor L.) (foto: Nina Brudar). ... 15
Slika 4: Rastline, ki so gojene v rastni komori (foto: Nina Brudar). ... 16
Slika 5: Dodajanje raztopine INT vsem vzorcem (foto: Nina Brudar). ... 20
Slika 6: Dodajanje raztopine INT vsem vzorcem (foto: Nina Brudar). ... 20
Slika 7: Merjenje fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) (foto: Nina Brudar). ... 21
Slika 8: Priprava raztopin vzorcev (foto: Nina Brudar). ... 22
Slika 9: Aktivnost elektronskega transportnega sistema (ETS) pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napak, pri prvem poskusu je N=4, pri drugem, tretjem in četrtem poskusu je N=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). ... 25
Slika 10: Potencialna fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, pri prvem poskusu je N=4, pri drugem, tretjem in četrtem poskusu je N=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). ... 26
Slika 11: Koncentracija klorofila a pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, pri prvem poskusu je N=4, pri drugem, tretjem in četrtem poskusu je N=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). ... 27
Slika 12: Koncentracija klorofila b pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, pri prvem poskusu je N=4, pri drugem, tretjem in četrtem poskusu je N=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). ... 28
Slika 13: Koncentracija karotenoidov pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, pri prvem poskusu je N=4, pri drugem, tretjem in četrtem poskusu je N=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). ... 29
Slika 14: Vsebnost antocianov pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, pri prvem poskusu je N=4, pri drugem, tretjem in četrtem poskusu je N=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). ... 30
vii
Slika 15: Vsebnost UV-B absorbirajočih snovi pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, pri prvem posk usu je N=4, pri drugem, tretjem in četrtem poskusu je N=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). 31 Slika 16: Vsebnost UV-A absorbirajočih snovi pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, pri prvem posk usu je N=4, pri drugem, tretjem in četrtem poskusu je N=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). 32 Slika 17: Število členkov pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, N=4). Različne črke nad stolpci o značujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). 33 Slika 18: Število členkov pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, N=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). 34 Slika 19: Število členkov pri mali vodni leči, ki smo jo obravnavali z 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI), 1 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(IV) in 2 mg/L kombinacije Se(VI), Se(IV) (povprečje ± standardna napaka, N=5). Različne črke nad stolpci o značujejo statistično značilno razliko med obravnavanji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). 35 Slika 20: Število členkov pri kontrolnih rastlinah, pri 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI) (foto: Nina Brudar). ... 35 Slika 21: Število členkov pri kontrolnih rastlinah, 1 mg/L Se(IV), 1 mg/L Se(VI) (foto: Nina Brudar). ... 35 Slika 22: Število členkov pri kontrolnih rastlinah, 2 mg/L Se(IV), 2 mg/L Se(VI) (foto: Nina Brudar). ... 36 Slika 23: Število členkov pri kontrolnih rastlinah, 5 mg/L Se(IV), 5 mg/L Se(VI) (foto: Nina Brudar). ... 36 Slika 24: Število členkov pri kontrolnih rastlinah ter kombinaciji Se(VI) in Se(IV) (foto: Nina Brudar). ... 36 Slika 25: Dolžine koreninic pri kontrolnih rastlinah, pri 1 mg/L Se(VI), 2 mg/L Se(VI), 5 mg/L Se(VI) (foto: Nina Brudar) ... 38 Slika 26: Dolžine koreninic pri 2 mg/L Se(IV), 1 mg/L Se(IV), kontrolnih rastlinah (foto: Nina Brudar). ... 39 Slika 27: Dolžine koreninic pri 1 mg/L Se(IV), 1 mg/L Se(VI) (foto: Nina Brudar)... 39 Slika 28: Dolžine koreninic pri kontrolnih rastlinah ter kombinaciji Se(VI) in Se(IV) (foto:
Nina Brudar). ... 39
viii KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Sestava Steinbergovega rastnega gojišča (ISO/CD 20079) ... 16
Preglednica 2: Redčenje natrijevega selenata (Na2SeO4 ) ... 17
Preglednica 3: Redčenje natrijevega selenita (Na2SeO3) ... 17
Preglednica 4: Redčenje natrijevega selenata (Na2SeO4 ) ... 18
Preglednica 5: Redčenje natrijevega selenita (Na2SeO3) ... 18
ix KAZALO PRILOG
Priloga A: Število listov in prisotnost alg pri posameznih obravnavanjih pri prvem poskusu Priloga B: Število listov in prisotnost alg pri posameznih obravnavanjih pri drugem poskusu Priloga C: Število listov in prisotnost alg pri posameznih obravnavanjih pri tretjem poskusu Priloga D: Število listov in prisotnost alg pri posameznih obravnavanjih pri četrtem poskusu
x
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
ant antociani
CaCO3 kalcijev karbonat
Cys cistein
DMSe dimetil selenid
DMDSe dimetil diselenid
ETS elektronski transportni sistem
Fm maksimalna fluorescenca klorofila a temotno adaptiranega vzorca
FS II fotosistem II
Fv variabilna fluorescenca klorofila a temotno adaptiranega vzorca Fv/Fm potencialna fotokemična učinkovitost fotosistema II
GSH-Px glutation peroksidaza
INT jodo-nitro-tetrazolijev-klorid
kar karotenoidi
kl a klorofil a
kl b klorofil b
Met metionin
N število vzorcev
Na2SeO3 natrijev selenit Na2SeO4 natrijev selenat NaOCl natrijev hipoklorit
S Žveplo
SE standardna napaka
Se selen
Se-2 selenid
Se0 elementarni selen
SeO32-
/ Se(IV) selenit SeO42-
/ Se(VI) selenat
SeCys selenocistein
SeMet selenometionin
1 1 UVOD
Selen je kemijski element v sledovih in je pomemben mikronutrient za ljudi in živali, potreben za ključne biološke funkcije (Lo, Elphick, Bailey, Baker in Kennedy, 2015). Za človeka je selen nujno potreben zaradi njegovih antioksidativnih lastnosti, prisotnosti v selen vsebujočih beljakovinah (Škrabanja, 2016), poleg tega pa tudi za nemoteno izgradnjo ščitničnih ter rastnih hormonov (Reilly, 2006). Za rastline dokazov o esencialnosti tega elementa še ni (Hasanuzzaman, Nahar in Fujita, 2014).
Selen je zelo razširjen po zemeljski obli. Na njegovo prisotnost v okolju pa vplivajo številni dejavniki. Privzem in akumulacija selena v rastlinah sta odvisna predvsem od koncentracije elementa, oblike, sposobnosti rastlin za privzem Se ter pH tal. Pri nižjih koncentracijah ima lahko pozitiven vpliv na rastline, medtem ko je pri višjih strupen (Germ in Stibilj, 2007).
Pozitiven vpliv na rastline se kaže v tem, da lahko selen omili učinke oksidativnega stresa, ki je posledica močne jakosti svetlobe (Seppänen, Turakainen in Hartikainen, 2003), nizkih temperatur (Abbas, 2012), visokih temperatur, slanosti, težkih kovin, UV sevanja ter suše (Hasanuzzaman, Hossain in Fujita, 2011; Hawrylak-Nowak, Dresler in Wójcik, 2014; Nawaz idr., 2015). Negativen vpliv selena se lahko kaže v slabši rasti, razvoju ter predčasnem propadanju rastlin (Kabata-Pendias, 2001). Za rastline sta od anorganskih oblik najbolj dostopni obliki selenat in selenit, ker sta najbolj topni (Mechora, Stibilj, Radešček, Gaberščik in Germ, 2011). Rastline lahko nalagajo in pretvorijo anorganske oblike selena v bioaktivne organske oblike. Ta sposobnost rastlin lahko vpliva na prehrano in zdravje ljudi (Žnidarčič, 2011).
