MAGISTRSKO DELO

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

MAGISTRSKO DELO

Primož Banfi

Ljubljana, 2022

(2)

(3)

(4)

(5)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE KEMIJA

RAZVOJ IN UPORABA KNJIŽNICE SPOJIN

MAGISTRSKO DELO

Primož Banfi

MENTOR: doc. dr. Črtomir Podlipnik

Ljubljana, 2022

(6)

(7)

magistrskega dela

Spodaj podpisani Primož Banfi sem avtor magistrskega dela z naslovom:

RAZVOJ IN UPORABA KNJIŽNICE SPOJIN S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je magistrsko delo izključno rezultat lastnega raziskovalnega dela pod mentostvom doc.

dr. Črtomirja Podlipnika;

• sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuja dela oziroma storitve predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorskih in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZAS - UPB3) (Ur. List RS, št. 16/2007));

• sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

• je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

Ljubljana, dne 18. 1. 2022 Podpis avtorja:

(8)

(9)

bilo opravljeno na UL FKKT.

Senat UL FKKT je za mentorja imenoval doc. dr. Črtomirja Podlipnika.

Recenzenti: izr. prof. dr. Miha Lukšič in prof. dr. Franc Požgan

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela

Predsednik komisije: prof. dr. Franc Požgan, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Član: doc. dr. Črtomir Podlipnik, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Član: izr. prof. dr. Miha Lukšič, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

(10)

(11)

pomoč in čas, ki ga je namenil meni in magistrskemu delu.

Zahvalil bi se vodji knjižnice spojin FKKT izr. prof. Urošu Grošlju, ki mi je omogočil dostop do vzorcev knjižnice in podal nasvete pri izvedbi magistrske naloge in dr. Mihi Bahunu, ki je

omogočil izvedbo bioloških testov.

Zahvaljujem se tudi družini in prijateljem, ki so mi ves čas študija stali ob strani, me vzpodbujali in podpirali.

(12)

(13)

RAZVOJ IN UPORABA KNJIŽNICE SPOJIN

Povzetek

Knjižnice so glavni vir informacij, katerih uporaba je namenjena hranjenju zapisov, knjig, znanstvenih člankov in ostalih stvari povezanih z informacijami. Posledica razvoja znanosti je kopičenje novih informacij, kar je povzročilo razvoj knjižnic. Sočasno z razvojem znanosti so se razvile tudi specificirane knjižnice, tako so se ob razvoju kemijske znanosti oblikovale tudi knjižnice kemijskih spojin. Vzorci in podatki v knjižnicah spojin so med drugim namenjeni hranjenju spojin, dostopu do informacij, nadaljnji sintezi spojin, raziskavam novih materialov ali odkrivanju novih medicinskih učinkovin.

V sklopu Fakultete za Kemijo in Kemijsko Tehnologijo Univerze v Ljubljani, se je leta 2018 oblikovala Knjižnica spojin FKKT. Knjižnica ima tako fizično knjižnico, kot virtualno knjižnico, v slednji so zabeležene strukture spojin iz fizične knjižnice spojin. V virtualni knjižnici so zavedeni še izračunani opisniki (»deskriptorji«) spojin. Knjižnica spojin FKKT je vodena ročno in vsebuje spojine sintetizirane na Fakulteti za Kemijo in Kemijsko tehnologijo.

Vzorci v knjižnici spojin FKKT so pretežno organske narave. S pomočjo NMR analize vzorcev sem določil, da je čistih okrog 85 % spojin v knjižnici, medtem ko so ostali razpadli ali imajo prisotne nečistoče.

Z virtualnim rešetanjem struktur iz virtualne knjižnice spojin smo analizirali potencial vzorcev v knjižnici za uporabo v medicini. Kot biološko pomembno tarčo smo uporabili 3CL^pro, proteazo pomembno pri replikaciji virusa SARS-CoV-2. Rezultati so pokazali potencial določenih vzorcev, vendar so za natančnejše informacije o vzorcih potrebne dodatne podrobnejše analize na več različnih tarčah.

Knjižnica spojin FKKT trenutno služi predvsem hranjenju vzorcev. Ob nadaljnjem širjenju knjižnice je pričakovana podrobnejša analiza vzorcev v knjižnici.

Ključne besede: knjižnica spojin, Knjižnica spojin FKKT, 85 % čistih spojin, potencialna medicinska uporaba spojin, hranjenje vzorcev.

(14)

(15)

COMPOUND LIBRARY PROCESSING AND APPLICATION

Abstract

Libraries are the main source of notes, books, information and everything related to information. The development of libraries is a consequence of the development of science. The development of science was accompanied by the development of special libraries, which include chemical compound libraries. Compound storage, quick access to information, easy access to compounds, research on new materials, and research in medicine are just some of the purposes of chemical compound libraries.

In 2018, the Faculty of Chemistry and Chemical Technology (FKKT) in Ljubljana opened its own chemical compounds library called "Knjižnica spojin FKKT". The library has a physical and a virtual form. The virtual compound library contains structures and some descriptors of the collected compounds. The FKKT chemical compound library is manually managed and contains compounds synthesized at FKKT.

The samples stored in the FKKT chemical compound library are mainly organic. Using NMR analysis, it was determined that 85 % of the samples stored in the FKKT chemical compound library are pure. The remaining 15 % of the samples are contaminated or have decomposed prior to storage.

By analyzing the structures from the virtual library, some potential pharmaceutical applications of the compounds were identified. In addition, molecular docking was performed. The biological target of the study was 3CLpro. 3CLpro is an important protease in the replication of the SARS-CoV-2 virus. The analysis provided some promising results. A more detailed analysis would be required to determine the further potential of the FKKT chemical compound library in medicine.

Storage of active compounds is currently the primary purpose of the FKKT chemical compound library. In the future, as the number of compounds stored increases, a more detailed compound analysis is expected.

Keywords: chemical compound library, FKKT chemical compound library, 85 % pure samples, potential use in medicine, sample storage.

(16)

(17)

KAZALO

1. Uvod ... 1

1.1. Zgodovina knjižnic ... 1

1.1.1. Babilon in stari Egipt ... 1

1.1.2. Staro Kitajsko cesarstvo ... 2

1.1.3. Stara Grčija in Rim ... 2

1.1.4. Srednji vek... 3

1.1.5. Reformacija ... 3

1.1.6. Novi vek ... 3

1.1.7. Moderne Knjižnice ... 3

1.1.8. Virtualne knjižnice ... 4

1.1.9. Raziskovanje v kemiji ... 5

1.2. Knjižnice in zbirke spojin ... 6

2. Namen dela... 7

2.1. Organiziranost knjižnic ... 7

2.2. Vzorci ... 7

2.3. Uporaba knjižnic spojin ... 8

3. Knjižnice spojin ... 9

3.1. Fizična oblika knjižnic spojin ... 10

3.1.1. Obdelava in hramba vzorcev ... 10

3.1.2. Obdelava in označevanje vzorcev ... 12

3.2. Virtualna knjižnica spojin ... 14

3.2.1. Podatki v knjižnicah in njihovo iskanje ... 15

(18)

3.2.2. Oblike zapisa struktur molekul spojin ... 16

3.2.2.1. Linearni zapisi struktur molekul s pomočjo ASCII znakov ... 18

3.2.2.2. Prostorski zapis molekul oz. molekulski formati ... 20

3.2.3. Prenos podatkov ... 22

3.3. Uporaba knjižnic spojin ... 24

3.3.1. Računalniška kemija ... 25

3.3.1.1. Virtualno rešetanje ... 26

3.3.1.2. Molekulska dinamika ... 27

3.3.2. HTS ... 28

3.3.3. HCS ... 29

3.3.4. Skupine analiznih elementov... 30

4. Knjižnica spojin FKKT ... 31

4.1. Fizična knjižnica ... 32

4.1.1. Prenos vzorcev ... 32

4.1.2. Shranjevanje vzorcev ... 34

4.1.3. Hranjenje vzorcev ... 35

4.2. Virtualna knjižnica ... 36

4.2.1. Priprava podatkov ... 36

4.2.2. Obdelava podatkov ... 38

4.2.3. Vzpostavitev knjižnice ... 38

4.2.3.1. Programska oprema ... 39

4.2.3.2. Prenos datotek ... 39

4.2.3.3. Uporaba knjižnice ... 39

5. Eksperimentalni del ... 43

5.1. Analiza vzorcev ... 43

(19)

