MAGISTRSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

MAGISTRSKO DELO

Tanja Peric

Ljubljana, 2022

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE BIOKEMIJA

Določanje funkcije proteaze CrMCA-I iz organizma Chlamydomonas reinhardtii

MAGISTRSKO DELO

Tanja Peric

M

ENTOR

: doc. dr. Marina Klemenčič

Ljubljana, 2022

(4)

(5)

(6)

IZJAVA O AVTORSTVU

magistrskega dela

Spodaj podpisana Tanja Peric sem avtorica magistrskega dela z naslovom Določanje funkcije proteaze CrMCA-I iz organizma Chlamydomonas reinhardtii.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr. Marine Klemenčič;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

 je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, _________ Podpis avtorice:

(7)

(8)

Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Biokemija. Delo je bilo opravljeno na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo UL.

Senat UL FKKT je za mentorico imenoval doc. dr. Marino Klemenčič.

Recenzenta: izr. prof. dr. Marko Novinec, izr. prof. dr. Marko Dolinar

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela

Predsednik komisije: izr. prof. dr. Marko Novinec, Univerza v Ljubljani, FKKT

Član: izr. prof. dr. Marko Dolinar, Univerza v Ljubljani, FKKT

Članica: doc. dr. Marina Klemenčič, Univerza v Ljubljani, FKKT

(9)

(10)

Zahvala

Rada bi se zahvalila doc. dr. Marini Klemenčič za mentorstvo in potrpežljivo vodenje tekom tega magistrskega dela. Zahvaljujem se tudi izr. prof. dr. Marku Dolinarju in izr. prof. dr. Marku Novincu za pregled magistrskega dela.

Hvala tudi Katarini, Niki, Vidi, Zali, Ani in Valentini za nasvete in pomoč pri delu.

Hvaležna sem tudi družini in prijateljem, ki so me v času izdelave magistrskega dela podpirali in mi stali ob strani.

(11)

(12)

Določanje funkcije proteaze CrMCA-I iz organizma Chlamydomonas reinhardtii

Povzetek:

Kaspaze so živalskecisteinske proteaze, ki igrajo odločilno vlogo pri regulaciji in izvedbi programirane celične smrti. Kaspaz pri neživalskih evkariontih ni, lahko pa tam najdemo njihove strukturne homologe, metakaspaze. Te ločimo na tri tipe, ki se med seboj razlikujejo po strukturi. Njihova natančna funkcija ni znana, je pa verjetno med drugim povezana tudi z odzivom na oksidativni stres.

V sklopu magistrskega dela smo se osredotočili na metakaspazo tipa I iz enocelične zelene alge Chlamydomonas reinhardtii, CrMCA-I. Piprava divjega tipa te proteaze v E. coli ni bila uspešna, saj se je ta proteaza sprva agregirala v netopni frakciji, dokler ji nismo odstranili hidrofobne N-končne regije in zanke 360, ki je značilna za metakaspaze tipa I iz organizmov iz klada Viridiplantae. Tako modificiran CrMCA-I (CrMCA-I_CL) smo izrazili v E. coli in ga izolirali. Podobno smo modificirali tudi zapisa za dve metakaspazi tipa I iz modelne rastline Arabidopsis thaliana, AtMCA-Ia in AtMCA-Ib, vendar nam jih ni uspelo pridobiti v topni frakciji.

Izoliranemu CrMCA-I_CL smo določili aktivnost pri različnih koncentracijah kalcijevih ionov in pri različnih pH. Ugotovili smo, da je CrMCA-I_CL neaktiven v odsotnosti Ca²⁺, največjo aktivnost pa doseže v nizkih milimolarnih koncentracijah Ca²⁺. Njegov pH optimum je v nevtralnem.

Poleg tega smo poskusili nemodificirano obliko CrMCA-I izraziti tudi v C. reinhardtii. Pri tem smo naleteli na težave z vzpostavljanjem stabilnih kolonij po transformaciji celic. Uspelo nam je pridobiti kolonije na trdnem gojišču z antibiotikom, vendar te kolonije po inokulaciji v tekoče gojišče niso zrasle.

