UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
MAGISTRSKO DELO
Tina Šilc
Ljubljana, 2022
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE
BIOKEMIJA
Optimizacija izolacije zunajceličnih veziklov iz plazme in cerebrospinalne tekočine
MAGISTRSKO DELO
Tina Šilc
MENTORICA: izr. prof. dr. Alja Videtič Paska
Ljubljana, 2022
IZJAVA O AVTORSTVU
magistrskega dela
Spodaj podpisana Tina Šilc sem avtorica magistrskega dela z naslovom: Optimizacija izolacije zunajceličnih veziklov iz plazme in cerebrospinalne tekočine.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom izr. prof.
dr. Alje Videtič Paska;
• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;
• je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.
V Ljubljani, 5. 1. 2022 Podpis avtorice:
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Biokemija.
Delo je bilo opravljeno na Medicinskem centru za molekularno biologijo, Inštitutu za biokemijo in molekularno genetiko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, pod skrbništvom izr. prof. dr. Alje Videtič Paska.
Senat UL FKKT je za mentorico imenoval izr. prof. dr. Aljo Videtič Paska.
Recenzenti: izr. prof. dr. Marko Novinec, doc. dr. Marina Klemenčič
Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela
Predsednica komisije: doc. dr. Marina Klemenčič, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Članica: izr. prof. dr. Alja Videtič Paska, Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta
Član: izr. prof. dr. Marko Novinec, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Najlepše se zahvaljujem svoji mentorici izr. prof. dr. Alji Videtič Paska za strokovno pomoč ter vso prijaznost, odzivnost in usmeritev v času nastajanja magistrskega dela.
Zahvaljujem se tudi sodelavcem na Inštitutu za biokemijo in molekularno genetiko, ki so kakorkoli pripomogli k magistrskemu delu.
Za strokoven pregled magistrskega dela se zahvaljujem doc. dr. Marini Klemenčič in izr.
prof. dr. Marku Novincu.
Na koncu bi se rada še posebej zahvalila svoji družini in vsem najbližjim, ki me vedno spodbujajo in mi stojijo ob strani.
Optimizacija izolacije zunajceličnih veziklov iz plazme in cerebrospinalne tekočine
Povzetek
Zunajcelični vezikli so majhne membransko zaprte strukture, ki se sproščajo iz pravzaprav vseh celic. Vsebujejo različne vrste molekul, vključno z majhnimi RNA in so udeleženi v številne fiziološke procese, zaradi česar se vse bolj preiskuje njihova vloga potencialnih biooznačevalcev, ki bi zdravnikom lahko pripomogli pri prilagajanju strategij zdravljenja posameznih pacientov in jim pomagali prepoznati tiste, pri katerih je večja verjetnost, da se bodo odzvali na določen pristop k zdravljenju. Vendar pa standardizacija in nadaljnja karakterizacija tehnik ločevanja, ki se uporabljajo pri študijah zunajceličnih veziklov, še vedno še ni bila izvedena. S tem namenom smo testirali nekaj izmed sodobnih molekularno-bioloških metod za izolacijo zunajceličnih veziklov iz cerebrospinalne tekočine in plazme pri tem pa sledili smernicam MISEV. Kot primerna metoda za izolacijo zunajceličnih veziklov iz cerebrospinalne tekočine se je izkazalo ultracentrifugiranje, za izolacijo zunajceličnih veziklov iz plazme pa tekočinska kromatografija za hitro ločevanje beljakovin v povezavi z ultracentrifugiranjem ter ultracentrifugiranje na saharozni blazinici, vendar ne gre za najbolj optimalni metodi, zato bo potrebna še nadaljnja optimizacija.
Ključne besede: zunajcelični vezikli, plazma, cerebrospinalna tekočina, izolacija, samomor
Optimisation of extracelular vesicles isolation from plasma and cerebrospinal fluid Abstract
Extracellular vesicles are small membrane-enclosed structures that are released from practically all cells. They contain different types of molecules, including small RNAs, and are involved in many physiological processes, which has led to increasing research into their role as potential biomarkers that could help doctors tailor treatment strategies to individual patients and help them identify those who are more likely to respond to a particular treatment approach. However, standardisation and further characterisation of the separation techniques used in extracellular vesicle studies is still ongoing. To this end, we have tested some of the current molecular biological methods for the isolation of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid and plasma, following the MISEV guidelines. Fast protein liquid chromatography Ultracentrifugation was found to be a suitable method for isolation of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid, and fast protein liquid chromatography in conjunction with ultracentrifugation and sucrose gradient centrifugation were considered to be suitable methods for isolation of extracellular vesicles from plasma, but given the results, further optimisation will be needed.
Keywords: extracellular vesicles, plasma, cerebrospinal fluid, isolation, suicide
Kazalo
1. Uvod ... 1
1.1. Samomor ... 1
1.2. Epigenetika samomorilnosti... 1
1.3. Biooznačevalci ... 2
1.4. Zunajcelični vezikli ... 3
1.5. Smernice na področju izolacije ZV... 5
1.6. Izolacija in validacija zunajceličnih veziklov ... 6
1.6.1. Ultracentrifugiranje ... 7
1.6.2. Tekočinska kromatografija za hitro ločevanje beljakovin ... 8
1.6.3. Metoda sledenja nanodelcem ... 8
2. Namen dela in hipoteze ... 9
3. Materiali in metode ... 10
3.1. Preiskovanci ... 11
3.2. Izolacija zunajceličnih veziklov ... 11
3.2.1. Priprava plazme za izolacijo zunajceličnih veziklov ... 13
3.2.2. Priprava cerebrospinalne tekočine za izolacijo zunajceličnih veziklov ... 14
3.2.3. Izolacija zunajceličnih veziklov z metodo tekočinske kromatografije za hitro ločevanje beljakovin na sistemu ÄKTA pure L25 ... 15
3.3. Validacija zunajceličnih veziklov ... 17
3.3.1. Merjenje koncentracije beljakovin ... 18
3.3.2. Prenos western... 19
3.3.3. Analiza sledenja nanodelcem ... 24
3.4. Izolacija in analiza miRNA iz zunajceličnih veziklov ... 25
3.4.1. Izolacija miRNA ... 25
3.4.2. Prepis miRNA v cDNA ... 27
4. Rezultati in razprava ... 32
4.1. Izolacija z metodo tekočinske kromatografije za hitro ločevanje beljakovin na sistemu ÄKTA Pure L25 ... 32
4.2. Prenos western ... 34
4.2.1. Priprava vzorcev za prenos western ... 34
4.2.2. Rezultati prenosa western... 36
4.3. Analiza sledenja nanodelcem ... 45
4.4. qRT-PCR... 47
6. Zaključek ... 51
7. Viri in literatura... 52
Kazalo preglednic
Preglednica 1: Seznam protiteles, uporabljenih za imunodetekcijo po prenosu western.