5.1.1. NMR ... 43

5.1.2. Vzorci ... 46

5.1.3. MestreNova ... 46

5.2. Analiza struktur molekul ... 47

5.2.1. Canvas ... 47

5.3. Virtualno rešetanje in biološka tarča ... 48

5.3.1. Maestro Schrödinger ... 50

5.3.2. CMDock ... 51

5.3.3. Biološko pomembna tarča za izvedbo virtualnega rešetanja ... 53

5.3.3.1. SARS-CoV-2 ... Napaka! Zaznamek ni definiran. 5.3.3.2. Antivirusne učinkovine proti COVID-19 ... 59

5.3.3.3. 3CL^pro ... 59

5.4. Biološki testi ... 61

5.4.1. Izvedba ... 61

6. Razprava in rezultati ... 63

6.1. Primerjava knjižnic s knjižnico FKKT ... 63

6.1.1. Virtualna knjižnica spojin ... 63

6.1.2. Fizična knjižnica spojin ... 64

6.2. Analiza spojin ... 64

6.2.1. Analiza vzorcev ... 65

6.2.2. Analiza struktur ... 66

6.2.2.1. Pravilo Lipinski in pravilo 3... 66

6.2.2.2. QSAR ... 69

6.3. Virtualno rešetanje – potencial spojin na izbrano biološko pomembno tarčo 3CL^pro . 75 6.3.1. 3CLpro ... 75

(20)

6.3.2. Priprava struktur ... 76

6.3.3. Priprava tarče... 77

6.3.4. Virtualno rešetanje s programom Glide ... 77

6.3.5. Virtualno rešetanje s CMDock ... 83

6.4. Biološki (in-vitro) testi ... 88

6.4.1. Izvedba ... 88

6.4.2. Rezultati ... 88

6.4.2.1. Vzorci z najboljšimi rezultati ... 89

6.4.2.2. Vzorci, ki povečajo aktivnost 3CL^pro ... 89

6.4.2.3. Vzorci z različnim delovanjem pri različnih koncentracijah ... 91

7. Zaključek... 93

8. Literatura ... 97

9. PRILOGA ... 107

(21)

Kazalo Slik

Slika 1: Prikaz knjižnice v stari Grčiji [2] ... 2

Slika 2: Moderna knjižnica v Stuttgartu v Nemčiji [3] ... 4

Slika 3: Število spojin z CAS registracijsko številko, po letih od leta 1965[5] ... 5

Slika 4: Prikaz shranjenih vzorcev v zamrzovalniku [9] ... 11

Slika 5: Prikaz shranjenih vial v knjižnici. [8] ... 12

Slika 6: Slika vial in stojala za kriogene viale z označenimi mesti [14]... 13

Slika 7: Primer vodenja knjižnice z robotom [18] ... 14

Slika 8: Primer iskanja spojine v zbirki ZINC s pomočjo izrisa strukture [20] ... 16

Slika 9: Prikaz zapisa molekule etanola (lastni vir, ustvarjeno s programom Chemdraw) ... 17

Slika 10: Prikaz molekule etanola s pomočjo računalniškega programa Spartan (lastni vir) ... 17

Slika 11: Prikaz zapisa makromolekule Citokroma C s Hemom (lastni vir, s programom SeeSar) ... 18

Slika 12: Prikaz generiranja zapisov molekule etanola levo InChI in desno SMILES (lastni vir, ustvarjeno s programom Chemdraw) ... 19

Slika 13: Askorbinska kislina (vitamin C) in njegova poimenovanja: Pod strukturo je IUPAC poimenovanje, na desni strani od zgoraj navzdol si sledijo zapisi SMILES, InChI, InChI-key in SLN. (lastni vir, ustvarjeno s programom Chemdraw) ... 19

Slika 14: Prikaz zapisa SMILES in zapis s pomočjo okrajšav aminokislin [28] ... 20

Slika 15: Prikaz kompleksnega zapisa parametrov pri PDB formatu zapisa [22] ... 21

Slika16: Prikaz zapisa molekule alanina v MDL molfile formatu (lastni vir) ... 22

Slika 17: Prikaz csv formata zapisa podatkov (lastni vir) ... 23

Slika 18: Prikaz obdelanih podatkov z IJC. [34]... 24

Slika 19: Preprosta shema raziskovanja novih zdravilnih učinkovin [43] ... 25

(22)

Slika 20: Prikaz običajnega iskanja novih zdravilnih učinkovin s pomočjo računalniških simulacij (prirejena slika) [44] ... 26 Slika 21: Primerjava energijske minimizacije in molekulske dinamike na grafu potencialne energijske ploskve [42] ... 27 Slika 22: Prikaz uporabe knjižnice za namene HTS [46] ... 28 Slika 23: Slikovni prikaz poteka prenosa spojin v knjižnico spojin (lastni vir)... 33 Slika 24: Slikovni prikaz poteka shranjevanja spojin v knjižnico spojin (lastni vir) ... 34 Slika 25: Hladilnik knjižnice spojin FKKT z vzorci (lastni vir) ... 35 Slika 26: Prikaz tabele s podatki potrebnih za tvorbo knjižice spojin (lastni vir)... 36 Slika 27: Prikaz tabele s podatki potrebnih za tvorbo knjižice spojin, nadaljevanje tabele iz slike 26 (lastni vir) ... 37 Slika 28: Prikaz tabele s podatki potrebnih za tvorbo knjižice spojin, nadaljevanje tabele iz slik 26 in 27 (lastni vir) ... 37 Slika 29: Prikaz naslovne strani knjižnice FKKT [59] ... 40 Slika 30: Prikaz naslovne strani knjižnice FKKT [62] ... 40 Sliki 31 in 32: Prikaz iskanja struktur molekul v knjižnici. [63, 64]] ... 41 Sliki 33 in 34: Prikaz iskanja struktur molekul v knjižnici. [65, 66] ... 41 Slika 35: Prikaz rezultata iskanja željene strukture v knjižnici FKKT. [67] ... 42 Slika 36: Enostavna shema NMR instrumenta [70](prirejena slika) ... 44 Slika 37: Prerez komore z magnetom [70](prirejena slika) ... 45 Slika 38: Prikaz signalov NMR analize (lastni vir) ... 46 Slika 39: Prikaz primera uporabe programa CANVAS (lastni vir) ... 47 Slika 40: Molekulsko sidranje ( princip ključ (ligand) – ključavnica (protein tarče)) [75]

... 48 Slika 41: Prikaz nekaterih pomembnih interakcij med ligandom in proteinom [75] ... 49

(23)

Slika 42: Simbolični prikaz kupa velikega števila ključev (pri virtualne rešetanju ligandi), iz katerega moramo najti pravega za odprtje željene ključavnice (pri virtualnem rešetanju tarčni protein) [75] ... 49 Slika 43: Prikaz delovnega polja v Schrödingerjevem programu Maestro (lastni vir) . 50 Slika 44: Primer vezave liganda v tarčo (A), pri čemer je (B) »vezavna« konformacija liganda, (C) napačno konformacija liganda v osnovnem stanju in (D) optimalna konformacija liganda z najnižjo energijo. [81] ... 52 Slika 45: Enostaven shema virusa in prikaz položaja strukturnih proteinov na virionu [85]

(prirejena slika) ... 54 Slika 46: a) struktura S proteina, b) vezava S proteina na receptor ACE2 [85] ... 55 Slika 47: Shema procesa prenosa virusa v celico [85] (prirejena slika) ... 55 Slika 48: Tvorba ne-strukturnih proteinov in njihova funkcija [86] ... 56 Slika 49: Prikaz delitve in prepisa verige RNK v ne-strukturne in strukturne proteine. [87]

... 57 Slika 50: Shema replikacije RNK verige virusa [85] ... 57 Slika 51: Prikaz cikla SARS-CoV-2 virusa v celici [85] ... 58 Slika 52: Shema dimera 3CL^proin prikaz domen monomera, C in N terminalnih koncev,

»N–fingerja« in katalitsko aktivnih položajev (Cys 145 in His 41) (prirejena slika) [92]

... 60 Slika 53: Prikaz katalitsko aktivnega mesta (votline) za virusne inhibtorje) [93] ... 60 Slika 54: Histogram razporeditve spojin glede na njihovo molsko maso [g/mol] ... 66 Slika 55: Histogram razporeditve spojin glede na število akceptorskih mest vodikove vezi ... 67 Slika 56: Histogram razporeditve spojin glede na število donorskih mest vodikove vezi ... 67 Slika 57: Histogram razporeditve spojin glede na AlogP ... 68 Slika 58: Primer preverjanja QSAR modela pri testiranju spojin namenjenih inhibiciji HIV proteaze [101] ... 70

(24)

Slika 59: Histogram razporeditve spojin glede na število potencialnih kiralnih centrov ... 71 Slika 60: Histogram razporeditve spojin, glede na indeks elektro topološkega stanja .. 71 Slika 61: Histogram razporeditve spojin glede na polarno površino molekul ... 72 Slika 62: Histogram razporeditve spojin glede na njihovo molekulsko polarizabilnost 74 Slika 63: Prikaz sheme površine elektrostatskega potenciala monomera 3CL^pro, s prikazom aktivnega veznega mesta. (lastni vir, ustvarjen z Maestrom) ... 76 Slika 64: Prikaz prileganja liganda NA7 s tarčo. Levo spodaj na sliki so predstavljene interakcije liganda s tarčo ... 80 Slika 65: Prikaz prileganja liganda JS-PB-162 s tarčo. Levo spodaj na sliki so predstavljene interakcije liganda s tarčo) ... 81 Slika 66: Prikaz prileganja liganda BC-13 s tarčo. Levo spodaj na sliki so predstavljene interakcije liganda s tarčo ... 81 Slika 67: Prikaz prileganja liganda BC-23 s tarčo. Levo spodaj na sliki so predstavljene interakcije liganda s tarčo ... 82 Slika 68: Prikaz prileganja liganda JS-MZ-06 s tarčo. Levo spodaj na sliki so predstavljene interakcije liganda s tarčo ... 82 Slika 69: : Prikaz prileganja liganda PP-7 s tarčo, po analizi s programom CMDock. Na spodnjem delu slike so predstavljene interakcije liganda s tarčo ... 85 Slika 70: Prikaz prileganja liganda JS-PB-154 s tarčo, po analizi s programom CMDock.

