MAGISTRSKO DELO

F

MAGISTRSKO DELO

Vid Modic

Ljubljana, 2021

F

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE BIOKEMIJA

Uporaba kavzalnih omrežij pri načrtovanju poti z neželenim izidom

MAGISTRSKO DELO

Vid Modic

M

: doc. dr. Anže Županič

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega/magistrskega dela

Spodaj podpisani Vid Modic sem avtor magistrskega dela z naslovom: Uporaba kavzalnih omrežij pri načrtovanju poti z neželenim izidom.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc.

dr. Anžeta Županiča;

• sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v

predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

• je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, 16. 12. 2021 Podpis avtorja:

Delo je bilo opravljeno na Nacionalnem inštitutu za biologijo.

Senat UL FKKT je za mentorja imenoval doc. dr. Anžeta Županiča.

Recenzentki: doc. dr. Marina Klemenčič, doc. dr. Vera Župunski

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela

Predsednica komisije: doc. dr. Vera Župunski

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Članica: doc. dr. Marina Klemenčič

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Član: doc. dr. Anže Županič

Nacionalni inštitut za biologijo

potrpežljivost in spodbudo pri mojih prvih korakih na področju raziskovalnega dela, ter pri izvedbi in izdelavi magistrske naloge.

Zahvaljujem se dr. Živi Ramšak za strokovno pomoč pri izdelavi magistrske naloge in predano znanje o računalniških kuracijskih pristopih, ki so bili potrebni za izvedbo in izdelavo magistrske naloge.

Zahvaljujem se članoma komisije, doc. dr. Marini Klemenčič in doc. dr. Veri Župunski, za temeljit pregled magistrske naloge.

Povzetek:

Napredek v analitični kemiji je omogočil odkritje številnih v okolju prisotnih kemikalij, ki so potencialno nevarne za ljudi in okolje. Da bi lahko ljudi in okolje zaščitili, moramo razumeti biološke tarče teh kemikalij in oceniti njihove škodljive učinke. Trenutno je ocena toksičnosti kemikalij omejena na merjenje izbranih fizioloških končnih točk na omejenem izboru modelnih organizmov, kar ni ugodno zaradi visokega števila kemikalij, ki zahtevajo testiranje. Potencialna rešitev je prehod na bolj mehanistični pristop, pri katerem bi testiranje na izbranih končnih fizioloških točkah nadomestili z molekularnimi testi visoke prepustnosti, ki temeljijo na celičnih kulturah, njihove rezultate pa bi razlagali z uporabo računalniških virov znanja, npr. poti z neželenim izidom (angl. adverse outcome pathways; AOP). V zadnjem desetletju je AOP koncept postal eno najmočnejših orodij v okoljski toksikologiji za ocenjevanje toksičnosti kemikalij, vendar je razvoj AOP še vedno počasen in zahteven proces.Namen magistrskega dela je bil ugotoviti, ali je mogoče hitrejše razviti nov AOP, če za osnovo vzamemo že razvita biološka kavzalna omrežja. Za osnovo razvoja AOP smo uporabili biološka kavzalna omrežja za kardiotoksičnost in nevrotoksičnost pri navadni cebrici (Danio rerio), razvita na Nacionalnem inštitutu za biologijo.V začetni fazi razvoja novih AOP smo za vse entitete v kavzalnih omrežjih dodali funkcionalne anotacije, potrebne za razvoj AOPjev. Izbrani nabor podatkov smo nato vizualizirali v računalniškem programu Cytoscape, kjer je sledilo filtriranje omrežja, s katerim smo odstranili nepovezane entitete omrežja in poti, ki niso vodile do nevronskih ali srčnih patologij. Tako smo ustvarili povezano enoto začetnega omrežja, kjer so bile vse entitete unikatne, imenovano omrežje potencialnih AOP. Takšno omrežje smo nato razbili na manjša podomrežja, ki so služila za lažji pregled linearnih poti v omrežju potencialnih AOP-jev in izpostavitev najboljših linearnih poti za razvoj v AOP.V nadaljevanju je sledil ročni pregled podomrežij in izbira najustreznejših linearnih poti za razvoj AOP na podlagi izbirnih kriterijev. Dve izbrani linearni poti smo na podlagi smernic OECD priročnika oblikovali v AOP-ja, opisali njune gradnike, ocenili težo dokazov gradnikov AOP in razvita AOP-ja objavili v bazi AOP- Wiki.

Ključne besede: pot z neželenim izidom, biološka kavzalna omrežja, ocena teže dokazov

Abstract:

Advances in analytical chemistry have made it possible to discover many chemicals present in the environment that are potentially dangerous to humans and the environment.

In order to protect people and the environment, we need to understand the biological targets of these chemicals and assess their harmful effects. Currently, the assessment of chemical toxicity is limited to the measurement of selected physiological endpoints on a limited selection of model organisms, which is not favourable due to the high number of chemicals requiring testing. A potential solution is to move to a more mechanistic approach, replacing testing at selected physiological endpoints with high-throughput molecular tests based on cell cultures, and interpreting their results using computerized knowledge sources, e.g. adverse outcome pathways (AOP). Over the last decade, the AOP concept has become one of the most powerful tools in environmental toxicology for assessing the toxicity of chemicals, but the development of AOP is still a slow and manually demanding process.The purpose of the master's thesis was to determine whether it is possible to develop new AOPs based on existing biological causal networks. We used neurotoxicological and cardiotoxicological biological causal networks developed at the National Institute of Biology for the zebrafish (Danio rerio) as the starting point for the development of the AOPs.In the initial phase of AOP development, the data set of biological causal networks of neurotoxic and cardiotoxic outcomes was manually curated in order to select the key network data needed to develop a network of potential AOPs.

The selected data set was then visualized in the computer program Cytoscape, followed by network filtering, which removed unrelated network entities and pathways that did not lead to pathologies. Thus, we created a connected unit of the initial network, where all the entities were unique, called a network of potential AOPs. Such network was then broken down into smaller subnetworks. Subnetworks made it easier to review the linear paths involved in network of potential AOPs and highlight the most appropriate ones for development into new AOPs.This was followed by a manual review of the subnetworks and the selection of the most appropriate linear pathways for AOP development based on the selection criteria. Based on the OECD guidelines, two selected linear pathways were developed into AOPs, for which we described the building blocks, estimated the weight of the evidence of the AOP building blocks, and published them in the AOP-Wiki database.

Keywords: adverse outcome pathway, biological causal networks, weight of evidence assessment

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Kavzalna omrežja ... 4

1.1.1 Primer izgradnje bioloških omrežij z uporabo BEL programskega jezika ... 6

1.1.2 Kvantitativni pristopi k predikciji fenotipov na podlagi bioloških omrežij . 7 1.2 Pot z neželenim izidom (AOP) ... 11

1.3 AOP baze znanja ... 13

1.4 AOP-omrežje ... 14

1.5 Načela razvoja AOP ... 15

1.5.1 Ocena zaupanja v dokaze KE, KER in AOP ... 16

1.5.2 Opisovanje in ocenjevanje AOP ... 18

2 Namen dela in hipoteze ... 20

3 Materiali in metode ... 21

3.1 Biološki ekspresijski jezik (BEL) ... 23

3.2 Izdelava nabora podatkov za definicijo odnosov vozlišč in definicijo vozlišč omrežja potencialnih AOP. ... 25

3.2.1 Izdelava nabora podatkov za definicijo odnosov vozlišč omrežja potencialnih AOP ... 26

3.2.2 Izdelava nabora podatkov za definicijo vozlišč omrežja potencialnih AOP .. ... 27

3.2.3 Krajšanje nabora podatkov za definicijo odnosov med vozlišči in za definicijo vozlišč... 29

3.3 Vizualizacija omrežja ... 30

3.3.1 Reduciranje omrežja v programu Cytoscape ... 31

3.3.2 Standardizacija vizualizacije ... 32

3.4 Analiza linearnih poti v omrežju potencialnih AOP ... 33

3.4.1 Izbor linearnih poti ... 36

3.5 Ocenjevanje teže dokazov ... 39

4 Rezultati ... 40

4.2 AOP 399: Inhibicija Fyna kinaze vodi do povečane umrljivosti preko zmanjšane

velikosti oči (mikroftalmija) ... 46

4.2.1 Kemični inciatorji AOP-ja, Inhibitorji Fyna kinaze ... 46

4.2.2 MIE: inhibicija Fyna kinaze ... 47

1.1.1 KER1: inhibicija Fyna kinaze vodi do inhibicije Plxna2 ... 47

1.1.2 KE1: inhibicija Plxna2 receptorja ... 48

1.1.3 KER2: inhibicija Plxna2 receptorja vodi do povečanja izražanja rasl11b . 49 1.1.4 KE2: prekomerno izražanje rasl11b ... 49