... 19 Preglednica 2: Priprava vzorcev za nanos na gel pri prenosu western. ... 22 Preglednica 3: Okrajšave imen vzorcev glede na posamezno metodo izolacije. ... 34 Preglednica 4: Preverjanje delovanja izbranih protiteles pri prenosu western za karakterizacijo ZV. ... 35 Preglednica 5: Priprava vzorcev plazme za karakterizacijo s prenosom western ... 36 Preglednica 6: Priprava vzorcev plazme in vzorcev CSF za karakterizacijo s prenosom western ... 38 Preglednica 7: Priprava vzorcev plazme in vzorcev CSF za karakterizacijo s prenosom western ... 40 Preglednica 8: Priprava vzorcev CSF za karakterizacijo s prenosom western ... 42 Preglednica 9: Priprava vzorcev plazme in vzorcev CSF za karakterizacijo s prenosom western ... 43 Preglednica 10: Rezultati analize NTA za vzorce plazme. ... 45 Preglednica 11: Rezultati analize NTA za vzorce CSF ... 46 Preglednica 12: Povprečne vrednosti Ct za posamezne miRNA za izbrane vzorce plazme in CSF ... 47 Preglednica 13: Barvna legenda za vzorce plazme in CSF pri merjenju izražanja izbranih miRNA... 48
Kazalo slik
Slika 1: Prikaz biogeneze in vloge miRNA ... 2
Slika 2: Shematski prikaz biogeneze zunajceličnih veziklov (ZV) in komunikacija med celicami. ... 4
Slika 3: Shematski prikaz optične konfiguracije, uporabljene v metodi sledenja nanodelcem. ... 8
Slika 4: Shematski diagram postopka izolacije in validacije zunajceličnih veziklov (ZV) iz cerebrospinalne tekočine (CSF) in plazme ... 10
Slika 5: Izolacija zunajceličnih veziklov (ZV) iz plazme na saharozni blazinici. ... 13
Slika 6: Pelet pri postopku izolacije zunajceličnih veziklov (ZV) iz cerebrospinalne tekočine (CSF) z ultracentrifugiranjem (UC). ... 14
Slika 7: Lestvica BlueStar Prestained Protein Marker (NIPPON Genetics, Nemčija). . 20
Slika 8: Izolacija ZV iz nefiltrirane plazme na sistemu ÄKTA pure L25. ... 33
Slika 9: Izolacija ZV iz plazme, filtrirane preko filtra s premerom 0,22 μm, na sistemu ÄKTA pure L25... 33
Slika 10: Prikaz uspešnosti prenosa western ... 35
Slika 11: Karakterizacija ZV, izoliranih iz plazme, s prenosom western ... 36
Slika 12: Karakterizacija ZV, izoliranih iz plazme in CSF, s prenosom western ... 39
Slika 13: Karakterizacija ZV, izoliranih iz plazme in CSF, s prenosom western ... 41
Slika 14: Karakterizacija ZV, izoliranih iz CSF, s prenosom western ... 42
Slika 15: Karakterizacija ZV, izoliranih iz plazme in CSF, s prenosom western ... 44
Slika 16: Prikaz Brownovega gibanja delcev vzorca plazme in CSF zajetega z metodo sledenja nanodelcem (NTA). ... 46
Slika 17: Krivulja pomnoževanja RT- in NTC pri merjenju izražanja miR-103a-3p. ... 48
Slika 18: Krivulja pomnoževanja RT- in NTC pri merjenju izražanja miR-16-5p. ... 48
Slika 19: Krivulja pomnoževanja RT- in NTC pri merjenju izražanja miR-99a-5p. ... 48
Slika 20: Krivulja pomnoževanja RT- in NTC pri merjenju izražanja miR-21-5p. ... 48
Slika 21: Krivulja pomnoževanja vzorcev plazme pri merjenju izražanja miR-103a-3p. ... 49
Slika 22: Krivulja pomnoževanja vzorcev CSF pri merjenju izražanja miR-103a-3p. . 49
Slika 23: Krivulja pomnoževanja vzorcev plazme pri merjenju izražanja miR-16-5p. . 49
Slika 24: Krivulja pomnoževanja vzorcev CSF pri merjenju izražanja miR-16-5p. ... 49
Slika 25: Krivulja pomnoževanja vzorcev plazme pri merjenju izražanja miR-99a-5p. 50 Slika 26: Krivulja pomnoževanja vzorcev CSF pri merjenju izražanja miR-99a-5p. ... 50
Slika 27: Krivulja pomnoževanja vzorcev plazme pri merjenju izražanja miR-21-5p. . 50
Slika 28: Krivulja pomnoževanja vzorcev CSF pri merjenju izražanja miR-21-5p. ... 50
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
BSA goveji serumski albumin (angl. bovine serum albumin) CSF cerebrospinalna tekočina
DGCR8 DiGeorge kritična regija 8 DNA deoksiribonukleinska kislina DTT ditiotreitol
FPLC tekočinska kromatografija za hitro ločevanje beljakovin (angl. fast protein liquid chromatography)
HRP hrenova peroksidaza ILV intraluminalni vezikli
ISEV Mednarodno združenje za zunajcelične vezikle ISM Inštitut za sodno medicino
MCMB Medicinski center za molekularno biologijo
MISEV Minimale eksperimentalne zahteve za opredelitev zunajceličnih veziklov in njihovih funkcij
MVB multivezikularna telesa (angl. multivesicular bodies)
NTA metoda sledenja nanodelcem (angl. nanoparticle tracking analysis) NTC negativna kontrola (angl. no template control)
OŽS osrednji živčni sistem
PBS posfatni pufer (angl. phosphate buffered saline) RT- rontrola brez reverzne transkriptaze (angl. no-RT) RIPA angl. radioimmunoprecipitation assay buffer
RISC z RNA inducirani kompleks za utišanje (genov) (angl. RNA-induced silencing complex)
SDS natrijev dodecil sulfat TBS angl. tris buffered saline UC ultracentrifugiranje ZDA Združene države Amerike ZV zunajcelični vezikli
1
1. Uvod
1.1. Samomor
Samomor je razlog za smrt več kot 700.000 oseb na svetu vsako leto in četrti najpogostejši vzrok smrti med mladimi, starimi 15 do 29 let [1]. Problematika je še bolj razširjena, če upoštevamo, da lahko samomorilnost nadalje razvrstimo na več pojavnih oblik, kot so samomorilni poskus, samomorilne misli in samopoškodovalno vedenje [2]. Ocenjeno je, da je na vsak dokončan samomor 20 poskusov samomora, zaradi česar lahko pomislimo o razsežnosti posledic, ki poleg posameznika, ki se s samomorilnostjo sooča, prizadenejo tudi njegove bližnje, znance, skupnost in nenazadnje družbo tako iz psihološkega kot ekonomskega vidika [1, 2].
Sicer ima samomor zelo kompleksen in heterogen fenotip s številnimi psihološkimi, okoljskimi, nevrobiološkimi in genetskimi mehanizmi. Med najmočnejše napovedne dejavnike dokončanja samomora uvrščamo družinsko anamnezo samomora, samomorilni poskus v preteklosti in duševno motnjo [3]. Izmed oseb, ki storijo samomor, jih ima več kot 80 % diagnosticirano duševno motnjo [4, 5].
1.2. Epigenetika samomorilnosti
Okoljski dejavniki igrajo pomembno vlogo pri samomorilnosti, hkrati pa ima pomemben vpliv na samomorilnost tudi genetika, zaradi česar je vse več raziskav na področju epigenetike [6]. Mehanizmi epigenetskega uravnavanja lahko pomagajo razložiti zapleteno medsebojno vplivanje zunanjih (okoljskih) dejavnikov, kot so na primer nizek socialno-ekonomski status in življenjski stresorji, z genetsko zasnovo posameznika pri nastanku samomorilnega vedenja [7]. V zvezi s samomorom so bile najbolj raziskane tri oblike epigenetskih sprememb: metilacija DNA, delovanje nekodirajočih RNA in posttranslacijske spremembe histonov [6]. Zaradi teme magistrskega dela se bomo osredotočili na eno izmed skupin nekodirajočih RNA, to so mikro (mi) RNA.
MiRNA spadajo v skupino kratkih nekodirajočih RNA in so dolge 19–25 baz. V celičnem jedru jih najdemo v obliki primarne miRNA, ki se s pomočjo različnih beljakovinskih kompleksov pretvori v končno obliko zrelih miRNA v citosolu celice. MiRNA lahko uravnavajo izražanje več različnih genov hkrati, poleg tega pa lahko več različnih miRNA uravnava posamezen gen, zaradi česar tvorijo časovno in prostorsko nadzorovano kompleksno mrežo uravnavanja procesov v celici in pomembno vplivajo na njeno delovanje. Pri njihovem mehanizmu delovanja je pomemben beljakovinski kompleks RISC (angl. RNA-induced silencing complex), ki se preko miRNA veže na 3’- neprevedeno regijo mRNA in tako vpliva na nastanek končne beljakovine [8, 9]. Biogeza in vloga miRNA je podrobneje prikazana na sliki 1.
2
Slika 1: Prikaz biogeneze in vloge miRNA. RNA polimeraza II v jedru prepiše primarni miRNA prepis, ki ga Drosha v kompleksu z DGCR8 sprocesira v približno 70 nukleotidov dolgo prekurzorsko miRNA lasnično zanko. Eksportin 5 in Ran-GTP lasnično zanko preneseta v citoplazmo, ki jo prepozna Dicer in cepi blizu terminalne zanke, da nastane miRNA dupleks, velikosti približno 22 nukleotidov. Funkcionalna oziroma zrela miRNA veriga iz miRNA dupleksa se z večdomenskimi beljakovinami iz družine argonavtov s katalitično aktivnostjo poveže v kompleks RISC, v katerem miRNA prepozna in se veže na tarčno mRNA. Kompleks RISC preko različnih mehanizmov delovanja vpliva na nastanek končne beljakovine, najpogostejši pa je destabilizacija mRNA oziroma odstranitev 5' kape in deadenilacija poli-A repa. Prirejeno po Geaghan s sodelavci [8]. miRNA – mikro RNA, DGCR8 – DiGeorge kritična regija 8, RISC – z RNA inducirani kompleks za utišanje genov.
1.3. Biooznačevalci
V zadnjem desetletju se je povečala tudi potreba po učinkovitih biooznačevalcih, ki bi zdravnikom lahko pomagali pri prilagajanju strategij zdravljenja posameznih pacientov.
V psihiatriji je potreba po vzpostavitvi specifičnih in občutljivih molekularno-bioloških testih še posebej velika, saj se psihiatri zaenkrat lahko zanašajo le na subjektivno klinično oceno pacienta. Prav tako del prizadevanja temelji na dejstvu, da so duševne motnje etiološko heterogene in da zdravljenje, čeprav učinkovito, pomaga le pri delu bolnikov [10], odziv bolnikov na zdravljenje pa je težko napovedati [9, 11]. Na podlagi navedenega se veča zanimanje za odkrivanje biooznačevalcev, ki bi lahko zdravnikom pomagali prepoznati paciente, pri katerih je večja verjetnost, da se bodo odzvali na določen pristop k zdravljenju, prav tako pa bi lahko nudili višjo stopnjo objektivnosti pri izboru ustrezne oblike terapije [11].