Na spodnjem delu slike so predstavljene interakcije liganda s tarčo ... 85 Slika 71: Prikaz prileganja liganda NA7 (+) s tarčo, po analizi s programom CMDock.

Na spodnjem delu slike so predstavljene interakcije liganda s tarčo ... 86 Slika 72: Prikaz prileganja liganda JS-PB-102 s tarčo, po analizi s programom CMDock.

Na spodnjem delu slike so predstavljene interakcije liganda s tarčo ... 86 Slika 73: Prikaz prileganja liganda MG-10A s tarčo, po analizi s programom CMDock.

Na spodnjem delu slike so predstavljene interakcije liganda s tarčo ... 87 Slika 74: Encimsko delovanje 3CL^pro ob dodatku potencialnega inhibitorja BC-23. .... 89

(25)

Slika 75: Encimsko delovanje 3CL^pro ob dodatku potencialnih inhibitorjev JS-LP-127, PP-17, JS-186/2 in JS-187/4.. ... 90 Slika 76: Encimsko delovanje 3CL^pro ob dodatku potencialnih inhibitorjev JS-PB-2, JS- PB-162 in JS-PB-493. ... 91

(26)

(27)

SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC IN SIMBOLOV

FKKT Fakulteta za Kemijo in kemijsko tehnologijo

CAS Chemical Abstracts Service

FFA Fakulteta za Farmacijo

DNK deoksiribonukleinska kislina

RNK ribonukleinska kislina

DMSO dimetil sulfoksid

ADP adenozin difosfat

ASCII American Standard Code for Information Interchange

InChI IUPAC-NIST Chemical Identifier

IUPAC Internationa union of Pure and Applied Chemistry SMILES Simplified Molecular Input Line Entry Specification

SLN SYBYL line notation

WLN Wiswesser Line Notation

NMR nuklearna (jedrska) magnetna resonanca

PDB protein data bank

CHARMM Chemistry at Harvard Molecular Mehanics

CT file Chemical table file

SDF Structure Data File

RDF Resource Description Framework

csv Coma separated values

CDD Collaborative Drug Discovery

IJC Instant Jchem

HTS High-throughout screening

HCS High-content screnning

IR infrardeča

Log P logaritem particijskega koeficienta

QSAR quantitative structure-activity relationship

TMS Tetrametilsilan

COSY Correlated Spectroscopy

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

2D Dvo dimenzionalno

HTVS high throughput virtual screening

MS Masna spektrometrija

SP standard precision

XP extra precision

SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 COVID-19 nova koronavirusna bolezen 2019

SARS-CoV severe acute respiratory syndrome coronavirus

MERS-CoV Middle East respiratory syndrome–related coronavirus

RBD »receptor vezna« domena

ACE2 Angiotensin-converting enzyme 2

(28)

TMPRSS2 transmembrane protease serine 2

HR heptapeptidna ponavljajoča sekvenca

Plpro Papain-like protease

3CL^pro 3-chymotrypsin-lile protease

Nsp ne-strukturni protein

RdRP RNK odvisna RNK polimeraza

sgRNK sub-genomske RNK

EDTA Etilendinitrilo-trtraocetna kislina

DTT ditioteritol

PDB protein data base

RMSE Root Mean Square Error

Estate Elektrotopološko stanje

PSA Polarna površina molekule

VR Virtualno rešetanje

M molska masa

don. v.v. donorska mesta za vodikovo vez Alogp logaritem particijskega koeficienta akc. v.v. akceptorska mesta za vodikovo vez FRET fluorescence resonance energy transfer

(29)

1

1. Uvod

Želja po vedno novih informacijah in po novih izboljšavah na različnih področjih, žene ljudi k raziskovanju sveta. Tako vedno znova najdemo nove izzive, ki nam omogočajo potešiti našo radovednost. Izzivi so precej raznoliki, posledično so precej različni tudi rezultati znanstvenih raziskav, na različnih področjih. Vsakega izziva se lotimo v težnji po pridobitvi rezultatov, ki jih lahko pridobimo relativno hitro, ali pa na njih čakamo tudi več desetletij. Želimo, da z rezultati pridobimo informacije, ki nam koristijo tako v sedanjosti za raziskovanje preteklosti, kakor tudi pri načrtovanju prihodnosti. Informacije so tako lahko nekoristne v sedanjosti, vendar nam lahko potencialno koristijo v prihodnosti. Posledično je potrebno zagotoviti shranjevanje teh informacij. Prostori, kjer ljudje že stoletja shranjujemo zapise informacij, imenujemo knjižnice.

1.1. Zgodovina knjižnic

Knjižnica izhaja iz besede knjiga. Osnovni namen knjižnic je hranjenje literature, ki se je skozi čas zapisovala. Danes se veliko gradiva hrani v elektronski obliki, posledično je beseda knjižnica pridobila nekoliko širši pomen. Zgodovinsko prvi primeri hramb literature segajo v tretje tisočletje pred našim štetjem. [1]

1.1.1. Babilon in stari Egipt

V Babilonskem templju v mestu Nippur so arheologi našli hrambo glinenih ploščic z zapisi iz tistega časa. Posledično lahko trdimo, da so se prve knjižnice razvile že v tistem času, pet tisoč let nazaj. Podobno zbirko glinenih plošč, kot v Nippurju, so arheologi našli v mestu Tell el-Amarna v starem Egiptu, ki sega v drugo tisočletje pred našim štetjem.

Znana je tudi zbirka, več kot 25000 glinenih plošč, zadnjega velikega kralja Asirije, Ashurbanipala (668 pred našim štetjem – 627 pred našim štetjem), ki so jo nabrali v templjih po ozemlju Asirskega kraljestva. Veliko hramb, glinenih zapisov, je bilo skozi tisočletja tudi uničenih, bodisi so se hrambe izgubile, ali so jih namerno uničevali, največkrat zaradi političnih razlogov. [1]

(30)

Razvoj in uporaba knjižnice spojin Primož Banfi

2

1.1.2. Staro Kitajsko cesarstvo

Najbolj znano takšno uničenje zgodovinskih hramb je potekalo na območju starega Kitajskega cesarstva, kjer je bilo v času dinastije Čin (okrog 200 pred našim štetjem) uničenega veliko shranjenega gradiva. Za razliko od dinastije Čin so cesarji v naslednji dinastiji (dinastiji Han), kot prvi v zgodovini začeli obnavljati staro literaturo prejšnjih ljudstev. Posledično je danes znanega veliko predvsem o staro kitajskem ljudstvu. V času dinastije Han so se začele tudi namenske razporeditve zapisov, tako iz tistega časa poznamo prve natančne zapise o vojskovanju in o medicini. Posebej staro kitajska medicina je pomembna in uporabna tudi v današnjem času. [1]

1.1.3. Stara Grčija in Rim

Še pred razvojem knjižnic na ozemlju stare Kitajske, so se prve »moderne« knjižnice, kot jih v podobni obliki poznamo tudi danes, pojavile v Stari Grčiji nekje, v šestem stoletju pred našim štetjem. V tem času so se začele tudi možnosti izposoje zapisane literature, kar je sovpadalo z razvojem šolstva in pismenosti. [1]

Slika 1: Prikaz knjižnice v stari Grčiji [2]

(31)

3

Nadaljnji razvoj knjižnic je sledil na območju Rimskega cesarstva, kjer so znane tudi prve zasebne knjižnice, predvsem Rimskih cesarjev. Najbolj znana zbirka knjig iz tistega časa, je Cicerova zbirka. [1]

1.1.4. Srednji vek

V srednjem veku sta imeli največji vpliv na življenje religija in cerkev, posledično v tem času beležimo predvsem zapise cerkvene literature, predvsem krščanskega in islamskega sveta. V to obdobje sodi tudi nastanek Vatikanske knjižnice. [1]

