ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Amadeja VOLARIČ
DNA ANALIZA TOBAKA (Nicotiana tabacum L.) PO TRANSFORMACIJI Z Agrobacterium tumefaciens
DIPLOMSKO DELO
Visokošolski strokovni študij – 1. stopnja
Ljubljana, 2021
Amadeja VOLARIČ
DNA ANALIZA TOBAKA (Nicotiana tabacum L.) PO TRANSFORMACIJI Z Agrobacterium tumefaciens
DIPLOMSKO DELO
Visokošolski strokovni študij – 1. stopnja
DNA ANALYSIS OF TOBACCO (Nicotiana tabacum L.) AFTER TRANSFORMATION BY Agrobacterium tumefaciens
B. SC. THESIS
Professional Study Programmes
Ljubljana, 2021
Diplomsko delo je zaključek Visokošolskega strokovnega študija Kmetijstvo – agronomija in hortikultura – 1. stopnja. Opravljeno je bilo na Katedri za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin Oddelka za agronomijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorico diplomskega dela imenovala izr.
prof. dr. Zlato Luthar.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: doc. dr. Zalika ČREPINŠEK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Članica: izr. prof. dr. Zlata LUTHAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Članica: izr. prof. dr. Nataša ŠTAJNER
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum zagovora:
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dv1
DK UDK 602.6:582.930.3:663.9:601.4:577.21(043.2)
KG tobak, Nicotiana tabacum, transformacija, Agrobacterium tumefaciens, DNA, transgen, fenotipska analiza, molekulska analiza
AV VOLARIČ, Amadeja
SA LUTHAR, Zlata (mentorica)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Visokošolski strokovni študijski program prve stopnje Kmetijstvo - agronomija in hortikultura LI 2021
IN DNA ANALIZA TOBAKA (Nicotiana tabacum L.) PO TRANSFORMACIJI Z Agrobacterium tumefaciens
TD Diplomsko delo (Visokošolski strokovni študij – 1. stopnja) OP X, 38 str., 4 pregl., 14 sl., 57 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V predhodno pripravljene listne izsečke tobaka (Nicotiana tabacum L.) smo s pomočjo seva LBA4404 bakterije Agrobacterium tumefaciens (A. t.), ki je imela vključen plazmid pART27 2mgfp5 ER ali pCAMBIA1390 DsRed, transformirali dva markerska in dva selekcijska gena. Fenotipsko izražanje obeh markerskih transgenov gfp oz. DsRed smo spremljali v živih celicah tobaka, ki so imele sintetiziran zeleno oz. rdeče fluorescentni protein. Za ločitev transformiranih celic in tkiv od netransformiranih smo uporabili selekcijska transgena nptII in hptII odpornost na antibiotik kanamicin oz. higromicin. Po okužbi izsečkov z A. t. in plazmidom pART27 2mgfp5 ER je bila uspešnost regeneracije 82,65 % in po okužbi z genskim konstruktom A. t. pCAMBIA1390 DsRed 77,89 %. Med vitalne regenerante smo šteli tiste, ki so imeli korenine in pokončne liste. Takih je bilo na gojišču s kanamicinom 63 oz. 77,78 %. Ti so bili tudi pokazatelji uspešnosti transforamcije z nptII transgenom. Po transformaciji izsečkov z A. t. pCAMBIA1390 DsRed je nastalo 51 vitalnih regenerantov. Ti regeneranti so bili sposobni razgrajevati aktivno sestavino higromicina. Uspešnost transformacije je bila 68,92 % za hptII transgen. Pri 4 regenerantih oz. 10 % se niso namnožili fragmenti dolžine 211 bp značilni za DsRed transgen, kljub temu da smo pri njih zasledili prisotnost rdeče fluorescentnega proteina.
.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Dv1
DC UDC 602.6:582.930.3:663.9:601.4:577.21(043.2)
CX tobacco, Nicotiana tabacum, transformation, Agrobacterium tumefaciens, DNA, transgene, fenotipe analysis, molecular analysis
AU VOLARIČ, Amadeja
AA LUTHAR, Zlata (supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Professional Study Programme in Agriculture - Agronomy and Horticulture PY 2021
TI DNA ANALYSIS OF TOBACCO (Nicotiana tabacum L.) AFTER TRANSFORMATION BY Agrobacterium tumefaciens
DT B. Sc. Thesis (Professional Study Programmes) NO X, 38 p., 4 tab., 14 fig., 57 ref.
LA sl AL sl/en
AB Two marker and two selection genes were transformed into pre-prepared tobacco leaf explants (Nicotiana tabacum L.) by Agrobacterium tumefaciens (A. t.) strain LBA4404, which included plasmid pART27 2mgfp5 ER or pCAMBIA1390 DsRed.
Phenotypic expression of gfp or DsRed marker transgenes was studied in live tobacco cells that had synthesized green or red fluorescent protein. To separate the transformed cells and tissues from the non-transformed ones, we used the selection transgenes nptII and hptII resistance to the antibiotic kanamycin or hygromycin.
After infection of the explants by A. t. and plasmid pART27 2mgfp5 ER, the regeneration efficiency was 82.65 % and after infection with the A. t. pCAMBIA1390 DsRed 77.89 %. Among the vital regenerants we considered those that had roots and upright leaves. There were 63 (77.78 %) on kanamycin medium. These were also indicators of the success of nptII transgene transformation. After transformation of the explants by A. t. pCAMBIA1390 DsRed was formed 51 viable regenerants. These regenerants were able to degrade the active ingredient hygromycin. The transformation success rate was 68.92 % for the hptII transgene. At 4 regenerants (10
%) fragments of 211 bp length characteristic of the DsRed transgene did not amplify, despite the presence of a red fluorescent protein.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VII
KAZALO SLIK VIII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X
1 UVOD 1
1.1 NAMEN DELA 2
1.2 DELOVNE HIPOTEZE 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 TOBAK 3
2.2 RAZŠIRJENOST PRIDELOVANJA TRANSGENIH RASTLIN 4 2.3 TRANSGENEZA, PREUREJANJE GENOMA IN
REGULATIVA 6
2.3.1 Neposredne metode transgeneze 8
2.3.2 Posredne oz. biološke metode transgeneze 8
2.3.2.1 Selekcijski transgeni 10
2.3.2.2 Markerski transgeni 11
3 MATERIAL IN METODE 13
3.1 RASTLINSKI MATERIAL 13
3.2 SESTAVINE GOJIŠČA 13
3.3 PRIPRAVA IN RAZKUŽEVANJE GOJIŠČA 14
3.4 BAKTERIJA IN BINARNI VEKTORSKI SISTEM 14
3.5 TRANSGENEZA TOBAKA 15
3.6 KONTROLNO OBRAVNAVANJE Z NEOKUŽENIMI
LISTNIMI IZSEČKI TOBAKA 16
3.7 FENOTIPSKA ANALIZA SELEKCIJSKIH IN MARKERSKIH
TRANSGENOV 16
3.8 MOLEKULSKA ANALIZA TRANSGENOV Z METODO PCR 17
3.8.1 DNA izolacija iz listov tobaka 17
3.8.2 Določitev koncentracije in redčitev DNA 18
3.8.3 Pomnoževanje DNA fragmentov z verižno reakcijo s
polimerazo 18
3.8.4 Agarozna gelska elektroforeza in analiza DNA fragmentov 19
4 REZULTATI 20
4.1 FENOTIPSKO IZRAŽANJE SELEKCIJSKIH TRANSGENOV 20 4.2 REGENERACIJA LISTNIH IZSEČKOV TOBAKA PO
TRANSFORMACIJI NA SELEKCIJSKEM GOJIŠČU 20
4.3 RAST IN KORENINJENJE REGENERANTOV NA
SELEKCIJSKEM GOJIŠČU 22
4.4 FENOTIPSKO IZRAŽANJE MARKERSKIH TRANSGENOV 23 4.5 MOLEKULSKA ANALIZA VKLJUČENOSTI gfp IN nptII TER
DsRed IN hptII TRANSGENOV Z METODO PCR 24
4.6 USPEŠNOST TRANSFORMACIJE 26
4.7 KONTROLNO OBRAVNAVANJE Z NEOKUŽENIMI
LISTNIMI IZSEČKI 26
5 RAZPRAVA IN SKLEPI 28
5.1 RAZPRAVA 28
5.2 SKLEPI 30
6 POVZETEK 32
7 VIRI 34
ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Sestava MSr gojišča v kontrolnem poskusu s petimi
obravnavanji za regeneracijo netransformiranih listnih izsečkov tobaka
16
Preglednica 2: Nukleotidno zaporedje začetnih oligonukleotidov za posamezni transgen in pričakovana dolžina pomnoženega fragmenta 18 Preglednica 3: Število odzivnih izsečkov tobaka, nastalih in vitalnih
regenerantov ter odstotek regeneracije na ustreznem selekcijskem MSr gojišču po transformaciji z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t. pCAMBIA1390 DsRed
21
Preglednica 4: Število in odstotek regenerantov tobaka s koreninami na ustreznem selekcijskem MS gojišču, nastalih po transformaciji listnih izsečkov z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t.
