MIHA LAMPE
VPLIV BIOLOŠKEGA POSPEŠEVALCA RASTI RASTLIN NA MINERALNO PREHRANO SONČNICE
DIPLOMSKO DELO
LJUBLJANA, 2019
MIHA LAMPE
Mentor: PROF. DR. KATARINA VOGEL MIKUŠ
VPLIV BIOLOŠKEGA POSPEŠEVALCA RASTI RASTLIN NA MINERALNO PREHRANO SONČNICE
DIPLOMSKO DELO
LJUBLJANA, 2019
II Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija kemije in biologije. Opravljeno je bilo na Katedri za fiziologijo rastlin Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: izr. prof. dr. Mateja GERM
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Mentorica: prof. dr. Katarina VOGEL MIKUŠ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Član: doc. dr. Matevž LIKAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora: ________________________________________________
Podpisani izjavljam, da je diplomska naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Izjavljam, da je elektronska verzija identična tiskani. Na Univerzo v Ljubljani prenašam pravico objave svoje diplomske naloge v polnem tekstu na svetovnem spletu preko Digitalne knjižnice Pedagoške fakultete.
Miha Lampe
III POVZETEK
Sončnica spada med kmetijsko in gospodarsko zelo pomembne rastlinske vrste. Za rastline je zadostna mineralna prehranjenost pogoj za uspešno rast in razvoj. Ker se z dodajanjem gnojil lahko povečata tako uspešnost donosa kot tudi rast rastlin, je za kmetijstvo izbira pravega gnojila vitalnega pomena. Ker navadna kemijska gnojila lahko škodujejo okolju, se v zadnjem času velik poudarek daje predvsem naravnim gnojilom, ki imajo poleg mineralne komponente gnojila prisotne tudi tako imenovane biološke pospeševalce, med katerimi so najštevilčnejše mikorizne glive in PGPB (plant growth promoting bacteria), torej bakterije, ki spodbujajo rast in razvoj rastlin. PGPB imajo več mehanizmov delovanja na rastlino, med katerimi so: biološka fiksacija dušika, proizvodnja indolskih spojin, proizvodnja sideroforov, aktivnost ACC deaminaze in raztapljanje fosfatov. Večina PGPB se nahaja v rizosferi, tanki plasti zemlje, ki neposredno obdaja koreninski sistem rastlin. V diplomskem delu smo preučevali vpliv bioloških pospeševalcev na rast in mineralno prehranjenost sončnic (Helianthus annuus L.) s pomočjo zasnovanega eksperimenta.
Eksperiment smo zasnovali tako, da smo posadili sončnice s tremi različnimi izpostavitvami. Prva serija je bila kontrola in ta skupina sončnic ni prejela gnojila. Drugi seriji vzorcev smo dodali avtoklavirano organsko gnojilo, pri čemer smo z avtoklaviranjem odstranili vse, kar je v gnojilu predstavljalo živo komponento. Tretja serija vzorcev je dobila nespremenjeno organsko gnojilo. Po enem mesecu rasti smo vzorce stehtali in jih analizirali z metodo rentgensko fluorescenčne spektrometrije. Poleg tega smo na poganjkih določili tudi vsebnost fotosinteznih pigmentov kot merilo stresa. Hipotezo, da bodo sončnice z dodanim gnojilom, ki ima biološke pospeševalce, bolj rasle in bodo imele primernejšo vsebnost mineralnih snovi kot sončnice z dodanim gnojilom brez bioloških pospeševalcev, smo po statistični obdelavi vzorcev ovrgli. Vzorci posameznih izpostavitev so se med seboj razlikovali le po vsebnosti treh elementov. V poganjkih sta se razlikovali koncentracija fosforja in kalija, v koreninah pa bakra. V eksperimentu nismo potrdili pozitivnega vpliva biološkega pospeševalca, ki smo ga v eksperimentu uporabili.
KLJUČNE BESEDE:
biološki pospeševalci, sončnica, PGPB (bakterije, ki spodbujajo rast rastlin), biognojilo, mineralna prehrana rastlin
IV ABSTRACT
The sunflower is one of the most economically important plant species. Sufficient mineral nutrition is a prerequisite for successful plant growth and development. Since the addition of fertilizers can increase both yield performance and plant growth, choosing the right fertilizer is vital for agriculture success. Since ordinary chemical fertilizers can be damaging to the environment, a great deal of emphasis has recently been placed on natural biofertilizers, which, in addition to the mineral component of the fertilizer, contain the so- called biological promotors, the most numerous being mycorrhizal fungi and PGPB (Plant growth promoting bacteria), which promote plant growth and development. PGPBs have several mechanisms of interaction with the plant, including: biological nitrogen fixation, production of indole compounds, and production of siderophores, ACC deaminase activity, and phosphate dissolution. Most PGPB bacteria are found in the rhizosphere, this refers to the thin layer of soil that directly surrounds the root system of the plants. In our thesis we studied the influence of these biopromotors on the mineral nutrition of sunflowers (Helianthus annuus L.) by means of a designed experiment. We designed the experiment by planting sunflowers with three different treatments. The first batch was a control and no biofertilizer was given to this group of sunflowers. An autoclaved biofertilizer was added to the second batch of samples, and the organic component of the biofertilizer was removed by autoclaving. The third batch of samples received unchanged biofertilizer.
After one month of growth, the samples were weighed and analysed by X-ray fluorescence spectrometry. In addition, the content of photosynthetic pigments was determined on shoots as an indicator of sunflower nutrition. The hypothesis that sunflowers with fertilizer with biological accelerators will grow more and have a more optimal value of mineral substances than sunflowers with fertilizer without biological accelerators has been rejected after the statistical treatment of samples. The samples were statistically different in only three items. Phosphorus and potassium concentrations differed in the shoots and copper in the roots. The positive effect of biopromotors on the biofertilizer used in the experiment has not been confirmed.