1.1.5. Reformacija

V času reformacije se je prvič začel razvoj posameznih jezikov in posledično razvoj kulture posameznih ljudstev. Martin Luther je s svojim uporom sprožil razvoj tako književnosti, kot tudi razvoj zapisov znanstvene dejavnosti po svetu. V času pred reformacijo so bili mnogi znanstveniki zatirani (npr. Galileo Galilei). Posledično so se razvile tudi knjižnice. V tem času smo dobili prve narodne knjižnice in knjižnice s specifično namembnostjo. [1]

1.1.6. Novi vek

V času po reformaciji se je število knjižnic po svetu precej povečalo. V tem času je znan velik razvoj knjižnic na območju Velike Britanije in Francije. V Evropi se je število knjižnic najbolj povečalo v času po francoski revoluciji. V nadaljevanju so se razvile knjižnice po vsem svetu. [1]

1.1.7. Moderne Knjižnice

Skozi stoletja se je količina novih informacij hitro povečevala, posledično so se razvijale tudi knjižnice. Z izjemo modernizacije, se je namen knjižnic ohranil v podobni obliki, kot so ga poznali že naši predniki, pred več kot dvema tisočletjema. Danes poznamo veliko knjižnic, vezanih na različna področja. Izgled knjižnic je danes popolnoma drugačen (prikaz na sliki 2), kot je bil izgled knjižnic pred več kot dva tisoč leti (slika 1). [1]

(32)

4

Slika 2: Moderna knjižnica v Stuttgartu v Nemčiji [3]

V današnjem svetu se srečujemo z veliko količino novih informacij, ki jih pridobimo z vedno bolj naprednimi in podrobnimi raziskavami. Posledično je nemogoče zagotoviti dovolj prostora, da bi bilo gradivo shranjeno in dostopno za vse ljudi, zgolj v »klasičnih«

knjižnicah, kot so jih poznali naši predniki.

1.1.8. Virtualne knjižnice

Posledično je danes veliko gradiva shranjenega v elektronski obliki, ki omogoča shranjevanje velike količine podatkov, na zelo malem prostoru (trdi diski). Takšne knjižnice, z drugo besedo, imenujemo tudi virtualne knjižnice. Elektronsko shranjeno gradivo je običajno lažje in hitreje dostopno, kot fizični zapisi shranjeni v knjižnicah.

Veliko povečanje števila novih informacij beležimo tudi v znanstveno naravoslovnem svetu. [1]

(33)

5

1.1.9. Raziskovanje v kemiji

V kemiji imamo predvsem veliko količino na novo pripravljenih spojin in reakcij, beležimo pa tudi nekatere na novo odkrite elemente. V začetku 19. stoletja se je začelo namensko izvajanje reakcij in natančnejše objavljanje novo odkritih spojin in reakcij. V prvi polovici 19. stoletja objave niso bile ravno pogoste, od leta 1860 pa beležimo prvo konstantno rast števila objavljenih, na novo odkritih spojin. Kot je razvidno iz slike 3, je rast števila novo odkritih spojin, molekul in elementov do nekje leta 2000 procentualno konstantna. Po letu 2000 je prirast števila spojin še višji in je rast števila novih molekul eksponentna. Količina podatkov posledično postaja čedalje večja. CAS registrsko številko spojine ima trenutno več kot 185 milijonov spojin. Skozi leta so se posledično razvile baze in knjižnice spojin. [4, 5]

Slika 3: Število spojin z CAS registracijsko številko, po letih od leta 1965[5]

(34)

6

1.2. Knjižnice in zbirke spojin

Knjižnica spojin je zbirka shranjenih kemikalij, katere namen je pravilno hranjene vzorcev, iskanje shranjenih kemikalij in uporaba le teh za omogočanje lažjega raziskovanja novih potencialnih spojin, zdravil in materialov. Veliko novih spojin v času njihove sinteze nima praktične uporabe, saj se mnogokrat zgodi, da spojine nimajo pričakovane aktivnosti zoper konkretno terapevtsko tarčo. Knjižnice spojin omogočajo shranitev teh spojin in njihovo nadaljnjo uporabo. Spojine, pripravljene kot rezultat raziskovalnega dela, ki nimajo takojšnje direktne ali indirektne uporabe, je smiselno ustrezno popisati in sistematično shraniti za morebitno uporabo v prihodnosti. Knjižnice spojin so sestavljene iz več zbirk spojin. Urejena zbirka spojin nam omogoča izvedbo hitrih bioloških testov, s katerimi lahko preverimo njihovo potencialno uporabnost.

Arhivirane spojine lahko služijo tudi kot izhodišče za sintezo novih spojin. Spojina je sestavljena iz več istih molekul, ki so sestavljene iz atomov kemijskih elementov. [5]

V virtualnih knjižnicah spojin so strukture molekul spojin zabeležene z zato namenjenimi zapisi, ki se lahko uporabljajo v računalniških aplikacijah. Računalniške aplikacije omogočajo reprezentacijo struktur molekul spojin, omogočajo napovedi lastnosti struktur molekul vzorcev spojin ali preverjajo biološko učinkovanje spojin. Ena izmed uporab računalniških aplikacij v kemiji je tudi izvedba virtualnega rešetanja. [5]

Med najbolj znanimi knjižnicami spojin so med drugim PubChem, v kateri je okoli 110 milijonov unikatnih struktur molekul spojin, SciFinder, ki jo ureja CAS, in vsebuje že več kot 185 milijonov unikatnih struktur molekul spojin in ZINC, v kateri je več kot 200 milijonov struktur molekul spojin.[5 – 7]

V letu 2018 se je začela oblikovati tudi Knjižnica spojin FKKT, Univerze v Ljubljani.

Knjižnica trenutno vsebuje preko 3000 spojin, sintetiziranih na FKKT, Univerze v Ljubljani.

(35)

7

2. Namen dela

V izgradnji knjižnice spojin FKKT sodelujem tudi sam, zato sem se odločil, da bom svoje magistrsko delu posvetil knjižnicam spojin, saj so za hranjenje in organizacijo sintetiziranih spojin zbirke knjižnic zelo pomembne. Osrednja tema magistrske naloge je organizacija knjižnic spojin in njihova praktična uporaba. Dodatno bom preveril potencialno vrednost knjižnice spojin FKKT in ovrednotil smiselnost njenega obstoja.

2.1. Organiziranost knjižnic

Knjižnice spojin so sestavljene iz raznih zbirk spojin. Namen magistrske naloge je ugotoviti različne organiziranosti posameznih zbirk podatkov in njihovo namembnost.

Preveriti želim dostopnost različnih podatkov, njihovo strukturiranost v različnih zbirkah, različne oznake in oblike zapisa podatkov v virtualnih zbirkah podatkov. Preveriti želim tudi povezanost zbranih podatkov v virtualnih zbirkah spojin, s spojinami v fizičnih zbirkah spojin. Ravno tako želim preveriti različne metode hranjenja podatkov v virtualnih zbirkah spojin. S primerjavo knjižnic spojin, ki so sestavljene iz več zbirk spojin, želim ugotoviti organiziranost knjižnice spojin FKKT in podati predloge morebitnih izboljšav trenutne knjižnice.

2.2. Vzorci

Knjižnica spojin FKKT ima poleg virtualne zbirke tudi svojo fizično zbirko spojin, ki omogoča hiter dostop do vzorcev in potencialno hitrejše raziskave. Sami vzorci v fizičnih zbirkah so različno obstojni, zato je namen magistrske naloge preveriti tudi trenutno stanje spojin v fizični zbirki spojin in oceniti njihovo čistost. S pomočjo NMR analize naključno izbranih vzorcev iz knjižnice, bom preveril obstojnost in kakovost vzorcev, shranjenih v knjižnici spojin FKKT.

(36)

8

2.3. Uporaba knjižnic spojin

Osrednji namen knjižnic spojin je pravilno hranjenje spojin. Knjižnice spojin se ob tem uporabljajo za iskanje shranjenih spojin, pomoč pri nadaljnji sintezi, uporabo shranjenih vzorcev v nadaljnji sintezi, iskanje novih potencialnih medicinskih učinkovin, raziskovanje novih materialov in več. V sklopu magistrske naloge bom s pomočjo računalniških programov izvedel analizo shranjenih struktur spojin. S pomočjo virtualnega rešetanja, oz. »dockinga«, na biološko pomembno tarčo, bom preveril potencial shranjenih spojin za morebitne farmacevtsko uporabne spojine. Kot zbirko spojin bom vzel strukture molekul spojin, zbrane v virtualni knjižnici spojin FKKT. Ob nadaljnji analizi bom izvedel tudi biološke teste s spojinami, ki bodo dale obetavne rezultate virtualnega rešetanja.