1.1.5 KER3: prekomerno izražanje rasl11b vodi do znižane celične proliferacije . ... 50

1.1.6 KE3: znižana celična proliferacija ... 50

1.1.7 KER4: znižana celična proliferacija vodi do zmanjšane velikosti očesa ... 50

1.1.8 KE4: zmanjšana velikost očesa (Mikroftalmija) ... 51

1.1.9 KER5: zmanjšana velikost očesa vodi do okvarjene funkcije očesa ... 52

1.1.10 KE5: okvarjena funkcija očesa ... 52

1.1.11 KER6: okvarjena funkcija očesa vodi do povečane umrljivost ... 53

1.1.12 KE6: povečana umrljivost ... 53

1.1.13 KER7: povečana umrljivost vodi do padca populacije ... 54

1.1.14 KE7: padec populacije ... 54

4.3 AOP 410: Inhibicija Gsk3b kinaze vodi do napak v razvoju notranjega ušesa in posledično do povečane umrljivosti ... 55

1.1.1 Kemični iniciatorji AOP, Inhibicija Gsk3b kinaze ... 55

1.1.2 MIE: inhibicija Gsk3b kinaze ... 56

1.1.3 KER1: inhibicija Gsk3b kinaze vodi do znižanega izražanja gbx2 ... 56

1.1.4 KE1: znižano izražanje gbx2 ... 57

1.1.5 KER2: znižano izražanje gbx2 vodi do povečanega izražanja foxi1 ... 57

1.1.6 KE2: povečano izražanje foxi1 ... 57

1.1.7 KER3: povečano izražanje foxi1 vodi do povečanega izražanja six1b ... 58

1.1.8 KE3: povečano izražanje six1b ... 58

1.1.10 KE4: inhibirano izražanje eya1 ... 59

1.1.11 KER5: inhibirano izražanje eya1 vodi do povečane celične smrti ... 60

1.1.12 KE5: povečana celična smrt ... 60

1.1.13 KER6: povečana celična smrt vodi do sprememb v razvoju notranjega ušesa ... 61

1.1.14 KE6: spremenjen razvoj notranjega ušesa ... 61

1.1.15 KER7: spremenjen razvoj notranjega ušesa vodi do okvarjenega sluha 62 1.1.16 KE7: okvarjen sluh ... 62

1.1.17 KER8: okvarjen sluh vodi do povečane umrljivosti ... 62

1.1.18 Nadaljnja ključna dogodka in njun odnos ... 63

4.4 Pregled gradnikov AOP, ocena teže dokazov gradnikov in skupna ocena AOP 399 in AOP 410 ... 64

5 Razprava ... 71

6 Zaključek ... 75

7 Literatura ... 76

8 Priloge ... 87

8.1 P1: BEL funkcije in imenski prostori ... 87

8.2 P2: Izdelava nabora podatkov za definicijo vozlišč omrežja potencialnih AOP ... 89

8.3 P3: Potek krajšanja naborov podatkov za definicijo odnosov in vozlišč omrežja potencialnih AOP ... 91

angl. angleško

AO neželeni izid (angl. Adverse Outcome)

npr. na primer

DEAB N,N-dietilaminobenzaldehid

Hpf ure po oploditvi (angl. hours post fertilization) idr. in drugi

KE ključni dogodek (angl. Key Event)

KER razmerje med ključnima dogodkoma (angl. Key Event Relationship) MIE molekularni iniciatorski dogodek (angl. Molecular initiating event) NER orodje za prepoznavanje imenskih entitet (angl. Named Entity Recognition

tool)

Phos-tag monomer, ki se specifično veže na dvovalentne fosfatne ione.

RPC retinalne prekurzorske celice

Na-PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega dodecilsulfat (angl. Sodium Dodecyl Sulphate–PolyacrylAmide Gel Electrophoresis)

TUNEL tehnika označevanja terminalnih koncev rezanja deoksinukleotidil transferaze (angl. terminal deoxynucleotidyl transferase nick end labeling)

ZFIN baza podatkov cebrice (angl. Zebrafish information network) XML razširljivi označevalni jezik (angl. eXtensible Markup Language)

1

1 Uvod

Regulativna toksikologija se v enaindvajsetem stoletju sooča s številnimi izzivi, kot je potreba po oceni varnosti vedno večjega števila kemikalij, da bi izpolnili nove zakonodajne naloge, hkrati pa zmanjšali uporabo živali, stroškov in časa, potrebnih za testiranja varnosti kemikalij¹.Za oceno toksičnosti kemikalij se tradicionalno uporabljajo klasične toksikološke metode. Te metode so večinoma opisne in poročajo o od odmerka odvisnih neželenih učinkih (angl. adverse outcome). Vendar je pri proučevanju kemijske toksičnosti razumevanje molekularnih dogodkov, ki vodijo do škodljivega izida, enako pomembno kot razumevanje samega izida. Mehanistično poznavanje toksičnosti omogoča modeliranje in silico, ekstrapolacijo na kemikalije s podobnimi načini delovanja, napoved posledic kronične izpostavljenosti, izpostavljenosti v drugih vrstah živih organizmov (vključno s človekom), razvoj terapevtskih strategij in navsezadnje regulativno odločanje². Zato je v enaindvajsetem stoletju bioinformatika oziroma biologija in silico postala pomembno področje naravoslovne znanosti. Področje bioinformatike združuje teorijo bioloških sistemov in uporabo računalniških pristopov za modeliranje, napovedovanje in razlago bioloških funkcij na molekularnem nivoju^3,4. Spoznanje, da so bolezni posledice motenj celičnih sistemov, zlasti molekularnih omrežij, je postavilo osnovo za nastanek številčnih računalniških pristopov, ki omogočajo razlago ogromne količine dostopnih molekularnih podatkov⁵.

Danes je mogoče z visokoprepustnimi tehnologijami pridobiti obsežen nabor molekularnih podatkov, ki omogočajo vpogled v mehanizme nastanka bolezni in delovanja biološko aktivnih snovi na izpostavljen organizem⁶. Primer takšnega nabora podatkov so rezultati omičnih pristopov (npr. transkriptomika, metabolomika, proteomika), ki vsebujejo ogromno količino informacij, vendar v kontekstu okoljske toksikologije še niso v celoti izkoriščeni⁷. Analiza podatkov pridobljenih z visokoprepustnimi tehnologijami običajno vodi do seznama različno izraženih genov, kar pa pogosto ne zagotovi mehanističnega vpogleda v osnovno biologijo. Problem predstavlja interpretacija pridobljenih podatkov v toksikološkem kontekstu in s tem vpogled v preučevane biološke sisteme ter določitev dejanskih vzrokov in posledic specifičnih molekularnih sprememb v organizmu¹. Za celostni izkoristek potenciala molekularnih podatkov pridobljenih z visokoprepustnimi analiznimi tehnologijami je potreben razvoj novih boljših metod za njihovo interpretacijo. Za razlago takšnih podatkov v kontekstu toksikologije sta se v zadnjih letih uveljavila dva pristopa, analiza poti z neželenim izidom (angl. Adverse Oucome Pathway; AOP) in kavzalna biološka omrežja. Namen obeh pristopov je med drugim tudi učinkovitejša uporaba podatkov,

2

zlasti tistih, ki jih je mogoče ustvariti hitreje in stroškovno učinkoviteje kot rezultate pridobljene z meritvami v tipičnih preskusih toksičnosti. Pristop bioloških kavzalnih omrežji omogoča shematski pregled cele celice ali organizma, preko katerega lahko preučujemo interakcije vključenih (molekularnih) entitet. Kavzalna omrežja so v večini večja (od nekaj deset do nekaj sto entitet in povezav med njimi) in predstavljajo znane kavzalne povezave, ki so povezave z določeno boleznijo/neželenim izidom ob izpostavitvi zunanjim faktorjem⁵. Medtem pa so AOP-ji zgoščeni opisi linearnih poti znotraj biološkega sistema, ki se začnejo z motnjo entitete oziroma molekularnim iniciatorskim dogodkom (angl. Molecular Initiating Event; MIE) in vodijo do za regulatorje pomembnega neželenega izida (angl. Adverse Outcome; AO) in so tako, predvsem v svoji kvantitativni obliki (angl. quantitative AOP; qAOP) lahko neposredno uporabni v regulaciji kemikalij⁸. MIE in AO sta v AOP-ju povezana preko ključnih dogodkov (angl. key event; KE) in odnosov med ključnimi dogodki (angl. Key Event Relationship; KER). Zaradi svoje preprostosti, in ker vključujejo zgolj najpomembnejše biološke spremembe, ki vodijo do neželenega izida, se v zadnjih letih čedalje bolj uveljavljajo kot osnova za razvoj novih molekularnih testov kemijske toksičnosti in tudi kot orodje za interpretacijo analiz toksičnosti kemikalij^1,9.

Za ocenjevanje potencialnega neželenega izida, ki ga povzroči izpostavljenost kemikalijam, kot so zdravila ali pesticidi, so potrebni dobri eksperimentalni modeli. Za pridobivanje podatkov visokoprepustnih presejalnih testov se izvaja presejanje knjižnic kemikalij na živalih. Eden najpogosteje uporabljenih živalskih modelov v biologiji je miš (Mus musculus). Vendar pa stroški povezani z njegovo uporabo omejujejo njegovo uporabo pri obsežnih presejalnih testih. Nasprotno pa riba cebrica (Danio rerio) pridobiva zagon v okviru (okoljske) toksikologije¹⁰. Cebrica je subtropska riba, ki ima številne značilnosti uporabne za preučevanje toksikološkega delovanja kemikalij. Je majhna, enostavna za gojenje in se hitro razmnožuje, kar omogoča raziskave v večjem obsegu, embrionalne razvojne stopnje pa so prozorne, kar omogoča enostavnejši pregled morfoloških sprememb in razvoja organov¹¹. Poleg tega poskusi z ličinkami cebrice, do 5 dni po oploditvi, v večini evropskih držav ne veljajo za poskuse na živalih¹².