KEYWORDS:
biopromotors, sunflower, PGPB (plant growth promoting bacteria), biofertilizers, mineral nutrition
V KAZALO
POVZETEK ... III ABSTRACT ... IV KAZALO ... V KAZALO SLIK ... VI OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... VII
1 UVOD ... 5
2 PREGLED OBJAV ... 7
2.1 SONČNICA (HELIANTHUS ANNUUS L.) ... 8
2.2 BIOLOŠKA GNOJILA ... 9
2.3 MEHANIZMI DELOVANJA PGPB ... 12
2.4 BIOPOSPEŠEVALEC, UPORABLJEN V EKSPERIMENTU ... 18
3 MATERIALI IN METODE ... 19
3.1 KEMIKALIJE ... 19
3.2 LABORATORIJSKA OPREMA ... 19
4 METODE DELA ... 20
4.1 PRIPRAVA POSKUSA ... 20
4.2 ANALIZA Z METODO RENTGENTSKO FLUORESCENČNE SPEKTROMETRIJE ... 20
4.3 POSTOPEK ANALIZE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV ... 21
4.4 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV ... 22
5 REZULTATI ... 23
5.1 SVEŽA IN SUHA MASA POGANJKOV IN KORENIN ... 23
5.2 ANALIZA Z XRF – KONCENTRACIJE MINERALNIH ELEMENTOV ... 24
5.3 ANALIZA FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV ... 26
6 DISKUSIJA ... 28
7 ZAKLJUČEK ... 29
VIRI ... 30
ZAHVALA ... 32
VI KAZALO SLIK
Slika 1: Sončnica (Helianthus annuus L.) (Vir:https://www.ekodezela.si/vsebina/vrtnarstvo/soncnice-za-sreco-za-cebele/ 2019) ... 8 Slika 2: Interakcije rizosfere in PGPB (Souza s sod., 2015) ... 12 Slika 3: Sveža masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10, n(korenin)= 3. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ... 23 Slika 4: Suha masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10, n(korenin)= 3. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ... 24 Slika 5: Vsebnost kalija v poganjkih sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ... 25 Slika 6: Vsebnost fosforja v poganjkih sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ... 25 Slika 7: Vsebnost bakra v koreninah sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka), n(korenin) = 3. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ... 26 Slika 8: Koncentracija klorofila b in klorofila a+b v mg na g vzorca pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ... 27 Slika 9: Koncentracija karotenoidov v mg na g vzorca pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka), n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ... 27
VII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
XRF Rentgenska fluorescenca
PGPB Plant Growth Promoting Bacteria – bakterije, ki spodbujajo rast rastlin BNF Biological Nitrogen Fixation – biološka fiksacija dušika
EDXRF Energy Dispersive X-ray Fluorescence – energijsko disperzivna rentgenska fluorescenca
FS Fotosintezni
5 1 UVOD
Poljedelstvo se je pojavilo pred približno 10.000 leti in je pomenilo velik korak v človekovem razvoju. Odkritje je omogočilo, da se je človek za stalno naselil na določenem območju. Osvajal je vedno nove površine, na katerih je gojil svoje rastline. S poljedelstvom se je zmanjšala človekova odvisnost od narave. Človek je začel naravo spreminjati po svojih željah in potrebah [1]. Ker ima poljedelstvo za celotno človeštvo zelo velik pomen, so se načini obdelovanja zemlje in poljščin skozi čas spreminjali. S časom so se v poljedelstvu pojavila gnojila. S pomočjo gnojil so lahko kmetje povečali svoj pridelek, imeli bolj uspešne rastline in boljšo obdelovalno zemljo. Znanost agronomije je odgovarjala na vprašanja, katera gnojila so najoptimalnejša in zagotavljajo najboljše razmere za rast in produktivnost rastlin. Torej, gnojila so naravna ali umetna snov, ki vsebuje kemične elemente, ki izboljšujejo rast in produktivnost rastlin. Gnojila povečujejo naravno plodnost zemlje ali nadomeščajo kemične elemente, ki so jih prejšnji posevki odvzeli iz tal. Uporaba gnoja in kompostov za gnojilo je verjetno stara skoraj toliko kot poljedelstvo samo. Sodobna kemična gnojila vključujejo enega ali več od treh elementov, ki so najpomembnejši v prehrani rastlin: dušik, fosfor in kalij. Drugotnega pomena so elementi žveplo, magnezij in kalcij. Večina dušikovih gnojil se pridobiva iz sintetičnega amonijaka; ta kemična spojina (NH3) se uporablja bodisi kot plin ali v vodni raztopini, lahko pa se jo pretvori v soli, kot so amonijev sulfat, amonijev nitrat in amonijev fosfat.
Pogosti viri so tudi običajni odpadki iz pakiranja, obdelani odpadki, odpadne vode in hlevski gnoj. Fosforna gnojila vključujejo kalcijev fosfat, pridobljen iz fosfatnih kamnin.
Bolj topni superfosfatni in trojni superfosfatni pripravki so pridobljeni z obdelavo kalcijevega fosfata z žveplovo oziroma fosforno kislino. Kalijeva gnojila, in sicer kalijev klorid in kalijev sulfat, se pridobivajo z rudarjenjem pepelike (kalijev karbonat). Mešana gnojila lahko vsebujejo več kot eno od treh glavnih hranilnih snovi: dušik, fosfor in kalij [2].
Rastlinska hranila delimo na: primarna hranila ali makrohranila: dušik (N), fosfor (P) in kalij (K); sekundarna hranila ali druga hranila, med katere sodijo: kalcij (Ca), magnezij (Mg), natrij (Na) in žveplo (S); ter mikrohranila: bor (B), kobalt (Co), baker (Cu), železo (Fe), mangan (Mn), molibden (Mo) in cink (Zn), pomembna za rast rastlin v količinah, ki
6 so majhne v primerjavi s količinami primarnih in sekundarnih hranil. Nadalje se gnojila ločijo na: mineralna gnojila, ki vsebujejo izključno mineralne komponente in so pridobljena v industrijskem postopku, ter organsko-mineralna gnojila, ki poleg mineralnih komponent vsebujejo tudi organske snovi živalskega ali rastlinskega izvora in so pridobljena z ekstrakcijo ali s fizikalnimi oz. kemijskimi industrijskimi postopki. Analize gnojil izvajamo z namenom ugotavljati skladnost vsebnosti primarnih in sekundarnih hranil ter mikrohranil z deklariranimi vsebnostmi. Določamo tudi nekatere fizikalne lastnosti gnojil in vsebnost neželenih snovi, kot so težke kovine [3].
Zaradi negativnih vplivov mineralnih gnojil v okolju (izpiranje v podtalnico, onesnaževanje in evtrofikacija vodotokov itd.) je vedno večji poudarek na uporabi bioloških gnojil (tudi biognojila), ki vsebujejo žive mikroorganizme. S tem, ko ga dodamo na semena, rastlinske dele ali zemljo, mikroorganizmi kolonizirajo rizosfero ali notranjost rastline in spodbujajo rast s povečanjem razpoložljivosti in zaloge primarnih hranil za rastlino, ki jim je izpostavljena. Biološka gnojila bi lahko pomembno vplivala na zmanjševanje uporabe umetnih gnojil in pesticidov [4].
Cilji:
• Ugotoviti, ali in v kolikšni meri izbrano biognojilo vpliva na rast in prevzem za rastlino potrebnih mineralnih snovi.
• S pomočjo eksperimenta ugotoviti, ali biognojilo vpliva na rast rastlin tudi, ko ga avtoklaviramo in gnojilo ne vsebuje bioloških pospeševalcev.
• S pomočjo analize fotosinteznih pigmentov ugotoviti, ali biognojilo izboljša fiziološko stanje rastline.
Hipoteze:
1. Rastline z dodanim gnojilom, ki vsebuje biološke pospeševalce, bodo bolje rasle in bodo imele primernejšo vsebnost mineralnih snovi kot sončnice z dodanim gnojilom brez bioloških pospeševalcev.
2. Rastline z dodanim gnojilom z biološkim pospeševalcem bodo imele višjo vsebnost klorofilov in karotenoidov kot tiste brez bioloških pospeševalcev.
3. Ker dodano gnojilo vsebuje fosfat, kalcijev oksid in železo, bomo pri analizi z XRF opazili povišane vrednosti elementov P, Ca in Fe pri rastlinah z dodanim gnojilom.
7 2 PREGLED OBJAV
Rastline za rast potrebujejo največ ogljika (C), kisika (O) in vodika (H). Iz teh elementov je sestavljenih od 90 do 99 % rastlinskega telesa, preostali del rastline pa sestavlja mineralna komponenta. Minerale (hranila) rastlina pridobi iz tal. Rastline potrebujejo razmeroma veliko dušika (N), fosforja (P), kalija (K), kalcija (Ca), magnezija (Mg) in žvepla (S), pravimo jim tudi makrohranila. Ker jih navadno v tleh ni dovolj, zanje običajno poskrbimo z gnojenjem preko tal. N, P in K so glavna rastlinska hranila v ožjem smislu oz.
t. i. primarna hranila, Ca, Mg in S pa so sekundarna hranila. Mikrohranila (mikroelementi) so tista rastlinska hranila, ki jih rastline potrebujejo le v sledovih, torej v manjših količinah (bor, mangan, baker, cink, molibden, železo). Rastlinam jih največkrat dodamo preko listov v obliki listnih gnojil (t. i. foliarno gnojenje). Ne glede na to, ali rastline navedena hranila potrebujejo v velikih ali majhnih količinah, so vsa nujno potrebna za rast in razvoj rastline, drugega z drugim pa ne moremo nadomestiti. Tudi če je le enega hranila premalo, rastlina ne more uspevati, tako kot poškodovan sod ne more zadržati vode (Liebigov zakon minimuma) (Polanec, 2014).
Hranila so snovi, s katerimi se rastline hranijo, gnojila pa so snovi, katerih glavni namen je zagotavljanje hranil za rastline. Posamezna gnojila vsebujejo več ali manj hranil.