pCAMBIA1390 DsRed
22
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: V letu 2017 je 24 držav na svetu pridelovalo gensko spremenjene
rastline (ISAAA …, 2017) 4
Slika 2: V letu 2017 je 10 držav na svetu pridelovalo gensko spremenjene
rastline na 1 milijonu ha in več (ISAAA …, 2017) 5 Slika 3: Skupne površine v milijon ha in trend naraščanja površin posajenih z
gensko spremenjenimi rastlinami v industrijsko razvitih državah in državah v razvoju med leti 1996 in 2017 (ISAAA …, 2017)
6
Slika 4: Plazmid: A - pART27 (Gleave, 1992) in B - pCAMBIA1390 (Cambia,
1997) 14
Slika 5: Transforamcija listnih izsečkov tobaka: A – inkubacija izsečkov z bakterijsko suspenzijo, B – zračno sušenje izsečkov na filtrskem papirju v brezprašni komori, C – kokultivacija na MSr gojišču, D – razrast bakterijske kolonije v treh dneh kokultivacije
16
Slika 6: Propad netransformiranih delov listnih izsečkov tobaka in regeneracija transformiranih celic na selekcijskem MSr gojišču z dodanim antibiotikom: A – kanamicin in B – higromocin
20
Slika 7: Regeneranti tobaka: A – na izsečku gojenem na selekcijskem MSr gojišču; B – regeneranti prestavljeni na selekcijsko MS gojišče za rast 21 Slika 8: Odstotek vitalnih in propadlih regenerantov tobaka, nastalih na
selekcijskem MSr gojišču po transformaciji izsečkov z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t. pCAMBIA1390 DsRed
21
Slika 9: Rast in razvoj regenerantov tobaka na selekcijskem MS gojišču, nastalih po transformaciji listnih izsečkov z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t.
pCAMBIA1390 DsRed
22
Slika 10: Odstotek propadlih regenerantov tobaka, s povešenimi listi in s koreninami na ustreznem selekcijskem MS gojišču, nastalih po transformaciji listnih izsečkov z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t.
pCAMBIA1390 DsRed
23
Slika 11: Prisotnost zelene fluorescence mGFP5 ER proteina v transformiranih celicah listnih izsečkov tobaka, opazovano z epifluorescentnim 23
mikroskopom: A – pri naravni svetlobi; B – s fluorescentno lučko in kombinacijo ustreznih filtrov
Slika 12 Prisotnost rdeče fluorescence DsRED EXPRESS proteina v transformiranih celicah listnih izsečkov tobaka, opazovano z epifluorescentnim mikroskopom: A – pri naravni svetlobi; B – s fluorescentno lučko in kombinacijo ustreznih filtrov
24
Slika 13: Pomnoženi fragmenti DNA v dupleks PCR s parom začetnih oligonukleotidov za nptII transgen (650 bp) in za mgfp5-ER transgen (422 bp). 1–40 – transformiran tobak, K – kontrola – netransformiran tobak, P – plazmid pART27 2mgfp5-ER, S – slepi vzorec, M – velikostni standard
25
Slika 14: Pomnoženi fragmenti DNA v dupleks PCR s parom začetnih oligonukleotidov za hptII transgen (641 bp) in za DsRed transgen (211 bp). 1–40 – transformiran tobak, K – kontrola – netransformiran tobak, P – plazmid pCAMBIA1390-DsRed, S – slepi vzorec, M – velikostni standard
25
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI A. t. Agrobacterium tumefaciens
BAP 6-benzilamino purin – citokinin BPB nanašalno barvilo brom fenol modro
bp bazni par
CaMV virus mozaika cvetače (cauliflower mosaic virus) DNA deoksiribonukleinska kislina
DsRED rdeči fluorescentni protein (red fluorescent protein) iz korale Discosoma sp.
DsRED rdeči fluorescentni transgen EDTA etilendiamin tetraocetna kislina
GFP zeleni fluorescentni protein (green fluorescent protein) iz meduze Aequorea victoria
gfp zeleni fluorescentni transgen GSO gensko spremenjen organizem GSR gensko spremenjena rastlina HPTII higromicin fosfotransferaza II
hptII higromicin fosfotransferaza II transgen Mbp/1C mega baznih parov na haploidni jedrni genom MS Murashige in Skoog gojišče
MSr MS regeneracijsko gojišče NAA α-naftalen ocetna kislina NPTII neomicin fosfotransferaza II
nptII neomicin fosfotransferaza II transgen
PCR verižna reakcija s polimerazo (polymerase chain reaction)
T-DNA prenosna DNA (transfer DNA), del Ti-plazmida, ki se vključi v genom rastline
Ti-plazmid plazmid iz A. t.(tumour inducing plasmid), ki povzroča novotvorbe pri rastlinah
YEB gojišče za rast bakterij (ang. yeast extract and beef)
1 UVOD
Žlahtnjenje je postopek s pomočjo katerega lahko izboljšamo obstoječe lastnosti rastlin. S klasičnim žlahtnjenjem, ki je dolgotrajen program in omejen na vrsto, v izbrane rastline s križanjem vnesemo želene agronomske lastnosti. Klasično žlahtnjenje je razen redkih izjem npr. tritikala, nekatere križnice, citrusi itd. omejeno na vrsto. In vitro tehnike omogočajo tudi medvrstna križanja, katerim sledi reševanje nedozorelih embrijev. Medvrstna križanja so še vedno omejena in uspejo v redkih kombinacijah. Alternativna metoda klasičnega žlahtnjenja je genski inženiring, ki nudi neomejene manipulacije z geni. Prednost transgeneze je tudi v tem, da lahko postopek bistveno skrajšamo, ker delamo zelo ciljno s posameznim genom oz.
skupino genov, ostali del genoma pustimo nedotaknjen. Izognemo se večletnemu, v povprečju štiri- do šestletnemu postopku povratnih križanj, v katerih se odstranjuje neželene gene, ki jih poleg želenih vključimo v križance pri običajnem križanju, kjer delamo s polovičnim genomom obeh staršev. Heterozigotne križance F1 generacije za lastnost, ki jo izboljšujemo, povratno križamo s staršem, ki ima večino dobrih lastnosti in jih želimo vključiti oz. ohraniti v potomcih. Na koncu opravimo še samooprašitev heterozigotnih rastlin. Trajanje celotnega postopka je odvisno ali v potomce vključujemo lastnost, ki je dominantno oz. recesivno dedovana (Kapusi in sod., 2013).
V samem postopku žlahtnjenja z genskim inženiringom se za ločevanje transformiranih tkiv od netransformiranih, predvsem v začetnih fazah optimizacije, uporabljajo selekcijski geni, ki večinoma slonijo na antibiotski, herbicidni, ksilozni, manozni in betain aldehidni metabolni odpornosti celic ali tkiv. Selekcijski geni dajejo transgenim celicam možnost razvoja na selekcijskih gojiščih, ker so celice sposobne razgrajevati dodani agens. Na netransformirane celice pa delujejo toksično in povzročajo odmrtje (nekroze) (Kapusi in sod., 2013).
Za študije fenotipskega proučevanja transgenih lastnosti pa se uporabljajo testni ali markerski geni, katerih prednost je ta, da je njihovo izražanje hitro in jih endogeno rastline ne vsebujejo. Markerski geni so zelo primerni za določanje produktov transgenih celic, saj je njihovo ekspresijo mogoče enostavno spremljati. Med pogosto uporabljenimi so transgeni, ki omogočajo celicam sintezo fluorescentnih proteinov. Njihova prednost je ta, da produkt spremljamo v živih celicah oz. tkivih in jih lahko uporabimo za nadaljnje raziskave (Vain in sod., 2000).
Za uspešno vzpostavitev transformacijskega sistema za določeno agronomsko pomembno lastnost in rastlinsko vrsto sta predhodno vzpostavljena primerna selekcija in uspešen markerski sistem, ki omogočata hitro izražanje lastnosti, nujno potrebna v kombinaciji z visoko odzivnostjo izsečkov in sposobnostjo regeneracije (Popescu in sod., 2010). Na podlagi rezultatov vzpostavljenega učinkovitega markerskega sistema lahko pričakujemo podoben odziv izražanja gospodarsko pomembnih lastnosti. To še posebej velja za tiste
vrste, ki se v tkivni kulturi počasi regenerirajo oz. so slabše odzivne, in gospodarske lastnosti, ki za izražanje potrebujejo dalj časa, npr. sintetske poti sekundarnih metabolitov, izražanja barve cvetov, plodov itd. Slednje je pri sadnih rastlinah vezano na prehod iz juvenilne v rodno fazo, kar pa lahko traja tudi do tri in več let (Zhang in sod., 2015).
1.1 NAMEN DELA
Namen dela je bil vnos štirih transgenov v genom tobaka, dveh selekcijskih nptII in hptII, odpornost na antibiotik kanamicin in higromicin ter dveh markerskih transgenov gfp in DsRed in spremljanje preživetja izsečkov ter regeneracije na selekcijskem gojišču. Po transformaciji smo pri nastalih regenerantih spremljali tudi fenotipsko izražanje gfp in DsRed proteina z epifluorescentnim mikroskopom in ustreznimi filtri ter preverili prisotnost transgenov na DNA nivoju.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Z dodanima antibiotikoma kanamicin oz. higromicin v gojišče za regeneracijo smo želeli potrditi njuno primernost za transformacijo tobaka, ki sloni na preživetju transformiranih celic oz. tkiv.
Primernost izbranih fluorescentnih markerskih transgenov smo fenotipsko spremljali z epifluorescentnim mikroskopom s pojavom zelene oz. rdeče fluorescence v celicah oz. tkivih izsečkov in nastalih regenerantih.
Z molekulsko analizo DNA regenerantov smo preverili:
- prisotnost transgenov v nastalih regenerantih,
- uskladitev DNA rezultatov s fenotipskim izražanjem transgenov in - možnost vgraditve dela genskega konstrukta oz. T-DNA
2 PREGLED OBJAV 2.1 TOBAK
Tobak (Nicotiana sp.) izvira iz subtropskih predelov in njegovo pridelovanje se je s prilagoditvijo sort razširilo tudi v druga zanj manj tipična pridelovalna območja. Gojijo ga zaradi listov, ki so surovina v tobačni industriji. Vsebuje zelo znan alkaloid nikotin, ki rastlino varuje pred insekti in se ga uporablja kot bioinsekticid v biološki pridelavi hrane.