3
Iskanje biooznačevalcev je večinoma usmerjeno na periferne molekularne označevalce, saj so ti lažje dosegljivi v primerjavi z označevalci, ki se nahajajo znotraj osrednjega živčnega sistema (OŽS). Omejitev teh študij pa je povezava sprememb v perifernem tkivu s tistimi, ki se dejansko pojavljajo v OŽS. Prav tu se pojavi velik potencial raziskovanja zunajceličnih veziklov (ZV) [9, 11].
1.4. Zunajcelični vezikli
ZV so majhne membransko zaprte strukture, ki se sproščajo iz pravzaprav vseh celic [12].
Zaradi njihove majhnosti in heterogenosti je odkrivanje in razvrščanje ZV zahtevno [13, 14]. Odkar se je področje ZV razširilo, so bile opisane različne vrste veziklov, ki se razlikujejo po svojih lastnostih in biogenezi: apoptotična telesa (velikosti 500-2000 nm), mikrovezikli (velikosti med 50 in 1000 nm) in eksosomi (velikosti med 40 in 200 nm) [15].
Apoptotska telesa so ZV, ki se sproščajo iz membran apoptotskih celic, mikrovezikli se odcepijo neposredno iz plazemske membrane, eksosomi, ki so najmanjši razred zunajceličnih veziklov, pa se tvorijo znotrajcelično kot intraluminalni vezikli (ILV), ki jih vsebujejo sekretorna multivezikularna telesa (angl. multivesicular bodies, MVB) [11, 16]. MVB se nato lahko združijo z lizosomom, pri čemer pride do razgradnje njihove vsebine, ali pa se zlijejo s plazemsko membrano in svojo vsebino tj. eksosome sprostijo v zunajcelični prostor, kar je prikazano na sliki 2 [11, 17].
ZV vsebujejo in prenašajo različne vrste molekul, vključno z lipidi, genomsko DNA, majhnimi RNA (sporočilna (m) RNA, miRNA in druge nekodirajoče RNA) in različnimi beljakovinami, zaradi česar so vključeni v številne fiziološke procese in (patološke) signalne poti, kjer igrajo vlogo medceličnih prenašalcev [18]. Poleg tega so ZV, v primerjavi s plazmo, slino ali drugimi biološkimi tekočinami, zelo obogateni z miRNA.
Večina miRNA, ki jih je mogoče pridobiti iz seruma ali sline, je v eksosomih, nekatere miRNA pa se zdijo odvisne od eksosomov, saj jih kot proste molekule v bioloških tekočinah ni mogoče odkriti [19, 11]. Čeprav se nekatere RNA v ZV lahko vgrajujejo nespecifično, je vse več dokazov o obogatitvi nekaterih vrst RNA v določenih vrstah veziklov [20, 21]. Profili miRNA v eksosomih se ne ujemajo vedno s profili matičnih celic, opažanja obogatitve miRNA v eksosomih pa dodatno nakazujejo mehanizem selektivne obogatitve miRNA [22, 23]. Kot že omenjeno pa so ZV zanimivi za raziskave tudi zato, ker se lahko izražanje miRNA v eksosomih spremeni glede na fiziološke spremembe – sem spadajo tudi bolezenska stanja [11].
4
Slika 2: Shematski prikaz biogeneze zunajceličnih veziklov (ZV) in komunikacija med celicami.
Apoptotska telesa se odcepijo od celične membrane in vsebujejo material iz celic, ki so v procesu apoptoze, ter signalizirajo makrofagom. Mikrovezikli se odcepijo od plazemske membrane in vsebujejo tovor, ki lahko olajša signalizacijo prejemnim celicam. Eksosomi so najmanjši ZV in se najprej tvorijo kot populacija heterogenih intraluminalnih veziklov v multivezikularnem telesu (MVB). MVB imajo na voljo dve poti, bodisi da se zlijejo z lizosomom bodisi s plazemsko membrano, kjer se sprostijo kot eksosomi. Eksosome lahko prevzamejo druge celice z endocitozo, mikropinocitozo ali fagocitozo, kjer lahko njihov tovor vpliva na različne celične procese, kot je na primer uravnavanje transkripcije. Slika je prirejena po Saeedi s sodelavci (11).
ZV lahko izoliramo iz različnih bioloških tekočin, vključno z urinom, slino, plazmo in cerebrospinalno tekočino (CSF) [24, 25, 26, 27]. Nedavno so raziskave pokazale, da lahko ZV prečkajo krvno-možgansko pregrado, čeprav natančne transportne poti še vedno niso dobro opisane [28]. Na podlagi tega lahko sklepamo, da lahko ZV iz OŽS opazimo v perifernih tkivih in da imajo velik potencial pri odkrivanju biooznačevalcev duševnega zdravja. V možganih so vključeni v procese kot so sinaptična plastičnost [29], odziv nevronov na stres, komunikacija med celicami in nevrogeneza [11, 30]. Medtem ko so razsikave ZV pri raku in nevrodegenerativnih boleznih že v razmahu, so raziskave o njihovi vlogi pri duševnih motnjah še vedno redke [11].
5
ZV se sproščajo iz vseh živčnih celic [31], vključno z nevroni, oligodendrociti, astrociti in mikroglijo [32]. Znotraj OŽS so ZV pomembni pri uravnavanju homeostaze, nevrogenih procesov in na splošno pri posredovanju komunikacije med celicami [33].
Fiziološke vloge ZV sicer še vedno ostajajo predmet razprave. Po eni strani je lahko izločanje ZV vloga sama po sebi, npr. izločanje eksosomov s strani retikulocitov omogoča izločanje beljakovin kot so integrini [34]. Po drugi strani pa bi lahko ZV sodelovali v medcelični komunikaciji, saj omogočajo izmenjavo beljakovin in lipidov med celicami, ki proizvajajo ZV in ciljnimi celicami [35]. Poleg tega se raziskuje tudi uporaba ZV kot nosilcev dostavnega sistema za uporabo v terapevtske namene [36].
1.5. Smernice na področju izolacije ZV
Kljub velikemu zanimanju za področje ZV pa standardizacija in nadaljnja karakterizacija tehnik ločevanja, ki se uporabljajo pri raziskavah ZV, še vedno še ni bila izvedena [37].
Napredek pri razumevanju biološke vloge ZV je bil dolgo časa omejen z različnimi metodološkimi ovirami. Neodvisno odkrivanje veziklov na različnih področjih je povzročilo zmedo v nomenklaturi, saj so bili vezikli poimenovani po svoji vlogi ali biogenezi. Prav tako bi lahko bili številni biološki učinki, ki jih v raziskavah pripisujejo ZV, tudi posledica prisotnosti sestavin, ki niso ZV. Zaradi vsega naštetega je potrebapo standardizaciji metodologije in tehnologije vse večja, saj je ravno standardizacija predpogoj za potrjevanje biooznačevalcev, povezanih z ZV [38].
Ker ni bilo jasnih meril za razlikovanje, izolacijo in identifikacijo subpopulacij veziklov celičnega izvora, so leta 2014 člani odbora Mednarodnega združenja za zunajcelične vezikle (ISEV) objavili uredniško stališče, v katerem so na podlagi lastnega strokovnega znanja in izkušenj podrobno opisali svoja priporočila o minimalnih eksperimentalnih zahtevah za opredelitev zunajceličnih veziklov in njihovih vlogah (MISEV ali MISEV2014), ki zajemajo ločevanje/izolacijo ZV, karakterizacijo in funkcionalne študije. Glavni cilj teh priporočil je bil ozavestiti raziskovalce ter urednike in recenzente revij o eksperimentalnih zahtevah in zahtevah za poročanje, značilnih za področje ZV za izboljšanje zanesljivosti in verodostojnosti poročanih ugotovitev. Prav tako je združenje ISEV uvedlo izraz ZV, ki se uporablja kot skupni izraz za celotno populacijo veziklov celičnega izvora, prisotnih v telesnih tekočinah [38, 39].
6
Leta 2018 so bila priporočila MISEV posodobljena (MISEV2018). Podani so bili tudi predlogi za beljakovinske označevalce za potrjevanje prisotnosti ZV [39]. Ker je uvrstitev ZV na določeno pot biogeneze izjemno težavna, razen če je ZV np. ujet med sproščanjem s tehnikami slikanja v živo, so avtorje pozvali, da razmislijo o uporabi operativnih izrazov za podtipe ZV, ki se nanašajo na:
a) fizikalne značilnosti ZV, razen če avtorji lahko določijo posebne označevalce subceličnega izvora, ki so zanesljivi v njihovem eksperimentalnem sistemu, kot sta velikost ("majhni ZV" (angl. small (s) EV) in "srednji/veliki ZV" (angl.
medium/large (m/l) EV), z opredeljenimi razponi, na primer < 100 nm ali < 200 nm [majhni] ali > 200 nm [veliki in/ali srednji]) ali gostota (nizka, srednja, visoka, z vsakim opredeljenim razponom);
b) biokemično sestavo (CD63+/CD81+ ZV, ZV, obarvani z aneksinom A5, ipd.); ali c) opis pogojev ali izvora celice (ZV iz podocitov, hipoksični ZV, veliki onkosomi,
apoptotična telesa) namesto izrazov, kot sta eksosom in mikrovezikel, ki sta zaradi pretekle rabe izrazov obremenjena z mnogimi, nasprotujočimi si opredelitvami in netočnimi pričakovanji o edinstveni biogenezi [39].