Najpomembnejše rastlinsko hranilo je dušik, ker je nepogrešljiv v obdobju intenzivne rasti – pospešuje rast zelenih delov rastlin (tvorba beljakovin). Rastlina ga iz tal dobiva v obliki nitratov, porabi pa lahko tudi dušik v amonijevi obliki. V prehrani rastlin z dušikom so pomembne nitrifikacijske bakterije. Te oksidirajo amonijevo obliko dušika (NH4) v nitritno (NO2), to pa v nitratno (NO3), ki je rastlinam dostopna. V kmetijstvu so pomembne še denitrifikacijske bakterije. Te v nasprotju z nitrifikacijskimi bakterijami razkrajajo nitrite in nitrate v prosti dušik, ki se sprošča v zrak (Polanec, 2014).
Mikoriza je vzajemna simbiontska zveza, ki temelji na dvosmernem prenosu hranil med glivami v tleh in koreninami vaskularnih rastlin. Rastlina oskrbuje glivo s sladkorji, ki jih proizvaja v procesu fotosinteze, medtem ko mreža hif izboljša sposobnost rastline za absorbiranje vode in hranil, predvsem prevzem fosforja, bakra in cinka. Arbuskularne mikorize (AM), imenovane tudi endomikorize, so najbolj starodavne, pogoste in razširjene vrste mikoriz (Roy-Bolduc in Hijri, 2010).
8 Razpoložljivost mineralnih hranil je odvisna od kemičnih dejavnikov, kot so skupna količina, kemijska oblika elementa in vezava mineralnega hranila na druge ione ali na tla, kot tudi fizikalnih dejavnikov, predvsem razporeditve v tleh in mobilnosti. Med dobro mobilne elemente štejemo dušik, fosfor, kalij, magnezij in klor; njihovo pomanjkanje se najprej opazi na starejših listih. Med srednje mobilne elemente štejemo bor, železo, cink, baker in molibden, med slabo mobilne pa kalcij in mangan. Simptomi pomanjkanja se najprej pojavijo na mlajših delih rastlin (Polanec, 2014).
2.1 SONČNICA (HELIANTHUS ANNUUS L.)
Slika 1: Sončnica (Helianthus annuus L.) (Vir:https://www.ekodezela.si/vsebina/vrtnarstvo/soncnice-za-sreco-za- cebele/ 2019)
Sončnico (Helianthus annuus L.) uvrščamo v družino košaric (Asteraceae, sin.
Compositae). Sončnica izvira iz južnega dela Severne Amerike, v Evropi so jo najprej uporabljali kot okrasno rastlino. Sončnica ima namreč veliko sort, večina je okrasnih. V rodu Helianthus je veliko vrst, najpomembnejši poleg sončnic je topinambur (Helianthus tuberosus L.). V sredini 19. stoletja so iz sončnice v Rusiji začeli iztiskati olje in tako je sončnica postala tudi gospodarsko pomembna. Seme sončnice vsebuje od 25 do 53 % kakovostnega olja. Pri nas se je v manjšem obsegu začela sejati konec 19. stoletja, predvsem so jih sejali na robovih njiv za okras. Največ površin pod sončnicami je bilo po
9 drugi svetovni vojni (okrog 1000 ha). V zadnjih letih se površine pod sončnicami gibljejo med 200 in 300 ha. V letu 2015 je bilo v Sloveniji s sončnicami posejanih 230 ha njiv [4].
Poleg uporabe v živilsko predelovalni industriji za prehrano ljudi (olje, margarina, majoneza, celo zrnje) sončnice lahko uporabljamo tudi kot krmno poljščino. Rastline siliramo v času cvetenja, lahko pa siliramo samo zrna v pozni mlečni zrelosti. Za krmo jo sejemo tudi v mešanih posevkih (npr. s krmnim grahom, bobom ali grašico). Kot beljakovinska krma so pomembne sončnične tropine, ki ostanejo po stiskanju zrnja za olje.
Zrnje sončnic je uporabno še kot hrana za ptice. Sončnice lahko uporabljamo tudi kot kurivo (stebla in koški sončnic), so pa tudi zelo priljubljene okrasne rastline. Sončnica je medovita rastlina. Njeni veliki zlato do rdečerumeni cvetovi so izredno privlačni za čebele in predstavljajo pomemben vir čebelje paše. Sončnični med zdravi in preprečuje bolezni dihal, vnetje želodčne in črevesne sluznice, srčne in ledvične bolezni ter uravnava krvni tlak. Cenjen je tudi v kozmetiki. Čebele, čmrlji in ose so glavni opraševalci sončnice [5].
2.2 BIOLOŠKA GNOJILA
Biološko gnojilo (tudi biognojilo) je gnojilo, ki poleg mineralnih hranil vsebuje tudi žive mikroorganizme. S tem, ko ga dodamo na semena, rastlinske dele ali zemljo, mikroorganizmi kolonizirajo rizosfero ali notranjost rastline in spodbujajo rast s povečanjem razpoložljivosti in zalogo primarnih hranil za rastlino, ki jim je izpostavljena.
Mikroorganizmi v bioloških gnojilih obnavljajo naravni ciklus hranil v tleh in ustvarjajo organske snovi. Z uporabo bioloških gnojil se obenem povečata obstojnost in zdravje tal.
Ker igrajo več vlog, je najprimernejši znanstveni izraz za take koristne mikroorganizme oz.
bakterije »plant growth promoting bacteria« (PGPB). Ti spodbujajo rast in razvoj rastlin s sintezo snovi, potrebnih za rastline, zato so izjemno koristni pri bogatenju in izboljšanju rodovitnosti tal, kakor tudi pri doprinosu rastlini potrebnih hranil. Biognojila zagotavljajo ekološko prijazen agrarni poseg [4].
Povpraševanje po kemičnih gnojilih v kmetijstvu je zgodovinsko vplivalo na več med seboj povezanih dejavnikov, kot so rast prebivalstva po vsem svetu, gospodarska rast,
10 agrarna produkcija, … (Morel s sod., 2012 v Souza s sod., 2015). Zanimanje za uporabo inokulantov, ki vsebujejo PGPB (Plant growth promoting bacteria), ki spodbujajo rast in pridelek rastlin, se je povečalo zaradi dušikovih gnojil, ki postajajo draga in lahko resno škodujejo okolju z onesnaženjem vode z nitrati in tudi pripomorejo k emisijam toplogrednih plinov (Adesemoye s sod. 2009; Hungria s sod., 2013 v Souza s sod., 2015).
Povezave med rastlinami in mikroorganizmi so že dolgo raziskane, vendar je njihovo izkoriščanje v kmetijstvu za delno nadomestitev ali nadomestitev dušikovih gnojil v celoti še vedno nizko (Hungria s sod., 2013 v Souza s sod., 2015). Če so bakterijski inokulanti učinkoviti, lahko prispevajo k povečanju agronomske učinkovitosti z zmanjšanjem proizvodnih stroškov in onesnaževanja okolja, kadar se uporaba kemičnih gnojil enkrat zmanjša ali odstrani (Souza s sod., 2015).
Rizosfera se nanaša na tanko plast zemlje, ki neposredno obdaja koreninski sistem (Zeppenfeld s sod. 2017 v Priyank s sod., 2019). Rizosferna regija je pomembna za heterogene, raznolike in aktivno presnavljajoče organizme v tleh, kot so bakterije, ki živijo v rizosferi, glive, foliarne in rastlinojede žuželke in gliste. Na splošno si biodiverziteta in biološke dejavnosti rizosferskih organizmov v rizosferskem okolju niso med seboj podobne. Kompleksnejše biološke aktivnosti se naravno odvijajo približno 2 mm od površine korenin in se bistveno razlikujejo kot tiste v prsti, v populacijah, vrstah in funkcijah organizmov, zato je znano, da je rizosfera »hot spot« bioloških dejavnosti (Mendes s sod. 2013 v Priyank Hanuman s sod., 2019). Korenine rastlin imajo ključno vlogo v raznolikosti rizosfer in njihovih bioloških aktivnostih z zagotavljanjem mehanske podpore ter lajšanjem prevzema vode in hranil. Poleg tega korenine rastlin sproščajo široko paleto spojin, kot so aminokisline, organske kisline, oligosaharidi, sladkorji, vitamini, nukleotidi, flavonoidi, encimi, hormoni, hlapne spojine, fenoli, sluzi, ogljikovi hidrati in različni sekundarni metaboliti, ki povečujejo biološke aktivnosti v rizosferni regiji (Rohrbacher in St-Arnaud, 2016 v Priyank s sod., 2019). Ta mikroflora je pomemben vir hrane za rastlinojede živali, kot so gliste, skakači in pršice, ki postanejo žrtev drugih malih živali, kot so pajki in stonoge. Saprofiti, ki se nahajajo v rizosferni regiji, razkrajajo odmrle snovi in razgrajujejo kompleksne molekule v preproste. V procesu razgradnje se sproščajo
11 hranilne snovi in odpadki, ki jih neposredno uporabljajo gostiteljske rastline (Priyank s sod., 2019).