Botanično je vključen v družino razhudnikov (Solanaceae) in njegov rod (Nicotiana) je vrstno zelo pester. Tržno zanimiv je navadni tobak (Nicotiana tabacum L.), ki doseže v višino do 2 m in je enoletna, samoprašna rastlina. Tobak je v skupini rastlin z velikim genomom, sestavlja ga 3,7 x 109 bp, ki so razporejeni v 48 majhnih kromosomov. Je alotetraploid (4x), ki je najverjetneje nastal s križanjem N. sylvestris Spegazz. in Comes (2n
= 12 ali 24 kromosomov) in N. tomentosiformis Goodsp. (2n = 24 kromosomov) (Wernsman in Matzinger, 1980; Arumuganathan in Earle, 1991).
Tobak velja za izjemno uspešno modelno rastlino za genske transformacije, saj njegov genom z lahkoto sprejme transgene. Listni izsečki v tkivni kulturi dosežejo velik odstotek direktne regeneracije in regenerante odlikuje hitra rast (Burow in sod., 1990; Stolarz in sod., 1991). Tobak ima dobro razvit in vitro posredni transformacijski sistem s talno fitopatogeno bakterijo Agrobacterium tumefaciens. Že leta 1983 je bil kot prvi rastlini s posredno metodo vnešen transgen, ki je odgovoren za antibiotsko odpornost na kanamicin (Horsch in sod., 1984). Leta 1986 je bil vključen v prve poljske poskuse z gensko spremenjenimi rastlinami (GSR), ki so potekali v Franciji in Združenih državah Amerike, z odpornostjo na glifosat.
Tobak je bil prva komercialno GSR odporna na virus, ki so jo na Kitajskem leta 1992 sprostili v pridelavo. Leta 1996 je transgeni tobak odporen na virus dobil dovoljenje za širšo pridelavo izven Kitajske. Tobak proizvede veliko biomase in njegova pomembnost je predvsem v fitofarmacevtski in tobačni industriji, ni pa primeren za prehrano ljudi in živali (Fischer in sod., 2004). To je tudi razlog, zakaj se je v pridelavi izven Kitajske tudi v Evropi, kar dolgo obdržal, saj njegova ocena tveganja navaja tehten razlog: "noben njegov del ni vključen v prehrano ljudi in živali". V Evropski uniji je imel tobak dovoljenje za pridelavo z odpornostjo na herbicid oksinil do leta 2012. V Združenih državah Amerike pa poleg odpornosti na virus in oksinil pridelujejo še tobak z manjšo vsebovanostjo nikotina in od leta 1996 še tobak, odporen na glifosat (ISAAA …, 2017). Od leta 1992 do 2017 je število komercialnih GSR naraslo na 27: lucerna, ogrščica, fižol, nageljn, radič, bombaž, plazeča šopulja, jajčevec, lan, koruza, melona, papaja, petunija, sliva, topol, krompir, riž, vrtnica, soja, buča, sladkorna pesa in trs, sladka paprika, tobak, paradižnik, pšenica in sončnica (ISAAA …, 2017). V poročilu za leto 2018 je navedena še komercialna pridelava: jablane, vrtnice in petunije (ISAAA …, 2018).
2.2 RAZŠIRJENOST PRIDELOVANJA TRANSGENIH RASTLIN
GSR so leta 2017 pridelovali v 24 državah na svetu na 189,8 milijonih ha. Površine posejane z GSR izven Evrope skokovito naraščajo, predvsem v nekaterih državah Latinske Amerike.
V letu 2017 je bilo posajenih 4,7 milijonov ha več kot v letu 2016, kar znaša 3 % (ISAAA
…, 2017).
Slika 1: V letu 2017 je 24 držav na svetu pridelovalo gensko spremenjene rastline (ISAAA …, 2017)
V 10 državah pridelujejo GSR na več kot 1,3 milijonih ha (Slika 2). V letu 2018 se je deseterici pridružil še Urugvaj. V ZDA so v letu 2017 pridelovali GSR na kar 75 milijonih ha. Druga največja pridelovalka GSR je Brazilija s 50,2 milijoni ha, sledijo ji Argentina s 23,6 milijoni ha, Kanada s 13,1 milijona ha, Indija z 11,4 milijoni ha itd. Komercialno so transgene rastline v pridelavi od leta 1996. Največ površin je bilo v letu 2017 posajenih s sojo (50 %), koruzo (33 %), bombažem (12 %) in oljno repico (5 %). Lastnosti teh rastlin so odpornost na škodljivce, izboljšana kakovost in toleranca na herbicide (Slika 2) (ISAAA …, 2017; ISAAA …, 2018; USDA ..., 2020).
Slika 2: V letu 2017 je 10 držav na svetu pridelovalo gensko spremenjene rastline na 1 milijonu ha in več (ISAAA …, 2017)
V Evropi je bila v letu 2017 v pridelavi samo GS koruza z odpornostjo na koruzno veščo, in sicer v Španiji na površini 124.227 ha in na Portugalskem na 7.308 ha, medtem ko so na Češkem in Slovaškem v letu 2017 nehali pridelovati GS koruzo. Na Češkem je bila v letu 2016 GS koruza posejana na 75 ha in na Slovaškem na samo 30 ha (ISAAA …, 2017).
V Evropi sta Španija in Portugalska v letu 2017 nadaljevali s pridelavo GSR na površini 131.535 ha, kar kaže na 4 % zmanjšanje primerjalno z letom 2016, ko je bilo v pridelavo vključenih 136.363 hektarjev (ISAAA …, 2017; USDA..., 2020). To pa ne pomeni, da raziskave in tudi poljski poskusi z GSR v Evropi ne potekajo. Prav v letu 2017 je Inštitut v INRI z genskim inženiringom pridobil odporno sorto slive 'HoneySweet' na virus šarke (Plum Pox virus - PPV). V letu 2019 so bila izdana dovoljenja za poljske poskuse v desetih državah EU. Vendar je samo sedem držav izvedlo testiranja na prostem: Belgija, Češka, Nizozemska, Romunija, Španija, Švedska in Velika Britanija. Žlahtnitelji in semenarske hiše, kot glavne razloge za opuščanje poljskih poskusov navajajo: ponavljajoče uničevanje poskusov s strani aktivistov, zahtevni in dolgotrajni postopki izdaje dovoljenj in neprivlačno naložbeno okolje za semenarska podjetja. Nekatere javne ustanove, ki opravljajo laboratorijske raziskave, sodelujejo v partnerstvu z zasebnimi podjetji in izvajajo poljske
poskuse izven EU, predvsem v ZDA in v zadnjem obdobju v državah Latinske Amerike (ISAAA …, 2018; USDA..., 2020)
Uporaba izsledkov sodobne biotehnologije je v kmetijstvu najbolj zastopana na področju žlahtnjenja rastlin. Po obsegu so GSR takoj za uporabo sodobne biotehnologije v medicini (USDA..., 2020).
Iz pridelovanja GSR v daljšem časovnem obdobju od leta 1996 do 2017 je razviden trend naraščanja in presenetljivo je to, da imajo države v razvoju po letu 2011 posajenih več GSR kot industrijsko razvite države. V letu 2017 je bilo razmerje 53 % države v razvoju in 47 % industrijsko razvite države (Slika 3). Glavni razlog za porast pridelave GSR v manj razvitih državah je bistveno povečan bruto prihodek s pridelavo GSR (ISAAA …, 2017).
Milijon hektarjev
Leta
Slika 3: Skupne površine v milijon ha in trend naraščanja površin posajenih z gensko spremenjenimi rastlinami v industrijsko razvitih državah in državah v razvoju med leti 1996 in 2017 (ISAAA …, 2017)
2.3 TRANSGENEZA, PREUREJANJE GENOMA IN REGULATIVA
S pomočjo specifičnih fizikalnih in bioloških metod je bilo doseženo, da rastline lahko sprejmejo transgene, izražajo in prenašajo na potomce. Te rastline imenujemo transgene rastline ali gensko spremenjene rastline (GSR). Njihova skupna značilnost je mednarodno določeno obvezna presoja tveganja pred njihovo uporabo, v kar sodijo odobritveni postopki
in dovoljenja za poskuse, pridelavo in trženje, saj je tako zagotovljena njihova varna uporaba.
Običajno se transgene vnaša v gospodarsko zelo pomembne sorte in s tem se jim izboljša posamezno lastnost ali skupino lastnosti. V primeru, če izoliramo gen iz neke sorte in ga vnesemo v genom druge sorte znotraj iste vrste, jih imenujemo cisgene rastline. Tak gen lahko prenesemo iz ene sorte v drugo z opraševanjem, kot to poteka v naravi ali se poslužujemo ročnega opraševanja oz. križanja v izolaciji pri tujeprašnicah, pri samoprašnicah pa predhodno odstranimo oz. onesposobimo prašnike (maskulacija), da preprečimo samooprašitev. V tem primeru nastali potomci ne sodijo v gensko regulativo in ne povzročajo tveganja, kljub temu, da ročno opraševanje ni naravni prenos peloda. V zgoraj navedenem primeru cisgenih rastlin, ko je vnos gena iz ene v drugo sorto znotraj vrste opravljen z genskim inženiringom, to sodi v gensko regulativo in je na nacionalnem nivoju regulirano z Zakonom o ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi (2005), ki je bil v letu 2010 uradno dopolnjen in spremenjen (Zakon o spremembah …, 2010) ter Direktivo Evropskega parlamenta in Sveta o namernem sproščanju gensko spremenjenih organizmov v okolje (2001). Prav tako rastline, ki sprejmejo s pomočjo genskega inženiringa tuje gene iz drugih vrst in rodov, jih imenujemo transgene rastline in sodijo v gensko regulativo (Zakon …, 2005; Zakon o spremembah …, 2010; Direktiva 2001/18/ES …, 2001). V gensko regulativo ne sodijo nastali organizmi oz. spremenjen genom organizmov, ki je nastal s postopki in vitro kultur (somaklonska variabilnost), fuzijo protoplastov, naravni postopki konjugacije, transdukcije in transformacije, ki potekajo pri prokariontih, nastanek haploidov, indukcija poliploidije, mutageneza vezana na mutagene agense, če ne vključujejo molekul rekombinantnih nukleinskih kislin oz. DNA.