Skladno s smernicami smo v magistrski nalogi za karakterizacijo ZV preverjali za več kot tri pozitivne označevalce za ZV, izmed katerih je bil vsaj eden transmembranski/lipidno vezan (za potrditev prisotnosti lipidnega dvosloja v vzorcu) in vsaj eden, ki je citosolni.
Prav tako smo preverjali za vsaj eno negativno kontrolo, čemur so služili označevalci za strukture, ki niso del ZV (npr. kalneksin, ki je označevalec endoplazemskega retikuluma) [39].
1.6. Izolacija in validacija zunajceličnih veziklov
Pri sesalcih obstaja več kot 30 vrst bioloških tekočin, k temu številu pa je treba prišteti še izpirke iz številnih predelov (čeprav niso prave biološke tekočine). Vsaka biološka tekočina ima posebne biofizikalne in kemijske lastnosti, zaradi katerih se razlikuje od gojišča, pripravljenega za kulturo, kar je treba upoštevati tudi pri izolaciji ZV [39].
Učinkovitost in čistost izolacije ZV iz vzorcev bioloških tekočin nista dobro opredeljeni.
Za diagnostične aplikacije bi bila najprimernejša izolacija ZV iz krvne plazme, saj se kri najpogosteje uporablja za raziskave biooznačevalcev [37].
Na voljo je veliko število različnih protokolov izolacije ZV, pri čemer še ni jasnega soglasja glede najustreznejšega protokola. V večini primerov se način izolacije prilagaja nadaljnji analizi tovora, ki ga ZV prenašajo in bo predmet analize določene raziskave.
Kot že omenjeno, so MISEV smernice sicer že objavljene, vendar jim vse študije ne sledijo v celotnem obsegu [39].
7
Ob vse večjem zanimanju za ZV, njihovo izolacijo in analizo, je tehnična standardizacija osrednjega pomena. Izolacijo ZV lahko dosežemo z različnimi metodami, vključno z ultracentrifugiranjem (UC), filtracijo, imunoafinitetno izolacijo in mikrofluidnimi tehnikami. Ni nujno, da se te metode med seboj izključujejo, potrebne so lahko tudi kombinacije. Pri izbiri metode je treba upoštevati zahtevano stopnjo čistosti in koncentracije ZV. Običajno uporabljen protokol za izolacijo, koncentriranje in delno čiščenje ZV iz bioloških tekočin ali celičnih kultur je diferencialno centrifugiranje z ali brez filtracije velikosti [40]. Zahteve posamezne metode za odkrivanje ZV so sicer določene glede na fizikalne lastnosti ZV. Idealna metoda bi morala zaznati ZV, ki so veliki 50 nm in več [41], imeti znane meje zaznavanja za vsako merjeno lastnost [42], imeti znano prostornino vzorca, ki omogoča določitev koncentracije ZV in omogočati določanje imunofenotipa vsakega ZV. Na podlagi imunofenotipa lahko sklepamo o celičnem izvoru in vlogi. V praksi sicer večina metod ne more zaznati najmanjših ZV in ima neznano mejo zaznavnosti, zaradi česar je izmerjene koncentracije ZV težko primerjati, statistični parametri porazdelitve velikosti pa so nesmiselni [38, 43].
1.6.1. Ultracentrifugiranje
V začetnih korakih UC »nečistoče« in večje ZV, kamor spadajo na primer celice, trombociti ali velika apoptotska telesa odstranimo z enim ali več koraki centrifugiranja pri nizkih hitrostih (sile v razponu od 10.000 do 20.000 g) ali z izključitvijo velikosti (uporaba filtrov). Nato se v končnem koraku centrifugiranja pri 100.000 ali 120.000 g in času vsaj 70 min peletirajo manjši ZV. Poleg tega se lahko uporabljajo tudi gostotni gradienti saharoze, ultrafiltriranje, protokoli na osnovi tekočinske kromatografije visoke ločljivosti in imunoafinitetni zajem, ki posamično ali v kombinaciji z uporabo UC zagotovijo visoko obogatitev in čistost ZV [40, 44, 45]. Z gradienti gostote se poveča strogost ločevanja delcev z različno gostoto. Pogosto uporabljen pristop vključuje nalaganje vzorca na vrh saharoznega gradienta ali saharozne blazinice pred centrifugiranjem za nekaj ur ali preko noči [40].
S postopnim ultracentrifugiranjem ni mogoče doseči absolutnega ločevanja po velikosti, saj je sedimentacija odvisna tudi od gostote ali "tovora" delcev in razdalje, ki jo le-ti prepotujejo. Nekateri majhni ZV blizu dna epruvete se bodo pri nizkih hitrostih [46]
peletirali v pelet velikih veziklov, medtem ko se bodo lahko nekateri večji delci blizu vrha epruvete peletirali le pri hitrem vrtenju. Agregacija ZV je prav tako pogost pojav, ki ovira ločevanje posameznih veziklov po velikosti. Podobno bo pelet iz hitrega vrtenja vseboval ekstravezikularne beljakovinske komplekse/agregate, lipoproteinske delce in druge kontaminante. Pri odstranjevanju nekaterih od teh nečistoč lahko pomaga ponovno suspendiranje in centrifugiranje peleta v fosfatnem pufru, vendar pa se zaradi tega lahko zmanjša izplen ZV [35, 40]
8
1.6.2. Tekočinska kromatografija za hitro ločevanje beljakovin
Tekočinska kromatografija za hitro ločevanje beljakovin (FPLC) je kromatografska tehnika, ki omogoča ločitev posameznih komponent v vzorcu na podlagi različne porazdelitve le-teh med stacionarno fazo v kromatografski koloni in tekočo mobilno fazo.
ÄKTA FPLC je eden izmed naprednih avtomatiziranih sistemov, zasnovanih za izvedbo FPLC. V vzorčno zanko se nanese vzorec, instrument pa ga nanese na kolono, povezano z detektorjem. Na podlagi UV signala v odvisnosti od časa se izriše kromatogram s kromatografskimi oziroma elucijskimi vrhovi za posamezne ločene komponente vzorca [47].
1.6.3. Metoda sledenja nanodelcem
Metoda sledenja nanodelcem (angl. nanoparticle tracking analysis, NTA) uporablja lastnosti tako sipanja svetlobe kot Brownovega gibanja, na podlagi katerega se določi porazdelitev velikosti delcev v vzorcih v tekoči suspenziji. Deluje tako, da laserski žarek poteka skozi plosko stekleno ploščo s prizmo v komori za vzorce. Vpadni kot in lomni količnik steklene plošče sta zasnovana tako, da ko laser doseže vmesnik med steklom in plastjo tekočega vzorca nad njim, se žarek lomi, kar povzroči stisnjen žarek z zmanjšanim profilom in visoko gostoto moči. Delci v suspenziji na poti tega snopa razpršijo svetlobo na tak način, da jih je mogoče zlahka vizualizirati prek objektiva za povečavo na dolgi delovni razdalji, nameščenega na sicer običajen optični mikroskop. Na to je nameščena ustrezna kamera, ki zajame približno 30 slik na sekundo in posname video datoteko svetlobe, ki jo razpršijo delci, ki se premikajo zaradi Brownovega gibanja v vidnem polju približno 100 μm x 80 μm x 10 μm (slika 3). Poudariti je treba, da NTA sicer ne loči ZV od delcev, ki niso ZV [38, 48].
Slika 3: Shematski prikaz optične konfiguracije, uporabljene v metodi sledenja nanodelcem.
Slika je prirejena po Hole s sodelavci (47).
9
2. Namen dela in hipoteze
Namen raziskave za magistrsko nalogo je bila uvedba sodobnih molekularno-bioloških metod za izolacijo ZV iz telesnih tekočin (CSF in plazma) v laboratorij Medicinskega centra za molekularno biologijo. Raziskava je retrospektivne narave, saj smo uporabili posmrtne vzorce CSF umrlih zaradi samomora in kontrol, ki so bili zbrani že za predhodne raziskave, ki jih je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko. Poleg tega smo pridobili vzorce krvi živih posameznikov za pripravo plazme.
Metod za izolacijo ZV je več, zato smo želeli nekatere med njimi testirati in validirati za uporabo v prihodnjih študijah, pri čemer smo upoštevali smernice MISEV. Dobro optimizirane metode nam bodo omogočile učinkovito preučevanje biooznačevalcev, ki bi lahko bili uporabni v klinični praksi pri prepoznavanju in zdravljenju duševnih motenj.