Učinkovitost kolonizacije korenin s PGPB je tesno povezana z mikrobno kompeticijo in preživetjem v tleh, pa tudi z modulacijo izražanja več genov in medcelično komunikacijo- via quorum sensing (Souza s sod., 2015). Korenine rastlin se odzivajo na različne okoljske razmere z izločanjem spojin širokega nabora, te spojine vplivajo na interakcijo med rastlino in bakterijo, kar kaže na učinkovitost inokulantov (Souzas sod., 2015). Tudi zdravje tal je pomemben dejavnik, ki vpliva na učinkovitost inokulacije. Značilnosti, kot so vrsta tal, nabor hranil in koncentracije strupenih kovin, vlažnost tal, mikrobna raznolikost in motnje tal, ki jih povzroča upravljanje s tlemi, so vsi dejavniki, ki vplivajo na učinkovitost inokulacije (Souza s sod., 2015).
Mehanizmi, s katerimi stimulira PGPB rast rastlin in dovaja razpoložljivost hranil, izvirajo iz genetskih procesov, kot so biološka fiksacija dušika, raztapljanje fosfatov, lajšanje stresa s pomočjo modulacije ekspresije ACC deaminaze, produkcijo fitohormonov in sideroforov kot tudi še nekatere druge. Interakcije med rastlinami in bakterijami se pojavijo s simbiotičnimi, endofitičnimi ali asociativnimi procesi z različnimi stopnjami oddaljenosti od korenin in okoliške prsti. Endofitične PGPB so dobre kandidatke za inokulacijo, ker kolonizirajo korenine in ustvarjajo ugodno okolje za razvoj in delovanje. Nesimbiotski endofitični odnosi se pojavljajo znotraj medceličnih prostorov rastlinskih tkiv, kjer tkiva vsebujejo veliko ogljikovih hidratov, aminokislin in anorganskih hranil (Bacon in Hinton, 2006 v Souza s sod., 2015).
12
Slika 2: Interakcije rizosfere in PGPB (Souza s sod., 2015)
Interakcije rizosfere in PGPB (Souza s sod., 2015)
a) Različne vrste povezav med koreninami rastlin in koristnimi bakterijami v tleh.
b) Po kolonizaciji ali povezanosti s koreninami in/ali rizosfero lahko bakterije koristijo rastlinam s/z:
• toleranco proti abiotskemu stresu z delovanjem ACC deaminaze;
• obrambo proti patogenom zaradi prisotnosti kompetitivnih lastnosti, kot je proizvodnja sideroforov;
• povečanjem rodnosti in rasti rastlin s pomočjo biološke fiksacije dušika (BNF), proizvodnjo IAA (indol-3-ocetne kisline) in raztapljanja fosfatov okoli korenin.
2.3 MEHANIZMI DELOVANJA PGPB Biološka fiksacija dušika
Vsi organizmi potrebujejo dušik (N) za sintezo biomolekul, kot so proteini in nukleinske kisline. Vendar pa glavni vir N v naravi, atmosferski dušik (N2), ni dostopen večini živih organizmov, tudi evkariontom. Biološko fiksiranje dušika (BNF) je proces, pri katerem se N2 reducira v amonijak (NH3) (Souza s sod., 2015). Proces se odvija predvsem v diazotrofnih mikroorganizmih, zlasti bakterijah in Arhejah (Dixon in Kahn, 2004 v Souza s sod., 2015). Diazotrofni mikroorganizmi izvajajo BNF skozi nitrogenaze, visoko konzerviran encim, ki obsega dva metaloproteina, in sicer FeMo-protein in Fe-protein
13 (Dixon in Kahn, 2004 v Souza s sod., 2015). Družina Fabaceae ima prisotne talne bakterije iz družine Rhizobiaceae (rhizobia), ki so omejene na korenske nodule (Willems, 2007 v Souza s sod., 2015). Znotraj teh nodulov rizobia učinkovito izvajajo BNF skozi ustrezni nadzor prisotnosti kisika, ki je inhibitor aktivnosti nitrogenaz. (Dixon in Kahn, 2004;
Shridhar, 2012 v Souza s sod., 2015).
Več vrst mikroorganizmov se uporablja v gojenju rastlin gospodarskih interesov. Na primer za proizvodnjo soje (Glycine max L.) (Souza s sod., 2015) in sladkornega trsa (Saccharum officinarum L.) (Thaweenut s sod., 2011 v Souza s sod., 2015) se uporablja več različnih sevov bakterije Bradyrhizobium sp., kot sta B. japonicum in B. elkanii.
Herbaspirillum sp. je gram-negativna bakterija, povezana s pomembnimi kmetijskimi pridelki, kot so riž (Oryza sativa L.) (Pedrosa s sod., 2011 v Souza s sod., 2015), sirek (Sorghum bicolor L.) (James s sod., 1997 v Souza s sod., 2015), koruza (Zea mays L.) (Monteiro s sod., 2008 v Souza s sod., 2015) in sladkorni trs (Pedrosa s sod., 2011 v Souza s sod., 2015).
Proizvodnja indolskih spojin
Vpliv bakterij v rizosferi rastlin je v veliki meri posledica proizvodnje avksinov (Spaepen s sod., 2007 v Souza s sod., 2015). Več vrst bakterij lahko proizvede indolske spojine (IC), kot je avksinski fitohormon indol-3-ocetna kislina (IAA), ki predstavlja veliko fiziološko pomembnost za interakcije med rastlinami in bakterijami od patogeneze do fitostimulacije (Spaepen s sod., 2007 v Souza s sod., 2015). Sposobnost proizvodnje IC je pogosta pri bakterijah, ki so z rastlinami povezane. Souza s sod. (2013) so pokazali, da približno 80 % bakterij, izoliranih iz rizosfere, za pridelavo riža lahko izloča IC. Druge študije so pokazale, da rizosferne bakterije proizvajajo več IC kot bakterije, ki se nahajajo v prsti poleg rastline (Khalid s sod., 2004 v Souza s sod., 2015). V nedavni študiji Costa s sod.
(2014) so pokazali, da je bil učinek visoke proizvodnje IC opazen tudi v endofitnih bakterijah, posebno v družini Enterobacteriaceae (Enterobacter, Escherichia, Grimontella, Klebsiella, Pantoea in Rahnella). Na primer: fižol (Phaseolus vulgaris L.; kultivar DOR364), cepljenje z A. brasilense Sp245 in Rhizobium etli CNPAF512 je pokazalo, da je pri rastlini zrastlo večje število nodulov. Azospirillum sp., ki producira IAA, prav tako
14 spodbuja spremembe v rasti in razvoju pšenice (Triticum aestivum L.) (Souza s sod., 2015). Prav tako lahko mikroorganizmi, ki katabolizirajo IAA, pozitivno vplivajo tudi na rast rastlin in preprečujejo napade patogenov (Leveau in Lindow, 2005 v Souza s sod., 2015).