Cebrica se v toksikologiji uporablja kot modelni organizem za preučevanje razvojne toksičnosti, predvsem ker imajo kemikalije (kardio- in nevro- toksične) na človeka in cebrico podoben učinek¹³. Z vidika nevrotoksičnosti je cebrica uporabna kot modelni organizem, ker omogoča opazovanje sprememb v živčnem sistemu med normalnim razvojem in delovanjem ter ob prisotnosti različnih kemikalij, ki izzovejo želene ali neželene učinke. Mehanistično razumevanje, pridobljeno z analizo cebrice kot modelnega

3

organizma, tako daje dobro osnovno znanje o tem, kako lahko nevro- in kardio- toksične kemikalije vplivajo na zdrav organizem².

Raziskovalci na inštitutu Eawag (Švicarski zvezni inštitut za vodno znanost in tehnologijo) in NIB (Nacionalni inštitut za biologijo) so za uporabo cebrice kot modelnega organizma razvili kavzalni omrežji razvojne kardiotoksičnosti in nevrotoksičnosti. Omrežji sta prosto dostopni v spletni bazi bioloških omrežji Causal Biological Network Database:

● Omrežje kardiotoksičnih izidov:

http://causalbionet.com/Home/NetworkVisualization/#/!/networkGraph?ID=5ea 0344201dd7708605b4e09

● Omrežje nevrotoksičnih izidov:

http://causalbionet.com/Home/NetworkVisualization/#/!/networkGraph?ID=5ff4 7ba901dd761144521b5e.

Omrežji služita za lažjo razlago transkriptomskih podatkov za potrebe okoljske toksikologije. Takšna biološka kavzalna omrežja nam dajo vpogled v biološki sistem cebrice. Kavzalna topologija omrežja pa nam podaja usmerjeno povezavo med entitetami². Zaradi prej omenjenih lastnosti imajo takšna omrežja potencial razvoja v AOP-je, ki so neposredno v regulativni toksikologiji bolj uporabna od kavzalnih omrežji.

4

1.1 Kavzalna omrežja

Biološka omrežja nam podajo načrt/shemo/opis celotne celice in organizma iz katerega lahko sistematično raziskujemo posamezne lastnosti, obnašanja in izide, ki nas zanimajo⁴. Omrežni pristopi se uporabljajo za razlago velikih naborov podatkov, ki jih je danes enostavno pridobiti z naprednimi tehnikami analize. Izgradnjo omrežja lahko vodijo podatki (angl. data-driven network), kar pomeni zajemanje ali združevanje podatkov v urejeno strukturo glede na prisotne vzorce (po skupinah, vrstah) brez smeri ali hierarhije.

Takšna omrežja se uporabljajo za analize zelo velike količine podatkov, vendar se v kontekstu toksikologije redkeje uporabljajo, ker ne vključujejo mehanističnega ozadja podatkov¹⁷. Druga možnost analize podatkov pa so omrežja, katera vodi znanje (angl.

knowledge-driven network) in med katera spadajo kavzalna biološka omrežja. Predhodno znanje za kavzalna biološka omrežja so lahko baze podatkov modelnih organizmov ali bolezni, ki vsebujejo zbirke sorodnih proteinov ali genov (baza podatkov cebrice-ZFIN).

Kavzalna biološka omrežja imajo znano smer in hierarhijo med entitetami v omrežju (npr.

entiteta A zniža entiteto B), kar nam razkrije vzrok in posledico določene motnje in izida.

Entitete omrežja (geni, proteini, patologije) predstavljajo vozlišča, usmerjene povezave med entitetami pa robove oziroma odnose med entitetami (inhibicija, aktivacija) (slika 1).

Omrežje, iz katerega smo izpeljali naše poti z neželenim izidom tekom magistrskega dela, spada med omrežja, ki jih vodi znanje.

Slika 1: Del biološkega kavzalnega omrežja. Kvadrati predstavljajo entitete (gen, protein, biološki proces, patologijo). Sive črte, ki povezujejo entitete predstavljajo usmerjene povezave oziroma robove med entitetam, ki predstavljajo odnos med entitetami (inhibicija, aktivacija). Slika je bila ustvarjena v programskem okolju Cytoscape.

Ena izmed možnosti razvoja bioloških kavzalnih omrežji je računalniška ekstrakcija relevantnih podatkov iz znanstvene literature in povezovanje v urejeno omrežje. Metode,

5

razvite za iskanje literature in ekstrakcijo bioloških podatkov, ki vodijo do sistematičnega zajemanja in organizacije informacij, npr. za informacije o zaporedju genov in njihovi funkciji so znane kot biokuracija (angl. biocuration). Nadzorovani besednjaki ali ontologije, kot je genska ontologija (angl. gene onthology; GO) (http://www.geneontology.org/)¹⁸, so bili razviti za zajem bioloških podatkov iz literature. Te ontologije se dosledno uporabljajo v različnih MOD-ih (angl. Model Organism Databases) in so primerne za računalniško manipulacijo. MOD-i so zbirke podatkov o modelnih organizmih, kot npr. ZFIN, WormBase in Mouse Genome informatics (MGI), kateri so bili razviti za shranjevanje genetskih in genomskih podatkov za sekvencirane vrste, v tem primeru cebrico, miši in ogorčice. Zaradi velike količine znanja, ki ga imamo danes na razpolago, postajajo orodja za rudarjenje in ekstrakcijo biološko pomembnih informacij vse bolj pomembna. Tekstovno rudarjenje pomaga pri identifikaciji genov ali proteinov in se lahko uporabi za njihovo mapiranje v kontrolirane besednjake, kot so genski seznami, fenotipi in ontologije. Večina kuriranih baz podatkov je še vedno opisnih z vidika bioloških entitet, kjer entitete niso medsebojno povezane in niso v računalniški obliki. Kuratorski izziv je torej pretvoriti odnose med entitetami, ki so vgrajeni v biomedicinsko literaturo, v strukturirano bazo znanja. Znanstveno znanje, ki je kurirano na sistemski ravni, raziskovalcem pomaga pri hitrem iskanju, vizualizaciji in analiziranju specifičnih interakcijskih omrežij, vpletenih v bolezni, in odpre nove priložnosti za identifikacijo kritičnih biomedicinskih entitet kot terapevtskih ciljev¹⁹. Kuriranje znanja v računalniško obliko zahteva dobro opredeljen, strukturiran in standardiziran jezik. Računalniški jeziki za modeliranje in za predstavitev znanstvenih dognanj naravoslovnih ved v računalniški obliki, ki se trenutno v biologiji najbolj uporabljajo, so jezik za izmenjavo bioloških poti (BioPAX) (angl. biological exchange language), označevalni jezik sistemske biologije (SBML) (angl. Systems Biology Markup Language) in biološki ekspresijski jezik (BEL) (angl. Biological Expression Language).

BioPAX se uporablja za opis biološke semantike presnovnih, signalnih, molekularnih, gensko-regulatornih in genskih interakcijskih mrež. Uporablja se predvsem za kvalitativno analizo in izmenjavo informacij. SBML je strukturiran jezik za izmenjavo podatkov, ki temelji na razširljivem označevalnem jeziku (XML) (angl. eXtensible Markup Language) in je uporaben za modeliranje biokemijskih reakcijskih mrež, vključno s celičnimi signalnimi presnovnimi potmi in regulacijo genov^19,20. BEL se uporablja za predstavitev biološkega znanja, zajetega v vzročnih in korelacijskih odnosih.

Biološko kavzalno omrežje, iz katerega smo izhajali pri razvoju AOP-jev, je bilo kodirano v BEL programskem jeziku. BEL programski jezik je bolj podrobno opisan v sekciji Materiali in metode.

6

1.1.1 Primer izgradnje bioloških omrežij z uporabo BEL programskega jezika Ustvarjanje omrežja sicer ni del magistrskega dela, a ker kavzalna omrežja predstavljajo osnovo za naš razvoj novih AOP, je pomembno razumeti, kako so ustvarjena. Zato je v tem poglavju povzet eden izmed načinov izdelave biološkega kavzalnega omrežja.

Izbor znanstvenih besedil: iz relevantne biološke vsebine, ki povzema relevantne biološke mehanizme. Ustrezne znanstvene članke se lahko poišče preko relevantnih terminov, kot so npr. patologije, biološki procesi, itd. v knjižnici PubMed (http: //

www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) ali kateri koli drugi bazi znanstvene literature. Zelo uporabni so pregledni članki, kateri povzemajo določene znanstvene ugotovitve in vodijo do literature, ki natančneje opisuje mehanske poti¹⁹.

Obdelava znanstvenih besedil: računalniški procesni delovod (angl. pipeline) zahteva navaden vnos besedila, kar je pogoj pri številnih orodjih za razčlenitev in analizo besedila.