1.1 OPREDELITEV RAZISKOVALNEGA PROBLEMA
Glede na to, da je onesnaževanje s selenom svetovni problem, poznamo veliko metod za čiščenje obremenjenih voda s selenom. Znano je, da so lahko makrofiti zelo dober pokazatelj stanja voda, v katerih rastejo. V svojo biomaso vežejo snovi iz sedimenta ter vode, s tem pa posledično lahko izboljšujejo kakovost vodnega okolja. Glede na to, v kolikšni koncentraciji in kakšni obliki se selen pojavlja, je odvisno, ali bo imel pozitivne ali negativne učinke na organizme. Z našim raziskovalnim delom smo ugotavljali vpliv različnih oblik in koncentracij selena na biokemijske in morfološke lastnosti male vodne leče. Rastline smo izpostavljali različnim koncentracijam (1 mg/L, 2 mg/L in 5 mg/L) raztopin natrijevega selenita (Na2SeO3) ter različnim koncentracijam (1 mg/L, 2 mg/L in 5 mg/L) raztopin natrijevega selenata (Na2SeO4). Rastline so bile tudi izpostavljene kombinaciji selenita in selenata, s koncentracijo 2 mg/L. Uporabili smo tudi kontrolno skupino, ki je rasla v rastnem gojišču brez dodanega selena. Malo vodno lečo smo izbrali zato, ker je majhna rastlina, ki relativno hitro raste pri različnih pH, temperaturah in vsebnostih hranil, se hitro razmnožuje ter jo je dokaj enostavno gojiti.
1.2 CILJI RAZISKAVE IN HIPOTEZE CILJI:
Cilj magistrske naloge je bil ugotoviti vpliv različnih koncentracij selenita in selenata ter kombinacije selenita in selenata na izbrane biokemijske in morfološke lastnosti pri mali vodni leči. Odzive male vodne leče smo ugotavljali z merjenjem potencialne fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II), z analizo vsebnosti fotosinteznih barvil in antocianov, z
2
merjenjem aktivnosti elektronskega transportnega sistema (ETS) ter z meritvijo rastnih parametrov (štetjem stebelnih členkov). Ugotavljali smo vizualne znake morebitne toksičnosti uporabljenih koncentracij in oblik selena s štetjem zelenih in kloroznih oz. nekroznih stebelnih členkov.
HIPOTEZE:
Predvidevamo, da najnižja uporabljena koncentracija selenita in selenata ne bo negativno vplivala na izbrane biokemijske in morfološke lastnosti pri mali vodni leči.
Predvidevamo, da bodo imele naraščajoče koncentracije selenita in selenata negativen učinek na izbrane biokemijske in morfološke lastnosti pri mali vodni leči.
Predvidevamo, da se bodo pri rastlinah male vodne leče, ki bodo uspevale v raztopini z različnimi koncentracijami selenita in selenata ter njune kombinacije, pojavile spremembe v vsebnosti fotosinteznih barvil, fotokemični učinkovitosti fotosistema II (FS II), vsebnosti vode ter v aktivnosti elektronskega transportnega sistema (ETS).
3 2 PREGLED OBJAV
2.1 SELEN
Leta 1817 je selen odkril švedski kemik Jons Jakob Berzelius v blatu na dnu svinčevih komor v tovarni žveplove kisline (Brenčič in Lazarini, 2011). Obstajajo pa tudi viri, ki govorijo, da je ta element kot rdeče žveplo, ostanek v peči po uparitvi žvepla, opisal že Arnold de Villanova, in sicer že v 13. stoletju (Reilly, 2006). Berzelius je elementarni selen poimenoval po luni (grško selene - luna), ker je opazil podobnost z elementom telurjem (Brenčič in Lazarini, 2011).
2.1.1 Fizikalne, kemijske in biološke lastnosti selena
Selen se nahaja v šesti skupini periodnega sistema, in sicer med žveplom (S) in telurjem (Te), in spada v skupino metaloidov, saj ima lastnosti nekovin in kovin (Combs, 1993). Selenov atom lahko tvori podobne vrste kovalentnih vezi ter podobne spojine kot žveplov atom (Brenčič in Lazarini, 2011). Nekatere selenove kemijske lastnosti (ionizacijska energija, atomska masa, elektronegativnost) so zelo podobne žveplovim, kljub temu pa se v bioloških sistemih vloga teh dveh elementov močno razlikuje (Reilly, 2006). Selenove spojine težijo bistveno bolj k reduciranemu stanju, medtem ko žveplove k oksidiranemu stanju. Sicer pa se povezanost med metabolizmom selena in žvepla kaže v tem, da so naravne selenove spojine derivati in analogi naravnih žveplovih spojin. Isti encimi sodelujejo pri asimilaciji anorganskih selenovih spojin in asimilaciji anorganskih žveplovih spojin (Dilworth in Bandurski, 1977). Ta dva elementa tekmujeta v biokemijskih procesih, ki vplivajo na vnos, prenos in asimilacijo v rastlinah (hiperakumulatorske in neakumulatorske) (Sors, Ellis in Salt, 2005). Slednje sta z različnimi poskusi na čebuli (Allium cepa L.) dokazala tudi Barak in Goldman (1997). Golob, Gadžo idr. (2016) so opazili, da je bila koncentracija selena v tatarski ajdi malo višja pri rastlinah, ki so bile škropljene s selenom in žveplom hkrati, kot pa pri rastlinah, ki so bile škropljene samo s selenom. S tem so ugotovili, da je žveplo pozitivno vplivalo na količino privzetega selena.
V naravi je prisotnih šest izotopov selena (Fernández-Martínez in Charlet, 2009). Pojavlja se lahko v štirih oksidacijskih stanjih.V anorganski obliki se nahaja kot Se-2 (selenid), Se0 (elementarni selen), Se+4 (selenit-SeO32-) in Se+6 (selenat-SeO42-). V organski obliki pa se nahaja kot seleno-aminokisline, metilirane selenove spojine in selenobeljakovine v bioloških sistemih (Pyrzyńska, 2002; Uden, Boakye, Kahakachchi in Tyson, 2004). Čisti kristal selena ne more prevajati električnega toka. Prevodnost kristala pa lahko močno povečajo sledovi nečistoč, zato se ga lahko uporablja za izdelavo fotoelementov, usmernikov ter v kserografiji (Brenčič in Lazarini, 2011).
Prevladujoče oblike selena in žvepla, ki so na voljo rastlinam, so selenat, selenit in sulfat (Sors idr., 2005). Fiziološki in biokemični učinki selena so predvsem odvisni od tega, v kakšni koncentraciji in v kateri obliki se selen pojavlja v organizmu (Fernández-Martínez in Charlet, 2009; Suturović, Švarz Gajič, Marjanović in Kravić, 2005; Tinggi, 2003). Torej je biorazpoložljivost selena za ljudi odvisna od vsebnosti in kemijske oblike, v kateri je ta prisoten v živilu (Finley, 2006; Reeves idr., 2005). Elementarni selen je za človeka najmanj biorazpoložljiv, selenit pa ima večjo sposobnost absorpcije in višjo biološko aktivnost v primerjavi s selenatom (Suturović idr., 2005; Tinggi, 2003).
4
Selen je eden izmed približno 60 esencialnih elementov, ki so potrebni za človekovo zdravje (Hatfield, Berry in Gladyshev, 2012). Prav tako je esencialen element za mikroorganizme in živali, medtem ko za rastline to ni dokazano (Hasanuzzaman, Nahar idr., 2014). Meja med esencialnostjo in toksičnostjo selena v prehrani ljudi in živali je 0,1 – 1 mg Se/kg suhe snovi.
Znano je, da so nekatere rastline sposobne absorbirati velike količine selena. Rastline se lahko branijo pred visokimi koncentracijami selena tako, da povečajo tvorjenje nebeljakovinskih aminokislin, da izključujejo iz beljakovin SeCys, ali pa s pretvarjanjem selena v hlapne spojine (Žnidarčič, 2011). Selenoaminokislina SeCys je prepoznana kot enaindvajseta genetsko določena aminokislina v beljakovinah, ki pa se lahko v telesu izgrajuje z lastno gensko kodo (Atkis in Gesteland, 2000).