Proizvodnja sideroforov
Železo (Fe) je nujno potrebno mikrohranilo za rastline in mikroorganizme, saj sodeluje pri različnih pomembnih bioloških procesih, kot so fotosinteza, dihanje, biosinteza klorofila (Kobayashi in Nishizawa, 2012 v Souza s sod., 2015) in BNF (Dixon in Kahn, 2004 v Souza s sod., 2015). Rastline v glavnem pridobivajo Fe iz rizosfere. Čeprav je Fe ena najpogostejših kovin v zemeljski skorji, je njegova razpoložljivost za korenine rastlin zelo majhna. Razpoložljivost Fe narekujeta obnovitveni potencial tal in pH. V tleh, ki so aerobna ali z višjim pH, Fe hitro oksidira in je večinoma v obliki netopnih železovih oksidov. Z nižjim pH se iz železovega oksida sprosti oksid, in s tem postane bolj na voljo za vnos preko korenin. Odzivi na pomanjkanje Fe vključujejo spremembe koreninske morfologije in up-reguliranje genov, vključenih v vnos Fe (Morrissey in Guerinot 2009).
Mehanizem vnosa železa, ki ga povzroči stres ob pomanjkanju le-tega, vključuje sproščanje vodikovih ionov in reducentov iz korenin. Znižani pH in prisotnost reducenta v koreninski coni skupaj z reduciranjem Fe3+ v Fe2+ na površini korenin omogočajo, da se Fe2+ prevzame predvsem skozi mlade lateralne korenine. Koreninsko absorbiran Fe2+ se oksidira do Fe3+ na stičišču protoksilema in metaksilema, kelira se s citratom, nato pa se po metaksilemu prenese v rastlinski vrh (Brown 1978).
V anaerobnih in kislih tleh, kot so poplavljena tla, nastanejo visoke koncentracije železovega (Fe2+) iona, ki nastane z redukcijo iz železovega (Fe3+) iona, to lahko povzroči strupenost zaradi prekomernega privzema železa (Stein s sod., 2009 v Souza s sod., 2015).
V aerobnih pogojih je topnost železa nizka, kar odraža prevlada Fe3+ ionov, ki so običajno vezani kot oksidihidroksidni polimeri, s čimer se omeji vnos železa za različne oblike življenja. To je zlasti značilno za apnenčasta tla (Andrews s sod., 2003; Lemanceau s sod., 2009 v Souza s sod., 2015). Mikroorganizmi so razvili aktivne strategije za absorpcijo Fe.
Bakterije lahko premagajo omejitve okolja pri vnosu Fe z uporabo kelatorjev, ki se imenujejo siderofori. Siderofori so opredeljeni kot molekule z nizko molekulsko maso (<
15 1000 Da) z visoko specifičnostjo in afiniteto za keliranje ali vezavo Fe3+, ki mu sledita transport in odlaganje Fe v bakterijske celice (Neilands, 1995; Krewulak in Vogel, 2008 v Souza s sod., 2015). Izločanje sideroforov spodbudi rast rastlin, s čimer se izboljša prehranjenost (neposredni učinek) ali zaviranje fitopatogenov (posredni učinek) z vplivom na Fe iz okolja. Za razliko od mikrobnih patogenov na rastline ne vpliva bakterijsko izčrpavanje železovih ionov, pri nekaterih rastline celo ujamejo in uporabijo bakterijski Fe3+ – sideroforne komplekse (Dimkpa s sod., 2009 v Souza s sod., 2015).
Aktivnost ACC deaminaze
Etilen je endogeno proizveden plinski fitohormon, ki sodeluje v nizkih koncentracijah pri regulaciji vseh procesov rasti, razvoja in staranja (Shaharoona s sod., 2006; Saleem s sod., 2007 v Souza s sod., 2015). Etilen je bil prav tako opredeljen kot fitohormon stresa. Pod abiotičnimi in biotičnimi stresi (poškodbe patogenov, poplave, suše, soli, organska in anorganska onesnaževala) se proizvodnja endogenega etilena bistveno pospeši, kar negativno vpliva na rast korenin in posledično rastline kot celote.
Preučenih je bilo več mehanizmov zmanjšanja ravni etilena v rastlinah. Eden od mehanizmov vključuje aktivnost bakterijskega encima 1-aminociklopropan-1-karboksilat (ACC) deaminazo (Souza s sod., 2015). ACC deaminaza ureja produkcijo etilena z metaboliziranjem ACC (neposredni prekurzor biosinteze etilena v višjih rastlinah) v 2- oksibutanojsko kislino ('Ketobutyric acid)'' in amonijak (Souza s sod., 2015). Znatna količina rastlinskega ACC se lahko izloči iz korenin rastlin, količino, ki jo lahko pozneje prevzamejo mikroorganizmi v tleh, pa hidrolizira encim ACC deaminaza, kar posledično zmanjšuje količino ACC v okolju. Skupnosti mikroorganizmov v tleh s prisotno aktivnostjo ACC deaminaze imajo lahko boljšo rast kot drugi prosti mikroorganizmi, saj ti organizmi uporabljajo ACC kot vir dušika (Glick, 2005). Onofre-Lemus s sod. (2009) (v Souza s sod., 2015) so opazili, da je aktivnost ACC deaminaze razširjena značilnost vrst rodu Burkholderia. Ti avtorji so identificirali 18 vrst tega roda, ki kažejo dejavnost; med temi bakterijami B. unamae lahko endofitično naseli paradižnik (Solanum lycopersicum L.). Poleg tega so rastline paradižnika, ki so jih inokulirali z B. unamae sevom divjega tipa, imele boljšo rast kot tiste, ki so jih inokulirali z mutiranim sevom brez aktivnosti ACC deaminaze (Onofre-Lemus s sod., 2009). Alcaligenes sp., Bacillus sp. in Ochrobactrum sp.
16 vplivajo na toleranco soli in posledično izboljšujejo rast riža v slanih pogojih. Arshad s sod. (2008) so pokazali podobne rezultate, da sev Pseudomonas spp. z aktivnostjo ACC deaminaze delno odpravi učinek stresa zaradi suše na rast graha (Pisum sativum L.) (Souza s sod., 2015).
Raztapljanje fosfatov
Fosfor (P) je bistveno hranilo za rastline, saj kot strukturna komponenta sodeluje pri nukleinskih kislinah, fosfolipidih in adenozin trifosfatu (ATP) kot ključni element metabolnih in biokemičnih poti, pomemben zlasti za BNF in fotosintezo (Khan s sod., 2009; Richardson in Simpson, 2011 v Souza s sod., 2015). Rastline absorbirajo fosfor v dveh topnih oblikah: H2PO4- in HPO42-(Glass, 1989 v Souza s sod., 2015). Vendar pa je velik delež P v netopnih oblikah in zato ni na voljo za prehrano rastlin. Nizke vrednosti P odražajo visoko reaktivnost fosforja z drugimi topnimi komponentami (Khan s sod., 2009 v Souza s sod., 2015), kot sta aluminij v kislih tleh (pH < 5) in kalcij v bazičnih tleh (pH >
7) (Holford, 1997; McLaughlin s sod., 2011 v Souza s sod., 2015). Organske (vključene v biomaso ali organske snovi v tleh) in anorganske spojine, predvsem v obliki netopnih mineralnih kompleksov, so največje zaloge razpoložljivega P v tleh (Rodríguez s sod., 2006; Richardson in Simpson, 2011 v Souza s sod., 2015). Zato je razpoložljivost P odvisna od topnosti tega elementa, na katerega bi lahko vplivali z delovanjem rastlinskih korenin in mikroorganizmov v tleh. Bakterije in glive, ki raztapljajo fosfate, tvorijo približno, v tem vrstnem redu, 1–50 % oz. 0,1–0,5 % celotne populacije mikroorganizmov v tleh, ki jih lahko gojimo (Chabot s sod., 1993; Khan s sod., 2009 v Souza s sod., 2015).