Iz vzorcev CSF in plazme smo z metodami UC, UC na saharozni blazinici ter FPLC v povezavi z UC izolirali ZV. Ustreznost izolacije ZV smo preverili s pomočjo prenosa western za izbrane eksosomske in izključitvene markerje ter s tehnologijo NTA. miRNA iz ZV smo izolirali z uporabo komercialnih kompletov po postopku proizvajalca, ustreznost izolirane miRNA pa testirali z metodo qRT-PCR.
H1: Izbrane metode so primerne za pridobivanje dovolj velike količine čistih ZV za nadaljnjo uporabo (določanje biooznačevalcev, nekodirajoče RNA, beljakovine).
10
3. Materiali in metode
Eksperimentalni del je potekal na sledeč način: v prvem delu smo opravili optimizacijo izolacije ZV iz CSF in plazme. ZV smo izolirali po protokolu, ki sestoji iz več korakov centrifugiranja in UC na saharozni blazinici ali brez nje, alternativno smo izolacijo izvedli z metodo FPLCna sistemu ÄKTA pure L25. V drugem delu raziskave pa smo ustreznost izolacije ZV preverili s pomočjo prenosa western za izbrane eksosomske in izključitvene markerje ter s tehnologijo NTA. Uporabnost izoliranih veziklov za nadaljnje analize smo testirali z določanjem izražanja miRNA, pri čemer smo uporabili metodo verižne reakcije v realnem času (qRT-PCR).
Shematski diagram, ki ponazarja korake izolacije in validacije ZV, izoliranih iz CSF in plazme, je prikazan na sliki 4.
Slika 4: Shematski diagram postopka izolacije in validacije zunajceličnih veziklov (ZV) iz cerebrospinalne tekočine (CSF) in plazme. Za izolacijo ZV smo pridobili manjše število vzorcev krvi prostovoljcev in CSF umrlih zaradi samomora. ZV smo izolirali po protokolu, ki sestoji iz več korakov centrifugiranja in ultracentrifugiranja (UC) na saharozni blazinici ali brez nje, alternativno smo izvedli tudi izolacijo s tekočinsko kromatografijo za hitro ločevanje beljakovin (angl. fast protein liquid chromatography, FPLC). Pelet smo nato resuspendirali v fosfatenem pufru in z metodo BCA izmerili koncentracijo dobljenih beljakovin. Ustreznost izolacije ZV smo preverili s prenosom western (WB) ter s tehnologijo NTA (angl. nanoparticle tracking analysis).
Zatem smo izolirali miRNA in ustreznost izolirane miRNA testirali z metodo qRT-PCR.
11
3.1. Preiskovanci
V raziskavo je bilo vključenih 55 umrlih zaradi samomora in kontrolnih oseb, katerih vzorci so že bili zbrani in shranjeni na Inštitutu za biokemijo in molekularno genetiko, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani (UL MF). Vzorci pokojnikov so bili zbrani v okviru preteklih in tekočih raziskav, ki jih je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko (KME). Vsi vzorci so bili odvzeti med obdukcijo na Inštitutu za sodno medicno, UL MF. Vsi vzorci so bili označeni s šiframi, tako da je bila zagotovljena posthumna zaupnost preiskovancev in ustrezno shranjeni.
Poleg tega smo pridobili manjše število novih vzorcev krvi živih posameznikov za pripravo plazme za izolacijo ZV. Za zbiranje novih vzorcev smo pripravili »Obrazec za prostovoljno in zavestno privolitev v raziskavo po poučitvi«. Osebe, pripravljene sodelovati, smo poiskali v okviru zaposlenih na UL MF.
V del raziskave, kjer je delo potekalo na vzorcih CSF, pridobljene od pokojnikov, so bile vključene izključno osebe moškega spola, stare med 18 in 65 let, ki so umrle zaradi samomora oziroma zaradi nenadne srčne smrti. V del raziskave, kjer je delo potekalo na vzorcih plazme pa smo vključili žive osebe med 18 in 65 letom starosti, neodvisno od spola. Drugih podatkov nismo zbirali.
Magistrsko delo je bilo odobreno s strani KME, št. dovoljenja 0120-393/2020/7, dne 11.
12. 2020.
3.2. Izolacija zunajceličnih veziklov
Protokol za izolacijo ZV iz CSF in plazme se sestoji iz več korakov centrifugiranja in UC pri + 4 °C skozi 20-% saharozo ali brez nje. Začetni koraki z zaporednim centrifugiranjem pri vedno višjih hitrostih so namenjeni odstranjevanju velikih odmrlih celic in ostankov celic. V vsakem od teh korakov se pelet zavrže, supernatant pa se uporabi za naslednji korak. Končni supernatant nato ultracentrifugiramo pri hitrosti 100 000 g, da se izlirajo majhni vezikli, ki ustrezajo zunajceličnim veziklom. Pelet speremo v fosfatnem pufru, da se odstranijo ostale beljakovine, nato pa lahko odvisno od protokola, ki ga uporabljamo, še enkrat ultracentrifugiramo [35].
Prav tako smo izolacijo ZV iz plazme izvedli z metodo FPLC na sistemu ÄKTA pure L25 v kombinaciji z UC.
Vzorce smo delali v duplikatih, tako da smo pred centrifugiranjem ali izolacijo z metodo FPLC enega izmed vzorcev prefiltrirali preko filtra s premerom 0,22 μm, nameščenega na brizgo.
12
Pri izolaciji ZV iz CSF in plazme smo uporabili naslednje materiale:
fosfatni pufer (angl. phosphate buffered saline, PBS)(Sigma-Aldrich, ZDA) (1 tableta do 200 mL dH2O)
20 % saharoza (Sigma-Aldrich, ZDA) (20 g 20 % saharoze do 100 mL PBS)
protein LoBind minicentrifugirke(mikrocentrifugirke, ki preprečujejo vezavo beljakovin na njihovo površino in s tem izgubo vzorca) volumna 1,5 mL (Eppendorf, Nemčija)
EDTA minicentrifugirke volumna 1,5 mL (Eppendorf, Nemčija) centrifugirke volumna 15 mL (TPP, Švica)
nastavki za pipete s filtrom in brez filtra za različne volumne
− do 10 μL
− do 200 μL
− do 1000 μL polavtomatske pipete različnih volumnov
(Gilson, ZDA)
− 0,5-1 μL
− 2-20 μL
− 20-200 μL
− 200-1000 μL inkubator CH-100 (Biosan, Nemčija)
mikroanalitska tehtnica (Sartorius, Nemčija) tehtnica (Kern, Nemčija)
vibracijski mešalnik MS1 (Ika, Nemčija) brizga 2 mL (Chirana T. Injecta, Slovaška) injekcijska igla 0,5 x 19 (TIK, Slovenija) brezprašni robčki (Kimtech, ZDA)
Minisart filter za brizgo premera 0,22 μm (Sartorius, Nemčija) etanol (Sigma-Aldrich, ZDA)
Za centrifugiranje vzorcev smo uporabili centrifugo 5910 R (Eppendorf, Nemčija) in centrifugo 5418 R (Eppendorf, Nemčija). Za UC smo uporabili ultracentrifugo Optima MAX-XP (Beckman Coulter, ZDA). Pred UC smo težo vzorcev umerili na dve decimalki natančno. V tabeli so predstavljeni rotorji in pripadajoče centrifugrke, ki smo jih uporabili za UC.
Rotor (Beckman Coulter, ZDA)
Centrifugirke (Beckman Coulter,
ZDA)
Največji volumen centrifugirke (mL)
Število mest za centrifugirke
MLA-55 polipropilen, 11mL 13,5 8
TLA-55 polipropilen, 1,5 mL 1,5 12
MLS-50 polipropilen, 5 mL 5 4
13
3.2.1. Priprava plazme za izolacijo zunajceličnih veziklov
Postopek izolacije ZV iz plazme se začne s predpripravo odvzete krvi, ki jo hranimo v epruvetah z EDTA:
Predpriprava krvi:
1. Centrifugiramo pri 820 g, 10 min pri +4 °C, prenesemo v 15 mL centrifugirko.
2. Centrifugiramopri 2500 g, 10 min pri +4 °C, alikvotiramo 1 mL/minicentrifugirko.
3. Zamrznemo pri -80 °C.
Odtajamo preko noči na ledu pri + 4 °C.
4. Centrifugiramo pri 10.000 g, 20 min pri +4 °C.
5. (Filtriramo preko filtra s premerom 0,22 μm).
6. V centrifugirko odpipetiramo 8 mL PBS in dodamo 900 μL plazme ter premešamo.
Sledi UC na saharozni blazinici (slika 5).