V Evropaki uniji v gensko regulativo po 25.7.2018 sodijo tudi rastline nastale z novimi genomskimi tehnikami mutageneze, ki za spremembo genoma ne uporabljajo mutagenih agensov in omogočajo spremembo genoma drugače kakor transgeneza, brez vstavitve tuje DNA (Sodišče EU, 2018). V zadnjem obdobju je s pomočjo teh nastalo nekaj sort, odpornih na selektivne herbicide, kar je sprožilo tožbo devetih kmetijskih zvez in društev, ki zastopajo interese malih kmetov, zoper francosko zakonodajo, s katero so organizmi dobljeni z mutagenezo, oproščeni obveznosti, določenih z Direktivo o GSO (Direktiva 2001/18/ES …, 2001). Ta direktiva določa, da se GSO odobri šele po opravljeni oceni tveganja, iz katere je razviden njegov vpliv na zdravje in varstvo okolja ter zanje velja zahteva glede sledljivosti, označevanja in spremljanja. Francoske kmetijske zveze in društva trdijo, da so se tehnike mutageneze sčasoma spremenile. Pred sprejetjem Direktive o GSO so se uporabljale samo konvencionalne ali naključne metode mutageneze, in sicer in vivo na posameznih delih ali celih rastlinah. Nato pa so se s tehničnim napredkom pojavile tehnike in vitro mutageneze, ki omogočajo usmerjanje mutacij. Po mnenju francoskih kmetijskih zvez in društev pri uporabi sort, nastalih s preurejanjem genoma z mutagenezo, obstaja enako tveganje za nastanek škode za okolje ter zdravje ljudi in živali, kot obstaja pri GSO dobljenih s
transgenezo. Conseil d’État (francoski državni svet) je Sodišče Evropske unije pozval, naj pojasni, ali so organizmi dobljeni z mutagenezo GSO, ali zanje veljajo obveznosti, določene z Direktivo o GSO. Sodišče Evropske unije je 25.7.2018 ugotovilo, da so organizmi, dobljeni z mutagenezo GSO v smislu Direktive o GSO, kadar se s tehnikami in metodami mutageneze genski material spremeni, tako da se v naravi ne pojavlja oz. ni mogoč. Iz tega izhaja, da ti organizmi načeloma spadajo na področje uporabe Direktive o GSO in da zanje veljajo obveznosti, določene s to direktivo. Sorte, dobljene s konvencionalnimi tehnikami mutageneze, ki so bile uporabljene že v številnih primerih in so se izkazale kot varne, pa so izvzete iz te obveznosti (Sodišče EU, 2018).
V rastlinski genom je s pomočjo različnih tehnik sodobne biotehnologije omogočen vnos transgenov, ki kodirajo beljakovine oz. izražajo želeno lastnost. Za stabilno transformacijo je značilen vnos transgena v jedrni ali plastidni genom. Za izboljšanje kmetijskih rastlin in odkrivanje funkcij genov v rastlinah so pomembne genske transformacije. Transformacija rastlinskega genoma se lahko opravi z dvema postopkona genskega inženiringa: neposredno (direktno) in posredno (indirektno) (Bohanec, 2004).
2.3.1 Neposredne metode transgeneze
Neposredno vnašanje transgenov (vključenih v T-DNA) z izolirano plazmidno DNA lahko poteka z (Finer in Dhillon, 2008):
- obstreljevanjem (biolitska) rastlinskih tkiv s pospešenimi delci, obdanimi s plazmidno DNA, ki vsebujejo transgene,
- elektroporacijo rastlinskih tkiv z elektro sunki, rastlinske izsečke skupaj s plazmidno DNA se v elektroporacijskem pufru izpostavi kratkim (ms) in šibkim elektro sunkom,
- ultrazvokom, ratlinska tkiva in plazmidno DNA se v tekočem gojišču izpostavi ultrazvočnemu valovanju v ultrazvočni kopeli,
- kemično s polietilen glikolom, v tekoča gojišča z rastlinskimi izsečki in plazmidno DNA se doda polietilen glikol, ki pospeši transformacijo in
- mikroiniciranjem, makro in mikro vbrizgavanje plazmidne DNA v rastlinske celice 2.3.2 Posredne oz. biološke metode transgeneze
Posredni oz. biološki način s pomočjo sevov bakterije Agrobacterium tumefaciens (A. t.) ali A. rhizogenes (A. r.) v naravi poteka med bakterijo in dvokaličnicami. Na ranjenem mestu po okužbi z A. t. nastane rakasta tvorba, medtem ko A. r. pospešuje rast lasastih korenin in fiksacijo dušika. Obe bakteriji imata poleg kromosomske DNA tudi plazmidno DNA, t.i. Ti oz. Ri plazmid. Bakteriji sta sposobni prenosa dela plazmida t.i. T-DNA v rastlinsko DNA ob pomoči večjega števila beljakovin, ki se sintetizirajo, ko bakterija vstopi v stik z rastlino.
Že leta 1907 je bilo ugotovljeno, da A. t. povzroča na hipokotilih dvokaličnic rast nediferenciranega rakastega tkiva (Smith and Townsend, 1907). Tumorske celice sintetizirajo opine, z ogljikom in dušikom bogate snovi podobne aminokislinam, ki jih A. t.
vključi v svoj metabolizem. Regija genov, ki je odgovorna za sintezo opinov, je locirana v delu Ti-plazmida, imenovanem prenosna oz. taransfer T-DNA in se ob okužbi naključno vgradi v rastlinski kromosom. V T-DNA je še t. i. onc regija, odgovorna za hormonsko sintezo avksinov in citokininov, ki so povzročitelji rasti tumorskih celic. Levo od mejnega nukleotidnega zaporedja T-DNA je locirana virulentna regija s t.i. vir geni, ki ob prisotnosti rastline povzročijo rastlinsko sintezo polifenolnih snovi in desno izven T-DNA je regija za razgradnjo opinov (Zupan in sod., 2000).
Pri izrezu enoverižne T-DNA sodelujejo tudi bakterijski kromosomski chv geni. Ob pomoči chvB gena se sintetizira protein ciklični glukan, odgovoren za pritrditev bakterije na rastlino, chvA gen pa kodira transportni protein, ki prenese ciklični glukan v celično steno (Stiekema in Visser, 1991).
Ob poškodovanih rastlinskih celicah se aktivirajo geni vir regije, ki imajo odločujočo vlogo pri prenosu enoverižne T-DNA. Polifenolne komponente acetosiringona in hemiacetosiringona, ki se sintetizirajo v bližini poškodovanih celic in se sproščajo v okolico, vplivajo na avtofosforilacijo protein virA in posledica tega je fosforilizacija proteina virG, ki vpliva na aktivnost ostalih vir genov. Mejna nukleotidna zaporedja T-DNA dolgo 25 bp prepoznata proteina virD1 in virD2 in povzročita znotraj njiju endonukleazno odcepitev enojne verige T-DNA. Takoj po odcepitvi se znotraj mejnih nukleotidnih zaporedij izgradi T-veriga. Na odcepljeno T-DNA verigo se vežeta protein virE2 in na 5' koncu še protein virD2 ter tvori se T-kompleks, ki ima sposobnost prehoda po bakterijski citoplazmi in steni.
Po vstopu skozi rastlinsko celično steno se dodatno opremi z rastlinskimi proteini, da je neprepoznaven za ratlinske endonukleaze in tako zaščiten pred njihovo razgradnjo. Po prehodu skozi celično jedrno poro se naključno vgradi v enega od rastlinskih kromosomov (Zupan in Zambryski, 1995).
Naravni plazmid je bil spremenjen za potrebe transgeneze. Iz levega in desnega mejnega nukleotidnega zaporedja je bila izrezana T-DNA. Ohranjene so ostale regije, ki so nujne za podvajanje, vnos in vgraditev želene DNA v rastlinski kromosom. Na predelu plazmida, kjer so bili prej locirani bakterijski funkcionalni geni, pa je vstavljen genski konstrukt z želenim transgenom oz. transgeni. Laboratorijski bakterijski sevi poleg dvokaličnic uspešno okužujejo tudi enokaličnice (Hiei in sod., 1994).
Za laboratorijski prenos transgenov v rastlinski genom se kot vektor pogosto uporablja Ti- plazmid, medtem ko je Ri-plazmid zelo redko uporabljen. Iz T-DNA naravnega plazmida so izrezani geni za tvorbo opinov in onc geni, ostanejo samo mejna nukeotidna zaporedja, med
katere se vključi želene transgene. Modificiran oz. razoroženi Ti-plazmid ni sposoben izzvati rasti tumorja, je pa sposoben vključitve T-DNA v rastlinski kromosom. Veliko odkritje na področju transgeneze je bil binarni oz. trans vektorski sistem. Avtorji Zambryski in sod.
(1983) so odkrili, da se lahko vir in T-DNA regiji nahajata na dveh različnih plazmidih.