Varovalni učinki selena za organizme so močno povezani z njegovo prisotnostjo v antioksidativnem encimu glutation peroksidazi (GSH-Px), ki ščiti določene celične komponente (številne celične membrane) ter DNK pred številnimi poškodbami, ki jih povzročajo kisikovi radikali (Hall idr., 2014; Schrauzer, 2001). Ta encim je zlasti aktiven v mitohondrijih (Bartoli, Gomez, Gergoff, Guiamet in Puntarulo, 2005). Splošno metabolno aktivnost posameznega organizma je mogoče oceniti s pomočjo merjenja aktivnosti elektronskega transportnega sistema (ETS) določenega tkiva (Bartoli idr., 2005). Organizmom, ki so pod stresom, se poveča potreba po energiji. Prekomeren stres pa lahko povzroči zmanjšanje vitalnosti tkiva, ki se kaže v zmanjšanju dihalnega potenciala (Germ in Gaberščik, 2003).
Koncentracija in identifikacija določene kemijske oblike selena sta torej ključni za opis molekulskih mehanizmov biološke aktivnosti selena ter opis presnovnih procesov v celicah. Ti presnovni procesi so ključ fizioloških, medicinskih ter prehranskih študij, in sicer z vidika vpliva Se na človekovo zdravje in razvoj bolezni, z vidika aktivnosti in presnove nanodelcev, ki vsebujejo Se, ter z vidika krmil in živil, ki so obogatena s selenom in pridobljena z različnimi biotehnološkimi postopki (Škrabanja, 2016).
2.2 SELEN V OKOLJU 2.2.1 Prisotnost selena v tleh
Selen se pojavlja v zemeljski skorji, prsti, morski ter sladki vodi, sedimentih in rudninah (Lemly, 2004). Selen kroži: zemlja – primarni proizvajalci – porabniki. V tla se lahko vrne z urinom ali kot netopni selen z blatom (Läuchli, 1993), katerega pa bakterije, ki se nahajajo v tleh, kasneje nazaj pretvorijo v selenate ter selenite (Fairweather-Tait, 1997). Skrilavci, premog, fosfatne kamnine in sedimenti, ki so obogateni z organskimi snovmi, povprečno vsebujejo okoli 1 mg Se kg-1, lahko pa tudi več (Fernández-Martínez in Charlet, 2009).
Sedimentne kamnine pa vsebujejo povprečno 0,088 mg Se kg-1 (Tamari, Ogawa, Fukumoto, Tsuji in Kusaka, 1990).
Na prisotnost selena vplivajo klimatske razmere, geološka sestava tal ter številni antropogeni dejavniki, kot so: industrijski in gospodinjski odpadki, pepel iz termoelektrarn, odplake iz rafinerij ipd. (Lemly, 2004). V zemeljski skorji je geografsko neenakomerno razporejen anorganski selen in je v koncentracijah od približno 0 do 1250 mg/kg (Hatfield, Schweizer, Tsuji in Gladyshev, 2016). Z izjemo območij, kjer se opravlja sežig fosilnih goriv, kjer se nahaja steklarska industrija ali obsežna proizvodnja kemikalij in elektronike, je vnos selena, s tem pa tudi vpliv na zdravje ljudi prek inhalacijskih poti, neznaten (Wang in Gao, 2001).
5
Vsebnost selena v tleh je med drugim najbolj odvisna od geološke sestave tal (Kabata-Pendias, 2001). Koncentracije selena v večini tal se gibljejo od 0,01 do 2 mg Se kg-1 (Fordyce, 2007).
Tla, ki so revna s selenom, vsebujejo nižje koncentracije od 0,1 mg Se kg-1. Tla, ki pa so bogata s selenom, pa vsebujejo višje koncentracije od 0,5 mg Se kg-1 in jih imenujemo selenozna tla (Karaj Dhillon in Surjit Dhillon, 2003). V alkalnih apnenčastih tleh ter tleh, ki so bogata z organskimi snovmi, je selena bistveno več, kot pa ga je v granitnih tleh (Kabata-Pendias, 2001)., Če je Se prisoten v topni obliki, se njegova vsebnost v tleh zmanjša v primeru padavin (klima) (Mathis, Korber in Jucker, 1982). Ravno zaradi izpiranja imajo tla na Novi Zelandiji in Tasmaniji malo selena (Reilly, 1993). Prav tako ga je malo na Finskem, na določenih predelih Kitajske, v vzhodnem delu Sibirije ter v Koreji (Bronzetti in Della Croce, 1993). V tleh je povprečna koncentracija selena bistveno večja na predelih sedimentnih kamnin, v primerjavi s tlemi z vulkansko podlago. Območja, kjer je zelo velika koncentracija Se v teh, so: predeli južne in severne Dakote v Ameriki, Wyominga, v določenih predelih Rusije, Kitajske, Irske, Venezuele in Kolumbije. Raziskovalci poročajo o koncentraciji, ki znaša več kot 600 mg v kilogramu črnega skrilavca (Johnson, Fordyce in Rayman, 2010). Nekatere rastline lahko iz tal, ki so zelo bogata s selenom, akumulirajo do 3 mg Se na gram rastline. Te rastline so lahko toksične za pašno živino (Combs, 2001). Tla na aridnih območjih Kanade, ZDA, osrednje Avstralije in Azije pa prav tako vsebujejo veliko selena (Hack in Brüggemann, 1996). Znotraj ene države (npr. Avstralija, Kitajska) se v tleh lahko močno razlikujejo koncentracije selena (Škrabanja, 2016). Rezultati raziskav so pokazali, da je v Sloveniji vsebnost selena v tleh pogosto <0,1, giblje pa se tudi med 0,3 in 0,7 mg/kg (Kolenc, 2013; Pirc in Šajn, 1997;
Žnidarčič, 2011). Torej so tla s selenom v Sloveniji revna in je velika možnost, da se pojavlja na določenih območjih pomanjkanje selena v prehrani ljudi (Škrabanja, 2016). V državah, kjer so tla revna s selenom, dodajajo natrijev selenit umetnim gnojilom ali živalski krmi (Wang, Mäkelä, Näntö, Mäkelä in Lagström, 1998; Watkinson, 1983). Običajno je to praksa za Finsko, severozahodni Oregon, Novo Zelandijo, velik del afriške celine, Srbijo (Ngo idr., 1997) ter Slovenijo (Pirc in Šajn, 1997). Obstajajo številni načini, s katerimi lahko bogatimo rastline s selenom: foliarno škropljenje rastlin s selenom (Stibilj, Kreft, Smrkolj in Osvald, 2004), namakanje semen v selenovi raztopini pred setvijo (Ožbolt, Kreft, Kreft, Germ in Stibilj, 2008) in hidroponsko gojenje rastlin v hranilni raztopini, ki vsebuje selen (Pezzarossa, Rosellini, Borghesi, Tonutti in Malorgio, 2014).
Raziskovalca Wolf in Goldschmidt (2007) poročata, da imajo rastline mehanizme, ki uravnavajo vrsto in tudi količino posamezne kemijske oblike selena. Prevzem in akumulacija Se v rastlinah sta odvisna predvsem od vrste (oblike), koncentracije selena, pH tal, vsebnosti kalcijevega karbonata (CaCO3), koncentracije drugih ionov v tleh ter sposobnosti rastlin za absorpcijo selena (Karaj Dhillon in Surjit Dhillon, 2003; Germ in Stibilj, 2007). Poleg tega pa na zmožnost črpanja selena pri rastlinah vplivajo tudi topnost selena, stopnja razvoja rastline in slanost (Raptis, Kaiser in Tölg, 1983). Ker na posameznih območjih lahko kisle padavine znižujejo pH prsti in vode, se pri tem prav tako zmanjšuje tudi delež razpoložljivega selena (Gerhardson, Oskarsson in Skerfving, 1994). Pri pH<6, se privzem selenita zniža, medtem ko se privzem selenata znižuje preko pH območja, od 2,5 do 10 (Hyun, Burns, Murarka in Lee, 2006). Zaradi vezave na organske komponente se posledično tudi zmanjša razpoložljivost selena (Johnsson, 1991). Na absorpcijo selena vpliva tudi temperatura. Rastline lahko absorbirajo več selena nad 20 °C, bistveno manj pa pod 15 °C (Kabata-Pendias, 2001; Mechora in Germ, 2010).