Da bi ugotovili, ali lahko s protitelesi, ki so bila ustvarjena proti metakaspazi GtMCA-III, spremljamo prisotnost metakaspaz pri odzivu na oksidativni stres, smo pri divjem tipu C. reinhardtii in pri insercijski mutanti C. reinhardtii CrMCA-I::AphVII inducirali oksidativni stres. Glede na to, da metakaspaz s protitelesi v vzorcih nismo zaznali, bomo v prihodnje morali za njihovo prisotnost in aktivnost pri oksidativnem stresu uporabiti drugačne metode.

Ključne besede: metakaspaze, CrMCA-I, Chlamydomonas reinhardtii, oksidativni stres

(13)

Determining the function of protease CrMCA-I in Chlamydomonas reinhardtii

Abstract:

Caspases are cysteine proteases in animals that play an important role in programmed cell death regulation and execution. Caspases are absent in non-animal eucaryotes; however, they contain structural homologues of caspases, metacaspases. These can be divided into three types that can be differentiated based on their domain architectures. Their function is yet not known, although it is likely linked to oxidative stress responses.

In this work, we focused on CrMCA-I, the only type I metacaspase from the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. When expressed in E. coli, it aggregated in the insoluble fraction. However, removal of the N-terminal region and the 360 loop (CrMCA-I_CL) resulted in expression of soluble and proteolytically active protease. Since this loop is characteristic of type I metacaspases from organisms of the Viridiplantae clade, we also tried to express two sequences encoding metacaspases from Arabidopsis thaliana, AtMCA-Ia and AtMCA-Ib. However, we were not successful in their expression.

We measured the activity of the isolated CrMCA-I_CL at different concentrations of calcium ions and different pH values. CrMCA-I_CL was shown to be inactive in the absence of Ca²⁺ ions and reached its maximum activity at low millimolar Ca²⁺ concentrations. Its pH optimum was at neutral values.

We also tried to express non-modified CrMCA-I homologously in C. reinhardtii, but we encountered problems with establishing stable colonies after transformation. While colonies did appear on solid medium with antibiotic, no growth could be observed in liquid media.

To asses if presence of metacaspases during oxidative stress response could be monitored using anti-metacaspase antibodies, we induced oxidative stress in the wild type C. reinhardtii and in CrMCA-I insertion mutant CrMCA-I::AphVII. Since no metacaspase could be detected, other methods will have to be used in the future for monitoring the presence and activity of metacaspases in this organism.

Keywords: metacaspases, CrMCA-I, Chlamydomonas reinhardtii, oxidative stress

(14)

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.2 Zelene alge ... 1

1.2.1 Enocelična alga Chlamydomonas reinhardtii ... 1

1.2 Regulirana celična smrt pri rastlinah in zelenih algah... 2

1.2.1 Kaspaze in kaspazni homologi ... 3

1.2.2 Metakaspaze pri Arabidopsis thaliana ... 5

1.2.3 Metakaspaze pri Chlamydomonas reinhardtii ... 7

2 Namen dela in hipoteze ... 8

3 Materiali in metode ... 9

3.1 Reagenti ... 9

3.1.1 Kemikalije ... 9

3.1.2 Kompleti regentov ... 9

3.1.3 Gojišča ... 10

3.1.4 Pufri in ostale raztopine ... 12

3.1.5 Protitelesa ... 13

3.1.6 Encimi in ostali proteini ... 14

3.1.7 Standardi velikosti ... 14

3.1.8 Začetni oligonukleotidi ... 15

3.1.9 Vektorji ... 16

3.2 Sevi E. coli in C. reinhardtii ... 20

3.3 Aparature in oprema ... 20

3.4 Izražanje in izolacija metakaspaz tipa I v E. coli ... 22

3.4.1 Priprava zapisov za metakaspaze tipa I ... 22

3.4.2 Verižna reakcija s polimerazo ... 23

3.4.3 Rezanje z restrikcijskimi endonukleazami ... 24

3.4.4 Agarozna gelska elektroforeza ... 25

3.4.5 Izolacija DNA iz agaroznega gela in ligacija ... 25

3.4.6 Transformacija celic E. coli ... 26

(15)