Bakterije, ki raztapljajo fosfate, raztopijo anorganske zemeljske fosfate, kot so Ca3(PO4)2, FePO4 in AlPO4, skozi produkcijo organskih kislin, sideroforov in hidroksilnih ionov (Souza s sod., 2015). Nekatere bakterije raztapljajo samo kalcijev fosfat, medtem ko so drugi mikroorganizmi sposobni raztapljanja tudi drugih oblik anorganskih fosfatov z različno intenziteto. Predvsem proizvodnja organskih kislin glukonskih in karboksilnih je eden od dobro preučenih mehanizmov, ki ga mikroorganizmi uporabijo za raztapljanje anorganskih fosfatov (Rodriguez in Fraga, 1999). Ambrosini s sod. (2012) (v Souza s sod., 2015) so dokazali, da so sevi Burkholderia, povezani z raztapljanjem Ca3(PO4)2,
17 prevladovali pri sončnicah. Chen s sod. (2006) so že prej poročali o več sevih bakterij, ki topijo fosfate in spadajo v rodove Bacillus, Rhodococcus, Arthrobacter, Serratia, Chryseobacterium, Gordonia, Phyllobacterium in Delftia (Souza s sod., 2015).
Qin s sod. (2011) so predlagali, da je sposobnost rizobija za raztapljanje anorganskega fosfata povezana z zakisanjem rizosfere. Še več, inokulacija z rizobijem izboljša pridobivanje P pri soji, zlasti, kjer je bil Ca3(PO4)2 primarni vir fosforja (Souza s sod., 2015).
Poleg bakterij simbiotske glive prav tako pomembno vplivajo na rast in razvoj rastlin.
Glive pospešujejo razkroj organskih spojin v prsti v spojine, sprejemljive za višje rastline.
Glive rastlinam dovajajo fosfor in dušik ter nekatere vitamine, v sušnem obdobju pa tudi vodo. Iz rastlin glive črpajo organske spojine, predvsem sladkorje, ki jih potrebujejo za svoj razvoj. Mikoriza je nujna za pravilen razvoj številnih vrst rastlin. V naravi je mikoriza zelo razširjena, saj ima mikorizno simbiozo kar 83 % dvokaličnic, 79 % enokaličnic in vse golosemenke [7].
Mikorizna simbioza pomembno prispeva k prehrani rastlin, zlasti pri prevzemu fosforja.
Prvič zaradi svoje zelo velike površine hife gliv zelo učinkovito prevzemajo hranila. Glive tvorijo izven koreninski micelij, ki je v tleh zelo obsežen in poveča območje absorpcije korenin. Drugič, fosfor je zelo nepremičen element, ker ga delci zemlje zlahka absorbirajo, okoli rastlinskih korenin pa hitro nastane območje brez fosfatov. Zelo obsežne hife segajo preko tega izčrpanega območja in absorbirajo biološko razpoložljiv fosfat, ki sicer ne bi bil dostopen rastlini. Tudi fosfatni ioni v tleh se hitro vežejo s kationi in tvorijo netopne komplekse, ki niso na voljo rastlinam. Znano je, da prisotnost mikoriznih gliv v tleh izboljša topnost fosfatov. Ali glive same sproščajo encime, ki razbijajo netopne fosfatne komplekse, se še vedno razpravlja. Kljub temu je zagotovo to, da glive medsebojno vzajemno delujejo z mikroorganizmi rizosfere in izboljšujejo vzpostavitev bakterij, od katerih mnoge izločajo encime, ki topijo fosfate. Te interakcije imajo pozitivne sinergijske učinke, ki se pokažejo kot povečana prehranjenost, rast in preživetje rastlin. Zgoraj opisani procesi mobilizacije hranil so še posebej pomembni pri prehrani rastlin in razlagajo, zakaj ne mikorizne rastline potrebujejo višjo raven rodovitnosti tal za vzdrževanje svojega zdravja. Za obvladovanje gliv AM (Arbuskularna mikoriza) pri posevkih sta dva glavna
18 pristopa: nanos inokuluma izbranih sevov AM gliv ali upoštevanje prakse za povečanje širjenja in kolonizacije avtohtonih gliv (Roy-Bolduc in Hijri, 2010).
2.4 BIOPOSPEŠEVALEC, UPORABLJEN V EKSPERIMENTU
Za namen eksperimenta smo uporabili biognojilo oz. biopospeševalec (proizvajalec želi ostati anonimen).
Biognojilo vsebuje:
• organski dušik (N) 3 %
• skupno fosfatnega pentaoksida (P2O5) 9 %
• kalcijev oksid (CaO) skupno 8 %
• magnezijev oksid (MgO) skupno 2 %
• železo (Fe) 2 %
• organski ogljik (C) biološkega porekla 16 % Dovoljeno v biološkem kmetovanju:
• Mineralno gnojilo: naraven razrahljan fosfat z vsebnostjo kadmija manj ali enako 90 mg/kg P2O5, naravni dolomit, železova sol (sulfat).
• Organska komponenta gnojila: posušen gnoj in posušeni iztrebki perutnineiz industrijskih farm, surov rastlinski material.
19 3 MATERIALI IN METODE
3.1 KEMIKALIJE
• biopospeševalec
• semena sončnic
• prst (Cvetal: univerzalni substrat)
• 80 % aceton (CH3(CO)CH3)
• tekoči dušik (N2) (za liofilizacijo)
• destilirana voda
3.2 LABORATORIJSKA OPREMA Drobni inventar
• mikrocentrifugirke (1,5 mL in 2 mL iz polipropilena), Ratiolab GMBH, Nemčija
• laboratorijska steklovina
Aparature
• EDXRF PDZ-02T (last Inštituta Jožefa Štefana)
• sterilizator lab. 446 PR
• Shimadzu UV spectrophotometer: UV 1800
20 4 METODE DELA
4.1 PRIPRAVA POSKUSA
V deset lončkov smo posadili po 3–5 semen sončnice. V prvo serijo vzorcev, ki smo jih poimenovali A, smo posadili 3–5 semen sončnice, vendar gnojila v to serijo nismo dodali (kontrola). V serijo, ki smo jo poimenovali B, smo prav tako dodali v deset lončkov po 3–5 semen, ki smo jim dodali avtoklavirano gnojilo. Gnojilo v seriji B smo avtoklavirali zato, da smo se znebili kakršnekoli biološke aktivnosti, ki bi vplivala na rast sončnic, saj smo z eksperimentom poskušali ugotoviti le faktor, ki ga imajo na rast sončnic dodani biološki pospeševalci. Torej, v tretjo serijo C smo dodali normalno neavtoklavirano gnojilo iz embalaže. Vsi vzorci (B in C) so dobili po 1 gram gnojila/lonček v luknjo, narejeno s prstom, v katero smo potem dodali semena. Pomembno je, da je imelo gnojilo stik z semeni, saj so tako lahko mikroorganizmi v gnojilu lažje razvili povezavo z razvijajočimi se kalicami. Vsi vzorci so tudi prejeli enako prst.
Lončke smo položili v pladnje, pladnje pa smo odnesli v rastne komore, kjer smo rastline gojili pod enakimi pogoji; 16/8 urni dan/noč, 23C, 80 % relativna zračna vlaga. Rast vzorcev je trajala od 2. 11. do 21. 12. 2019, torej vsega skupaj 49 dni. V tretjem tednu (21 dan) smo število rastlin omejili na dve na lonček.
Po koncu rasti sončnic smo rastline ločili od prsti in razdelili vzorce na poganjke (P) in korenine (K), ki smo jih dodatno oprali. Vzorce smo sveže stehtali (sveža masa vzorcev), zavili v alufolijo in zamrznili v tekočem dušiku ter shranili v zamrzovalniku do nadaljnjih analiz.
Vzorce smo nato liofilizirali, določili suho maso in uprašili v terilnici.
4.2 ANALIZA Z METODO RENTGENTSKO FLUORESCENČNE SPEKTROMETRIJE
XRF (rentgenska fluorescenca) je nedestruktivna analitska tehnika, ki se uporablja za določanje elementne sestave materialov. XRF analizatorji določajo kemijo vzorca z merjenjem fluorescenčnega (ali sekundarnega) rentgenskega spektra, ki ga vzorec oddaja, ko ga vzbudi primarni vir rentgenskih žarkov. Vsak od elementov v vzorcu proizvaja niz značilnih fluorescentnih rentgenskih žarkov (»prstni odtis«), ki je edinstven za ta specifični
21 element, zato je XRF spektroskopija odlična tehnika za kvalitativno in kvantitativno analizo sestave materiala [6].