Selenit in selenat sta najbolj topni anorganski obliki selena in zaradi tega tudi za rastline najbolj dostopni obliki (Mechora idr., 2011). Vodne rastline (makrofiti) ju lahko pretvarjajo v razne
6
organske spojine Se (Carvalho in Martin, 2001). V okolju se Se torej pojavlja v organski in anorganski obliki. Rastline so sposobne akumulacije in transformacije anorganskih oblik selena v bioaktivne organske oblike. Ta sposobnost rastlin lahko pomembno vpliva na človekovo prehrano in posledično tudi na njegovo zdravje (Žnidarčič, 2011). Seleniti se zaradi mikrobiološke aktivnosti lahko pretvorijo v selenate (Johnsson, 1991).
Slika 1:Kroženje selena v tleh (vir: Terry idr., 2000).
Zgornja slika (slika 1) nazorno prikazuje, da je v kislih tleh prisoten selen v obliki Se(IV), ki ima zelo nizko topnost v vodi in slabo dostopa v rastline. Selen se v alkalnih in dobro prezračenih tleh oksidira do selenata (SeO42-
), ki pa je v vodi zelo dobro topen in lahko posledično lažje vstopa v rastline (Mechora idr., 2011). V tleh je selen velikokrat vezan v komplekse organskih snovi, kar ima posledično velik vpliv na njegovo mobilnost (Fernández- Martínez in Charlet, 2009). Selenit je vezan na železove ter aluminijeve okside ali hidrokside in je manj mobilen od selenata, ki je zelo dobro mobilen. Selen se v organsko bogatih kislih tleh nahaja v obliki selenida, lahko pa tudi v elementarni obliki (White, 2016).
Pretvorba različnih oblik selena v različnih razmerah tal temelji predvsem na postopkih pretvorbe selenata v selenit (počasen proces) in pretvorbe selenita v selenid, v elementarni selen ter organsko obliko selena (zelo počasen proces). (Kabata-Pendias, 2011).
2.2.2 Prisotnost selena v vodi in zraku
Selen se v večji meri akumulira v sedimentu stoječih ali počasi tekočih voda (Germ, 2013). V površinskih vodah je selena le nekaj µg/L, razen na območjih, ki pa so s selenom zelo bogata, kjer pa ga voda lahko vsebuje tudi več mg/L, kar pa že lahko pri živih bitjih povzroča zastrupitve (Cornelis, Crews, Caruso in Heumann, 2005). Torej lahko zaradi geografskih razmer količine selena v površinskih vodah ali v podtalnicah zelo variirajo, in sicer od 0,06 do 400 µg/L, ponekod do 6000 µg/L (Hatfield idr., 2016). Pitna voda, ki vsebuje običajne količine selena, zelo malo prispeva k dnevnemu vnosu (Deveau, 2010). Raziskovalci pa so leta 1975 zaradi izrazite suše izjeme opazili v ruralnem območju jugovzhodnega Kolorada in v vodnih izvirih osrednjega in zahodnega dela ZDA, kjer so se vrednosti gibale med 50 in 300 µg/L (Hatfield idr., 2012). Prav tako so Vincenti, Bonvicini, Bergomi in Malagoli (2010) zabeležili, da so leta 1990 v severni Italiji izmerili v vodovodni vodi velike količine selena. Ameriška regulativa v pitni vodi tolerira koncentracije do 50 µg/L, ki pa je v primerjavi z evropskimi državami, kjer imajo zapisano zgornjo mejo v vodovodni vodi samo do 10 µg/L, veliko večja
7
(Hatfield, Berry idr., 2012; Hatfield, Schweizer idr., 2016). Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) je določila priporočeno vrednost selena v pitni vodi in ta znaša 10 µg/L. Ta vrednost je izračunana na kar 10 % delež z vodo vnesenega selena (Nacionalni inštitut za javno zdravje, 2014). V slovenskem Pravilniku o pitni vodi je ta mejna vrednost selena v pitni vodi prav tako določena na 10 µg/L (Pravilnik o pitni vodi, 2004). V pitni vodi so koncentracije selena torej geografsko pogojene in so višje zaradi večje topnosti v okolju, kjer je pH zelo nizek ali pa zelo visok (Nacionalni inštitut za javno zdravje, 2014).
Znanstveniki predvidevajo, da se selen ob prisotnosti planktona lahko pretvori v številne organske selenove spojine, ali se preko mikroorganizmov lahko pretvori v elementarni selen in anorganski Se. V morski vodi se torej selen nahaja predvsem v obliki selenita in selenata (Cornelis idr., 2005). V morski vodi ga zasledimo samo v majhnih količinah, in sicer od 0,09 do 0,11 µg/L. Vsa živa bitja, ki živijo v morski vodi, vretenčarji in nevretenčarji, vključno z algami, imajo sposobnosti, da ta element akumulirajo. Tako so za človeka ti organizmi pomemben vir selena, ki pa ga človek lahko vnese v svoje telo preko prehranske verige (Hatfield idr., 2012).
Selen se nahaja tudi v podzemnih vodah. Raziskave kažejo, da se vsebnost selena v severovzhodni Sloveniji v geotermalnih vodah giblje od >0,1 do 41 ppm (Kralj, 2001). Selena je malo tudi v atmosferi, in sicer le nekaj ng/m3. Selen se nahaja v prašnih delcih in v hlapnih metiliranih spojinah (DMSe in DMDSe) (Cornelis idr., 2005). Dimetilselenid (DMSe) je glavna oblika hlapljivih selenovih spojin (Lewis, Johnson in Broyer, 1974). V ozračje pa lahko pride selen z izbruhi vulkanov ter zaradi sežiga fosilnih goriv (Cornelis idr., 2005).
2.2.3 Absorpcija selena v rastlinah in transport
Di Gregorgio (2008) je napisal obsežen pregled metabolizma selena v rastlinah. Ugotovil je, da imajo rastline različne zmogljivosti za pridobivanje in kopičenje tega elementa. V večini primerov obstaja pozitivna linearna korelacija med selenom v rastlinskih tkivih ter selenom v tleh. Lahko pa imajo spremenljivi dejavniki (npr. oblika selena, pH) kompleksen vpliv na sprejem selena v rastline, s tem pa se posledično močno spremeni tudi razmerje med količino selena v rastlinah in v tleh. Torej rastlinske vrste in sorte glede na različne sposobnosti absorpcije selena iz tal (prsti, peska, vodnih raztopin) in kopičenja Se v posameznih tkivih uvrščamo v selen akumulirajoče, sekundarne akumulirajoče in selen neakumulirajoče rastline (Karaj Dhillon in Surjit Dhillon, 2003; Terry, Zayed, de Souza in Tarun, 2000). Selen akumulirajoče rastline lahko kopičijo do 4000 mg Se kg-1 suhe snovi (Ellis in Salt, 2003).
Sekundarne akumulirajoče/indikatorske rastline lahko kopičijo do 1000 mg Se kg-1 suhe snovi (Ellis in Salt, 2003; El Mehdawi in Pilon-Smits, 2012). Večina rastlin, ki je neakumulirajočih, kopiči od 10 do 100 mg Se Kg-1 suhe snovi (El Mehdawi in Pilon-Smits, 2012).
Absorpcija ionov poteka prek korenin, tako da grejo najprej ioni skozi celično steno do plazmaleme (Marschner, 2002; White idr., 2004). Kot smo že omenili, pri akumulaciji v rastlinsko celico selenat s sulfatom tekmuje. Pri tem oba aniona s sulfatnim prenašalcem potujeta prek plazmaleme korenin. Pri višjih rastlinah se z aktivnim transportom selenat prenaša od nižjega proti višjemu elektrokemičnemu potencialu (Sors idr., 2005).