7. V centrifugirke za UC odpipetiramo 2 mL 20-% saharoze.
8. Na saharozo previdno naložimo vso plazmo redčeno s PBS, tako da se plasti med seboj ne premešata.
9. Centrifugiramo pri 100.000 g, 2 h 15 min pri +4 °C (uporabimo rotor MLA-55).
10. Odstranimo supernatant.
11. Z brezprašnimi robčki obrišemo notranjost centrifugirke.
12. Pelet resuspendiramo v 50 μL PBS.
13. Zamrznemo pri -20 °C.
Slika 5: Izolacija zunajceličnih veziklov (ZV) iz plazme na saharozni blazinici.
14
3.2.2. Priprava cerebrospinalne tekočine za izolacijo zunajceličnih veziklov Postopek izolacije ZV iz CSF:
Predpriprava CSF:
1. Po odvzemu vzorce hranimo pri -80 °C v polipropilenskih centrifugirkah.
2. Centrifugiramo pri 2000 g, 10 min pri sobni temperaturi, alikvotiramo 1 mL/minicentrifugirko.
3. Zamrznemo pri -80 °C.
Odtajamo preko noči pri +4 °C.
4. Centrifugiramo pri 2000 g, 15 min pri +4 °C.
5. Centrifugiramo pri 10.000 g, 20 min pri +4 °C ali filtriramo preko filtra s premerom 0,22 μm.
Sledi UC (slika 6) ali UC na saharozni blazinici.
Postopek za UC:
6. Centrifugiramo pri 100.000 g, 100 min pri +4 °C (uporabimo rotor MLS-50).
7. Pelet resuspendiramo v 900 μL PBS.
8. Centrifugiramo pri 100.000 g, 90 min pri +4 °C (uporabimo rotor TLA-55).
9. Pelet resuspendiramo v 50 μL PBS.
10. Zamrznemo pri -80 °C.
Slika 6: Pelet pri postopku izolacije zunajceličnih veziklov (ZV) iz cerebrospinalne tekočine (CSF) z ultracentrifugiranjem (UC). Slika a.) Pelet viden po koraku 6 pri postopku za izolacije ZV iz CSF z UC. Slika b.) Pelet viden po koraku 8 pri postopku izolacije ZV iz CSF z UC.
15 Postopek za UC na saharozni blazinici:
6. V centrifugirke za UC odpipetiramo 1 mL 20-% saharoze (pri izolaciji na 30-%
saharozni blazinici odpipetiramo 1 mL 30-% saharoze).
7. Na saharozo previdno naložimo 4 mL supernatanta, tako da se plasti med seboj ne premešata.
8. Centrifugiramo pri 100.000 g, 100 min pri +4 °C (uporabimo rotor MLS-50).
9. Pelet resuspendiramo v 50 μL PBS.
10. Zamrznemo pri -80 °C .
3.2.3. Izolacija zunajceličnih veziklov z metodo tekočinske kromatografije za hitro ločevanje beljakovin na sistemu ÄKTA pure L25
Pri izolaciji ZV iz CSF in plazme z metodo FPLC na sistemu ÄKTA pure L25 smo uporabili naslednje materiale:
benzonaza (Sigma-Aldrich, ZDA) pH meter (Mettler Toledo, Švica) HEPES (Sigma-Aldrich, ZDA)
Pufri in raztopine za izolacijo, ki morajo biti prefiltrirani preko filtra s premerom 0,22 μm Durapore (Merck Millipore, ZDA) s pomočjo vakuumske črpalke (Merck Millipore, ZDA):
Mobilna faza A: 50 mM HEPES, 20 mM NaCl, pH 7,0. Dopolnimo z dH2O do 1 L.
Mobilna faza B: 50 mM HEPES, 1,0 M NaCl, pH 7,0. Dopolnimo z dH2O do 500 mL.
Raztopina za čiščenje kolon: 1,0 M NaOH (Baker B.V., Nizozemska), 2,0 M NaCl. Dopolnimo z dH2O do 250 mL.
Raztopina za regeneracijo kolon: 1,0 M amonijev acetat (Merck, Nemčija). Dopolnimo z dH2O do 250 mL.
Raztopina za nevtralizacijo in čiščenje kolon na mestu: 1,0 M ocetna kislina (Carlo Erba Reagents, Italija). Dopolnimo z ddH2O do 50 mL.
Ultra čista voda dH2O: 1 L 20-% etanol: 200 mL
16
Za ločevanje in čiščenje ZV smo uporabili napravo ÄKTA pure L25 (Cytiva, ZDA) in delali v programu Unicorn 7.
Postopek izolacije ZV iz plazme z metodo FPLC na sistemu ÄKTA pure L25:
Predpriprava krvi (kri-EDTA)
1. Centrifugiramo pri 820 g, 10 min pri +4 °C, prenesemo v 15 mL centrifugirko.
2. Centrifugiramo pri 2500 g, 10 min pri +4 °C, alikvotiramo 1 mL/minicentrifugirko.
3. Zamrznemo pri -80 °C.
Plazmo odtajamo preko noči na ledu pri +4 °C.
1. Centrifugiramo pri 10.000 g, 20 min pri +4 °C ali filtriramo preko filtra s premerom 0,22 μm.
2. Dodamo benzonazo (0,5 μL / 1 mL vzorca) in premešamo na vibracijskem mešalu.
3. Inkubiramo 1 h pri +37 °C.
Sledi čiščenje na sistemu ÄKTA pure L25.
7. Cevke razporedimo v ustrezne pufre (cevka A2 v mobilno fazo A, cevka B1 v mobilno fazo B, cevki A1 in B2 v dH2O) in izvedemo čiščenje cevk (angl. pump wash). Pretok (angl. system flow) je 0,5 mL / min.
8. Priklopimo kolono in ustavimo pretok ter zaženemo protokol za izolacijo.
9. Odpremo vhod na koloni.
10. Vstavimo cevko COL v vhod kolone in začasno ustavimo napravo.
11. Odvijemo izhod kolone in ponovno zaženemo napravo.
12. Izhod kolone privežemo na detekor U9-L.
13. V vzorčno zanko (angl. superloop) odpipetiramo 4 mL mobilne faze A in 1 mL vzorca.
14. Premešamo s pipeto in pazimo, da ne ustvarjamo mehurčkov.
15. Na drugo stran vzorčne zanke nanesemo 5 mL mobilne faze A.
16. Del vzorčne zanke, kjer je samo mobilna faza A, priklopimo na odprtino injektorja Injection Valve LoopE (praznjenje).
17. Počakamo, da se na delu vzorčne zanke, kjer je vzorec, znebimo mehurčkov, nato ustavimo napravo. Ta del priklopimo na odprtino injektorja Injection Valve LoopF (polnjenje).
18. Po priklopu počakamo, da konduktivnost pade in se bazna linija izravna, nato zaženemo napravo.
19. Frakcije zbiramo v minicentrifugirkah, ki preprečujejo vezavo beljakovin na njihovo površino in s tem izgubo vzorca.
20. Ko se UV ustali na 0 mAU oziroma ko je bazna linija ponovno ravna, prenehamo z zbiranjem frakcij (angl. stop peak fractionation).
17 21. Zamrznemo pri -20 °C.
Po končanem protokolu sledi čiščenje kolone.
22. Cevke razporedimo v ustrezne pufre (cevka A1 v ddH2O, cevka A2 v 20-%
etanol, cevka B1 v raztopino za regeneracijo kolon, cevka B2 v raztopino za čiščenje kolon) in izvedemo čiščenje cevk.
23. Lahko izberemo tudi čiščenje brez etanola, če se kolona uporablja isti ali naslednji dan.
24. Aparat na frakcionirki zbere približno 10 mL frakcijo. V tej frakciji se iz kolone eluira vse, kar je še ostalo vezanega (“nečistoče”). To frakcijo lahko nevtraliziramo z raztopino za nevtralizacijo in čiščenje kolon na mestu.
25. Odklopimo kolono v obratni smeri kot smo jo priklopili.
26. Pretok z etanolom je 0,5 mL / min.
27. Vse cevke, razen cevke A2, prestavimo v dH2O.
28. Izvedemo čiščenje cevk.
29. Izvedemo čiščenje sistema (angl. system wash) s 15 mL dH2O (cevka A1).
30. Vzorčno zanko umijemo s toplo dH2O in jo namočimo v dH2O ter damo sušit na brisačke.
Sledi UC.
31. Frakcije, kjer se je začela elucija, odpipetiramo po 1 mL v minicentrifugirke za UC.
32. Minicentrifugirke umerimo na dve decimalki natačno (dodajamo mobilno fazo A).
33. Centrifugiramo pri 100.000 g, 60 min pri +4 °C (uporabimo rotor MLA-55).
34. Pelet resuspendiramo v 50 μL PBS.
35. Zamrznemo pri -20 °C.
3.3. Validacija zunajceličnih veziklov
Ustreznost izolacije ZV smo analizirali s prenosom western za nekatere eksosomske in izključitvene markerje ter s tehnologijo NTA. Pred tem smo določili koncentracijo beljakovin v vzorcih.
18 3.3.1. Merjenje koncentracije beljakovin
Dobljeno količino beljakovin smo določili s kompletom reagentov PierceTM BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher, ZDA).