Ločitev omenjenih regij na dva plazmida ne vpliva na uspeh prenosa. Avtorji so potrdili, da imajo pomembno vlogo za izrez in prenos T-DNA mejna nukleotidna zaporedja T-DNA, ki v binarnem sistemu delujejo cis (Hoekema in sod., 1983).
2.3.2.1 Selekcijski transgeni
Majhno število rastlinskih celic sprejme transgen, zato se za zanesljivo ločevanje z željenim genom vgradi še selekcijski gen, ki omogoča transformiranim celicam razgrajevati selekcijski agens. Tako imajo transformirane celice in tkiva metabolno prednost v rasti in razvoju na selekcijskih gojiščih. Večkrat uporabljena je pozitivna selekcija, kjer tansgen kodira protein, lahko tudi encim, ki je sposoben razgradnje toksičnega selekcijskega agensa, bodisi: antibiotika, herbicida, manoze, prekurzorja fitohormonov. Najbolj pogosto uporabljen selekcijski transgen je nptII za sintezo encima neomicin fosfotransferaze II, ki daje transformiranim celicam prednost v rasti na gojišču z antibiotikom kanamicin.
Netransformirane celice niso sposobne sinteze encima, ki bi jim omogočal razgradnjo toksičnega kanamicina in propadejo (Miki in McHugh, 2004). Izbrana toksična koncentracija mora onemogočiti rast in razvoj netransformiranih tkiv in preprečiti nastanek netransformiranih regenerantov, kot rezultat delovanja sosednjih transformiranih celic oz.
regenerantov, ki so sposobni detoksifikacije bližnje okolice (Park in sod., 1998).
Največ pomislekov in nasprotojočih mnenj za komercialno uporabo transgenih rastlin je v vključitvi antibiotikov in herbicidov kot selekcijskih genov. Horizontalni prenos genov med transgenimi rastlinami in ostalimi organizmi ni možen, zato nptII transgen ne predstavlja tveganja za zdravje ljudi in živali (Fuchs in sod., 1993). Kljub vsem tem dejstvom, je odstranitev selekcijskega transgena zaželena in bi verjetno vplivala na večjo sprejemljivost in uporabo gensko spremenjenih rastlin. Afolabi (2007) je priporočil nekaj metod uspešne odstranitve teh genov, Kapusi in sod. (2013) pa so priporočali zamenjavo z manoznimi geni.
2.3.2.2 Markerski transgeni
Transgeni, katerih produkt oz. izražanje je možno vizualno ali s pomočjo kemijskih analiz spremljati, se imenujejo markerski ali testni transgeni in omogočajo enostavno in hitro določitev transformiranih tkiv (Witty, 1989). Do sedaj je bil kot markerski transgen za določitev uspešnosti transformacije najpogosteje uporabljen gusA, odgovoren za sintezo encima β-glukuronidaza. Izoliran je iz Escherichie coli in s primernim rastlinskim promotorjem je sposoben izražati lastnost tudi v rastlinah (Miki in McHugh, 2004; Miki, 2008; Khan in sod., 2013). Rastlinske celice endogeno niso sposobne sinteze β- glukuronidaze in posledično ne izražajo aktivnosti GUS encima, zato lahko njegovo prisotnost pripišemo transformiranim celicam in ga določimo histokemično z modrim obarvanjem ali kvantitativno s fluorometrom (Jefferson in sod., 1987). Pred analizo je potrebno tkivu dodati substrat X-Gluc (5-bromo-4-kloro-3-indolil glukuronid). V transgenih celicah prisoten encim β-glukuronidaza razgradi X-Gluc in produkt razgradnje se obarva modro, ki ga lahko vizualno ali s pomočjo stereomikroskopa spremljamo. Pomanjkljiva stran tega preverjanja je, da tkivo, ki ga analiziramo, poškodujemo.
Z namenom, da bi ohranili tkivo, so se začeli uporabljati fluorescentni transgeni za sintezo fluorescentnih proteinov. Med prvimi in še vedno pogosto uporabljan je zeleno fluorescentni gfp transgen, izoliran iz meduze (Aequorea victoria), ki kodira zeleni fluorescentni protein (GFP) in ga lahko spremljamo z uporabo epifluorescentnega mikroskopa v živih celicah brez uporabe škodljivih postopkov. Naravni tip gfp gena iz meduze je bil spremenjen in opremljen s promotorji, ki mu omogočajo, da se lahko uspešno izraža tudi v rastlinah. Prav tako ima opravljene spremembe v spektralnih lastnostih in izboljšana je fluorescenca (Haseloff in sod., 1997; Reichel in sod., 1996). Transformirane celice, predvsem prehodno izražanje, je mogoče določiti zelo hitro po transformaciji (Haseloff in Amos, 1995; Harper in sod., 1999).
S pomočjo fluorescentnih proteinov v kombinaciji s katerimikoli celičnimi proteini lahko spremljamo in določimo lokacijo, transport, funkcijo, interakcije med proteini in ostalimi molekulami ter usodo proteinov v celicah (Lippincott-Schwartz in Patterson, 2003). Zelo so primerni za študije spremljanja usode vnešenih transgenov in njihovega vpliva na okolje in posledično na človeka in živali (Stewart, 2005).
Za vzpostavitev transformacijskega sistema pri rastlinah se uporablja tudi rdeče fluorescentni DsRed transgen, ki je bil izoliran iz korale (Discosoma sp.). Njegova prednost pred gfp je v tem, da je določitev fluorescence natančnejša, ker jo je enostavneje ločiti od avtofluorescence klorofila (Matz in sod., 1999). DsRed transgen se uporablja kot markerski gen za študije prehodne in stabilne transformacije pri tobaku in tudi pri drugih vrstah. V kombinaciji z gfp in katerim drugim fluorescentnim transgenom je primeren za hkratno spremljanje izražanja dveh transgenov. Pri sesalskih celicah se pogosto uporablja več fluorescentnih transgenov za spremljanje spremenjenih in tudi patoloških metabolnih poti (Jach in sod., 2001).
Uporabljajo se tudi drugi fluorescentni transgeni za tkivno specifično izražanje ali izražanje, ki je omejeno na posamezne celične vključke, kjer je potreben močnejši signal. Primera oranžno fluorescentnega transgenena sta TdTomato-ER, ki med vsemi fluorescentnimi proteini fluorescira najsvetleje, in mOrange-ER, katerega fluorescenca je zelo izrazita (Mann in sod., 2012).
3 MATERIAL IN METODE 3.1 RASTLINSKI MATERIAL
Vnos transgenov smo izvedli v celice listnih izsečkov in vitro gojenega tobaka sorte 'Havana 38'.
3.2 SESTAVINE GOJIŠČA
MS osnovno gojišče za in vitro gojenje tobaka (Murashige in Skoog, 1962) in dodatki:
mikro- in makroelementi 4,3 g/l nikotinska kislina 1 mg/l
piridoksin 1 mg/l
tiamin 2 mg/l
saharoza 30 g/l
agar 8 g/l
pH 5,8
MSr regeneracijsko gojišče za tobak (Stolarz in sod., 1991):
mikro- in makroelementi 4,3 g/l Fe-Na2-EDTA 0,1 mg/l
saharoza 30 g/l
tiamin 0,1 mg/l
inozitol 0,1 g/l
NAA 0,1 mg/l
BAP 1,0 mg/l
agar 8 g/l
pH 5,8
YEB gojišče za gojenje A. tumefaciens sev LBA4404:
pepton 5 g/l
goveji ekstrakt 5 g/l
saharoza 5 g/l
kvasni ekstrakt 1 g/l MgSO4 × 7H2O 1 g/l
agar 15 g/l
pH 7,0
3.3 PRIPRAVA IN RAZKUŽEVANJE GOJIŠČA
Kompleksno osnovno gojišče MS in ostale sestavine MS ter YEB gojišča, razen agarja, smo stehtali, dali v čašo in jih stopili z bidestilirano vodo do bistre tekočine. Iz založnih raztopin smo odpipetirali vitamine in hormone ter jih dodali ostalim sestavinam. Volumen gojišča smo umerili z merilno bučko in določili vrednost pH 5,8 z 1N KOH ali 1N HCl. Gojišče smo prelili v steklenice proizvajalca Schott-Duran, primerne za avtoklaviranje, v katere smo predhodno pretresli stehtan agar. Vlažno razkuževanje gojišča je potekalo v avtoklavu 20 min pri 121 °C in tlaku 1,1 bar. V sterilnih razmerah brezprašne komore smo ohlajenemu gojišču na približno 40 °C filtrsko dodali antibiotika kanamicin (300 mg/l) oz. higromicin (25 mg/l), odvisno od genskega konstrukta. Gojišče smo z vrtenjem steklenice po delovni površini brezprašne komore premešali in prelili v sterilne petrijevke 90 × 15 mm.
3.4 BAKTERIJA IN BINARNI VEKTORSKI SISTEM
Za vnos fluorescentnih transgenov gfp in DsRed ter selekcijskih transgenov nptII in hptII v tobak smo uporabili bakterijo A. t. sev LBA4404 s plazmidom pART27 2mgfp5 ER za sintezo zeleno fluorescentnega proteina gfp (Slika 4A) (Gleave, 1992) in enak sev z modificiranim plazmidom pCAMBIA1390 DsRed za sintezo rdeče fluorescentnega proteina DsRed (Slika 4B) (Cambia, 1997; Škof, 2008). Bakterija vsebuje poleg Ti-plazmida še razorožen plazmid, na katerem ima bakterijski selekcijski gen odpornost na antibiotik rifampicin.