Selenat pa poleg sulfata tekmuje za vezavna mesta permeaze tudi z nitratom, kloridom in fosfatom (Läuchli, 1993). Z aktivnim transportom lahko rastline tudi privzemajo organske
8
oblike selena (npr. SeMet) (Terry idr., 2000). Ugotovili so, da ob prisotnosti sulfatov lahko riž in gorčica prednostno privzemata selen. Pri lucerni, pšenici, brokoliju, ječmenu in ljulki pa je privzem selena ob večji prisotnosti sulfatov zelo omejen (Smrkolj, 2003). Ker se v rastlinah selenit zelo hitro lahko pretvori v organsko obliko selena, ki ostaja v koreninskem sistemu, je to poglavitni razlog za nekoliko manjši prenos iz korenin v liste (Terry idr., 2000).
2.2.4 Onesnaževanje okolja s selenom
Onesnaževanje s selenom je svetovni problem, zato obstaja veliko zanimanje za čiščenje obremenjenih voda s Se (Germ idr., 2007). Rastline, ki lahko absorbirajo večje količine selena, je možno uporabiti za fitoremediacijo tal in vode, ki so onesnažena s selenom. Znano je, da so malo vodno lečo uporabljali za čiščenje komunalnih in industrijskih odpadnih voda že pred letom 1990. Razlog je v tem, da relativno hitro raste pri različnih temperaturah, pH ter vsebnosti hranil (Landesman idr., 2011). Prav tako je bila narejena raziskava na štirih makrofitih (Typha domingensis, Crinum americanum, Hydrilla verticillata, Lemna obscura), ki so bili sposobni akumulacije selena in so tako uspešno odstranili ta element iz vodnega okolja (Carvalho in Martin, 2001).
Do kontaminacije s selenom lahko pride zaradi kmetijskih odplak, ki so posledica namakanja tal, bogatih s selenom, rudarjenja, rafiniranja premoga in nafte in drugih industrijskih virov (Hamilton, 2004; Hamilton in Buhl, 2003; Lemly, 2004; Lemly in Ohlendorf, 2002; Mayland, Jams, Panter in Sonderegger, 1989; Wu, 2004). Na zahodu ZDA je agencija USGS (United States Geological Survey) določila približno 400.000 km2 površin, ogroženih s kontaminacijo s selenom, povzročeno z namakanjem (Seiler, Skorupa in Peltz, 1999).
Akumulacija selena v vodnih rastlinah, ki rastejo na takšnih kontaminiranih območjih, lahko močno vpliva na prosto živeče živali in rastline, ki so življenjsko odvisne od njih (Emerick in Demarco, 1991; Lemly, 1997; Ohlendorf, Hoffman, Saiki in Aldrich, 1986). To je vzbudilo skrb glede onesnaženja s selenom še posebej v vodnih okoljih (Hamilton, 2004; Lemly, 2004).
Kot je opisal avtor Wu (2004), je bila bioakumulacija selena ugotovljena kot glavni vzrok za smrt in deformacijo embrijev pri gnezdenju vodnih ptic v mokriščnem habitatu Kesterson Reservoir National Wildlife Refuge, ki se nahaja v Central Valley v Kaliforniji. V zadnjem desetletju se je poglobila raziskava, posvečena fitosanaciji takšnih območij z uporabo naravno prisotnih selenovih akumulacijskih rastlin ali transgenih rastlin s povečano zmožnostjo kopičenja in strpnosti na selen (Bañuelos, 2001; Berken, Mulholland, LeDuc in Terry, 2002;
Van Huysen, Terry in Pilon-Smits, 2004; Wu, 2004). Poleg tega je vse več zanimanja za razvoj transgenih rastlin, ki akumulirajo selenove spojine z možnimi koristmi za človeško zdravje (Bañuelos idr., 1997; Ellis idr., 2004; Orser idr., 1999). Takšna raziskava je ponudila vpogled v mehanizem biokemijskih reakcij selena v rastlinah in v možne strategije za gensko inženirstvo rastlin, ki akumulirajo selen (Ellis in Salt, 2003). Strupeni učinki selena na prosto živeče živali in rastline so bile dobro dokumentirane na območjih, onesnaženih s selenom (Sors idr., 2005).
2.2.4.1 Fitoremediacija
Fitoremediacija je metoda, ki s pomočjo višjih rastlin in z njimi povezanih mikroorganizmov spremeni in izboljša razmere v onesnaženih okoljih. Gre za cenovno ugoden in okolju prijazen način, ki omogoča zmanjšanje ravni onesnaženosti v določenem okolju (Landesman idr., 2011).
Vodne rastline lahko s fitoremediacijo pripomorejo k izboljšanju kakovosti voda (Germ idr., 2007). Kljub temu da so selenove hiperakumulatorske rastline učinkovite pri odstranitvi selena,
9
je velikokrat zaradi počasne rasti in nizke proizvodnje biomase proces fitoremediacije omejen.
Za učinkovitejšo fitoremediacijo bi lahko uporabili hitro rastoče rastline z visoko sposobnostjo proizvodnje biomase ter zmerno sposobnostjo kopičenja selena (LeDuc idr., 2006).
Fitoremediacija vključuje pet različnih mehanizmov: rizofiltracijo, fitostabilizacijo, fitotransformacijo, fitoekstrakcijo in fitovolatilizacijo (Ghosh in Singh, 2005). Rizofiltracija pomeni, da rastline privzemajo, koncentrirajo in obarjajo kontaminante iz onesnaženega vodnega okolja s pomočjo korenin. Fitostabilizacija vključuje stabilizacijo kontaminirane zemlje in s tem imobilizira nečistoče v zemlji in jim tako prepreči širjenje na druga območja.
Hkrati pa je to proces absorpcije onesnaževal v koreninski sistem, adsorpcije in obarjanja.
Fitotransformacija je znana tudi kot fitodegradacija. Gre za proces, kjer rastlina s svojim metabolizmom odstrani nečistoče iz okolja (Landesman idr., 2011). Selen pa lahko učinkovito odstranimo iz tal in vode tudi s fitovolatilizacijo (izhlapevanjem) in fitoekstrakcijo (Germ idr., 2007). Fitoremediacija je prikazana na spodnji sliki (Slika 2).
Slika 2:Prikaz transporta in metabolne poti selena v rastlinah (vir: Pilon-Smits in Quinn, 2010).
Pri tej inovativni tehnologiji, ko rastline v svojo biomaso vgradijo selen, je potem potrebno rastline takoj požeti in jih odstraniti s kontaminiranega območja. Varna metoda odstranitve selena iz okolja je tudi uporaba selena za obogatitev krme za živali, ki jim v krvi primanjkuje selena (Bañuelos in Mayland, 2000). Druga metoda je uporaba rastlin, ki vsebujejo velike količine selena, za organsko gnojilo, ki je obogateno s selenom, in kot dodatek h krmilnim rastlinam (Bañuelos, Lin, Yin in Duan, 2011; Hamlin in Barker, 2008; Turan in Bringue, 2007).
V primeru, da rastline, ki so bogate s selenom, privzemajo tudi strupene elemente, kot sta to živo srebro in arzen, v koncentracijah, ki presegajo meje varne prehrane živali, lahko uporabimo rastlinski material kot gorivo v proizvodnji elektrike (Carvalho in Martin, 2001).
selenat / selenit
Privzem in akumulacija selena Transport selena Asimilacija selena: anorganska oblika Se → organska oblika Se
Akumulacija Se Volatilizacija Se
Transport Se
10
Selen se lahko prav tako uspešno odstrani iz okolja tudi z fitovolatilizacijo. Pri tem se selen sprosti v atmosfero in sicer v obliki relativno nestrupenih hlapov. V procesu fitovolatilizacije je glavna selenova oblika dimetilselenid (DMSe) (Dumont, Vanhaecke in Cornelis, 2006).