(37)

9

3. Knjižnice spojin

Knjižnica spojin je zbirka kemijsko pridobljenih snovi (kemikalij), med katere spadajo kemijski elementi, spojine, raztopine reakcijskih zmesi in literature, povezane s shranjenimi spojinami. Knjižnice spojin danes, zaradi razcveta tehnologije, znanosti in posledično vedno novih odkritij, postajajo čedalje pomembnejše, saj omogočajo hiter dostop do znanih spojin, elementov, zabeleženih sinteznih poti in lastnosti shranjenih snovi. Knjižnice spojin omogočajo hitrejše znanstveno usmerjene raziskave, saj so zbrani podatki v knjižnicah relativno hitro in enostavno dostopni. Same knjižnice imajo različno strukturiranost. Nekaj namembnosti knjižnic s primeri je prikazano v tabeli 1.

Namen Primer Št. spojin

Nespecifične

Virtualne knjižnice z velikim številom manjših molekul

PubChem SciFinder

ZINC

110 milijonov 190 milijonov 200 milijonov Virtualne knjižnice z

velikimi molekulami

PDB DDBJ GenBank

180000 5000 10000 Knjižnice s fizičnimi

vzorci spojin

BCL FKKT

100000 3000

Specifične

Zdravilne učinkovine (bioaktivne snovi)

DrugBank ChEMBL

TCM FDA ADL

500000 2 milijona

15000 1000

Naravne spojine NubbeDB

TimTec NPL

2000 2000 Sintetične snovi Synthetic Comp. Lib. 2000

Novi materiali ML comp. Lib. 2000

Tabela 1: Nekaj primerov knjižnic spojin z njihovo namembnostjo in približnim številom shranjenih spojin [6 – 8]

(38)

10

Poznamo knjižnice spojin, ki shranjujejo zgolj naravne produkte, knjižnice znanih medicinskih učinkovin in knjižnice zbira spojin različnega izvora, kot so recimo tudi spojine, zbrane v zbirki ZINC. V knjižnicah lahko imamo shranjene zgolj spojine s strukturno podobnostjo, ki so največkrat namenjene raziskovanju določenih bioloških tarč. Lahko imamo tudi knjižnice v katerih so shranjene zgolj spojine z določenega območja, kot je tudi knjižnica spojin FKKT, ki vsebuje spojine, sintetizirane na Fakulteti za Kemijo in Kemijsko Tehnologijo, Univerze v Ljubljani. Glavna delitev knjižnic spojin je na fizične knjižnice spojin, ki vsebujejo fizične vzorce ali njihove raztopine, in virtualne knjižnice spojin, ki vsebujejo zapise struktur molekul spojin, njihovih fragmentov ter literature povezane s shranjenimi strukturami. Običajno imajo tudi vzorci iz fizičnih knjižnic elektronski zapis v svojih virtualnih knjižnicah. [6, 7]

3.1. Fizična oblika knjižnic spojin

Fizična knjižnica spojin predstavlja zbirko kemikalij, katerih natehtana količina je shranjena na točno določenih položajih. Vzorci so shranjeni v primernih pogojih, ki zagotavljajo stabilnost vzorcev.

3.1.1. Obdelava in hramba vzorcev

Vzorci se shranjujejo v viale različnih velikosti, ki ob primernem shranjevanju vzorcev preprečujejo zunanji vpliv na vzorce in omogočajo relativno hiter dostop do le-teh. Vzorci so običajno prepihani z inertnim plinom, največkrat argonom, in shranjeni v zamrzovalnikih, v pogojih brez svetlobe, pri temperaturi okog –20 °C. Na ta način sta omogočeni termična in fotokemična stabilnost vzorcev. Viale imajo ob tem dodatna tesnila, ki onemogočajo izmenjavanje plinov in dostop vlage do vzorcev.

(39)

11

Slika 4: Prikaz shranjenih vzorcev v zamrzovalniku [9]

S pomočjo raziskav je bilo ugotovljeno, da imajo spojine v inertnih pogojih dvakrat večjo stabilnost, kot spojine izpostavljene kisiku. Zagotavljanje pogojev termične stabilnosti se je izkazala za še pomembnejšo, saj je več kot 50 % spojin, izpostavljenih višji temperaturi, kazalo znake razgradnje. Najprimernejša temperatura za zagotavljanje termične stabilnosti je –20 °C (253 K). Zagotovitev pogojev, ki preprečujejo dostop svetlobe vzorcem, omogoči fotokemično stabilnost. Stabilnost vzorcev je ravno tako zelo odvisna od topil in deleža le-teh v vzorcih, torej tudi čistost samih vzorcev. Vzorci se v nekaterih knjižnicah hranijo raztopljeni v topilih, ki omogočajo lažjo uporabo pri morebitnih raziskavah, med drugim za HTS (»high throughput screening »). Kot topilo se v večini primerov uporablja DMSO (dimetil sulfoksid), ki je sam po sebi precej higroskopen, posledično je potrebno vse vzorce pred raztapljanjem ravno tako prepihovati z inertnim plinom in zagotoviti kakovosten DMSO (svež in destiliran v inertnih pogojih).

Shranjevanje trdnih in poltrdnih vzorcev, ravno tako zahteva prepihovanje z inertnim plinom, običajno argonom, pri čemer se kot alternativa uporablja tudi dušik. [8 – 10]

(40)

12

3.1.2. Obdelava in označevanje vzorcev

Vzorci se shranjujejo v viale različnih velikosti, v katere natehtamo nekje od 0,3 mg do tudi nekaj sto gramov trdnih in poltrdnih vzorcev, pri slednjih si pomagamo tudi z hlapnimi topili, pri čemer moramo paziti, da topila ne vplivajo na same vzorce. Tekočih vzorcev shranimo nekaj mililitrov. Za lažje prepoznavanje vial imajo le-te 2D prepoznavno kodo (QR kodo). Viale so postavljene v stojala, ki imajo označeno mesto, ki omogoča hitrejši dostop do vzorca. [9, 12, 13]

Slika 5: Prikaz shranjenih vial v knjižnici. [8]

V knjižnicah, kjer se shranjuje manjše količine vzorcev, se vzorce shranjuje v kriogene viale, ki omogočajo enostavno vzpostavitev primernega okolja za hrambo vzorcev in shranjevanje velikega števila vzorcev na majhnem prostoru.

(41)

13

Slika 6: Slika vial in stojala za kriogene viale z označenimi mesti [14]

Natančen položaj viale omogoča tudi računalniško vodenje knjižnice z roboti. Slednje lahko uporabimo pri hitrejši obdelavi željenih vzorcev in množičnem preizkušanju vzorcev za biološko uporabo (biološki testi). Posebej pomembne so oznake za HTS, saj je tako omogočena računalniška obdelava velikega števila (tudi več milijonov) spojin. Za boljše vodenje in rezultate je pomembna tudi sama organiziranost vzorcev v sami knjižnici, tako so običajno strukturno podobne spojine shranjene blizu, posledično je analiza precej hitrejša. [11 – 13, 15]

(42)

14

Slika 7: Primer vodenja knjižnice z robotom [18]

Za kakovost je najbolj pomembna kvaliteta samih vzorcev oz. raztopin shranjenih v knjižnicah. Vzorci morajo biti očiščeni, torej brez morebitnih nečistoč in ostankov topil (razen v primerih, ko je vzorec namenoma shranjen v topilu). Ravno tako morajo biti vzorci pravilno obravnavani in hranjeni. Danes je v knjižnicah ogromno spojin, posledično postajajo knjižnice čedalje kompleksnejše. Vzorci spojin, shranjenih v fizičnih knjižnicah, imajo običajno zapis svojih struktur v virtualnih knjižnicah. [14 – 18]

3.2. Virtualna knjižnica spojin

Virtualne knjižnice spojin so zbiri struktur molekul spojin, njihovih fragmentov, lastnosti le-teh in z njimi povezanih reakcijskih shem. V knjižnicah so zabeleženi zapisi struktur molekul v različnih formatih, ki običajno predstavljajo spojine vzorcev v fizičnih knjižnicah spojin ali predstavljajo strukture iz razne literature. Strukture molekul spojin so z vzorci iz fizičnih knjižnic povezane preko oznak spojin (oznaka je dodatno odtisnjena

(43)

15

na viali), preko položaja v stojalu in preko 2D kode (QR kode) na viali ter stojalu. Slednje je ključno pri robotsko vodenih fizičnih knjižnicah spojin. Dodatno vrednost virtualnih knjižnic predstavljajo dodane sintezne poti (kemijske reakcije) za strukture spojin shranjene v knjižnici spojin. To so informacije, ki predvsem omogočajo hitrejši razvoj novih podobnih spojin. Primer uporabe takšne knjižnice je baza organskih in anorganskih spojin SCIFinder (baza pod okriljem CAS), ki omogoča hiter dostop do iskanih struktur molekul spojin, reakcijskih shem in literature. Nekatere knjižnice za dostop do podatkov zahtevajo plačilo licence, tak primer je tudi SCIFinder, spet druge so prosto dostopne.