A B Slika 4: Plazmid: A - pART27 (Gleave, 1992) in B - pCAMBIA1390 (Cambia, 1997)
Del binarnega vektorskega sistema je plazmid pART27 2mgfp5-ER, ki so ga pripravili v raziskovalni skupini prof. dr. C. C. Eadyja (inštitut Crop and Food Research, Christchurch, Nova Zelandija). V plazmid pART27 (Slika 4A) sta bili na restrikcijskem mestu SpeI vgrajeni dve ponovitvi zeleno fluorescentnega mgfp5 ER transgena iz vektorja pBIN mgfp5 ER. Poleg fluorescentnega markerskega gena je v T-DNA regiji še selekcijski nptII transgen za odpornost transformiranih rastlinskih tkiv na antibiotika geneticin in kanamicin.
Bakterijski selekcijski spec transgen se nahaja izven T-DNA tegije in daje transformiranim bakterijam odpornost na antibiotik spektinomicin (Gleave, 1992).
Za vektor z markerskim DsRed transgenom je bil uporabljen plazmid pDsRed-Express (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, ZDA). DsRed transgenu je bil dodan močan CaMV35S promotor iz vektorja pBIN mgfp5 ER in transformiran v plazmidni vektor pCAMBIA1390 (Cambia, Canberra, Avstralija) (Slika 4B). Transgen DsRed je odgovoren za sintezo rdeče fluorescentnega proteina DsRED in je bil izoliran iz korale Discoscoma sp.. Plazmid pCAMBIA1390 vsebuje poleg markerskega DsRed transgena tudi rastlinski selekcijski hptII transgen, odpornost transformiranih rastlinskih tkiv na antibiotik higromicin in izven T- DNA selekcijski nptII transgen odpornost na antibiotik kanamicin za selekcijo transformiranih bakterij (Hajdukiewiez in sod., 1994; Cambia, 1997; Škof, 2008).
3.5 TRANSGENEZA TOBAKA
Transgenezo tobaka z vektorskim sistemom A. t. smo opravili z nekoliko spremenjeno metodologijo transformacije listnih izsečkov kot jo navajajo avtorji Horsch in sod. (1985) ter Fisher in Guiltinan (1995). S pomočjo sterilne pincete in skalpa smo v brezprašni komori narezali liste tobaka gojenega v in vitro razmerah na izsečke, velikosti približno 1 cm2. Za vsak genski konstrukt smo narezali po 100 listnih izsečkov.
Bakterijo A. t. z ustreznim plazmidom smo gojili čez noč v tekočem YEB gojišču pri 28 °C in 400 obratih/minuto. Nato smo bakterijsko suspenzijo prelili v 30 ml centrifugirke in centrifugirali 7 minut pri 6000 obratih/minuto v centrifugi proizvajalca Beckman, Nemčija.
Supernatant smo previdno odlili in peletu dolili tekoče ½ MS gojišče. Pelet smo s tresenjem čimbolj razbili in prelili v petrijevke premera 90 × 15 mm ter listne izsečke inkubirali približno 15 minut (Slika 5A). Po končani inkubaciji smo listne izsečke položili na sterilni filtrski papir v brezprašni komori in jih rahlo zračno osušili ter jih kokultivirali na MSr gojišču s 100 μM acetosiringonom. Kokultivacija (Slika 5D) je trajala 3 dni in nato smo listne izsečke dvakrat spirali z raztopino antibiotika timentin 200 mg/l [tikarcilin : klavulonska kislina v razmerju 100:1 (w/w)] in jih zračno osušili (Slika 5B). Inokulirali smo jih na selekcijsko MSr gojišče z dodatkom 300 mg/l kanamicina po transformaciji z gfp transgenom oz. 25 mg/l higromicina po transformaciji z DsRed transgenom.
A B C D
Slika 5: Transforamcija listnih izsečkov tobaka: A – inkubacija izsečkov z bakterijsko suspenzijo, B – zračno sušenje izsečkov na filtrskem papirju v brezprašni komori, C – kokultivacija na MSr gojišču, D – razrast bakterijske kolonije v treh dneh kokultivacije
Izsečke in nastale regenerante smo kokultivirali in gojili v rastni komori pri 16 urni svetlobi in 8 urni temi ter osvetlitvi 40 μmol/m2s in temperaturi 24 ± 1 °C. Po štirih tednih smo nastale regenerante odrezali pri bazi in prestavili na sveže pripravljeno selekcijsko MS gojišče za rast v enake petrijevke (Sliki 6A in B).
3.6 KONTROLNO OBRAVNAVANJE Z NEOKUŽENIMI LISTNIMI IZSEČKI TOBAKA
Kontrolna obavnavanja z neokuženimi izsečki in regeneranti tobaka smo izvedli z namenom testiranja učinka gojišč z dodanim acetosiringonom ter različnih antibiotikov (Preglednica 1). V vsakem obravnavanju smo imeli po štiri petrijevke premera 90 × 15 mm z desetimi listnimi izsečki, skupno 40 izsečkov velikih približno 1 cm2. Gojili smo jih istočasno kot transformirane izsečke in regenerante.
Preglednica 1: Sestava MSr gojišča v kontrolnem poskusu s petimi obravnavanji za regeneracijo netransformiranih listnih izsečkov tobaka
Oznaka obravnavanj v
kontrolnem poskusu MSr gojišče z dodatki in koncentracije
KP1 brez dodatkov
KP2 100 μM acetosiringon
KP3 300 mg/l kanamicin
KP4 25 mg/l higromicin
KP5 150 mg/l timentin
3.7 FENOTIPSKA ANALIZA SELEKCIJSKIH IN MARKERSKIH TRANSGENOV Fenostipsko smo spremljali izražanje slekcijskih genov z uspešnim preživetjem celic listnih izsečkov in regeneracije na MSr gojišču ter rastjo regenerantov na selekcijskem MS gojišču in dodanim antibiotikom kanamicin za genski konstrukt pART27 2mgfp5 ER in higromicin za pCAMBIA1390 DsRed (Sliki 3A in 3B).
Izražanje fluorescentnih markerskih transgenov smo po okužbi z A. t. in ustrezno kombinacijo plazmidov spremljali na listnih izsečkih, na oblikovanem kalusu in globulah (somatskih embrijih) ter regenerantih. Transformirane celice listnih izsečkov in nastale regenerante smo pregledali z epifluorescentnim mikroskopom, proizvajalca Nikon SMZ 1000 pri 20-kratni povečavi in ustrezno kombinacijo filtrov. Zeleno fluorescenco gfp transgena z emisijskim maksimumom 510 nm in ekscitacijskim maksimumom 484 nm smo spremljali v kombinaciji s setom filtrov BA 535/50 nm, DM 505 nm in EX 480/40 nm.
Rdečo fluorescenco DsRed transgena z emisijskim maksimumom 579 nm in ekscitacijskim maksimumom 557 nm v kombinaciji s setom filtrov BA 620 nm, DM 575 nm in EX 546/10 nm.
3.8 MOLEKULSKA ANALIZA TRANSGENOV Z METODO PCR
Za molekulsko analizo smo regenerante s koreninami na zunanji strani spodnjega dela petrijevke oštevilčili in naključno izbrali po 40 regenerantov za vsak genski konstrukt. Iz listov izbranih regenerantov smo po uveljavljeni metodi izolirali DNA, določili koncentracijo, redčili na 20 ng/μl, izvedli verižno reakcijo s polimerazo (PCR) in analizirali prisotnost pomnoženih DNA fragmentov s pomočjo agarozno gelske elektroforeze.
3.8.1 DNA izolacija iz listov tobaka
Iz listov netransformiranega tobaka (kontrola) in trasformiranih regenerantov smo z maceracijo izolirali celokupno genomsko DNA (Kump in sod., 1992). V terilnico smo dali del lista, mu dodali 700 μl CTAB pufra segretega na 68 °C in s pestilom zdrobili. V označene 1,5 ml mikrocentrifugirke smo prelili nastalo suspenzijo in inkubirali 1,5 ure pri 68 °C. Med inkubacijo smo vzorce nekajkrat premešali z obračanjem in tresenjem stojala. Suspenziji smo dodali 700 μl topila kloroform : izoamilalkohol v razmerju 24 : 1 in s tresenjem premešali. Takoj smo jih centrifugirali 10 minut pri 11000 obratih/minuto. Nastali supernatant oz. vodno fazo z DNA smo odpipetirali v označeno čisto mikrocentrifugirko in dodali 70 μl 3 M Na-acetata pH 5,2 in 700 μl ledeno mrzlega izopropanola ter dobro premešali. Sledila je 20 minutna inkubacija v zamrzovalniku pri -20 °C in takojšnje centrifugiranje 10 minut pri 11000 obratih/minuto. Supernatant smo odlili in nastalemu DNA peletu dodali 500 μl 70 % etanola ter premešali. Po 20 min smo odlili in nato še s pipeto odstranili etanol ter DNA pelet posušili pri sobni temperaturi. Dodali smo 40 μl pufra TE in vzorce hranili v hladilniku pri 4 °C.
3.8.2 Določitev koncentracije in redčitev DNA
S pomočjo fluorometra DyNA QuantTM 200 (GE Healthcare) smo vzorcem izolirane DNA izmerili koncentracijo. Pripravili smo delovno raztopino iz 10 × pufra TNE [10 mM Tris- HCl, 1 mM EDTA in 0,1 M NaCl (pH 7)] in ji dodali 0,1 μg/ml barvila Hoechts 33258.
Fluorometer smo umerili z DNA telečjega priželjca (1 mg/ml DNA v 1 × TNE pufru). V kiveto smo odpipetirali 2 ml delovne raztopine in dodali 2 μl vzorca DNA, pokrili s pokrovom in z obračenjem v roki premešali ter z umerjenim fluorometrom izmerili koncentracijo. Vzorce DNA smo redčili z bidestilirano vodo na 20 ng/μl.