Fitovolatilizacija poteka na osnovi povezav med rastlinami, mikroorganizmi ter tlemi (Pilon- Smits in Quinn, 2010). Pri tem obrambnem mehanizmu rastlin je količina hlapnega selena odvisna od rastlinske vrste, interakcij med posameznimi rizosfernimi mikrobi in rastlinami ter od koncentracije ter kemične oblike selena v koreninskem sistemu. Rizosferni mikrobi še dodatno spodbujajo izhlapevanje selena (Eapen in D'Souza, 2005; Terry idr., 2000). Proces fitoremediacije, prek katere rastline v povezavi z mikroorganizmi ekstrahirajo, nato akumulirajo in kasneje s pomočjo fitovolatilizacije selen tudi izločijo, po svetu dosega pomembne rezultate (Di Gregorgio, 2008; Pilon-Smits idr., 1999). Proces fitoremediacije se še vedno podrobno raziskuje, ker je potrebno odgovoriti še na številna vprašanja, hkrati pa tudi obljublja in daje celovito možnost ustreznega ravnanja z odpadki (Parra, Torres, Arenas, Sánchez in Rodríguez, 2012).
2.3 VPLIV SELENA
2.3.1 Vpliv selena na rastline
Kmetijska praksa in razmere v okolju pomembno vplivajo na vsebnost selena v rastlinah.
Gojenje rastlin, ki so obogatene s selenom, je lahko učinkovit način dodajanja selena v prehrano organizmov, ki pa tega esencialnega elementa ne prejemajo v zadostnih količinah. S selenom obogatena živila so lahko dodatni vir Se, ki pa se prek prehranske verige vnaša v vse organizeme (Škrabanja, 2016).
Pionirske raziskave, izvedene v 30. letih prejšnjega stoletja, so privedle do odkritja, da so imele številne rastlinske vrste, ki so izvirale iz selenoznih tal na zahodu ZDA, sposobnost akumuliranja visokih koncentracij selena (Beath, Draize, Eppson, Gilbert in McCreary, 1934;
Knight in Beath, 1938; Trelease in Trelease, 1938, 1939). Nekateri rodovi, npr. Astragalus, Neptunia in Stanleya, lahko v svojih poganjkih hiperakumulirajo Se v koncentracijah od 10–15 mg Se g-1 suhe teže (Davis, 1972, 1986; Virupaksha in Shrift, 1965). Večina rastlinskih vrst pa vsebuje manj kot 25 µg Se g-1 suhe mase in ne more tolerirati visokih koncentracij selena v okolju (White idr., 2004). Nespecifična vezava selenoamino kislin selenocistein (SeCys) in selenometionin (SeMet) v proteine naj bi največ prispevala k toksičnosti selena v rastlinah (Brown in Shrift, 1981). Sposobnost selenovih hiperakumulacijskih rastlin, da akumulirajo in tolerirajo visoke koncentracije selena, naj bi bila povezana s posebno sposobnostjo, ki jim omogoča, da se Se ne vključuje v proteine (Brown in Shrift, 1981). Obstoj selenovih analognih metabolitov, ki vsebujejo S, v rastlinah kaže na to, da je biosinteza večine selenovih spojin odvisna od encimov, vključenih v asimilacijsko pot žvepla (Sors idr., 2005).
V zadnjem času so študije pokazale, da nizke ravni selena (0,1 ppm v talni raztopini) lahko odpravijo učinke oksidativnih stresov, ki so posledica nizkih temperatur (Abbas, 2012), močne jakosti svetlobe in obdelave krompirja s parakvatom (Seppänen idr., 2003), slanosti, visokih temperatur, UV sevanja, suše, težkih kovin (Hasanuzzaman, Hossain idr., 2011; Hawrylak- Nowak idr., 2014; Nawaz idr., 2015), in hkrati lahko za 14 % spodbujajo rast solatnih sadik (Xue, Hartikainen in Piironen, 2001).
Raziskovalci proučujejo vpliv selena na potopljene in plavajoče makrofite, ki so sposobne odstranjevanja tega elementa iz onesnaženih vod. Ena raziskava je bila narejena na vodnih
11
rastlinah - klasasti rmanec (Myriophyllum spicatum) in navadni rogolist (Ceratophyllum demersum) -, ki lahko v svojih tkivih kopičijo velike količine selena. Raziskovalci so ugotovili, da nizke koncentracije selena fotokemično učinkovitost fotosistema II povečujejo, medtem ko jo visoke koncentracije selena znižajo. Pri tem pa selen ni vplival na vsebnost klorofila a in b.
(Mechora idr., 2011). Druga raziskava pa je bila narejena na vrstah iz rodov Elodea, Lemna, Potamogeton in Phalaris, ki so bili izpostavljene različnim koncentracijam selenita. Rezultati so pokazali, da so sicer vse rastline akumulirale selen pri vseh koncentracijah, a najvišjo vsebnost selena v tkivih pri vseh izmerjenih koncentracijah je imel rod Lemna, ker je bila edina plavajača rastlina (ostale so bile ukoreninjene) (Swift, 2002).
Glede na kemijsko obliko selena je privzem selena prikazan v sledečem vrstnem redu: natrijev selenat > selenometionin > natrijev selenit (Cuderman, Ožbolt, Kreft in Stibilj, 2010; Ožbolt idr., 2008).
Številni raziskovalci zagovarjajo, da lahko pri rastlinskih organizmih selen pospešuje antioksidacijsko aktivnost in s tem zmanjša oksidativni stres, zavira procese, ki so povezani s staranjem, pozitivno vpliva na produkcijo ter omili stres, ki je nastal zaradi suše/visoke intenzitete svetlobe (Germ, Kreft in Osvald, 2005; Kuznetsov, Kholodova, Kuznetsov in Yagodin, 2003; Pennanen, Xue in Hartikainen, 2002; Xue idr., 2001). Selen lahko ščiti rastline pred rastlinojedimi živalmi in patogenimi mikroorganizmi. Ta zaščitni učinek je že prisoten, kadar je v rastlinskem tkivu 10 mg Se kg-1 suhe snovi (Pilon-Smits, 2015).
2.3.1.1 Strupenost selena za rastline
Organizmi, ki so izpostavljeni povišanim koncentracijam selena, imajo lahko številne fiziološke motnje: črne pike na listih ter bledenje listov. Toksične koncentracije selena se lahko kažejo v slabšem razvoju ter predčasnem odmiranju rastlin (Kabata-Pendias, 2001).
Na koncentracije selena, do katerih je rastlina še strpna, vplivata predvsem prisotnost sulfatnih ionov in starost rastline. Torej so mlajše rastline veliko bolj občutljive in je pri njih zato zaviranje rasti zaradi prisotnosti Se večje, kot pa je pri starejših. Pri selen neakumulirajočih rastlinah so mejne koncentracije selena odvisne predvsem od oblike selena. Kot smo že omenili, sta za rastline najpogostejši strupeni obliki selena selenit in selenat, ker ju rastline zelo hitro absorbirajo in kasneje pretvorijo v organske selenove spojine. Znano je, da naj bi bil selenit bolj dostopen ter 5- do 10-krat bolj toksičen od selenata (Terry idr., 2000). Mechora, Stibilj in Germ (2013) ravno tako navajajo, da je bil selenit za tri makrofite bolj toksičen kot selenat, in sicer zaradi hitrega ter bolj učinkovitega privzema selenita kot selenata. Glavni mehanizem, ki lahko povzroči toksičnost pri zelo visoki akumulaciji selena v tkivih, je vključitev selenocisteina (SeCys) ter selenometionina (SeMet) v posamezne proteine, in sicer na mesto cisteina (Cys) ter metionina (Met) (Terry idr., 2000). Tako se pojavijo spremembe v 3D zgradbi proteinov, kar lahko vodi do motenega delovanja encimov (Germ idr., 2007).