3.4.7 Izolacija plazmidov iz celic E. coli in preverjanje

nukleotidnih zaporedij... 26

3.4.8 Izražanje proteinov in priprava vzorca za nikljevo afinitetno kromatografijo ... 26

3.4.9 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS ... 27

3.4.10 Nikljeva afinitetna kromatografija... 28

3.4.11 Ionskoizmenjevalna kromatografija ... 29

3.4.12 Gelska filtracija ... 29

3.5 Analiza encimske aktivnosti CrMCA-I ... 29

3.5.1 Analiza encimske aktivnosti CrMCA-I v odvisnosti od Ca²⁺ ... 30

3.5.2 Analiza encimske aktivnosti CrMCA-I v odvisnosti od pH ... 30

3.6 Transformacija Chlamydomonas reinhardtii ... 30

3.7 Analiza seva insercijske mutante CrMCA-I na stresni odziv C. reinhardtii ... 31

3.7.1 Prenos western in imunodetekcija ... 31

3.7.2 Liza celic Chlamydomonas reinhardtii ... 32

3.7.3 Test po Bradfordu... 32

4 Rezultati ... 34

4.1 Računalniška analiza aminokislinskih zaporedij metakaspaz tipa I ... 34

4.2 Priprava vektorjev za izražanje skrajšanih metakaspaz tipa I brez zanke 360 v E. coli in C. reinhardtii ... 35

4.3 Izražanje in čiščenje skrajšanih metakaspaz tipa I brezzanke 360 v E. coli ... 37

4.4 Analiza encimske aktivnosti CrMCA-I_CL v odvisnosti od koncentracije Ca²⁺ ... 39

4.5 Analiza encimske aktivnosti CrMCA-I_CL v odvisnosti od pH ... 40

4.6 Analiza rasti Chlamydomonas reinhardtii ... 41

4.7 Priprava celic Chlamydomonas reinhardtii za prekomerno izražanje CrMCA-I_FL ... 42

4.8 Preverjanje ustreznosti protiteles anti-GtMCA-III za detekcijo CrMCA-I_CL ... 43

(16)

4.9 Določanje prisotnosti endogenih metakaspaz v C. reinhardtii ... 44

5 Diskusija ... 47

6 Zaključek ... 50

7 Literatura ... 51

(17)

(18)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

3'-UTR neprevajujoča se regija na 3'- koncu (angl. 3'- untranslated region) 6×His heksahistidinska oznaka

A280 absorbanca pri valovni dolžini 280 nm AGE agarozna gelska elektroforeza

AMC 7-amino-4-metil kumarin APS amonijev persulfat

AtMCA metakaspaza iz Arabidopsis thaliana

AtSerpin inhibitor serinskih proteaz iz Arabidopsis thaliana CHAPS 3-[(3-holamidopropil)dimetilamonij]-1-propansulfonat CAPS N-cikloheksil-3-aminopropansulfonska kislina

CARD domena za vezavo kaspaz (angl. caspase recruitment domain) cCA karboanhidraza iz Chlamydomonas reinhardtii

CrMCA metakaspaza iz Chlamydomonas reinhardtii

DED efektorska domena smrti (angl. death effector domain) DHA dehidroaskorbat

DNA deoksiribonukleinska kislina EDTA etilendiamintetraocetna kislina GtMCA metakaspaza iz Guillardia theta

HEPES 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kislina

HSP70AP promotor proteina toplotnega šoka 70A (angl. heat shock protein 70A promoter)

IPTG izopropil β-D-tiogalaktopiranozid kb kilobazni par

(19)

lac laktozni operon

lacI represor laktoznega operona LB lizogeno gojišče

LBA lizogeno gojišče z ampicilinom LBK lizogeno gojišče s kanamicinom

LSD1 protein bolezni, ki simulira lezije 1 (angl. lesion simulated disease 1) MCS poliklonsko mesto (angl. multiple cloning site)