3.8.3 Pomnoževanje DNA fragmentov z verižno reakcijo s polimerazo
Značilno pomnoževanje transgenov smo izvedli v dupleks verižni reakciji s polimerazo (PCR) z dvema paroma začetnih oligonukleotidov, odvisno od kombinacije transgenov (Preglednica 2). Za analizo vključitve mgfp5-ER in nptII transgena smo uporabili para začetnih oligonukleotidov GFP1a/GFP1b in NPTII1a/NPTII1b ter za DsRed in hptII transgena kombinacijo začetnih oligonukleotidov REDfor/RED2right in HPTII-for/HPTII- rev1.
Preglednica 2: Nukleotidno zaporedje začetnih oligonukleotidov za posamezni transgen in pričakovana dolžina pomnoženega fragmenta
Oznaka začetnih
oligonukleotidov Nukleotidno zaporedje začetnega oligonukleotida
5' - 3' Pričakovana dolžina
fragmenta NPTII1a
NPTII1b
GAGGCTATTCGGCTATGACTG ATGGGGAGCGGCGATACCGTA
650 bp HPTII-for
HPTII-rev1
ATGACCGCTGTTATGCGGCCATTG AAAAAGCCTGAACTCACCGCGACG
641 bp GFP1a
GFP1b
AGTGGAGAGGGTGAAGGTGATG TTGTGGCGGGTCTTGAAGTTGG
422 bp REDfor
RED2right
AGGACGTCATCAAGGAGTTCAT GTGCTTCACGTACACCTTGGAG
211 bp
V brezprašni komori smo na ledu v 2 ml centrifugirkah pripravili PCR reakcijske mešanice, ki so vsebovale 1 × PCR-pufer [50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,08% Nonidet P40]
(Fermentas), 2 mM MgCl2, 0,2 mM vsakega deoksinukleotida (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 4 × 0,5 μM ustreznega začetnega oligonukleotida in 0,5 enote encima Taq DNA polimeraze (Fermentas) in centrifugirali do 1000 obratov/minuto. V PCR mikrocentrifugirke smo odpipetirali 5 μl vzorca DNA s koncentracijo 20 ng/μl in jih centrifugirali do 1000 obratov/minuto ter dodali 45 μl reakcijske mešanice. Pomnoževanje DNA fragmentov je
potekalo v PCR cikličnem termostatu GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems, ZDA) po rahlo spremenjenem temperaturnem vzorcu (Lakshmi in sod., 1998):
- začetna denaturacija je trajala 5 min pri 94 °C, - sledilo je 33 ponavljajočih ciklov, ki so vključevali:
a) denaturacijo DNA, ki je trajala 1 min pri 94 °C,
b) prileganje začetnih oligonukleotidov, trajanje 1 min pri 58 °C, c) izgradnjo fragmentov DNA, trajanje 1,5 min pri 72 °C,
- končna inkubacija je trajala 7 min pri 72 °C in - zaključek analize ter hranjenje vzorcev pri 12 °C.
3.8.4 Agarozna gelska elektroforeza in analiza DNA fragmentov
Nastale DNA fragmente v verižni reakciji s polimerazo smo ločili v 1,4 % agaroznem gelu (agaroza: SeaKem LE, Cambrex, ZDA) s horizontalno elektroforezo.
Pripravili smo 1,4 % agarozni gel za elektroforetski model velikosti: 10 cm × 25 cm ×0,5 cm = 125 cm3 oz. volumen gela je bil 125 ml. V 500 ml steklenico smo stehtali 2,57 g agaroze in jo prelili z 0,5 × TBE pufrom [147 ml des. H2O in 36,75 ml 5 × TBE pufer].
Agarozo smo popolnoma stopili v mikrovalovni pečici, vmes smo 3-krat premešali.
Agarozno raztopino smo ohladili na približno 55 ºC in dodali 6,25 μl etidijevega bromida iz založne raztopine 10 mg/ml, koncentracija etidijevega bormida v gelu je bila 0,5 μg/ml ter na rahlo premešali. Previdno, da se niso naredili mehurčki, smo zlili v pripravljen elektroforetski model, na dveh straneh oblepljen s selotejpom in vstavljenim glavnikom.
Počakali smo približno 20 minut, da se je gelska raztopina strdila in postala mat barve. Nato smo previdno odstranili glavnik, da nismo poškodovali nastalih vdolbin. Gel smo namestili v elektroforetsko posodo (Bio Rad Sub-Cell, model 192) in prelili z 0,5 × TBE pufrom, da je bil 2-3 mm prekrit s pufrom, zaradi prevodnosti električnega toka. PCR vzorcem smo zaradi boljšega vsidranja v odprtine gela in sledljivosti potovanja DNA vzorca po gelu dodali 5 μl nanašalnega barvila brom fenol modro (BPB) [12,5 % (w/v) ficol 400; 0,2 % (w/v) brom fenol modro in 6,7 % (v/v) 10×TBE]. Zmes smo premešali in 17 μl nanesli v vdolbine gela.
Na gel smo poleg DNA transformiranih vzorcev nanesli še kontrole: DNA iz netransformiranega tobaka (K), čisti plazmid, izoliran iz E. coli (P), slepi vzorec, vse komponente reakcijske mešanice, razen DNA, namesto katere smo dodali 5 μl vode (S) in velikostni standard GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder, Fermentas s 14 fragmenti: 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 in 100 bp (M). Elektroforeza je potekala v anodni smeri približno 1 uro in 30 min pri 140 V. Etidijev bromid se je vezal na molekule DNA in omogočil njihovo spremljanje pod UV svetlobo valovne dolžine 302 nm, ki jo je oddajal transiluminator TMF-30 (UVP Inc., Velika Britanija). Za obdelavo in objavo rezultatov smo gele fotografirali z digitalnim fotoaparatom.
4 REZULTATI
4.1 FENOTIPSKO IZRAŽANJE SELEKCIJSKIH TRANSGENOV
Po transformaciji smo listne izsečke prestavili na selekcijsko MSr gojišče z ustreznim antibiotikom. Netrasformirane celice so po dveh tednih začele propadati in nastajale so vedno večje nekroze. Transformirane celice so bile sposobne razgrajevati dodan antibiotik v gojišču in se nemoteno delile ter po dveh tednih se je oblikoval kalus in tudi prvi somatski embriji, iz katerih so nastali regeneranti (Slika 6). Na selekcijskem gojišču z dodatkom 300 mg/l kanamicina so propadli manjši deli izsečkov (Slika 6A), medtem ko so na izsečkih, ki so bili inokulirani na gojišče s 25 mg/l higromicina, propadli večji deli (Slika 6B).
A B
Slika 6: Propad netransformiranih delov listnih izsečkov tobaka in regeneracija transformiranih celic na selekcijskem MSr gojišču z dodanim antibiotikom: A – kanamicin in B – higromocin
4.2 REGENERACIJA LISTNIH IZSEČKOV TOBAKA PO TRANSFORMACIJI NA SELEKCIJSKEM GOJIŠČU
Pet tednov po transformaciji je nastalo že veliko regenerantov. Na gojišču z dodanim kanamicinom je bila regeneracija v primerjavi z gojiščem v katerem je bil dodan higromicin za 7 do 10 dni počasnejša in nastalo je za 5,85 % več vitalnih regenerantov (Slika 8).
Regenerante nastale na listnih izsečkih, ki so uspešno rastli na obeh selekcijskih MSr gojiščih, smo pri bazi odrezali (Slika 7A) in prestavili na MS gojišče z ustreznim selekcijskim antibiotikom (Slika 7B). Na MSr gojišču z dodatkom kanamicina je bilo 11 % v rasti zaostalih regenerantov, rozetaste rasti, svetlozelenih in nekaj med njimi je bilo vitrificiranih. Teh nismo prestavili na MS gojišče za rast. Na MSr gojišču z dodatkom higromicina je bilo propadlih 16,85 % regenerantov in te smo izločili oz. jih prav tako nismo prestavili na MS selekcijsko gojišče za rast. Število oz. odstotek vitalnih poganjkov, ki so bili prestavljeni na selekcijsko MS gojišče, je podano v preglednici 3 in sliki 7.
A B
Slika 7: Regeneranti tobaka: A – na izsečku gojenem na selekcijskem MSr gojišču; B – regeneranti prestavljeni na selekcijsko MS gojišče za rast
Po okužbi izsečkov z A. t. in plazmidom pART27 2mgfp5 ER je bila uspešnost regeneracije 82,65 % in po okužbi z genskim konstruktom A. t. pCAMBIA1390 DsRed 77,89 % (Preglednica 3).
Preglednica 3: Število odzivnih izsečkov tobaka, nastalih in vitalnih regenerantov ter odstotek regeneracije na ustreznem selekcijskem MSr gojišču po transformaciji z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t. pCAMBIA1390 DsRed
Oznaka plazmida Število Odstotek
regeneracije odzivnih
izsečkov nastalih
regenerantov vitalnih regenerantov
pART27 2mgfp5 ER 98 91 81 82,65
pCAMBIA1390 DsRed 95 89 74 77,89
Slika 8: Odstotek vitalnih in propadlih regenerantov tobaka, nastalih na selekcijskem MSr gojišču po transformaciji izsečkov z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t. pCAMBIA1390 DsRed
4.3 RAST IN KORENINJENJE REGENERANTOV NA SELEKCIJSKEM GOJIŠČU Na ustreznem selekcijskem MS gojišču za rast (Slika 7B) so regeneranti, ki so uspešno rastli, tudi koreninili (Slika 9). Med neuspešne regenerante smo šteli tiste brez korenin, ki so imeli svetlo zelene povešene liste z razbarvanimi žilami, in propadle, na katerih so bile vidne nekroze.