Raziskovalci so ugotovili, da so višje koncentracije (2, 5 in 10mg Se(IV) L−1) pri mali vodni leči večinoma negativno vplivale na fotokemično učinkovitost fotosistema II in aktivnost ETS.
Višje koncentracije selenita (10 mg Se L-1) so bile strupene za vodno lečo. Prav tako se je vsebnost selena v mali vodni leči povečala s povečanim trajanjem izpostvaljenosti teh rastlin selenu. Njihova raziskava je torej pokazala, da lahko vodna leča absorbira večje količine Se (IV) iz vodnega medija (Mechora, Stibilj in Germ, 2015). Mehanizem raztrupljanja pa lahko zaščiti rastline samo do neke mere, kajti v primeru, da so rastline daljše obdobje izpostavljene
12
stresu, mehanizem ne deluje več pravilno in posledično lahko rastline odmre (Mechora idr., 2015).
2.3.2 Vpliv selena na živali
Človek v svoje telo vnese relativno velik delež selena tudi z mesom, mesnimi izdelki in ribami, mlečnimi izdelki ter jajci (Hatfield idr., 2012). Številni poskusi na različnih živalih so pokazali, da se lahko ob zadostni količini selena v prehrani zmanjšuje število tumorjev. Pri različnih živalskih vrstah so vpliv preprečevanja raka pri večjem vnosu selena raziskovalci opazili v različnih fazah rakastih obolenj. V večini primerov je bil vir selena v obliki selenita (Harrison in Conrad, 1984; Koenig, Rode, Cohen in Buckley, 1997; Lipinski, 2005; Peter, Whanger, Lindsay in Buscall, 1982). Schwart in Foltz (1957) sta raziskala, da lahko dodajanje selenita prepreči pri kokoših nekrozo jeter. Za vse živalske vrste pa velja, da so dovzetne za zastrupitev zaradi prevelike količine zaužitega selena. Pogosto se ta zastrupitev lahko pojavi pri pašnih živalih (ovce, govedo, konji), ker se te prehranjujejo s krmnimi rastlinami, ki kopičijo selen (Hall idr., 2014).
Selen v organski obliki se zaradi večje biološke razpoložljivosti in manjše toksičnosti dlje časa kopiči v tkivih živali kot pa selen v anorganski obliki (Hall idr., 2014). Tako v živalskih virih prevladuje selenometionin. Številne študije pa tudi poročajo, da se lahko v živalskih virih poveča selenocistein, in sicer v primeru, da se kot dodatek h krmi živalim dodaja anorganski selen, in sicer selenit ter selenat (Hatfield idr., 2012).
2.3.3 Vpliv selena na človeka
Strokovnjaki so od odkritja selena pa vse do danes proučevali njegovo vlogo z molekulskega, biokemijskega ter genetskega vidika. Številni raziskovalci proučujejo vpliv presežka ali pa pomanjkanja selena v prehrani na živalih ter s kliničnimi raziskavami pri ljudeh. Za človekovo zdravje je nujno potrebna primerna preskrbljenost s selenom, in sicer zaradi njegovih antioksidativnih lastnosti, prisotnosti v selen vsebujočih beljakovinah (selenobeljakovinah) (Škrabanja, 2016), hkrati pa selen poskrbi tudi za nemoteno sintezo rastnih in ščitničnih hormonov (Reilly, 2006).
Ljudje in živali zaužijemo večino selena s hrano, in sicer v obliki selenovih aminokislin (SeCys in SeMet). Največje količine selena se v telesu nahajajo v skeletnih mišicah, ledvicah ter jetrih (Foster in Sumar, 1997). Znanstveniki opozarjajo glede na presnovo in vpliv selena na zdravje ljudi tudi na številne razlike med ženskim in moškim spolom (Škrabanja, 2016). Znaki pomanjkanja selena se v človeškem telesu pokažejo v primeru, da je dnevni vnos selena manjši od 19µg selena na dan pri moških in 13 µg selena na dan pri ženskah. Zgornja meja, ki pa še ne povzroča težav, je 400 µg selena na dan (Peter, 1989).
V zadnjih nekaj letih so se bolj začeli zanimati za rastline s povišano količino naravno prisotnega selena, ker je preskrbljenost ljudi s selenom v številnih evropskih državah manjša od priporočenega dnevnega vnosa selena (Finley, 2007). Torej je gojenje rastlin, ki so obogatena s selenom, zelo učinkovit način dodajanja selena v prehrano ljudi, ki pa tega elementa ne sprejmejo v zadostnih količinah (Škrabanja, 2016). S premajhno preskrbljenostjo s selenom so povezane naslednje bolezni: povišan krvni tlak, anemija, rak, multipla skleroza, mišična distrofija, neplodnost (Peters idr., 2007). Lahko pa se pojavijo tudi vrtoglavice, izguba apetita, povečanje srca, srčno popuščanje, slabost, srčne aritmija, Keshanova bolezen, Kashin Beckova
13
bolezen, poškodbe trebušne slinavke in srčne mišice ter izguba kožnega in lasnega pigmenta (Hatfield, Berry idr., 2012; Hatfield, Schweizer idr., 2016; Reilly, 2006).
Zadostna količina selena v prehrani naj bi torej zmanjšala možnost za nastanek rakavih obolenj pri človeku. Raziskave so bile narejena v ZDA, na Finskem ter Kitajskem. Epidemiološke raziskave so ponazorile obratno sorazmerno povezavo med količino selena v prehrani in možnim tveganjem za rakastimi obolenji, kot so to rak prebavnega trakta, debelega črevesja, pljuč, dojk, jajčnikov, levkemija itd. (Brooks idr., 2001; Finley, 2003, 2007; Lipsky idr., 2004).
Toda selen je lahko toksičen v prevelikih zaužitih odmerkih (Vinceti, Wei, Malagoli, Bergomi in Vivoli, 2001). Najbolj značilen znak prevelikih zaužitih količin selena je zadah po česnu.
Razlog je v izločanju hlapnih selenovih spojin (še posebno DMSe). Poznamo pa tudi druge znake prevelikih zaužitih količin selena: izguba las ter morfološke spremembe nohtov (Yang, Gu, Zhou in Yin, 1989). Poleg tega pa lahko kratkotrajno uživanje visokih koncentracij selena povzroči pri ljudeh tudi slabost, bruhanje in drisko, medtem ko lahko dolgotrajno uživanje visokih koncentracij (več kot 3200 μg/dan) vodi do selenoze, pri kateri glavne tarče akutne toksičnosti selena predstavljajo kardiovaskularni, gastrointestinalni, nevrološki in hematopoetski sistemi (Raisbeck, 2000; Reilly, 2006).
2.4 POSKUSNI ORGANIZMI - MAKROFITI
Makrofiti so organizmi, ki so kar veliki, da se jih lahko v vodi opazi s protim očesom. Glede na položaj v vodnem stolpcu in način pritrjevanja jih delimo na: potopljene (submerzne) ukoreninjene, plavajoče (natantne) ukoreninjene, plavajoče (natantne) neukoreninjene ter emerzne makrofite (Chambers, Lacoul, Murphy in Thomaz, 2008; Fox, 1992; Hutchinson, 1975). Plavajočim in potopljenim makrofitom pravimo tudi prave vodne rastline ali hidrofiti.
Pri njih se razvijejo hidromorfoze (morfološke in anatomske prilagoditve na vodno okolje) (Germ, 2013).
Makrofiti zelo vplivajo na kroženje snovi ter pretok energije v jezerih. So dober pokazatelj stanja okolja, v katerem uspevajo (Golob, Gaberščik idr., 2015). V glavnem so ogroženi zaradi neposrednega vpliva človeka na vodne in obvodne ekosisteme (Germ, 2013). S tem ko v svojo biomaso vežejo hranila iz sedimenta in vode, lahko prispevajo k samočistilni sposobnosti vodnih teles in tako izboljšujejo kakovost vode (Madsen idr., 2001).