Pri naši analizi vzorcev z EDXRF smo analizirali elemente: fosfor (P), žveplo (S), kalij (K), kalcij (Ca), mangan (Mn), železo (Fe), nikelj (Ni), baker (Cu), cink (Zn).
Postopek priprave tabletk in meritve XRF
Uprašene korenine in poganjke smo shranili v epice ter jih označili. Analizo mineralov v vzorcih se je merilo s pomočjo prenosnega rentgenskega fluorescenčnega spektrometra v laboratoriju za Rentgensko fluorescenčno spektrometrijo na Katedri za botaniko in fiziologijo rastlin Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Iz posušenih in zmletih vzorcev smo s pomočjo hidravlične stiskalnice stisnili tabletke tako, da so imele približno enako maso. Tabletke smo stehtali in določili površinsko gostoto. Podatke smo uporabili pri nadaljnjih izračunih koncentracij elementov v vzorcu s programsko opremo QAES (Nečemer s sod., 2008).
4.3 POSTOPEK ANALIZE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV
Metoda analize FS je rahlo spremenjena, vendar v celoti temelji na metodi avtorice Monni (2001).
30 mg uprašenih vzorcev poganjkov smo natehtali v čiste centrifugirke. V centrifugirke smo nalili 5 ml 80 % acetona, označili vzorce s flomastrom, pokrili z gumijastimi pokrovčki in jih dobro zvorteksirali ter označili višino acetona. Centrifugirke smo čez noč pustili v hladilniku, nato pa smo vanje dolil 80 % aceton do oznake, torej, kar ga je izhlapelo. Vzorce smo še enkrat zvorteksirali in docentrifugirali 2 minuti na 2500 obratov /min. Spektrofotometer smo umerili z 80 % acetonom in pomerili absorpcijo vzorcev pri valovnih dolžinah 647 nm, 664 nm in 470 nm. Za izračun koncentracije pigmentov v vzorcih smo uporabili izračun, povzet po Lichtenthaler in Buschmann (2001) (Kržič M.
2015).
Enačbe:
Klorofil a (Chla) (µmol/l) = 12,25 × A664 – 2,79 × A647
Klorofil b (Chlb) (µmol/l) = 21,50 × A647 – 5,10 × A664
22 Klorofil a+b (µmol/l) = 7,15 × A664 + 18,71 × A647
Ʃ karotenoidov = (1000 × A470 – 1,82 × Chla – 85,02 Chlb) ÷ 198 X (mg/g) = (konc. Chl(mg/l) × Vekstrakta (l)) ÷ mvzorca (g)
A664 = absorpcija ekstrakta pri valovni dolžini 664 nm A647 = absorpcija ekstrakta pri valovni dolžini 647 nm A470 = absorpcija ekstrakta pri valovni dolžini 470 nm.
4.4 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV
Podatke smo analizirali s standardnimi statističnimi metodami. Pri analizi smo si pomagali z MS Excel 2013 in programskim kompletom Statistica (Statsoft 7.0.61.0 EN). Statistično značilne razlike smo izračunali s pomočjo programa enosmerna ANOVA, Duncanov test (p < 0,05).
23 5 REZULTATI
5.1 SVEŽA IN SUHA MASA POGANJKOV IN KORENIN
Vpliv biološkega pospeševalca na sončnico smo preverili tudi z določanjem sveže in suhe mase korenin in poganjkov. V splošnem je bila sveža masa korenin manjša od sveže mase poganjkov (Slika 3).
Sveže mase poganjkov in korenin med seboj niso statistično značilno različne (Slika 3) .
Slika 3: Sveža masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10, n(korenin)= 3. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p
< 0,05).
24
Slika 4: Suha masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov)
= 10, n(korenin)= 3. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).
Suha masa poganjkov je bila večja od suhe mase korenin. Suhe mase poganjkov in korenin med seboj niso statistično značilno različne (Slika 4) .
5.2 ANALIZA Z XRF – KONCENTRACIJE MINERALNIH ELEMENTOV Po analizi z XRF in statistični obdelavi podatkov smo ugotovili, da se med posameznimi obravnavami statistično značilno razlikujejo le koncentracije fosforja (P) in kalija (K) v poganjkih (Slika 5 in 6) in bakra v koreninah (Slika 7).
25
Slika 5: Vsebnost kalija v poganjkih sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).
Slika 6: Vsebnost fosforja v poganjkih sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).
26
Slika 7: Vsebnost bakra v koreninah sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka), n(korenin) = 3.
Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).
5.3 ANALIZA FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV
Po statistični analizi vsebnosti fotosinteznih pigmentov vzorcev poganjkov smo ugotovili, da se serije med seboj statistično razlikujejo v vsebnosti klorofila b (Slika 8) in vsebnosti karotenoidov (Slika 9). Prav tako se serije med seboj statistično razlikujejo, vendar ne v toliki meri, v vsebnosti klorofila a+b (Slika 8).
27
Slika 8: Koncentracija klorofila b in klorofila a+b v mg na g vzorca pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p <
0,05).
Slika 9: Koncentracija karotenoidov v mg na g vzorca pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka), n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).
28 6 DISKUSIJA
Med različnimi avtorji obstaja različno mnenje o vplivu biognojil na rast in uspešnost rastlin, ki so jih avtorji preučevali. »Uporaba biognojila, ki vsebuje koristne mikrobe, je pokazala spodbuden učinek na rast koruze (Z. mays) in izboljšanje lastnosti tal s 87-dnevno toplogredno študijo.« »Cepljenje z rizobakterijami lahko znatno poveča mikorizno kolonizacijo korenin. Prisotnost mikoriznih gliv je imela vpliv na populacijo rizobakterij in G. intraradices je spodbudila rast vnesenih koristnih bakterij v tleh rizosfere (Wu s sod., 2005). Iz teh pridobljenih mnenj in rezultatov lahko sklepamo, da smo v našem eksperimentu uporabili biognojilo, ki ni vsebovalo specifičnih vrst rizobakteriji, saj bi se vpliv mikoriznih gliv na rastlino pokazal v večji meri, če bi jih gnojilo vsebovalo.
Rast riža (Oryza sativa L.) je bila boljša na hlevskem gnoju kot v serijah NPK gnojil in zelenega gnoja, tem primeru zeleni gnoj pomeni zmlete odpadle veje in listje rastlin.
Očitno je sočasna inokulacija z dvema biognojiloma (''Biopower'' in ''EM'') izboljšala rast korenin in poganjkov na tleh, pognojenih z gnojem. Ta študija zaključuje, da sta dve gnojili očitno povečali biomaso poganjkov in donos zrnja na tleh, pognojenih z zelenim gnojem (Javaid, 2011). Za izboljšanje naših rezultatov eksperimenta bi lahko preučevali tudi vpliv našega biopromotorja v različnih vrstah substrata, torej, kako na razvoj PGPB vpliva prst, v kateri se rastlina nahaja.
Ko smo SS (sewage sludges) uporabili neposredno na tleh, analizirana koncentracija makro- in mikronutrientov tako v tleh kot v listih ni pokazala bistvenih razlik med rastnimi dobami. Pomembni učinki so bili opaženi, ko je bil SS uporabljen kot foliarno gnojilo (Tejada s sod., 2016). Iz tega lahko sklepamo, da bi v našem eksperimentu dobili drugačne rezultate, če bi v eksperimentu uporabili gnojilo v foliarni obliki.
Uporaba rizobakterijskih inokulantov kot biognojil in biokontrolerjev je sestavni del prakse trajnostnega kmetijstva (Babalola, 2010 v Aloo s sod., 2018) in je bila predmet preiskav že dolgo (Stamenković s sod., 2018 v Aloo s sod., 2018). Z naraščajočim poudarkom na trajnostnem kmetijstvu, varstvu okolja in zanesljivi preskrbi s hrano, je izkoriščanje koristne mikrobiote tal neizogibno (Ilangumaranand Smith, 2017 v Aloo s sod., 2018).