Računalniški programi ne morejo učinkovito pridobivati informacij iz nestrukturiranega besedila, kar je oblika, ki jo sprejema večina revij in baz podatkov. Ker je večina znanstvenih besedil na voljo samo v obliki .pdf, je potrebno besedila, ki so v obliki .pdf, pretvoriti v besedilne (.txt) datoteke. Ker so znanstvena literatura in baze podatkov namenjene branju ljudi in ne računalnikom, je besedila potrebno pregledati in ročno izbrati odseke, ki vsebujejo želene informacije (npr. povzetki, materiali in metode ter rezultati). Z ročno izbiro podatkov se izognemo morebitnim napakam pretvorbe, ker uvod, razprava in zaključki ponavadi vsebujejo nevzročne dokaze, ponavljanje rezultatov in opise hipotez. Nekateri založniki, npr. Public Library of Science (PLoS) in BioMed Central, poskušajo to težavo odpraviti tako, da celotna besedila svojih publikacij objavijo tudi kot prenosljive datoteke XML, ki jih računalniški programi zlahka obdelajo ^19,21. Računalniški delovod za rudarjenje informacij (angl. Text mining pipeline):

Prepoznavanje ustreznih bioloških izrazov v besedilu je bistvenega pomena za pomensko iskanje entitet in zajemanje odnosov. Za prepoznavanje entitet in odnosov med njimi v znanstvenih besedilih se uporabljajo orodja za prepoznavanje imenskih entitet (NER) (angl. Named Entity Recognition), kot je ProMiner ²². Orodja za prepoznavanje entitet v besedilih potrebujejo slovar, katerega je mogoče pridobiti in sestaviti iz različnih MOD- ov, kot so ZFIN, WormBase in MGI. Literatura, ki vstopi v delovod za rudarjenje besedil v obliki tekstovne datoteke izstopi iz delovoda (npr. BEL programski jezik) v XML- bazirani BEL datoteki (XBEL). BEL pretvornik ustvari izjave BEL in kot izhod ustvari dva dokumenta (XBEL in XMI). XBEL omogoča preoblikovanje zajetih podatkov v sestavljeno biološko omrežje. Dokument XMI vsebuje informacije, ki jih ni mogoče kodirati v jeziku BEL, vendar podajo dodatne informacije o zajetnem biološkem izrazu

7

(referenco, nadomestni imenski prostor, stavek na podlagi katerega je bila izjava ustvarjena)¹⁹.

Kuracijski vmesnik (angl. Curation interface): BEL računalniški procesni delovod (BELIEF) (angl. BEL Information Extraction workFlow) med svojimi orodji vsebuje kuracijski vmesnik. Kuracijski vmesnik je pripomoček za uporabnike z malo kuracijskimi izkušnjami. Zato je pri vsakem dokazu oziroma BEL stavku znotraj dokumenta BEL dodan in prikazan poln ali delni povzetek kavzalnega razmerja med dvema entitetama.

Kuracijski vmesnik omogoča uporabniku ročni vnos popravkov. Delne BEL stavke (npr.

levi interaktor-razmerje ali razmerje-desni interaktor), ki lahko nastanejo zaradi napak v iskanju povezav, je možno v kuracijskem vmesniku ročno zložiti v nove polne BEL stavke ali pa odstraniti¹⁹.

Izgradnja biološkega omrežja: Preverjene BEL dokumente se obdela z orodji BEL programa, kot je BEL združevalnik, ki sestavi biološko omrežje. Obdelane BEL dokumente se nato izvozi v formatu eXtensible Graph Markup and Modeling Language (XGMML), ki je standardni format Cytoscape za shranjevanje postavitev grafov¹⁹. Vizualizacija biološkega omrežja: Vizualizacijski program Cytoscape omogoča branje XGMML formata izvoženega iz BEL programa in integracijo omrežja z različnimi podatki, ki so potrebni za nadaljnje analize omrežja²³.

Z izgradnjo omrežja je omogočena lažja razlaga vzročnih mehanizmov, odgovornih za nastanek bolezni. Takšni pristopi izpostavijo terapevtske tarče, lahko usmerjeno narekujejo izbiro zdravljenja in pripomorejo k razvoju zdravil. Topologija omrežja lahko razkrije vpliv, ki ga ima entiteta na določeno biološko stanje in tako vodi k boljši in lažji karakterizaciji bolezni in razvoju naprednih terapij zdravljenja²⁴.

1.1.2 Kvantitativni pristopi k predikciji fenotipov na podlagi bioloških omrežij Poleg tega, da takšni mrežni modeli omogočajo lažje razumevanje molekularnih mehanizmov toksičnosti, se mrežne modele lahko uporablja tudi za kvantitativno napoved izraženosti fenotipskih lastnosti glede na molekularne meritve. Trenutno obstajata dva pristopa, ki sta uporabna za takšen namen: Bayesove verjetnostne mreže²⁵ (angl. Bayesian Networks; BN) in kavzalno modeliranje²⁶ (angl. causal modeling)¹⁹.

8

1.1.2.1 Bayesove mreže

Bayesove mreže (BN) so grafični, verjetnostni in kavzalni modeli. Povezujejo kvalitativno znanje in kvantitativne podatke za izgradnjo sistema, ki temelji na pogojni verjetnosti, in omogočajo kvantitativne izračune sprememb (pogojnih) vrednosti spremenljivk^17,27. Bayesove verjetnostne mreže predstavljajo skupno porazdelitev verjetnosti med več spremenljivkami v grafični obliki. Grafično komponento BN sestavljajo vozlišča (angl. nodes), ki predstavljajo naključne spremenljivke, in puščice, ki povezujejo spremenljivke (slika 2). Tabele pogojne verjetnosti nam podajo pogojno verjetnost posameznega dogodka.

Slika 2: Shema hipotetičnega binarnega (AOP) Bayesovega omrežja. Tabele poleg vozlišč (MIE1, KE1, AO) opisujejo pogojno verjetnost, da so MIE, KE in AO aktivni ali neaktivni glede na stanje (aktiven/neaktiven) navzgornjega vozlišča. Spodnja tabela poleg vozlišča AO opisuje pogojno verjetnost, da je neželeni izid aktiven ali neaktiven. Simbol (+) predstavlja aktivno stanje vozlišča; simbol (-) predstavlja neaktivno stanje vozlišča⁸.

Vozlišča BN in puščice tvorijo usmerjeni aciklični graf, kar pomeni, da ima omrežje lahko zaprte zanke, brez ciklov, ker ti praktično onemogočijo metode sklepanja. Puščice, ki kažejo na vozlišče v BN, predstavljajo vzročno zvezo, ki je kvantificirana v pogojni verjetnostni tabeli (angl. Conditional Probability Table; CPT), ki verjetnost za vsako stanje navzgornjega vozlišča poveže z vsakim stanjem navzdolnjega vozlišča.

Porazdelitev verjetnosti navzdolnjega vozlišča se izračuna iz porazdelitve verjetnosti njegovih navzgornjih vozlišč v kombinaciji z njegovo CPT in v skladu z Bayesovim pravilom, ki opisuje verjetnost dogodka²⁷. Ker Bayesove mreže potrebujejo usmerjene

9

povezave med vzrokom in posledico, je mogoče Bayesov verjetnosti model uporabiti na kavzalnem biološkem omrežju, AOP-jih in AOP omrežjih, če le-ti vsebujejo dovolj podatkov kvantitativnih meritev za določitev verjetnosti, da navzgornji dogodek vodi do navzdolnjega²⁶. Bayesovo formulo za izračunavanje »pogojne verjetnosti« se pogosto uporablja za verjetnostna induktivna sklepanja od opaženih posledic k hipotezam o možnih vzrokih teh posledic²⁸.

10

Formula za izračun pogojne verjetnosti, Bayesova formula:

𝑃𝑃(𝐻𝐻|𝑒𝑒) =𝑃𝑃(𝑒𝑒|𝐻𝐻)⋅ 𝑃𝑃(𝐻𝐻) 𝑃𝑃(𝑒𝑒)

P pomeni verjetnost (angl. probability). P(H|e) pomeni verjetnost hipoteze H ob danih novih opažanjih e (znak ‘|’ pomeni ‘ob’ ali ‘spričo’ ali ‘po’). To verjetnost običajno imenujemo posteriorna verjetnost, P(H) pa je apriorna verjetnost hipoteze H. Za izračun posteriorne verjetnosti P(H|e) moramo torej vedeti/oceniti:

(1) kolikšna je verjetnost opažanja e ob (privzeti) hipotezi H, tj. P(e|H);

(2) kolikšna je apriorna verjetnost hipoteze H, tj. P(H);

(3) kolikšna je verjetnost za samo opažanje e, tj. P(e).

Z uporabo metode BN v kavzalnih bioloških omrežjih, ob zadostnih kvantitativnih podatkih, lahko izračunamo pogojno verjetnost določenega izida ob vstopni motnji entitete²⁸.

1.1.2.2 Kavzalno modeliranje bioloških omrežij

Kavzalno modeliranje je širši pojem za združevanje kvantitativnih meritev od odmerka odvisnih odzivov na nivoju omrežja in mehanističnih povezav kavzalnih omrežij. Takšne metode omogočajo razlago odziva celičnega sistema ali organizma izpostavljenega biološko aktivnim substancam²⁶.