[8, 16 – 18]

3.2.1. Podatki v knjižnicah in njihovo iskanje

Podatki v knjižnicah so predstavljeni v različnih oblikah in zapisani v različnih formatih.

Glavni podatki so običajno zapis dodeljenega imena spojine (spojini običajno dodeli ime raziskovalec), ime raziskovalca oz. raziskovalcev, datum vnosa in zapis spojine v različnih formatih (več o njih v nadaljevanju). Dodatno v knjižnicah spojin lahko shranjujemo informacije o sami zalogi spojine in položaju viale s spojino v skladišču.

Zabeležimo lahko tudi informacije, ki omogočajo dostop do strokovne literature, v kateri so bile le-te spojine objavljene. Nekatere knjižnice, kot je SciFinder, temeljijo na strokovni literaturi, preko katere so informacije tudi dostopne. Izvor informacij o posamezni snovi je lahko različen med posameznimi knjižnicami. Tako recimo v zbirki ZINC (zbirka je prosto dostopna) najdemo podrobnejše informacije o spojini, kot so število različnih atomov, hibridizacija posameznih atomov, informacija o obročih, molska masa spojine in več. Pri iskanju spojin v knjižnicah se sklicujemo na zgoraj navedene podatke. Za iskanje točno določenih spojin običajno uporabimo kar ime željene spojine ali tudi IUPAC poimenovanje strukture spojine. Za iskanje spojin po podobnosti ali specifični potrebi, kot so na primer posamezne funkcionalne skupine, največkrat iščemo s pomočjo izrisa strukturne formule željene spojine, oz. željenih spojin, kot je primer na sliki 8. [18, 22]

(44)

16

Slika 8: Primer iskanja spojine v zbirki ZINC s pomočjo izrisa strukture [20]

Za samo uporabo knjižnice za namene sidranja in drugih računalniških simulacijah so pomembni sami različni zapisi spojin, saj so običajno preko njih strukture molekul spojin enolično določene in primerne za računalniško uporabo. [19 – 21]

3.2.2. Oblike zapisa struktur molekul spojin

Poznamo različne zapise struktur molekul. Za prikaz samih molekul se največkrat uporabljajo strukturna formula, racionalna formula in skeletna formula. Na sliki 9 so prikazi zapisa molekule etanola. Od leve proti desni si sledijo strukturna formula, racionalna formula in skeletna formula. Za prikaz večjih molekul, kot so na primer proteini, se pogosto poslužujemo prikaza z dodeljenimi kraticami. [22]

(45)

17

Slika 9: Prikaz zapisa molekule etanola (lastni vir, ustvarjeno s programom Chemdraw)

Za lažji zapis struktur si pomagamo z zato namenjenimi programi, kot sta na primer Chemdraw in MarvinSketch. Z računalniškimi programi se pogosto poslužujemo tudi prikaza molekul s kroglicami in palčkami, pogosta je tudi uporaba raznih računskih operacij, ki nam omogočajo dodatne informacije o spojini. Tako si lahko pomagamo s pomočjo vizualizacij molekulskih površin, s prikazom molekulskega elektrostatskega potenciala, projekcije elektronske gostote, homo orbitale, lumo orbitale, ionizacijske ploskve in več. Na sliki 10, od leve proti desni so predstavitve, s pomočjo računalniškega programa Spartan; paličastega prikaza molekule, prikaza izračunanega lokalnega ionizacijskega potenciala in transparentnega prikaza izračunanega potenciala na izoelektronski ploskvi, molekule etanola. [23, 24]

Slika 10: Prikaz molekule etanola s pomočjo računalniškega programa Spartan (lastni vir)

Prikaz s pomočjo kroglic in palčic ni uporaben za večje molekule. Za slednje uporabljamo računalniške programe, pri katerih uporabljamo tako imenovano vizualizacijo makromolekul s pomočjo alfa vijačnic, beta ploskev, zavojev in poudarjenih ostankov strukture, saj bi bilo prikazovanje s pomočjo kroglic in palčic nepregledno. [22, 25]

(46)

18

Slika 11: Prikaz zapisa makromolekule Citokroma C s Hemom (lastni vir, s programom SeeSar)

Sami prikazi imajo svoja poimenovanja molekul. Pri samem poimenovanju molekul si pomagamo s pomočjo IUPAC nomenklature. Uporaba slednje se je odlično prijela, vendar ni uporabna za računalniško rabo. Za slednjo je potrebna specifikacija, ki programom omogoči enostavno prepoznavo strukture molekule, z relativno preprostim zapisom. [22, 25]

3.2.2.1. Linearni zapisi struktur molekul s pomočjo ASCII znakov

Zaradi potrebe po krajšem in enostavnejšem zapisu molekul, so se razvili linearni zapisi struktur, ki s pomočjo ASCII znakov omogočajo nedvoumen zapis strukture molekul v računalniški obliki. Kot standard za zapis kemijskih formul za prepoznavanje je IUPAC določil zapis InChI, ki je linearni zapis formule, vendar je širše bolj poznan in lažje razumevajoč zapis SMILES, ki se generira v zaporedju atomov v posamezni molekuli.

Na sliki 11 sta predstavljena zapisa molekule etanola, levo v obliki InChI zapisa in desno z zapisom SMILES. Iz slike je razviden kompleksnejši zapis InChI že za manjše strukture.

[22, 25, 26]

(47)

19

Slika 12: Prikaz generiranja zapisov molekule etanola levo InChI in desno SMILES (lastni vir, ustvarjeno s programom Chemdraw)

Med linearne zapise spadajo tudi zgoščen zapis InChI, poznan kot InChI-key, SLN (SYBYL line notation) in WLN (Wiswesser Line Notation). Slednji je bil eden prvih sistemov zapisa molekul s pomočjo ASCII znakov. [22]

Slika 13: Askorbinska kislina (vitamin C) in njegova poimenovanja: Pod strukturo je IUPAC poimenovanje, na desni strani od zgoraj navzdol si sledijo zapisi SMILES,

InChI, InChI-key in SLN. (lastni vir, ustvarjeno s programom Chemdraw)

Za večje molekule zgoraj navedeni linearni zapisi običajno niso primerni, saj so predolgi, oziroma so večje molekule preveč kompleksne. Tako se uporabljajo skrajšana, posebej definirana imena večjih molekul, na primer proteinov ali verig DNK. Za potrebe teh zapisov se so razvili tudi okrajšani zapisi za posamezne aminokisline, ki omogočajo zapis spojin s pomočjo črkovnih okrajšav (prikaz slika 13). [22, 25, 27]

(48)

20

Slika 14: Prikaz zapisa SMILES in zapis s pomočjo okrajšav aminokislin [28]

Za zaporedje nukleinskih kislin poznamo tudi eno-črkovne okrajšave za posamezne kisline.

3.2.2.2. Prostorski zapis molekul oz. molekulski formati

Zbirka spojin, ki vsebuje zapis večjih molekul, kot so proteini, nukleinske kisline in podobne daljše molekule je tudi PDB (protein data bank). V PDB zbirki so molekule na podlagi določenega sistema poimenovanja, poimenovane s črkami in številkami, ki dajejo natančnejše informacije o geometriji molekule in o lastnostih gradnikov v samih molekulah. Zbirko PDB in njen zapis prepoznava tudi večina računalniških programov, ki so namenjeni molekulski dinamiki. Programi, s katerimi izvajamo računalniške simulacije, kot sta molekulsko sidranje ali molekulska dinamika, potrebujejo dodatne strukturne informacije o molekulah, da le-te izvedejo natančneje in hitreje. Posledično so se razvile prostorske oblike zapisa molekul, ki dajejo več informacij o samih molekulah.