Slika 9: Rast in razvoj regenerantov tobaka na selekcijskem MS gojišču, nastalih po transformaciji listnih izsečkov z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t. pCAMBIA1390 DsRed
Preglednica 4: Število in odstotek regenerantov tobaka s koreninami na ustreznem selekcijskem MS gojišču, nastalih po transformaciji listnih izsečkov z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t. pCAMBIA1390 DsRed
Oznaka plazmida Število regenerantov na MS gojišču za rast Odstotek transformacije prestavljenih propadlih s povešenimi
listi s koreninami
pART27 2mgfp5 ER 81 12 6 63 77,78
pCAMBIA1390 DsRed 74 14 9 51 68,92
Med uspešne regenerante smo šteli tiste, ki so imeli korenine in pokončno stoječe liste (Slika 9). Takih je bilo na gojišču s kanamicinom 63 oz. 77,78 %. Ti so bili tudi pokazatelji uspešnosti transforamcije z nptII transgenom (Preglednica 4 in Slika 10). Po transformaciji izsečkov z A. t. pCAMBIA1390 DsRed je nastalo 51 vitalnih regenerantov, ki so oblikovali korenine. Ti regeneranti so bili sposobni razgrajevati aktivno sestavino higromicina.
Uspešnost transformacije na selekcijskem gojišču je bila 68,92 % za hptII transgen (Preglednica 4 in Slika 10).
Slika 10: Odstotek propadlih regenerantov tobaka, s povešenimi listi in s koreninami na ustreznem selekcijskem MS gojišču, nastalih po transformaciji listnih izsečkov z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t.
pCAMBIA1390 DsRed
4.4 FENOTIPSKO IZRAŽANJE MARKERSKIH TRANSGENOV
Markerski gfp transgen smo spremljali z epifluorescentnim mikroskopom in ustrezno kombinacijo filtrov za detekcijo zelene fluorescence. V ta namen smo pregledali 98 izsečkov tobaka 2 tedna po transformaciji z A. t. pART27 2mgfp5 ER (Slika 11A). Na predelih, ki niso propadli, smo pri vseh opazili točkovno izražanje zelene fluorescence mGFP5 ER proteina (Slika 11B).
A B
Slika 11: Prisotnost zelene fluorescence mGFP5 ER proteina v transformiranih celicah listnih izsečkov tobaka, opazovano z epifluorescentnim mikroskopom: A – pri naravni svetlobi; B – s fluorescentno lučko in kombinacijo ustreznih filtrov
Prav tako smo z epifluorescentnim mikroskopom in ustrezno kombinacijo filtrov za spremljanje rdeče fluorescence DsRed transgena pregledali 95 izsečkov tobaka po transformaciji z A. t. pCAMBIA1390 DsRed (Slika 12A). Pri vseh smo opazili izrazito točkovno izražanje rdeče fluorescence DsRED EXPRESS proteina (Slika 12B).
A B
Slika 12: Prisotnost rdeče fluorescence DsRED EXPRESS proteina v transformiranih celicah listnih izsečkov tobaka, opazovano z epifluorescentnim mikroskopom: A – pri naravni svetlobi; B – s fluorescentno lučko in kombinacijo ustreznih filtrov
Preden smo izolirali DNA iz naključno izbranih 40 koreninjenih regenerantov tobaka, za vsak genski konstrukt, smo jih pregledali z epifluorescentnim mikroskopom na enak način kot izsečke. Pri vseh smo opazili prisotnost zelene oz. rdeče fluorescence. Pri konstruktu A.
t. pART27 2mgfp5 ER so večji deli, ponekod tudi celi listi imeli prisotnost zelene fluorescence. Pri konstruktu A. t. pCAMBIA1390 DsRed je bilo izražanje rdeče fluorescence šibkejše in točkovno omejeno po listih regenerantov.
4.5 MOLEKULSKA ANALIZA VKLJUČENOSTI gfp IN nptII TER DsRed IN hptII TRANSGENOV Z METODO PCR
Celokupno DNA smo izolirali iz listov 40 koreninjenih regenerantov tobaka za vsak genski konstrukt, ki so uspešno rastli na ustreznem selekcijskem MS gojišču (Preglednica 4, Sliki 9 in 10).
Slika 13: Pomnoženi fragmenti DNA v dupleks PCR s parom začetnih oligonukleotidov za nptII transgen (650 bp) in za mgfp5 ER transgen (422 bp). 1–40 – transformiran tobak, K – kontrola – netransformiran tobak, P – plazmid pART27 2mgfp5 ER, S – slepi vzorec, M – velikostni standard
Pri vseh 40 molekulsko analiziranih regenerantih tobaka, transformiranih z A. t. pART27 2mgfp5 ER, ki so rastli in se koreninili na gojišču s kanamicinom, so se pomnožili fragmenti dolžine 650 bp značilni za selekcijski nptII transgen in dolžine 422 bp značilni za markerski mgfp5 ER transgen (Slika 13). S tem smo potrdili, da se je v genom vseh 40 regenerantov vgradil celoten genski konstrukt oz. T-DNA.
Slika 14: Pomnoženi fragmenti DNA v dupleks PCR s parom začetnih oligonukleotidov za hptII transgen (641 bp) in za DsRed transgen (211 bp). 1–40 – transformiran tobak, K – kontrola – netransformiran tobak, P – plazmid pCAMBIA1390 DsRed, S – slepi vzorec, M – velikostni standard
Pri izbranih 40 regenerantih od 51, ki so nastali po transformciji z A. t. pCAMBIA1390 DsRed in so uspešno rastli na selekcijskem gojišču s higromicinom, so se pomnožili fragmenti dolžine 641 bp, značilni za hpt II transgen. Medtem ko se pri 4 oz. 10 % regenerantov z oznakami 12, 14, 29 in 36 niso pomnožili fragmenti dolžine 211 bp, značilni za DsRed transgen. Pri teh 10 % regenerantov smo fenotipsko izražanje zasledili, vendar se fragmenti, značilni za rdeče fluorescentni protein, niso pomnožili, kar nakazuje, da je prišlo do manjših mutacij v nukleotidnem zaporedju transgena (Slika 14).
4.6 USPEŠNOST TRANSFORAMCIJE
Od 100 listnih izsečkov sta po transforamciji z A. t. pART27 2mgfp5 ER na selekcijskem gojišču s 300 mg/l kanamicina popolnoma propadla 2 izsečka. Na ostalih 98 izsečkih so bile vidne samo posamezne manjše nekroze (Sliki 6A in 7A). Na delih izsečkov, kjer so se celice transformirale in se delile, je prišlo do regeneracije in nastalo je 91 regenerantov, ki smo jih odrezali pri bazi in subkultivirali na selekcijsko MS gojišče za rast (Slika 7B). Uspešno je rastlo in oblikovalo korenine 81 regenerantov in regeneracija je bila 82,65 %. Od teh je 12 izsečkov oz. 13,8 % propadlo in 6 je imelo povešene liste z razbarvanim predelom okrog žil.
Ostalih 63 regenerantov je koreninilo in uspešnost transformacije je bila 77,78 % (Preglednica 4 in Sliki 9 in 13).
Po transformaciji z A. t. pCAMBIA1390 DsRed je na selekcijskem gojišču s 25 mg/l higromicina propadlo 5 izsečkov. Na ostalih 95 izsečkih ja nastalo 89 regenerantov in od teh je bilo 74 vitalnih. Uspešnot regeneracije je bila 77,89 % (Preglednica 3, Slika 7). Na selekcijskem gojišču MS za rast je 14 regenerantov propadlo in 9 je imelo povešane liste ter 51 jih je koreninilo oz. uspešnost transformacije je bila 68,82 % za hptII transgen. Pri 4 regenerantih oz. 10 % se niso pomnožili fragmenti, značilni za DsRed transgen. Oba transgena oz. celoten genski konstrukt je imelo prisotno 58,82 % regenerantov (Preglednica 4 in Sliki 9 in 13).
4.7 KONTROLNO OBRAVNAVANJE Z NEOKUŽENIMI LISTNIMI IZSEČKI
Listne izsečke tobaka, ki jih nismo okužili z A. t. pART27 2mgfp5 ER oz. A. t.
pCAMBIA1390 DsRed in so nam predstavljali kontrolo, smo ves čas poskusa primerjali z okuženimi izsečki. Kontrolni poskus smo zaključili šest tednov po inokulaciji na MSr gojišče brez dodatkov (KP1), z dodanim acetosiringonom (KP2), antibiotikom timentin (KP3) za uničenje bakterije, selekcijskim antibiotikom kanamicin (KP4) oz. higromicin (KP5).
KP1 – MSr gojišče brez dodatkov.
Na izsečkih je nastalo veliko regenerantov, nekateri so imeli po dva in več listov, brez nekroz.
KP2 – MSr gojišče z dodanim acetosiringon (100 μM).
Prav tako kot pri poskusu KP1 je bilo na izsečkih veliko regenerantov, približno enake velikosti.
KP3 – MSr gojišče z dodanim antibiotikom kanamicin (300 mg/l).
Izsečki so bili zaradi razpada klorofila svetlo zeleni in brez regenerantov.
KP4 – MSr gojišče z dodanim antibiotikom higromicin (25 mg/l).
Izsečki so bili svetlo zeleni do svetlo rjavi z manjšim številom zametkov za regenerante, ki so čez čas propadli.
KP5 – MSr gojišče z dodanim antibiotikom timentin za uničenje bakterije A. t. (150 mg/l).
Podobno kot pri prvih dveh poskusih KP1 in KP2 je bilo nekaj izsečkov z dvema in več listi.