1.1.2.3 Primer kavzalnega modeliranja: Uporaba dveh nivojev kavzalnega omrežja Osnovnemu biološkemu kavzalnemu omrežju, ki je t.i. funkcionalni nivo, se lahko doda podnivoje omrežja oziroma dodatno omrežje, ki vsebuje druge informacije. Te informacije so lahko izmerjene spremembe na nivoju transkriptov ob motnji določene entitete v osnovnem omrežju, ki so še vedno kavzalno povezane z osnovnim omrežjem, kot tudi med seboj (slika 3). Ko se v toksikološkem eksperimentu izmerijo spremembe na nivoju transkriptov ob izpostavljenosti kemikaliji, se lahko primerja transkriptomske vzorce in tako sklepa, ali je izpostavljenost kemikaliji dejansko povzročila motnjo entitete v osnovnem omrežju.

11

Slika 3: Primer modeliranja kavzalnega biološkega omrežja. Oranžno je obarvano osnovno biološko kavzalno omrežje. Črno je obarvano dodatno omrežje, ki zajema podatke o spremembah transkriptov ob motnji osnovnega omrežja²⁶.

Z združitvijo dveh nivojev je na tak način omogočena ocena vodilnih (angl. Leading Node; LN) oziroma gonilnih vozlišč motnje sistema, ker preko transkriptomskega nivoja vidimo katero vozlišče funkcionalnega nivoja je najbolj perturbirano. Vodilna vozlišča so vozlišča v osnovnem nivoju kavzalnega omrežja, katera so odgovorna za 80 % perturbacijske amplitude omrežja in so zato najbolj odgovorna za motnjo sistema.

Amplituda je vrednost, ki temelji na eksperimentalnih podatkih (izražanje genov po izpostavitvi kemikaliji) in topologije funkcionalnega omrežja (kje se nahaja vozlišče v omrežju, kdo so njegovi sosedje, itd.). Takšen pristop učinkovito združuje transkriptomske podatke in mrežne modele, kar omogoča enostavnejšo interpretacijo transkriptomskih podatkov in kvantitativno oceno izida^2,26.

1.2 Pot z neželenim izidom (AOP)

Koncept AOP povezuje molekularni iniciatorski dogodek z neželenim izidom preko vmesnih ključnih dogodkov. Takšne poti omogočajo interpretacijo molekularnih podatkov in računalniških modelov na osnovi dosedanjega biološkega znanja za potrebe področja toksikologije^1,9.

AOP opisuje linearno zaporedje dogodkov, kateri se začnejo z interakcijo motilca (kemikalije) in biološke molekule v organizmu, kar pripelje do motnje biološkega stanja.

Začetna interakcija motilca z biološkimi molekulami se imenuje molekularni iniciatorski dogodek (MIE). MIE lahko napreduje preko številnih ključnih dogodkov (KE) do

12

neželenega izida (AO). Ključni dogodki v zaporedju so merljive biološke spremembe, za katere je mogoče pričakovati, da pripeljejo do neželenega izida ob zadostni začetni motnji vstopnega dogodka (MIE) (slika 4). AOP-ji ne opisujejo vseh bioloških podrobnosti poti, ampak se osredotočajo na opis kritičnih točk, katere vodijo do neželenega izida. Te morajo biti merljive in imeti napovedno moč, ker so tako neposredno uporabne v regulativni toksikologiji²⁹.

Slika 4: Shematski prikaz poti z neželenim izidom. Slika prikazuje, kako lahko gradnike biološkega sistema z usmerjeno povezavo sestavimo v celoto (AOP).

Modularno opisani KE so povezani preko bolj specifičnih KER.

Organizacija obstoječega znanja v opise poti z neželenim izidom omogoča sistematično in transparentno sestavljanje oziroma povezovanje dokazov, ki podpirajo biološke motnje entitet v uporabne predikcije potencialnih nevarnosti. Čeprav je poudarek razvoja AOP zajemanje in organizacija znanja, lahko postopek razvoja pomaga zapolniti vrzeli v znanju in tako pripomore k boljšemu razumevanju bioloških sistemov. S tem je glavni cilj razvoja AOP-jev dovolj podroben opis ključnih gradnikov, KE in KER, kateri povezujejo MIE in AO, da podprejo uporabo številnih mehanistično utemeljenih podatkov pri oceni tveganja in regulativnem odločanju³⁰.

Ključni dogodki (KE) so merljive biološke spremembe, ki so nujne za napredovanje AOP.

Ključnost pomeni, da imajo KE vzročno vlogo v poti, tako, da če je KE preprečen ali se ne zgodi, ne bo prišlo do napredovanja po AOP navzdol do neželenega izida. KE so ključnega pomena za napredovanje po AOP, vendar niso nujno zadostni. Samo zato, ker opazimo določen KE, še ne pomeni, da bo motnja nujno napredovala vse do neželenega izida. Pogoji, pod katerimi je mogoče pričakovati napredovanje, so opisani kot odnos med

13

dvema KE-jema imenovan KER, ki zaporedno in usmerjeno povezuje dva ključna dogodka²⁹.

1.3 AOP baze znanja

Združevanje in standardizirana organizacija znanja sta ključnega pomena za celostno izrabo potenciala AOP-jev. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj (angl.

Organisation for Economic Co-operation and Development; OECD) je v ta namen razvila vrsto orodij, skupaj znanih kot AOP baza znanja (angl. AOP knowledge base), ki omogoča standardizirano, sistematično strukturo za razvoj AOP-jev in širjenje znanja.

Eno od teh orodij, AOP-wiki (www.aopwiki.org), omogoča sodelovanje razvijalcev pri razvoju AOP-jev z zbiranjem in povezovanjem strokovno kuriranega AOP znanja preko enotnega ogrodja za opise AOP-jev (slika 5)^15,31.

Slika 5: Prikaz vsebine spletne strani AOP-Wiki. Spletna stran omogoča pregled objavljenih AOP-jev, ključnih dogodkov, odnosov ter motilcev. Poleg tega je možen tudi prenos znanja, ki je že opisan v bazi za uporabo v drugih orodjih.

Ko je nov AOP dodan v bazo AOP-Wiki, se AOP samodejno poveže v AOP omrežje, kadar je ključni dogodek ali razmerje med ključnima dogodkoma skupen večim AOP- jem. To je pomembno, ker razvijalci AOP-jev tako niso omejeni na opisovanje samo linearnih poti in lahko namerno opisujejo kompleksnejše strukture, ki so bolj zapletene kot ena motnja, ki vodi v en neželen izid. Takšen proces lahko razumemo kot razvoj AOP- jev na podlagi AOP omrežja. Prednost razvoja AOP na podlagi AOP omrežja je, da se konceptualno in metodološko ne razlikuje od razvoja in opisa posameznih AOP: enaka

14

načela, smernice in prakse v smislu opisa v okviru AOP-Wiki veljajo. Za razvoj omrežja AOP ni potrebno storiti ničesar drugega, kot je za opis linearnega AOP-ja, razen namerno deliti opise ključnih dogodkov ali povezav ključnih dogodkov med več kot enim AOP- jem (slika 6)³².

Slika 6: Primer, kako se AOP v AOP-Wiki vključi v omrežje AOP-jev. AOP25 (https://aopwiki.org/aops/25). Obarvani elementi pripadajo izbranemu AOP-ju. Sivi elementi pa so drugi AOP-ji, ki si delijo z izbranim AOP-jem ključni dogodek ali povezave/odnose med ključnimi dogodki. Rumeno obarvan kvadrat je skupni AO.

1.4 AOP-omrežje

AOP omrežje je definirano kot skupek dveh ali več AOP-jev, ki si delijo enega ali več ključnih dogodkov (slika 7). Če so gradniki (KE in KER) AOP-jev opisani modularno, to omogoča povezljivost med AOP-ji in posledično nastanek omrežij. V AOP omrežju KE predstavljajo vozlišča, medtem ko KER predstavljajo usmerjene robove, ki ta vozlišča povezujejo. Z uporabo »predpostavljene« oblike AOP-jev in dodajanjem novih AOP-jev

15

v AOP-KB, lahko omrežja AOP zajamejo širše znanje o obsegu možnih AO-jev, ki jih lahko povzroči MIE, ali o različnih načinih, preko katerih lahko pride do določenega AO.

Omrežja AOP so ključnega pomena tudi za obravnavanje izpostavljenosti več stresorjem, ki vodijo do istega AO, ali posameznim stresorjem, ki motijo več MIE, ter razumevanje potencialnih interakcij med AOP-ji ^1,16.

Slika 7: Shematski prikaz povezljivosti modularnih enot v AOP. Prikazana je povezljivost modularnih enot kot so ključni dogodki (KE#) in odnosi med njimi (puščice), kateri lahko nastopajo v več različnih AOP-jih in tako tvorijo AOP omrežje. Obarvani kvadrati predstavljajo enak KE, ki je skupen večim AOP-jem.