Rizobakterije Bacilli ne predstavljajo le okolju prijazne, temveč tudi učinkovito tehnologijo (Shafi s sod., 2017 v Aloo s sod., 2018), PGPB vplivajo prek različnih mehanizmov, vključno z biološko zaščito rastlin, proizvodnjo hormonov in solubilizacijo
29 hranil. Sestava, komercializacija in uporaba rizobakterij v kmetijstvu v resnici ne odraža obsega raziskav, ki so bila storjena z njimi in njihovimi različnimi sposobnostmi in edinstvenimi lastnosti. Potrebnih je več preiskav v zvezi z njihovimi načini delovanja, praktičnimi formulacijami, uporabo, prav tako je treba preveriti stabilnost pogojev na polju in preverjanje učinkovitosti sevov (Aloo s sod., 2018). V našem eksperimentu bi morali zagotovo določiti seve kultur prisotnih mikroorganizmov v biognojilu, in na podlagi izsledkov inokulacije z temi sevi pridobiti realno sliko vplivov specifičnih sevov na rast sončnice. Prav tako je treba omeniti, da bi lahko pri eksperimentu dobili drugačne rezultate, če bi rast vzorcev trajala dalj časa. Na rezultate korenin je vplivalo tudi dejstvo, da je bilo število vzorcev korenin v vsaki seriji le tri.
7 ZAKLJUČEK
• Našo prvo hipotezo lahko po analizi rezultatov z XRF ovržemo. Prav tako bi se bolj uspešna rast lahko pokazala pri sami teži vzorcev oz. razliki med suho in svežo maso vzorcev, vendar se serije vzorcev med seboj statistično ne razlikujejo.
• Drugo hipoteza smo ovrgli. Biognojilo je negativno delovalo na vsebnost klorofila b, a+b in karotenoidov.
• Tretja hipoteza je prav tako ovržena.
• Uporabljen biološki pospeševalec rasti ni pomembno vplival na mineralno prehranjenost sončnic.
• Biološka komponenta gnojila, ki smo jo preučevali s tem eksperimentom, se ni pokazala, to lahko sklepamo iz rezultatov vzorcev med avtoklaviranim gnojilom (B) in neavtoklaviranim gnojilom (C).
• Točno podani sevi v gnojilu niso napisani, kar pomeni, da je gnojilo lahko vsebovalo vrste bakterij, ki škodujejo sončnicam.
• Sklepamo lahko, da je v primeru sončnic biognojilo premalo specifično za našo vrsto rastline (sončnico). Gnojilo bi lahko izboljšali z inokulacijo vrste rastline s točno določenim in specifičnim sevom, ki dokazano izboljša rast in razvoj vrste, kar bi zagotovo prineslo boljše rezultate.
30 VIRI
[1] Kmetijstvo (2019). Pridobljeno s: https://sl.wikipedia.org/wiki/Kmetijstvo [Datum dostopa: 10. 5. 2019]
[2] Fertilizer (2019). Pridobljeno s: https://www.britannica.com/topic/fertilizer [Datum dostopa: 23. 5. 2019]
[3] Gnojila (2019). Pridobljeno s: https://www.kis.si/Gnojila/ [Datum dostopa: 10. 5.
2019]
[4] Biofertilizer (2019). Pridobljeno s: https://en.wikipedia.org/wiki/Biofertilizer [Datum dostopa: 10. 5. 2019]
[5] Sončnica (2017). Pridobljeno s:
https://lj.kgzs.si/Portals/1/2017%20%20novice/TN%20soncnica%2010%2004%2017.p df [Datum dostopa: 10. 5. 2019]
[6] X-ray-diffraction (2019). Pridobljeno s: https://www.bruker.com/products/x-ray- diffraction-and-elemental-analysis/x-ray-fluorescence/what-is-xrf.html [Datum dostopa: 12. 5. 2019]
[7] Mikoriza (2019). Pridobljeno s: https://sl.wikipedia.org/wiki/Mikoriza
Alooa B.N., Makumbab B.A., Mbega E.R. (2018): The potential of Bacilli rhizobacteria for sustainable crop production and environmental sustainability.
Microbiological Research, 219 26–39. Arusha, Eldoret.
Azizi M., Mahmoudabadi E., (2013): Effect of Biological Plant Growth Promoters on Yield and Yield Components of Sesame, Agriculture Science Developments, 84–86.
Brown J. C. (1978): Mechanism of iron uptake by plants. Plant, Cell &
Environment, Volume 1, Pridobljeno s: https://doi.org/10.1111/j.1365- 3040.1978.tb02037.x
Javaid A. (2011): Effects of biofertilizers combined with different soil amendments on potted rice plants. Chilean journal of agricultural research 71(1):157–163.
Likar M., (2012): Navodila za laboratorijske vaje pri predmetih fiziologija rastlin in fitofiziologija. Biotehniška fakulteta.
Lichenthaler H.K., Buschmann C., (2001): Extraction of photosynthetic tissues:
chlorophylls and carotenoids. Current protocols in food analytical chemistry. John Wiley, New York.
31 Morrissey, J., Guerinot M. L. (2009). Iron uptake and transport in plants: the good, the bad, and the ionome. Chemical reviews, 109(10), 4553–4567. doi:10.1021/cr900112r Nečemer M., Kump P., Ščančar J., Jaćimović R., Simčič J., Pelicon P., … Vogel- Mikuš K., (2008): Application of X-ray fluorescence analytical techniques in phytoremediation and plant biology studies. Spectrochim. Acta Part B At. Spectrosc.
63, 1240–1247. https://doi.org/10.1016/j.sab.2008.07.006.
Priyank H. M., Karthik C., Kadirvelu K., Divya K.L., … Shanmuganathan R. (2019):
Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR): A potential alternative tool for
nematodes bio-control. Sciencedirect, Volume 17, strani 119–128. Pridobljeno s strani:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1878818118306546#!
Polanec A. R., Košuta M., Jug T. (2014): Osnove prehrane rastlin in gnojenja. KGZS – Kmetijsko gozdarski zavod Nova Gorica. Nova Gorica.
Roy-Bolduc A., Hijri M. (2010): The Use of Mycorrhizae to Enhance Phosphorus Uptake: A Way Out The Phosphorus Crisis. Journal of Biofertilizers & Biopesticides, Montreal. doi: 10.4172/2155-6202.1000104
Rouessac F., Rouessac A., (2000): Chemical Analysis - Modern Instrumental Methods, Wiley, Chichester.
Souza R., Ambrosini A., Passaglia L. M. P., (2015): Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils, Genetics and Molecular Biology, 401–419.
Tejadaa M, Rodríguez-Morgado B., Gómez I., Franco-Andreua L., Benítezc C., Parrado J. (2016): Use of biofertilizers obtained from sewage sludges on maize yield.
European Journal of Agronomy 78 (2016) 13–19. Sevilla.
Whiteside M. D., Werner G.D.A., Caldas V. E. A., Shimizu T. S., West S. A., Kiers E.
T., (2019): Mycorrhizal Fungi Respond to Resource Inequalityby Moving Phosphorus from Rich to Poor Patchesacross Networks. Current biology 29, strani 2043–2050.
Pridobljeno s strani: https://doi.org/10.1016/j.cub.2019.04.061
Wu, S. C., Cao, Z. H., Li, Z. G., Cheung, K. C., Wong, M. H. (2005): Effects of biofertilizer containing N-fixer, P and K solubilizers and AM fungi on maize growth: a greenhouse trial. Geoderma, 125(1–2), 155–166. doi:10.1016/j.geoderma.2004.07.003
32 ZAHVALA
Zahvaljujem se moji mentorici prof. dr. Katarini Vogel Mikuš za mentorstvo, dostopnost, vodenje in prijaznost.
Za pomoč pri delu se zahvaljujem zaposlenim v laboratoriju, še posebno Mileni Kubelj.
Zahvaljujem se tudi svoji družini in sestri, saj so me na poti študija spodbujali in mi pomagali. Hvala tudi Ajdi, Anželjcu in Davidu za neomajno podporo.