Molekulski formati določajo točne informacije o dolžinah vezi in velikosti kotov med atomi v molekuli. [27 – 29]

(49)

21

Slika 15: Prikaz kompleksnega zapisa parametrov pri PDB formatu zapisa [22]

Podoben zapis, kot format PDB, je zapis v GROMACS formatu, ki je bil razvit specifično za uporabo pri simulacijah molekulske dinamike in ima v zapisu dodatne informacije, kot so parametri hitrosti molekul, trajektorije posameznih delcev in spreminjanje molekule s časom simulacije. Zapisa, ki sta ravno tako namenjena primarno za uporabo pri simulacijah molekulske dinamike, sta tudi CHARMM in AMBER. Zapisi se med seboj razlikujejo glede na same podane informacije in po obliki predstavitve le-teh. Izvedba simulacije in sami rezultati so odvisni tudi od oblike zapisa, ki ga uporabimo. [22, 31]

Poznamo še več različnih zapisov. XYZ format je zapis, ki temelji na zapisu vseh atomov v kartezičnih koordinatah in ne podaja samih informacij o topologiji molekul, torej med posameznimi atomi vezi niso eksplicitno določene. Zapis z Z matriko ima poleg razdalje sosednjih atomov dodane kote med atomi in torzijske kote med ravninama, ki jih tvorijo štirje atomi. Chemical table file, ali tudi CT file, je družina tekstovnih formatov zapisov struktur molekul, ki podaja informacijo o vsakem atomu v molekuli in vezmi s sosednjimi atomi. V družino CT file spadajo tudi formati MDL, ki jih je razvilo podjetje Molecular Design Limited. Med MDL formati je najpogosteje uporabljan format MDL molfile, ki ga ravno tako prepoznava večina računalniških programov, namenjenim računalniškim simulacijam. Na sliki 15 je prikaz zapisa alanina ((S)-2-aminopropanoata) s formatom MDL molfile. [22, 25, 31]

(50)

22

Slika16: Prikaz zapisa molekule alanina v MDL molfile formatu (lastni vir) Molecular Design Limited je razvilo več zapisov, med katerimi se ob MDL zapisu pogosto uporablja tudi SDF zapis, katerega bistvena lastnost je vsebovanje podrobnejših strukturnih lastnosti molekul. Molekule s SDF zapisom se uporablja tudi pri molekulskem rešetanju, za katerega potrebujemo zbirke spojin z natančnejšimi opisi struktur. [33, 34]

3.2.3. Prenos podatkov

Za vzpostavitev knjižnice spojin moramo informacije o spojinah in njihove zapise prenesti v računalniško berljivo obliko, ki se nato lahko naloži na pripravljeno platformo.

Informacije spojin moremo navesti v pregledni obliki. Zraven osnovnih informacij, kot so oznaka spojine, njena natehta, imena raziskovalcev, morebiten položaj v fizični knjižnici spojin in objavljeno literaturo o spojini, dodamo tudi dodatne opise spojin, kot so na primer stabilnost, obstojnost in čistost. Zapisi v knjižnicah so v različnih oblikah, najpogosteje so navedeni SMILES zapisi, ravno tako so pogosti InChI, InChI-key in SDF.

[22, 25, 33]

(51)

23

Podatke običajno beležimo v tabelah, primer takšne tabele, pripravljene s programom Microsoft Excel, je na sliki 17. Pripravljeno datoteko spremenimo v obliko, ki jo programi za obdelavo prepoznajo, pogosto se uporabljata obliki csv in sdf, kjer lahko poleg same kemijske strukture shranjujemo tudi druge pridružene podatke. [32 – 35]

Slika 17: Prikaz csv formata zapisa podatkov (lastni vir)

Pri tem moramo paziti na zaporedje vnesenih lastnosti, saj se glede na program, ki ga uporabljamo za obdelavo podatkov, potrebno zaporedje spreminja. Poznamo več programov, ki omogočajo hiter prenos podatkov na pripravljeno platformo (običajno spletni strežnik). CDD Vault je platforma, ki je primerna za prenos datotek iz csv oblike in ob tem omogoča še druge računske funkcije, kot so izračun pKa, selektivnosti reaktivnosti in več. Dobro programsko opremo omogočata tudi Schrödinger suite s programom Canvas in ChemAxon s programom JChem, ki med drugim vsebuje program IJC (Instant JChem), ki omogoča enostavno podporo bazam. Obstaja še več platform, kot so med drugim tudi Spectrus, Schrödinger, RDkit in MolDB. IJC omogoča izračun raznih kemijskih parametrov, kot so pKa, logP, topnost itd., izdelavo fragmentov spojin, vzpostavitev spletne platforme, enostaven prenos spojin na spletno platformo in iz nje.

Primer izračunov nekaterih parametrov spojin s podstrukturo pirimidina, s programom Instant JChem je predstavljen na sliki 18. IJC ravno tako omogoča razporeditev struktur glede na njihovo podobnost, kot so recimo funkcionalne skupine ali fragmenti posameznih molekul. [34 – 41]

(52)

24

Slika 18: Prikaz obdelanih podatkov z IJC. [34]

Platforme uporabljajo za upravljanje s svojimi podatki več sistemov, pri čemer se največkrat zasledi povezava s sistemom MySQL, ki je tudi svetovno najbolj uporabljen sistem povezav podatkov in se uporablja v večini operacijskih sistemov, kot so Windows, Linux, Android in MacOS. [36, 39, 41]

3.3. Uporaba knjižnic spojin

Iskanje vzorcev, struktur, literature in pravilno hranjenje vzorcev spojin so glavne uporabe knjižnic spojin. Čedalje pogostejši aplikaciji, uporabe virtualnih in fizičnih knjižnic spojin, sta tudi raziskovanje novih materialov in iskanje novih zdravilnih učinkovin.

(53)

25

Slika 19: Preprosta shema raziskovanja novih zdravilnih učinkovin [43]

3.3.1. Računalniška kemija

Računalniški svet je vse pomembnejši, posledično se tudi v kemiji uporablja vedno več računalniških pripomočkov. Računalniška pomoč se uporablja za razne aplikacije, kot so napovedi mehanizmov kemijskih reakcij, preverjanje lastnosti kemijskih spojin, iskanje zdravilnih učinkovin in več. Uporaba simulacij je posebej pomembna pri iskanju novih zdravilnih učinkovin, saj lahko precej zmanjša čas razvoja le-teh.

(54)

26

Slika 20: Prikaz običajnega iskanja novih zdravilnih učinkovin s pomočjo računalniških simulacij (prirejena slika) [44]

Na sliki 20 je preprosta shema iskanja novih zdravilnih učinkovin s pomočjo uporabe računalniških simulacij. Najprej izberemo potencialno tarčo, ki mora vplivati na določeni patogeni organizem. Nato izbrano tarčo predelamo v obliko, ki omogoča izvedbo virtualnega rešetanja. Vzporedno pripravimo željeno zbirko spojin, ki jih običajno prej analiziramo in neprimerne strukture izločimo, sledi izvedba virtualnega rešetanja. Z uporabo različnih cenilnih funkcij izvedemo analizo vseh spojin iz analizirane zbirke spojin. Pri spojinah, kjer dobimo najboljše rezultate virtualnega rešetanja, analiziramo stabilnost kompleksov z uporabo raznih računalniških tehnik, kot je na primer molekulska dinamika. [43, 44]

3.3.1.1. Virtualno rešetanje

Virtualno rešetanje je tehnika računalniške kemije, s katero iščemo nove biološko aktivne molekule, ki jih nato lahko uporabimo pri razvoju novih zdravilnih učinkovin. Pri virtualnem rešetanju z avtomatiziranim pristopom iščemo spojine, ki se prilegajo izbrani biološki tarči. Rezultate določimo s pomočjo različnih cenilnih funkcij. Delovanje potencialnih učinkovin v realnem okolju, preverimo s pomočjo nadaljnjih analiz kompleksov, kjer najpogosteje uporabljamo molekulsko dinamiko. [43, 44]

(55)

27

3.3.1.2. Molekulska dinamika

Molekulska dinamika je metoda računalniške simulacije za raziskovanje strukturnih in dinamičnih lastnosti v molekulskih in atomskih sistemih. Pri simulacijah molekulske dinamike je potrebno določiti začetne pogoje (hitrost in položaj delcev) raziskovanega sistema. Z uporabo integracij Newtonovih enačb gibanja, programi namenjeni molekulski dinamiki nato izračunajo trajektorije posameznih delcev v sistemu. Znani programi za izvajanje molekulske dinamike so med drugim Charrm, Namd in Yasara. Funkcije potencialne energije so osnove za simulacije molekulske dinamike. Molekulska dinamika nam poda energijsko optimiziran preiskovani kompleks. Podobni namen imajo tudi simulacije geometrijske optimizacije, kjer običajno na energijski potencialni ploskvi, z metodami geometrijske optimizacije, najdemo lokalni minimum (postopek se imenuje energijska minimizacija), medtem ko molekulska dinamika običajno najde globalni minimum na energijski potencialni ploskvi (prikaz na sliki 21).