1.5 Načela razvoja AOP

AOP so zasnovani kot enotno linearno zaporedje dogodkov, ki potekajo od MIE do AO preko KE in KER. To pomeni, da opisujejo, kako lahko določen MIE povzroči specifičen AO, ne vseh možnih AO, prav tako tudi ne vseh možnih načinov, ki pripeljejo do AO.

Različni AOP-ji pa si lahko delijo sestavne dele. Zato je zaželeno, da se ključne dogodke (KE) opisuje kot diskretne (modularne) enote brez navezovanja na specifične MIE, AO ali druge KE. Prav tako naj se opis razmerij med diskretnimi pari KE (KER) ne navezuje na druge ključne dogodke v AOP-ju. Takšen način opisovanja omogoča razvoj generičnih ključnih dogodkov ali pa njihovih razmerji in kot taki se lahko povezujejo z drugimi AOP-ji (Slika 8). Takšen pristop k opisovanju AOP-jev omogoča tudi boljšo doslednost in povečuje učinkovitost procesa razvoja AOP-jev, ker razvijalcem AOP-jev ni potrebno ponovno v celoti opisovati ključnega dogodka ali razmerij med njimi. Prav tako takšen pristop olajša posodabljanje opisov KE in KER, saj se razvijajo nove metode za merjenje sprememb KE in nastajajo novi dokazi, ki podpirajo KER. Navsezadnje, ker si AOP-ji delijo gradnike, takšen pristop opisovanja omogoča nastanek AOP omrežij (slike 6, 7, 8)²⁹.

16

Slika 8: Shematski prikaz AOP in povezljivosti med njimi. Povezovanje AOP-jev prikazuje, kako se lahko zaradi dveh modularnih skupnih enot (KE 1, KE 2) sestavi omrežje štirih AOP-jev. Vsak AOP je obrobljen s svojo barvo.

AOP opisi odražajo trenutno znanje, a so živi dokumenti, ki se sproti spreminjajo, ko so na voljo dodatne informacije. Pri vpisovanju AOP v AOP-Wiki tako ni treba popolno izpolniti vseh informacijskih polj, saj se predvideva, da imajo lahko AOP pomanjkljive opise, ki se bodo sčasoma dopolnjevali z napredovanjem znanosti, razvojem analiznih tehnologij, potreb človeštva in prispevki drugih raziskovalcev²⁹.

1.5.1 Ocena zaupanja v dokaze KE, KER in AOP

Pri razvoju AOP je ključen sistematičen pregled znanstvene podprtosti KE, KER in celotnega AOP. Dva glavna pristopa se uporabljata za določanje zaupanja v AOP-je. Prvi je prirejeni kriterij Bradford-Hill za oceno kavzalnosti. Pri tem kriteriju zaupanje temelji na razvijalčevi strokovni presoji količine in kakovosti podatkov, ki podpirajo (1) Biološko verjetnost (angl. biological plausibility) KER; (2) Ključnost (angl. essentiality) KE; in (3) empirične dokaze za od časa in od odmerka odvisne odzive. Drugi pristop pa se osredotoča na znanstveno zaupanje v uporabljene analizne metode, razvoj napovednih modelov, ter njihove uporabnosti in sprejemljivosti v regulativni skupnosti³³. Za

17

sistematično ocenjevanje AOP in njegovih gradnikov OECD predlaga uporabo prirejenega Bradford-Hill kriterija. Ocena teže dokazov s tem kriterijem poda zrelost oziroma nivo zaupanja v AOP ³³. Uporaba kriterija je podrobno opisana v sekciji Materiali in metode.

Z uporabo pristopa ocenjevanja AOP-ja, katerega predlaga OECD, je mogoče izvesti kvalitativno, celostno oceno nizke, zmerne ali visoke stopnje zaupanja v AOP.

Ocenjevanje biološke verjetnosti ključnih dogodkov pomaga pri identifikaciji vrzeli v trenutnem znanju in negotovosti v AOP, kar navsezadnje definira nivo zaupanja, s katerim se AOP lahko uporabi za napovedovanje neželenega izida v regulativne namene.

Čeprav so za napovedovanje nevarnosti kemikalij v resničnem svetu potrebna kompleksna dobro definirana AOP omrežja, lahko biološke poti ali procesi, predstavljeni v posameznih AOP-jih, pripomorejo k povečanju razumevanja dogodkov s slabo znanstveno podporo^14,31. Razvoj AOP-jev, ki niso popolno opisani (npr. manjka MIE, ali pa določeni dogodki niso dobro definirani), je tako še vedno uporaben, saj lahko izpostavi slabo raziskane spremembe in procese, ki vodijo do neželenih izidov. To je možno, ker AOP preko opisov ključnih dogodkov in ocene biološke verjetnosti in ključnosti KE vodi pregled trenutnega znanja, trdnosti dokazov KE ter KER^14,34.

AOP z nizko oceno zaupanja nimajo zadostnih informacij za podprtje vsakega izmed ključnih dogodkov (KE) in/ali odnosov med njimi (KER). Dokler se kritični, merljivi dogodki, kot je MIE v AOP-ju, lahko statistično povežejo z neželenim izidom, so AOP- ji z nizko oceno zaupanja in negostovostmi glede vmesnih KE, lahko zelo uporabni pri kategorizaciji, ekstrapolaciji kemikalij ter določanju stopnje nevarnosti pri izpostavitvi kemikaliji. Pri AOP-jih z zmerno oceno ponavadi le določeni ključni dogodki niso dobro znanstveno podprti. Takšni AOP-ji še vedno lahko služijo kot ogrodje za oceno negativnih vplivov določenih kemikalij na organizme. Prav tako lahko izpostavijo določena področja v poteh, kjer bi bilo potrebno več raziskav vmesnih ključnih dogodkov za boljše razumevanje (lahko že dobro raziskanega) neželenega izida. V regulatorne namene se AOP-ji z dobro oceno zaupanja lahko uporabijo, dokler raziskave od odmerka odvisnega odziva in vivo ter in vitro podajo povezavo z neželenim izidom. AOP-ji z visokim nivojem zaupanja so poti, kjer so MIE/KE kavzalno povezani in obstaja kvantitativna povezava med vsemi KE in AO. Takšni AOP-ji so uporabni za razvoj kvantitativnih napovednih modelov, ki omogočajo ekstrapolacijo in vitro meritev do verjetnosti pojava AO in vivo¹⁴.

18

1.5.2 Opisovanje in ocenjevanje AOP

AOP-Wiki in OECD sta objavila smernice, katere je treba upoštevati pri opisu AOP-jev.

Vsa informacijska polja je potrebno kar se da temeljito izpolniti in podati reference dokazov. Za posamezne gradnike AOP in celotni AOP je potrebno oceniti biološko verjetnost odnosov med ključnimi dogodki (KER), ključnost KE in empirične dokaze KER. Biološka verjetnost se nanaša na strukturno ali funkcionalno razmerje med KE, kot je opredeljeno predvsem z razumevanjem "normalne" nemotene biologije³⁵. Na primer, če je znano, da je za signalizacijo Plxna2 receptorja potrebna fosforilacija tirozinskih ostankov Plxna2, je zelo verjetno, da bi lahko inhibicija Fyna kinaze, katera je odgovorna za fosforilacijo, preprečila signalizacijo. Biološka verjetnost se ne nanaša na točno izmerjene dokaze motnje, ampak na trenutno znanje, ki podpira odnos. Dokazi za ključnost KE se nanašajo na dokazovanje, da, če se prepreči dani KE, se ne pojavijo tudi drugi navzdolnji KE za dani AOP. Dokazi o ključnosti KE učinkovito vzpostavljajo navzgornji KE kot vzrok za spremembe v naslednjih KE v zaporedju. Klasične vrste poskusov, ki se uporabljajo za ugotavljanje ključnosti, vključujejo izbijanje genov ali prekomerno izražanje, sočasno zdravljenje s farmacevtskimi substancami z nasprotnim delovanjem ali študije ustavitve izpostavljenosti in okrevanja. Nazadnje, empirični dokazi se nanašajo na posebne dokaze analiz, ki kažejo, da se ob pojavu navzgornjega KE ponavadi pojavi tudi spodnji KE, in to na način, ki je skladen s predpostavko vzročne zveze. Med njimi je biološka verjetnost najbolj pomembna pri ocenjevanju splošne teže podatkov ali zaupanja v odnose med KE²⁹.

Za določanje ocene teže dokazov OECD postavlja vprašanja izpeljana iz Bradford-Hill- ovega kriterija biološke verjetnosti, ključnosti ključnih dogodkov in podpore empiričnih dokazov, na podlagi katerih razvijalci AOP vsakemu biološkemu podatku pripiše t.i.

oceno "visoko", "zmerno" ali "nizko" na podlagi dokazov KE in KER.

1.5.2.1 Ocena teže dokazov biološke verjetnosti KER

Za oceno teže dokazov biološke verjetnosti si mora razvijalec zastaviti naslednje vprašanje. Ali je mehanistični (strukturni ali funkcionalni) odnos med navzgornjim in navzdolnjim ključnim dogodkov konsistenten s trenutnim sprejetim znanjem biologije.