Pri merjenju koncentracije beljakovin smo uporabili naslednje materiale:
mikrotitrska plošča s 96 vdolbinami (ThermoFisher, ZDA)
komplet standardov BSA (goveji serumski albumin, angl. bovine serum albumin) (ThermoFisher, ZDA)
pufer RIPA (angl. radioimmunoprecipitation assay buffer) (ThermoFisher, ZDA) 100-x mešanica HaltTM proteaznih inhibitorjev (ThermoFisher, ZDA)
ultra čista voda dH2O PBS
komplet reagentov PierceTM BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher, ZDA) alufolija
namizni stresalni inkubator (New Brunswick Scientific, ZDA)
Za merjenje koncentracije beljakovin pri valovni dolžini 562 nm smo uporabili napravo Synergy H4 (BioTek, ZDA) in program Gen5 2.09.
Postopek merjenja koncentracije beljakovin:
Vzorce odtajamo preko noči pri +4 °C.
1. Vzorce kratko premešamo na vibracijskem mešalu in centrifugiramo.
2. Izmerimo volumen vzorca in dopolnimo s PBS do 50 μL.
3. Kratko premešamo na vibracijskem mešalu.
4. V minicentrifugirke, ki preprečujejo vezavo beljakovin na njihovo površino in s tem izgubo vzorca, odpipetiramo 30 μL vzorca.
5. Vzorcu dodamo 6 μL 5-x RIPE in premešamo s pipetiranjem.
6. Dodamo 0,36 μL 100-x mešanice HaltTM proteaznih inhibitorjev in premešamo s tipsom, nato pofrcamo in kratko premešamo na vibracijskem mešalu.
7. Vzorce inkubiramo na ledu 15 min.
8. Pripravimo raztopino A + B (50 : 1). Končni volumen gledamo glede na število vzorcev in kontrol (7 standardov, dH2O, PBS, število vzorcev. Upoštevamo tudi 10-% napako pri odmerjanju), ki ga pomnožimo z 200, ker damo v vsako vdolbinico 200 μL raztopine A + B.
9. Nanesemo vzorce in kontrole na mikrotitrsko ploščo in sicer po 10 μL / vdolbinico 10. Čez vdolbinice dodamo 200 μL raztopine A + B.
11. Ploščo ovijemo v alufolijo in pretresemo ter damo za 30 min v prej ogret inkubator na +37 °C (brez stresanja).
12. Na spektrofotometru Synergy H4 izmerimo koncentracijo pri 562 nm.
19 3.3.2. Prenos western
Ustreznost izolacije ZV smo preverili s prenosom western, pri čemer smo detektirali eksosomske in izključitvene označevalce. Gre za protitelesa, ki so s svojimi uporabljenimi redčitvami prikazana v preglednici 1. Izbrali smo jih iz različnih kategorij na podlagi MISEV smernic:
Kategorija 1: transmembranski/lipidno vezani proteini (povezava s plazemsko membrano in/ali endosomi);
Kategorija 2: citosolni proteini v ZV;
Kategorija 3: druge strukture, ki niso povezane z ZV (negativna kontrola);
Kategorija 4: transmembranski/lipidno vezani proteini (povezava z drugimi znotrajceličnimi predelki, ki niso plazemska membrana in/ali endosomi).
Kategorija 4 služi za opredelitev podtipov ZV [39].
Preglednica 1: Seznam protiteles, uporabljenih za imunodetekcijo po prenosu western.
Protitelo Vloga za EV in kategorija
Proizvajalec Molekulska masa tarčnege
bejakovine (kDa)*
Redčitev
Zajčja kalneksin
Negativni označevalec, 4
Sigma Aldrich, ZDA
90 1:2000
Zajčja flotillin Pozitivni označevalec, 2
Cell Signalling, ZDA
49 1:1000
Mišja Apo-AI Negativni označevalec, 3
Santa Cruz Biotechnology,
ZDA
28 1:1000
Mišja IgG2a
HSP-70
Pozitivni označevalec, 2
Santa Cruz Biotechnology,
ZDA (sc-24)
70 1:1000, 1:200
Mišja IgG2a
tsg101
Pozitivni označevalec, 2
Santa Cruz Biotechnology, ZDA (sc-7964)
45 1:1000
Mišja IgG1
CD9
Pozitivni označevalec, 1
Santa Cruz Biotechnology, ZDA (sc-13118)
24 1:900
Mišja CD63 Pozitivni označevalec, 1
Santa Cruz Biotechnology,
ZDA
30-60 1:200
*molekulska masa kot jo navaja proizvajalec
20
Pri prenosu western smo uporabili naslednje materiale:
minicentrifugirke, ki preprečujejo vezavo beljakovin na njihovo površino in s tem izgubo vzorca (Eppendorf, Nemčija)
4-x LDS pufer NuPAGE (ThermoFisher, ZDA) 1M ditiotreitol (DTT)
ultračista voda dH2O
polivinil difluoridna (PVDF) membrana (Sigma-Aldrich, ZDA)
lestvica BlueStar Prestained Protein Marker (NIPPON Genetics, Nemčija) (slika 7) celični lizat glioblastomske celične linije U251
NuPAGE 4 – 12-% Bis-Tris Gel 1.0 mm X 10 well (ThermoFisher, ZDA) NuPAGE 4-x nanašalni pufer LDS (ThermoFisher, ZDA)
SuperSignalTM West Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoFisher, ZDA) SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (ThermoFisher, ZDA)
Slika 7: Lestvica BlueStar Prestained Protein Marker (NIPPON Genetics, Nemčija).
Sekundarna protitelesa, konjugirana s HRP (hrenovo peroksidazo):
Kozja proti-zajčja (1:7500, Sigma Aldrich, ZDA) Kozja proti-mišja (1:4000, Sigma Aldrich, ZDA)
21
Pufri in njihova sestava (biti morajo hladni, hranimo jih pri +4 °C):
Pufer za elektroforezo
50 mL pufra za elektoroforezo (NuPAGE MOPS SDS Running Buffer 20-x (Thermo Fisher Scientific, ZDA))
950 mL dH2O Pufer za prenos
50 mL pufra za prenos (NuPAGE Transfer Buffer 20-x (Thermo Fisher Scientific, ZDA)) 200 mL metanola
750 mL dH2O Razbarvalni pufer
Voda : metanol: ocetna kislina = 50 : 40 : 10 = v : v : v 1-x TBS-Tween (TBST) pufer
100 mL 10-x TBS (angl. tris buffered saline) 10-x TBS
24 g trizma base (Sigma-Aldrich, ZDA) 88 g NaCl (Honeywell, ZDA)
dopolnimo z dH2O do 1 L uravnamo pH na 7,6 900 mL dH2O
1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich, ZDA)
Pufer za odstranjevanje protiteles (angl. stripping buffer) 15 g glicin
1 g natrijev dodecil sulfat (SDS) 10 mL Tween 20
dopolnimo z dH2O do 800 mL
uravnamo pH na 2,2 in dopolnimo z dH2O do 1 L
Za slikanje membran smo uporabili napravo LAS-4000 CCD camera (Fujifilm, Japonska).
Postopek za prenos western:
1. Pripravimo vzorce za nanos na gel
Uporabljamo vzorce, ki jim mora biti dodana 5-x RIPA in smo jih shranili pri postopku merjenja koncentracije beljakovin. Poleg tega moramo imeti tudi celični lizat U251 kot pozitivno kontrolo in po potrebi slepi vzorec (angl. blank), da zapolnimo vse luknje v gelu. Slepi vzorec je mešanica 4-x nanašalnega pufra LDS v enakem volumnu, kot je dodan pri vzorcih, dopolnjena z dH2O do končnega volumna, ki ga nanesemo na gel (v našem primeru 25 μL). Vzorce za nanos, ki vsebujejo 10 μg ZV / 25 μL, pripravimo tako, kot je prikazano v preglednici 2.
22
Preglednica 2: Priprava vzorcev za nanos na gel pri prenosu western.
Lestvica Vzorec Celični lizat U251
Vvzorca [μL] 7 preračunamo, da velja 10 μg
ZV / 25 μL
6,5
V 4-x LDS [μL] 0 6 6
V 1M DTT [μL] 0 1,5 1,5
V ddH2O [μL] 0 dopolnimo do 25 μL 11
2. Vzorce premešamo na vibracijskem mešalu in centrifugiramo ter jih inkubiramo 5 min pri +95 °C.
3. Komercialno pripravljen gel vstavimo v kadičko in dolijemo pufer za elektroforezo do oznake na kadički. Iz gela odstranimo glavniček. Nanesemo po 25 μL vzorcev in 7 μL lestvice.
4. Gel pustimo teči 65 – 70 min in 200 V.
5. Aktiviramo PVDF membrano (0,45 um):
− 15 sekund v metanolu,
− 2 min v dH2O,
− do uporabe v pufru za prenos.