Na rast in razvoj makrofitov vplivajo: hitrost vodnega toka in pretok, izpostavljenost valovom in vetru, svetloba, vrsta substrata, toplota, razpoložljivost plinov (kisika in ogljikovega dioksida), vsebnost hranil, kemizem vode, tekmovanje ter upravljanje z rečnim ekosistemom (Franklin, Dunbar in Whitehead, 2008; Šraj-Kržič idr., 2007), širina ter globina struge, red vodotoka, globina in oblika jezerske kotanje (Germ, 2013), naklon dna, naklon brega nad vodo, tip sedimenta, vegetacija obrežnega pasu, prisotnost makroalg, izraba tal v zaledju ter tudi kalnost vode (Golob, Gaberščik idr., 2015).
2.4.1 Mala vodna leča (Lemna minor L.)
Mala vodna leča je plavajoči vodni makrofit (Germ, 2013). Sodi v družino vodolečevk (Lemniaceae), ki je zastopana v Sloveniji s kar tremi rodovi, in sicer vodna leča (Lemna), žabja leča (Spirodela) ter vodna lečica (Wolffia) (Martinčič idr., 2007).
14
Plitva vodna telesa se lahko v poletnem času izsušijo in prav zato se lahko na teh predelih pojavljajo vrste, na primer mala vodna leča, ki so bolj strpne na občasna izsuševanja (Haslam, 1987). Pri mali vodni leči korenine popolnoma izgubijo svojo vlogo pritrjevanja. Njihova vloga je izključno le črpanje vode in hranil (Janković, 1979).
Uspeva predvsem na površini stoječih ali počasi tekočih vodah. Je od 2 do 4 mm velika enokaličnica. Ker so njeni pravi listi popolnoma zakrneli, imajo razvite stebelne členke. Ti stebelni členki so listom podobne tvorbe, ki so sploščene, kroglaste do eliptične oblike, posamične ali pa so sestavljene iz dveh do pet členkov (kolonija). Vsak posamezen členek ima tri žile, eno ali več enostavnih korenin ter zmerno razvit aerenhim (parenhimsko tkivo z velikimi medceličnimi prostori), ki rastlini omogoča plavanje na vodni površini (Martinčič idr., 2007).
Zaradi njene hitre prilagodljivosti vodnim razmeram je zelo uporabna za pridobivanje ter kopičenje škodljivih snovi iz vodnih sistemov. Kopiči lahko težke kovine in je zato uporabna pri proučevanju strupenih kovin v vodnem ekosistemu (Azeez in Sabbar, 2012). Prosto plavajoče makrofite, na primer različne vrste iz rodu vodna leča (Lemna spp.), pogosto uporabljajo v procesu čiščenja odpadnih voda (Landesman idr., 2011; Matamoros, Nguyen, Arias, Salvado in Brix, 2012; Priya, Avishek in Pathak, 2012; Sekomo, Rousseau, Saleh in Lens, 2012). Raziskovalci so ugotovili, da lahko malo vodno lečo uporabljamo tudi za odstranjevanje selena (Parra idr., 2012), bakra, cinka, kadmija, kroma, živega srebra, svinca (Horvat, Vidaković-Cifrek, Oreščanin, Tkalec in Pevalek-Kozlina, 2007; Mukherjee, Mukherjee, Bhattacharyya in Duttagupta, 2004), arzena, bora in urana (Alvarado idr., 2008).
Vendar pa lahko visoke koncentracije težkih kovin zmanjšajo rast vodne leče ter pri tem zmanjšajo njeno učinkovitost pri odstranjevanju strupenih snovi iz okolja, kjer rastejo (Boniardi, Rota in Nano, 1999).
Pri nas se razmnožuje vegetativno z ločitvijo posameznih členkov, na katerih v brstnem mešičku kasneje požene nov stebelni členek. Cveti le v toplejših območjih. Zimo pa prezimi v obliki zimskih brstov na zamuljenem delu stoječih voda. Cvetovi so enodomni, enospolni, z enim prašnikom oziroma enim pestičem in brez cvetnega odevala. Cvetovi so nameščeni na zgornji strani stebelnega členka v vrečasti vdolbinici (Martinčič idr., 2007).
Mala vodna leča je zaradi preproste zgradbe, razmnoževanja, preprostega gojenja in hitre rasti ustrezen organizem za preučevanje različnih vplivov iz okolja (Keppeler, 2009; Lewis, 1995;
Wang, 1991). Je zelo občutljiva na različna onesnaževala (Keppeler, 2009). Prav tako jo zaradi njene velikosti (majhnosti) in sposobnosti kopičenja kovin pogosto uporabljajo v raznih laboratorijskih in terenskih ekotoksikoloških raziskavah (Smith in Kwan, 1989).
Skratka, mala vodna leča je rastlina, ki je dragocena za krmo, hrano in je za človeka zdravilna rastlina (Landesman idr., 2011; Makhlayuk, 1992; Markova, 2007; Tikhonov, 1968). Študije so v vodni leči identificirale 32 biološko aktivnih snovi iz različnih kemijskih skupin. Med identificirane spojine štejemo tiste, ki so bile navzoče v največjih količinah, fitosterole (52,8 mg/kg), nasičene ogljikovodike (23,1 mg/kg), aldehide in ketone (20,2 mg/kg) in maščobne kisline ter njihove derivate (11,1 mg/kg) (Vladimirova in Georgiyants, 2014). Vsebuje torej esencialne aminokisline (arginin, lizin), asparaginsko kislino, glutaminsko kislino, ogljikove hidrate ter A, B in E vitamine. Najpomembnejši makroelementi in elementi v sledovih so brom, jod, kalcij, fosfor itd. Pripravki iz vodne leče pa se lahko uporabljajo za zdravljenje vnetja
15
zgornjih dihalnih poti, revmatizma, jetrnih bolezni, bolezni ščitnice ter razkuževanje kroničnih ran (Makhlayuk, 1992; Markova, 2007; Tikhonov, 1968). Uporablja se lahko tudi kot vir energije za proizvodnjo biogoriv (Landesman idr., 2011).
Slika 3: Mala vodna leča (Lemna minor L.) (foto: Nina Brudar).
3 MATERIALI IN METODE DELA
V raziskavi smo ugotavljali vpliv dodajanja različnih koncentracij selenita in selenata ter kombinacije selenita in selenata rastlinam male vodne leče in odziv rastlin na dodani selen v času rasti. Za poskus smo uporabili malo vodno lečo (Lemna minor L.). Magistrsko delo je potekalo v laboratorijih na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete v Ljubljani, na Katedri za ekologijo in varsvo okolja. Poskus je bil zasnovan v štirih ponovitvah in osmih obravnavanjih. Vsak poskus smo po enem tednu zaključili.
3.1 RASTLINSKI MATERIAL IN RASTNE RAZMERE
Malo vodno lečo smo nabrali 21.4.2016 v bajerju blizu Biološkega središča in jo dva tedna gojili v nadzorovanih razmerah v rastnih komorah Biotehniške fakultete. Rastline smo pred prestavitvijo v rastno komoro za 30 sekund potopili v 0,01 M raztopino natrijevega hipoklorita (NaOCl) in jih nato sprali z vodovodno vodo. Tako smo omejili oz. preprečili rast alg. Založno kulturo smo hranili v 10-litrski plastični posodi s Steinbergovim rastnim gojiščem, v rastni komori pri 22 ± 1 °C pod hladno belo fluorescentno svetlobo z jakostjo 160 µM m-2s-1 PAR, s ciklom svetlobe/teme v razmerju 18h : 6h. Po dveh tednih aklimatizacije rastlin smo pričeli s prvim poskusom.
3.1.1 Priprava poskusa
Poskusne rastline smo pri prvem poskusu gojili v 32 kristalizirkah, v katere smo predhodno nalili 250 mL Steinbergovega rastnega gojišča. Pri drugem, tretjem in čertem poskusu pa smo