Ocena visoko se odnosu pripiše, če je razumevanje odnosa med KE široko sprejeto, podrobno in stoji na obsežni predhodnji dokumentaciji. Ocena odnosa zmerno se pripiše KER, če je ta možen glede na analogijo sprejetih bioloških odnosov, vendar znanstveno razumevanje še ni celotno postavljeno. Ocena nizko se pripiše, če obstaja empirična podpora za statistično povezavo med KE, vendar strukturni ali funkcionalni odnos med njimi ni podprt s trenutnim znanjem²⁹.

19

1.5.2.2 Ocena teže dokazov ključnosti KE

Za določanje ocene teže zaupanja v dokaze ključnosti KE si morajo razvijalci odgovoriti na vprašanje: Kakšen je vpliv na navzdolnje KE in/ali AO, če je navzgornji KE preprečen? Ocena visoko se pripiše, če obstajajo neposredni dokazi iz posebno zasnovanih eksperimentalnih raziskav, ki kažejo preprečitev ali spremembo navzdolnjih KE in/ali AO, če je navzgornji KE preprečen ali spremenjen. Oceno zmerno se pripiše, če obstajajo posredni dokazi, da sprememba navzgornjih KE vodi do spremembe (poveča, zniža) navzdolnjih KE in/ali AO. Ocena nizko se pripiše, če podatkov o ključnosti ni ali pa obstaja veliko nasprotujočih eksperimentalnih dokazov²⁹.

1.5.2.3 Ocena teže zaupanja v empirične dokaze KER

Za določanje ocene teže zaupanja v empirične dokaze KER si morajo razvijalci zastaviti naslednji dve vprašanji. Ali empirični dokazi podpirajo, da sprememba navzgornjega ključnega dogodka (KEup) vodi do ustrezne spremembe v navzdolnjem ključnem dogodku (KEdown)? Ali navzgornji KE nastane pri nižjih odmerkih in časovno prej pride do izraza kot navzdolnji KE? Ocena visoko se KER pripiše, če pride do odvisnih sprememb v obeh dogodkih (KEup, KEdown) po izpostavljenosti številnim specifičnim motilcem, obstajajo obsežni dokazi o od časa in od odmerka odvisnem odzivu in ni (ali jih je zelo malo) nasprotujočih dokazov. Ocena zmerno se pripiše, če obstajajo podatki, ki kažejo, da pride do ustrezne spremembe obeh KE po izpostavitvi majhnemu številu motilcev/kemikalij. Če dokaze, ki se ne ujemajo z predpostavljeno spremembo, lahko razložimo z faktorji, kot so različno eksperimentalno oblikovanje, tehnični pomisleki, razlike med laboratoriji, itd. lahko teži empiričnih podatkov vseeno pripišemo oceno zmerno. Oceno nizko se pripiše, če empiričnih podatkov za dokazovanje KER ni (od časa in od odmerka odvisnega odziva), ali pa obstajajo številna neujemanja med raziskavami na istem ali drugem organizmu²⁹

20

2 Namen dela in hipoteze

Namen magistrskega dela je ugotoviti, ali je mogoče z ustreznimi spremembami obstoječih kavzalnih omrežij, izkoristiti njihov potencial za razvoj omrežja potencialnih AOP. Zato smo v začetku raziskovalnega dela z različnimi računalniškimi programi, kot so Excel, Cytoscape, Perl in Rstudio, predelali že obstoječi kavzalni omrežji razvojne kardiotoksičnosti in nevrotoksičnosti cebrice v omrežji potencialnih AOP-jev. Predelati jih je potrebno zato, ker začetna omrežja vsebujejo veliko podatkov, ki jih ne potrebujemo za razvoj AOP in ne vsebujejo podatkov, preko katerih bi lahko izvedli filtriranje omrežja za izpostavitev linearnih poti, katere bi služile razvoju AOP. V drugem delu raziskovalnega dela smo iz podomrežji, katera so predstavljala potencialne linearne poti, izbrali dve linearni poti, ki sta ustrezali zastavljenim kriterijem za nadalnji razvoj v AOP.

Za izbrana potencialna AOP-ja smo pregledali literaturo, na kateri je temeljila kavzalnost njunih gradnikov in poiskali dodatne dokaze za njun opis in dodelitev ocene teže dokazov, na katerih temeljijo KE, KER in celotna AOP-ja.

Glede na navodila za opisovanje AOP s strani Organizacije za gospodarsko sodelovanje in razvoj (angl. Organisation for Economic Co-operation and Development; OECD) smo izbrani linearni poti razvili v AOP-ja ju opisali in ocenili težo zaupanja v dokaze. Z oceno teže dokazov (angl. Weight of Evidence assessment; WoE) smo tako pokazali do kakšne stopnje razvitosti lahko AOP z našim pristopom razvijemo iz biološkega kavzalnega omrežja. Polno razvita AOP-ja smo objavili v bazo AOP-jev AOP-Wiki (https://aopwiki.org/).

Pred začetkom dela smo postavili hipotezi:

1. Iz bioloških kavzalnih omrežij lahko z ustreznimi pristopi urejanja in reduciranja podatkov pridemo do velikega števila potencialnih AOP.

2. Če izhajamo iz biološkega kavzalnega omrežja, bodo razviti AOP-ji imeli zelo dobro oziroma visoko oceno teže dokazov biološke verjetnosti.

21

3 Materiali in metode

Razvoj AOP-jev smo začeli iz dveh osnovnih kavzalnih bioloških omrežij, kavzalnega omrežja kardiotoksičnih izidov in kavzalnega omrežja nevrotoksičnih izidov, kateri so razvili na Nacionalnem inštitutu za biologijo in Eawag, Švica. Za izgradnjo kardiotoksičnega in nevrotoksičnega omrežja so bili za osnovo uporabljeni članki, ki so opisovali kardiotoksične/nevrotoksične izide v embrionalnih razvojnih stopnjah cebrice, kot posledico izpostavitve kemikalijam ali kot rezultat analiz pridobitve in/ali izgube funkcije genov. Za razvoj AOP-jev smo z različnimi računalniškimi metodami obe omrežji spremenili v omrežji potencialnih AOP-jev, katera so omogočala boljši pregled možnih linearnih poti. Sledil je pregled literature, oziroma dokazov ustreznih poti z neželenim izidom in opis najboljših.

Osnovno kardiotoksično omrežje:

Omrežje kardiotoksičnih izidov je bilo kurirano iz 81 člankov. Vsebuje 277 vozlišč in 412 robov. Med dokaze kardiotoksičnosti so bile vključene tudi študije, ki so temeljile na podatkih pridobljenih na drugih modelnih organizmih (miš, podgana). Ti podatki so bili uporabljeni za zapolnitev manjkajočih povezav med vozlišči, ki ustrezajo evolucijsko ohranjenim molekularnim potem (npr. MAP kinazna signalna pot). Omrežje vsebuje 381 od skupno 606 dokazov odnosov, ki izvirajo iz študij na drugih organizmih. Omrežje

(v1.0) je prosto dostopno na spletnem naslovu:

http://causalbionet.com/Home/NetworkVisualization/#/!/networkGraph?ID=5ea034420 1dd7708605b4e09

Omrežje vsebuje 5 patologij:

● Odpoved srca: srčno popuščanje, ki vodi do odpovedi srca.

● Perikardni edem: je posledica kopičenja tekočine v osrčniku.

● Endomiokardično fibrozo: fibrozne spremembe v endo- in miokardu.

● Hipertrofija: patološko povečanje srčne mišice.

● Bradikardijo: patološko upočasnjen srčni utrip.

22

Osnovno nevrotoksično omrežje:

Omrežje nevrotoksičnih izidov je bilo kurirano iz 90 člankov. Vsebuje 515 vozlišč in 682 robov. Nevrotoksično omrežje je vsebovalo samo dokaze pridobljene na cebrici. V omrežju je 11 od 972 povezav z dokazi na ljudeh in miših, kateri so stranski produkt rudarjenja literature. Starejša verzija omrežja (v1.0) je prosto dostopno na spletnem naslovu:

http://causalbionet.com/Home/NetworkVisualization/#/!/networkGraph?ID=5ff47ba901 dd761144521b5e.

Omrežje vsebuje 5 patologij:

● Mikroftalmija: sindrom majhnega očesa, nenormalno majhno in slepo oko ali obe očesi.

● Mikrocefalija: nenormalna majhnost glave, najpogosteje zaradi motenega razvoja možganov.

● Nevrogeno vnetje: vnetje, ki je posledica motnje perifernega živčnega sistema.

● Hidrocefalija ali vodenoglavost: prekomerno nabiranje cerebrospinalne tekočine v možganih in drugih anatomskih strukturah v lobanji.

● Megaloencefalija: nenormalno veliki možgani.