6. V pufru za prenos namočimo filter papir in gobice.
7. Gel prenesemo v kadičko s pufrom za prenos.
8. V pufru za prenos sestavimo sendvič:
− črna stran vstavka,
− gobica,
− filter papir,
− gel,
− membrana,
− filter papir – valjamo s centrifugirko, da se znebimo mehurčkov,
− gobica,
− prozorna stran vstavka.
9. Sendvič damo v kadičko. V kolikor delamo prenos na eno samo membrano, damo vkadičko damo tudi sendvič, kjer sta samo gobici.
10. Dolijemo pufer za prenos in v kadičko vstavimo posodico z ledom.
11. Celotno kadičko damo na led.
12. Prenos traja 90 min na 100 V.
13. Gel prenesemo v kadičko in ga barvamo z barvilom Coomassie Brilliant Blue, tako da kadičko na hitro segrejemo v mikrovalovni pečici in stresamo na rotacijskem stresalniku 15 min pri sobni temperaturi, nato razbarvamo s 100 mL razbarvalnega pufra 1 – 2 uri in speremo z dH2O.
14. Membrano prenesemo v kadičko in barvamo s Ponceau S 30 min pri sobni temperaturi s stresanjem, nato razbarvamo z dH2O: 2-krat speremo, damo v
23
plastično prozorno mapico in slikamo, nato stresamo za približno 30 min in vmes večkrat menjamo dH2O.
15. Membrano blokiramo tako, da jo inkubiramo 1 h s 5-% mlekom v PBS s stresanjem pri sobni temperaturi.
16. Membrano primerno razrežemo in prenesemo v kadičko, kjer dodamo primarna protitelesa (v 1-% mleku v PBS), ovijemo s parafilmom in stresamo čez noč v hladni sobi pri +4 °C.
17. Membrano spiramo 3 x 5 min s pufrom TBS-T, nato jo 2 uri inkubiramo s sekundarnimi protitelesi pri sobni temperaturi s stresanjem:
− kozja proti-zajčja 1 : 7500 v 1-% mleku / PBS,
− kozja proti-mišja 1 : 4000 v 1-% mleku / PBS.
18. Membrano spiramo 4 x 5 min s pufrom TBS-T in slikamo. Za detekcijo signala na membrani smo uporabili komercialni kit SuperSignalTM West Pico ali SuperSignal™ West Femto.
Po slikanju lahko membrano shranimo pri -20 °C ali izvedemo odstranjevanje protiteles z membrane (angl. membrane stripping) in ponovno detekcijo beljakovin na membrani:
1. Dvakrat spiramo s pufrom za odstranjevanje protiteles po 5 – 10 min s stresanjem.
2. Dvakrat spiramo s PBS po 10 min s stresanjem.
3. Dvakrat spiramo s pufrom TBS-T po 5 min s stresanjem.
4. Membrano speremo s 5-% mlekom/PBS.
5. Na LAS-4000 preverimo, ali smo z membrane odstranili protitelesa.
Ob uspešni odstranitvi protiteles z membrane je membrana pripravljena za ponoven nanos primarnih protiteles, nato je postopek do slikanja enak kot prej (od koraka 16 pri postopku za prenos western naprej).
24 3.3.3. Analiza sledenja nanodelcem
ZV smo detektirali z metodo sledenja nanodelcem, NTA, kar smo izvedli z aparaturo NanoSight NS300 (Malvern Panalytical, Združeno kraljestvo).
Za analizo NTA smo uporabili naslednje materiale:
standard velikosti NanosphereTM (Thermo Scientific, ZDA) filtri z 0,22 μm velikimi porami (Cornig, ZDA)
Priprava standarda NanosphereTM (za meritve z avtomatskim nanosom vzorca mora biti standard redčen 50.000 x):
1. Pred redčenjem standard vedno temperiramo na sobno temperaturo.
2. Standard premešamo z obračanjem.
3. 1 kapljico standarda zavržemo.
4. 4 kapljice standarda zberemo v minicentrifugirko.
5. 10 μL prenesemo v 990 μL ultračiste vode.
6. 10 μL mešanice iz koraka 5 prenesemo v 990 μL ultračiste vode.
7. 625 μL mešanice iz koraka 6 prenesemo v 2600 μL ultračiste vode.
Postopek za detekcijo ZV z metodo NTA:
1. Pripravimo 1 L PBS, ki ga prefiltriramo in soniciramo 3 x 10 s.
2. 1 μL, 5 μL in 15 μL vzorca redčimo s 1000 μL PBS.
3. Na ploščo za analizo NTA nanesemo po 1 mL pripravljenih vzorcev in standard.
4. Na napravi Malvern NanoSight NS300 detektiramo ZV v programu NTA 3.4 – Sample Assistant.
5. Nastavitve v programski opremi NTA 3.4:
Posnetek
Nivo kamere 14
Trajanje 60 s
Ponovitve/vdolbinico 5
Spiranje/vdolbinico 1
Temperatura meritve 25
25
3.4. Izolacija in analiza miRNA iz zunajceličnih veziklov
miRNA iz ZV smo izolirali z uporabo komercialnega kompleta za izolacijo miRNA mirVanaTM (Thermo Fisher Scientific, ZDA) po postopku proizvajalca. Kakovost izolirane miRNA smo preverili s spektrofotometričnimi meritvami čistosti in koncentracije. Ustreznost izolirane miRNA smo testirali z metodo qRT-PCR.
3.4.1. Izolacija miRNA
Iz ZV iz plazme in CSF smo miRNA izolirali s kompletom reagentov za izolacijo miRNA mirVanaTM (Thermo Fisher Scientific, ZDA). Digestorij, pipete in ostale pripomočke smo predhodno očistili z RNaseZAPTM (Sigma-Aldrich, ZDA).
Material, ki smo ga uporabili pri izolaciji miRNA:
minicentrifugirke 1,5 mL (Eppendorf, Nemčija)
Za merjenje koncentracije smo uporabili napravo Synergy H4 (BioTek, ZDA) in računalniški program Gen5 2.09.
Postopek izolacije miRNA iz ZV iz plazme in CSF:
1. Na ledu odtajamo vzorce.
2. K vzorcem dodamo 300 μL raztopine za liziranje.
3. Premešamo na vibracijskem mešalu ali zelo intenzivno pipetiramo da dobimo homogeno mešanico.
4. Dodamo 1/10 volumna (30 μL) miRNA homogenat aditiva in dobro premešamo na vibracijskem mešalu ali z obračanjem minicentrifugirke.
5. Inkubiramo na ledu 10 min.
6. Dodamo raztopino fenol-kloroform v enakem volumnu kot raztopine za liziranje (300 μL).
− Raztopino fenol-kloroform moramo vzeti iz sredine spodnje tekočine, ker je na vrhu vodna faza.
7. Premešamo na vibracijskem mešalu 30 sekund pri najvišji hitrosti. Vzorcev ne inkubiramo več na ledu.
8. Centrifugiramo pri 10.000 g, 5 min pri sobni temperaturi, da se ločita vodna in organska faza. Po centrifugiranju bi morala biti interfaza kompaktna, če ni, še enkrat centrifugiramo.
9. Previdno odstranimo zgornjo, vodno fazo in jo prenesemo v novo minicentrifugirko. Zapišemo volumen, ki smo ga prenesli in označimo vzorce.
10. Dodamo 1,25 volumna 100 -% etanola (sobne temperature) v vodno fazo (375 μL).
11. Premešamo na vibracijskem mešalu in kratko centrifugiramo.
26
12. Za vsak vzorec damo filter v centrifugirko za zbiranje vzorca.
13. Napipetiramo vzorec lizat/etanol na filter (700 μL je največji volumen, ki ga lahko nanesemo).
14. Centrifugiramo pri 10.000 g, 15 s pri sobni temperaturi.
15. Odstranimo, kar je šlo skozi filter in ponovimo, da porabimo vso mešanico.
16. Dodamo 700 μL raztopine za spiranje miRNA 1, ki jo predhodno zmešamo z etanolom, na filter in centrifugiramo pri 10.000 g, 10 s pri sobni temperaturi.
17. Odstranimo, kar je šlo skozi filter.
18. Dodamo 500 μL raztopine za spiranje miRNA 2/3, ki jo predhodno zmešamo z etanolom, na filter in še enkrat centrifugiramo pri 10.000 g, 10 s pri sobni temperaturi.
19. Enako ponovimo še z drugim alikvotom 500 μL raztopine za spiranje miRNA 2/3.
20. Odstranimo, kar je šlo skozi filter in centrifugitamo pri 10.000 g, 1 min pri sobni temperaturi, da odstranimo odvečno tekočino.
21. Prenesemo filter v novo centrifugirko za zbiranje in dodamo 50 μL vode brez RNaz ogrete na +95 °C. Vodo dodajamo na sredino filtra.
22. Počakamo 3 minute.
23. Centrifugiramo pri najvišji hitrosti (16.000 g), 30 s pri sobni temperaturi.
24. Zberemo eluat.
25. Na spektrofotometru Synergy H4 izmerimo koncentracijo miRNA v eluciji.
26. Zamrznemo pri -80 °C.