Slika 21: Primerjava energijske minimizacije in molekulske dinamike na grafu potencialne energijske ploskve [42]

Simulacije molekulske dinamike so običajno občutno počasnejše kot simulacije geometrijske optimizacije. Posledično se simulacije molekulske dinamike uporabljajo pri podrobnejši analizi kompleksov. S simulacijami molekulske dinamike lahko napovemo optimizirano strukturo kompleksa in njegovo obnašanje pri določenih pogojih. [42, 44]

(56)

28

Računalniške simulacije nam relativno hitro podajo teoretične rezultate, ki pa so v realnih razmerah velikokrat nepravilni, saj simulacije ne morejo predvideti vseh dejavnikov, ki nastopijo pri realnih pogojih, posledično je rezultate potrebno preveriti. Preverjanje rezultatov poteka s testiranjem vzorcev iz fizičnih knjižnic spojin, s pomočjo bioloških testov. Testi za vsako spojino posebej so seveda dolgotrajni in zamudni, posledično se je razvil tako imenovani high-throughput screening (HTS), ki omogoča testiranje velike količine molekul v relativno kratkem času. [42]

3.3.2. HTS

HTS se je razvil v devetdesetih letih dvajsetega stoletja in omogoča analizo velikega števila struktur iz knjižnic spojin na potencialno biološko aktivnih tarčah, ki se uporabljajo za razvijanje raznih medicinskih učinkovin. HTS poteka s pomočjo robotskega vodenja knjižnice spojin, pri čemer je robot povezan s platformo, ki omogoča testiranje učinkovin, kot je prikazano sliki 17. Slika 17 prikazuje vodenje in testiranje knjižnice farmacevtskega podjetja Bayer. [45 – 47]

Slika 22: Prikaz uporabe knjižnice za namene HTS [46]

(57)

29

Za samo uspešno uporabo HTS je zelo pomembna organiziranost knjižnic, saj je robotsko voden proces, ki se za prepoznavo željenih spojin za testiranje osredotoča na mesta na stojalih z vialami in 2D kodo na stojalih in vilah. Ob tem morajo za uspešnost analiz biti vzorci čisti in pravilno shranjeni. HTS vodimo preko računalniških ukazov, s pomočjo katerih navedemo željene teste, ki jih nato robot izvaja. Najpogostejša uporaba HTS je testiranje izbranih spojin v knjižnici spojin, na izbrane specifične biološke tarče, s ciljem izmeriti aktivacijski signal, ali signal inhibicije, določene spojine na izbrani tarči. Analiza običajno poteka tako, da robot prepozna mesto, na katerem je skladiščena testirana spojina, odvzame željeno količino vzorca in ga premesti na položaj v nosilcu z vialami, kjer poteka test. V viali so namnožene biološke tarčne kulture (bakterijske celice, encimi, virus, itd.). Pri tem poteka še veliko vmesnih postopkov, ki so odvisni od samega postopka izvedbe biološkega testa. Pri izvedbi je potrebno pripraviti primerne pogoje (pH, prevodnost, ipd.). Trdne strukture je potrebno za analizo običajno raztopiti. Nato je potrebno dodati potrebne reagente in počakati določeno inkubacijsko dobo. Po pretečenem času inkubacijske dobe, s pomočjo elektro senzorjev in biosenzorjev analiziramo reakcijske viale z analitičnimi postopki, kot so UV/VIS, Raman, IR in fluorescenčna spektroskopija. Preverimo rezultate analize in zabeležimo morebitne učinkovine. Za zmanjšanje napak in boljšo zanesljivost rezultatov se iste analize največkrat izvedejo vsaj dvakrat. Same analize HTS lahko izvajajo tudi nekaj tisoč analiz hkrati. Z napredkom tehnologije in računalniške moči se je razvila tudi uporaba HTS, saj je zdaj možno sproti spremljati same teste na osnovi celic. Tehnologija se imenuje »High- content screnning« (HCS). [48 – 51]

3.3.3. HCS

Proces analize s pomočjo HCS je podoben procesu analize HTS. HCS ob tem omogoča sprotno spremljanje reakcij v samih celicah tarčnih snovi in s tem omogoča natančnejše informacije o poteku samega testa. Sprotne informacije zagotovimo s pomočjo analize sprotnih signalov, ki jih običajno preverjamo s pomočjo uporabe fluorescence. HCS napram HTS omogoča spremljanje testa s spreminjajočimi pogoji, ki jih lahko spreminjamo in istočasno analiziramo dogodke v reakcijski posodi. Omogoča tudi spremljanje posameznih delov reakcijske posode in podaja manj lažno pozitivnih ter manj lažno negativnih rezultatov. HTS in HCS imata čedalje večji vpliv pri raziskavah v

(58)

30

sintetični biologiji, nanotehnologiji in tudi tehnologiji raziskovanja anorganskih materialov. Primer slednjega je raziskovanje novih antiperovskitnih struktur.

Najpogostejša uporaba tako HTS, HCS in virtualnega rešetanja so raziskave iskanja novih medicinskih učinkovin. Pri tem so raziskave velikokrat osredotočene na določene skupine analiznih elementov, predvidene glede na tarče. [52, 53]

3.3.4. Skupine analiznih elementov

Spojine v knjižnicah spojin delimo na skupino majhnih molekul in skupino večjih molekul (makromolekul). Slednjih je precej manj. V skupino večjih molekul spadajo večje biološke molekule, kot so proteini, nukleinske kisline, lipidi ter RNK in DNK verige, in večje sintetične molekule. [54]

(59)

31

4. Knjižnica spojin FKKT

V letu 2018 se je začela oblikovati knjižnica spojin FKKT pod vodstvom doc. dr.

Črtomirja Podlipnika in izr. prof. dr. Uroša Grošlja. Od leta 2019 pa pri samem projektu sodelujem tudi sam. Knjižnica vsebuje molekule in nekaj reakcijskih zmesi, sintetiziranih na FKKT, in trenutno vsebuje več kot 3000 vzorcev. Strukture nekaterih vzorcev iz knjižnice spojin FKKT so bile objavljene v strokovnih člankih in jih posledično najdemo tudi v CAS virtualni knjižnici spojin SciFinder (primeri v tabeli 2).

Struktura Oznaka spojine v

knjižnici FKKT CAS registrska številka

JB-8F 1394014-81-3

JS-MZ-07 1822824-14-5

JS-A16 1431557-71-9

JS-UG-B53/F1 868852-54-4

UG-6 74253-47-7

Tabela 2: Primeri nekaj spojin iz knjižnice spojin, ki imajo CAS registrsko številko v zbirki SciFinder.

(60)

32

Razvoj in uporabnost knjižnice je precej odvisna od lastnosti samih vzorcev, pri čemer je trenutno večina vzorcev organske narave. Knjižnica spojin ima virtualno in fizično obliko.

4.1. Fizična knjižnica

Fizična knjižnica spojin FKKT se nahaja na organski katedri v lameli B drugega nadstropja stavbe Fakultete za Kemijo in Kemijsko tehnologijo, Univerze v Ljubljani.

Shranjeni so vzorci mase od nekaj mikrogramov do nekaj gramov. Nekateri vzorci so shranjeni tudi v večji količini. Za zagotavljanje obstojnosti in avtentičnosti vzorcev knjižnice spojin je potreben ustrezni prenos vzorcev, ustrezno shranjevanje le-teh in primerni pogoji hranjenja vzorcev spojin.

4.1.1. Prenos vzorcev

Vzorce, ki jih shranimo v knjižnico spojin FKKT, opredelimo kot trdne, poltrdne ali tekoče. Glede na samo opredeljenost je postopek prenosa vzorcev nekoliko drugačen.

Vzorcem najprej dodelimo oznake, pri čemer običajno ohranimo oznako, ki jo je dodelil raziskovalec, v primeru pomanjkanje le-te, mu dodelimo svojo oznako. Strukture spojin nato prerišemo v program ChemDraw, s katerim tvorimo zapis SMILES, ki ga nato uporabimo pri kreiranju virtualne knjižnice spojin. Podatke shranimo v Excel dokumentu.

Trdno spojino stehtamo, zabeležimo maso in prenesemo vzorec v kriogeno vialo. Glede na količino vzorca uporabimo 0,5 mL, 1 mL ali 2 mL velikost viale. Pri poltrdnem vzorcu si pomagamo s hlapnimi topili, v katerih raztopimo poltrdne vzorce, jih prenesemo v viale in pustimo, da topilo izhlapi. Pri poltrdnih vzorcih s tem običajno v manjši meri vzorce onesnažimo. Pri poltrdnih in pri tekočih vzorcih si pomagamo z lijaki.

(61)

33

Slika 23: Slikovni prikaz poteka prenosa spojin v knjižnico spojin (lastni vir) Postopek prenosa spojin je prikazan na sliki 23, kjer so levo zgoraj prikazane začetne spojine, katerih strukture molekul spojin najprej prerišemo v ChemDraw, vzorec spojine stehtamo in ga prenesemo v viale. Maso in oznako spojine zabeležimo na etiketah, ki jih prilepimo na viale. Etiketo nato prelepimo še z lepilnim trakom in s tem preprečimo njeno odlepitev. V Excelov dokument zabeležimo oznako, maso spojine, dodamo SMILES zapise struktur in preverimo ali so spojine literaturno poznane. Viale imajo nanešeno QR

(62)

34

kodo, ki jo odčitamo in jo zabeležimo v Excel dokument. Preko QR kode lahko nato sledimo vzorcu. Enako storimo s QR kodo na stojalih.

4.1.2. Shranjevanje vzorcev

Po prenosu vzorca moramo zagotoviti inertne pogoje okolice shranjenih vzorcev.

Postopek shranjevanja spojin je prikazan na sliki 24.

Slika 24: Slikovni prikaz poteka shranjevanja spojin v knjižnico spojin (lastni vir)