BEL stavki kardiotoksičnega in nevrotoksičnega kavzalnega omrežja so bili generirani z BELIEF, semiavtomatizirano kuracijsko platformo za zaznavanje genov in imen proteinov cebrice v znanstvenih besedilih^19,36. Za odkrivanje imen genov in proteinov cebrice v znanstvenem besedilu in njihovo kodiranje v BEL programskem jeziku so v BELIEF vključili dve novi komponenti, modul za prepoznavanje imenovanih entitet in imenski prostor genov cebrice za BEL (ZFIN). Kot modul za prepoznavanje imenovanih entitet so uporabili programsko opremo ProMiner, ki olajša zaznavanje imen genov in proteinov cebrice v besedilih s pristopom, ki temelji na slovarskih geslih dobljenih iz baz podatkov (npr. ZFIN). Pri izdelavi slovarja za ProMiner in imenskih BEL prostorov so zbrali imena genov cebrice in tem pripadajoče edinstvene identifikatorje (angl. unique identifier) iz ZFIN-a, ki služi kot baza podatkov cebrice. Baza ZFIN ponuja podatke o genetskih označevalcih, vključuje identifikatorje, simbole in imena različnih genetskih objektov, kot so geni, psevdogeni in prepisi. Iz te baze podatkov so poiskali vse gene in psevdogene, skupaj z njihovimi edinstvenimi identifikatorji. Uporabljene so bile preslikave med genetskimi označevalci zebrafish in bazo znanja UniProt, ki jih

23

zagotavljata baza podatkov ZFIN Marker

(http://zfin.org/downloads/genetic_%20markers.txt) in UniProtKB³⁷. Izjave BEL so bile nato zbrane v povezano omrežje z uporabo odprtokodnega ogrodja za za združevanje BEL izjav OpenBEL 3.0.0 (https: // github. com / OpenBEL / openbel-framework)².

3.1 Biološki ekspresijski jezik (BEL)

Biološki kavzalni omrežji, iz katerih smo izhajali pri razvoju poti z neželenim izidom, sta bili narejeni z uporabo BEL programskega jezika, verzija 1.0 (https://github.com/OpenBEL/language). BEL (www.openbel.org) omogoča modeliranje znanja v računalniški obliki in se uporablja za predstavitev biološkega znanja, zajetega v vzročnih in medsebojnih odnosih. BEL sestavljeni odnosi so trojčki, ki vsebujejo levi interaktor (navzgornje vozlišče), odnos oziroma tip interakcije (ki predstavlja razmerje med interaktorjema) in desni interaktor (navzdolnje vozlišče). Lahko je predstavljen v treh različnih strojno berljivih oblikah: v XML, ogrodju za opis virov dokazov (angl.

resource description framework) in BEL skripti. Slednja je blizu nestrukturiranemu besedilu, oziroma zelo podobno človeškemu jeziku (slika 9), vendar še vseeno omogoča strukturirano sintakso (strojno berljivost). Zaradi podobnosti nestrukturiranemu besedilu je zelo primeren za avtomatizirano pridobivanje in kodiranje znanja. BEL je bil zasnovan tako, da predstavlja diskretne znanstvene ugotovitve in njihove ustrezne kontekstualne informacije kot kvalitativne vzročne zveze, ki lahko vodijo na znanju temelječo analitiko (angl. knowledge-based analytics). Jezik podpira primerjanje in uporabo znanstvenih spoznanj za dinamično sestavljanje bioloških modelov. Biološki modeli segajo od velikih modelov, ki jih lahko štejemo za (kavzalna) biološka omrežja, do majhnih modelov, ki predstavljajo biološke poti ali pa celo biološke poti z neželenim izidom (AOP). Baza znanja, kodirana v BEL, se lahko uporablja za poizvedovanje, interpretacijo, analizo in vizualizacijo omrežij. Takšni podatki o odnosih v računalniški obliki služijo pristopom sistemske biologije, zlasti mrežnim pristopom, ki so se pojavili kot močno orodje za razlago podatkov, pridobljenih z visokoprepustnimi analiznimi tehnologijami^19,38.

24

Slika 9: Primer BEL generirane izjave in sestavnih delov. GBX2 in FOXI1 sta entitete v izjavi. Tip interakcije med entitetama je inhibicija. ZFIN predstavlja imenski prostor, s katerim so bila zajeta imena entitet v besedilih. BEL pripisana funkcija podaja informacijo o vrsti entitete (p-protein).

Vozlišča v BEL stavkih predstavljajo (biološke) entitete, kot so RNA, protein, metaboliti, kemikalije, biološki procesi ali patologije. Odnosi pa predstavljajo pozitivno ali negativno regulacijo. BEL ustavljeni nabori podatkov vsebujejo poleg BEL izjave tudi metapodatke, kot so: publikacija, uporabljena za ustvarjanje izjave, modelni organizem, tkivo in eksperimentalno metodo, s katero je bila izmerjena sprememba entitete. BEL generirani stavki vsebujejo pripise kot so BEL funkcije in imenski prostori za popoln opis BEL stavkov (slika 9). Imenski prostori se uporabljajo kot reference za ontologije in slovarje, ki so bili uporabljeni za zajem bioloških entitet v besedilih (npr. ZFIN)(slika 9). Pripisane BEL funkcije pa definirajo vrsto entitete, ki označuje protein) (slika 9)³⁹. Večina BEL generiranih podatkov in pripisov ni potrebnih za izgradnjo omrežja potencialnih AOP- jev, zato je bilo potrebno odvečne podatke odstraniti. Iz osnovnega BEL nabora podatkov tako nismo uporabili anotacij celic, celičnih linij, bolezni, anatomije (tu so navedene razvojne stopnje ali organi), ki jih je računalniški delovod uporabil za definiranje izjave.

25

3.2 Izdelava nabora podatkov za definicijo odnosov vozlišč in definicijo vozlišč omrežja potencialnih AOP.

Slika 10: Procesni diagram izdelave naborov podatkov za definicije vozlišč in njihovih odnosov. Koraki računalniške in biološke kuracije, ki vodijo iz začetnega biološkega kavzalnega omrežja do potencialnih AOP.

Za vizualizacijo omrežja v programu Cytoscape je potrebno omrežje definirati z dvema naboroma podatkov²³. Prvi nabor podatkov zavzema definicije odnosov med vozlišči

26

(reakcijske anotacije) in drugi nabor vsebuje podatke za definicijo vozlišč (anotacije vozlišč).

3.2.1 Izdelava nabora podatkov za definicijo odnosov vozlišč omrežja potencialnih AOP

Za izdelavo nabora podatkov o odnosih vozlišč smo iz osnovnega omrežja kardio- in nevro-toksičnih izidov izbrali podatke, ki so bili potrebni za izgradnjo našega novega omrežja potencialnih AOP-jev kardio- in nevro- toksičnih izidov (slika 11).

Slika 11: Primer začetnega nabora podatkov iz osnovnega omrežja. Podatki, katere smo kopirali iz osnovnega nabora podatkov in tako ustvarili naš začeten nabor podatkov za definicijo odnosov med vozlišči. Posamezni okvirjeni izseki služijo lažji predstavi vsebine nabora podatkov.

Iz nabora podatkov osnovnih omrežij smo izbrali naslednje podatke za definicijo odnosov (slika 11): Tip interakcije (intType), BEL generirano izjavo (reaction_BEL), levi interaktor (intL), desni interaktor (IntR), referenco literature (2_Citation), stopnjo zaupanja (2_Confidence), metodo uporabljeno za analizo spremembe entitete (2_Eco), dokaz oziroma stavek iz literature, na podlagi katerega je bila sestavljena BEL izjava (2_Evidence) in modelni organizem (2_SpeciesNames).

Nabor podatkov o odnosih vozlišč je vseboval vse pripise BEL funkcij in imenskih prostorov (slika 9). Pripisov v omrežju potencialnih AOP-jev ne potrebujemo, zato smo ustvarili nov reduciran nabor podatkov, kateremu smo odstranili vse pripise (BEL funkcije in imenske prostore), celostnega pa smo obdržali za morebitno kasnejšo pomoč in orientacijo (slika 12). Pripisi BEL funkcij in imenskih prostorov so podrobneje opisani v prilogi (poglavje 8.1.). Pripisi so različni in v končni fazi pomnožijo določene BEL

27

generirane izjave in so nepomembni iz vidika razvoja AOP (npr. podajo podatek, da je ista entiteta v omrežju v obliki aktivnega proteina in mRNA) (Slika 13).

Slika 12: Primer izbrisa pripisov interaktorjev v skrajšanem naboru podatkov odnosov med vozlišči. V nizu podatkov reaction_BEL vidimo prisotne vse pripise (BEL funkcije (a(…), p(…)) in imenskih prostorov (CHEBI)) pod nizi intL in intR pa so pripisi odstranjeni.

3.2.2 Izdelava nabora podatkov za definicijo vozlišč omrežja potencialnih AOP Naslednji korak je bil sestaviti nabor podatkov za definicijo vozlišč. Iz nabora podatkov za definicijo odnosov med vozlišči smo kopirali imena levega in desnega interaktorja (entitet) v ločen nabor podatkov za definicijo vozlišč. Nabor podatkov je vseboval vsa imena interaktorjev (levi in desni interaktor) s pripisanimi BEL funkcijami in imenskimi prostori ter dodatno definicijo, kjer smo enako kot pri odnosih odstranili pripise (slika 13).

Slika 13: Primer izbrisa pripisov za ustvarjanje skrajšanega nabora podatkov za definicijo vozlišč. Levo so entitete omrežja z vsemi pripisanimi BEL funkcijami in imenskimi prostori. Desno je nabor entitet brez pripisov.