MES 2-(N-morfolino)etansulfonska kislina NaDS natrijev dodecilsulfat

nt nukleotid

NTP nukleozid trifosfat (angl. nucleoside triphosphate) OD470 optična gostota pri valovni dolžini 470 nm

PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza PCR verižna reakcija s polimerazo

Pep1 peptid 1

PROPEP1 prekurzor peptida 1

RBCS2 mala podenota ribuloza bisfosfat karboksilaze (angl. ribulose bisphosphate carboxylase small subunit)

RBS vezavno mesto za ribosome (angl. ribosome binding site) RCS regulirana celična smrt (angl. regulated cell death)

Rubisco ribuloza bisfosfat karboksilaza TAE pufer tris-acetat-EDTA

TAP gojišče tris-acetat-fosfat

TbMCA metakaspaza iz Trypanosoma bruceii Tris tris(hidroksimetil)aminometan

(20)

TEMED tetrametiletilendiamin

Tm temperatura tališča (angl. melting temperature) Strep-tag streptavidinska oznaka

wt divji tip (angl. wild type)

Z-RR-AMC benziloksikarbonil-arginil-arginil-AMC

(21)

(22)

Tanja Peric

Določanje funkcije proteaze CrMCA-I iz organizma Chlamydomonas reinhardtii

1

1 Uvod

1.2 Zelene alge

Alge so raznolika taksonomska skupina fotosintetskih organizmov. Za razliko od rastlin nimajo diferenciranih celic, ampak so enocelični organizmi ali pa tvorijo steljke. Kljub temu, da ta definicija vključuje tudi prokarionte, ki jih imenujemo cianobakterije oziroma modro-zelene alge, le-teh ne prištevamo k algam. Alge so evolucijsko raznolika polifiletska skupina, saj pripadajo različnim kladom – skupinam organizmov s skupnim prednikom. Zelene alge skupaj s kopenskimi rastlinami spadajo v klad Viridiplantae, zelene rastline. Zelene alge pretežno sestavljata debli Chlorophyta in Charophyta [1].

Obe debli zelenih alg povezujeta predvsem podobna pigmentacija in način shranjevanja ogljika. Vsebujejo klorofila tipa a in b, α, β in γ-karoten ter enake ksantofile, ogljik pa shranjujejo predvsem v obliki škroba v kloroplastih.

Charophyta so izmed alg najbolj sorodne kopenskim rastlinam in so večinoma prisotne v sladkih vodah, medtem ko so organizmi iz debla Chlorophyta razširjeni tudi v morskih vodah. V nadaljevanju se bomo osredotočili predvsem na deblo Chlorophyta. To vključuje tako enocelične kot večcelične organizme, ki tvorijo steljke različnih oblik, kar je pogosto temeljna značilnost za nadaljnje taksonomsko razvrščanje znotraj debla. Skupne značilnosti debla Chlorophyta so predvsem povezane z njihovo strukturo kloroplastov. Ti so obdani z dvoslojno membrano in vsebujejo tilakoide, zložene v grane. Prisotni so lahko tudi pirenoidi.

To so specifična območja v kloroplastih, kjer je koncentriran protein RuBisCo in so lahko vidna pod mikroskopom [2].

1.2.1 Enocelična alga Chlamydomonas reinhardtii

Rod Chlamydomonas je opredeljen na podlagi morfoloških kriterijev: pripadniki so enocelične zelene alge iz debla Chlorophyta z dvema anteriornima bičkoma, celično steno in enim kloroplastom z enim ali več pirenoidi. Najbolj raziskan pripadnik rodu Chlamydomonas je Chlamydomonas reinhardtii, ki se je v štiridesetih in petdesetih letih prejšnjega stoletja uveljavil kot pomemben modelni organizem [3].

Razlogi za široko uporabo te alge v raziskovanju so številni. Raste relativno hitro v primerjavi z drugimi rastlinskimi modelnimi organizmi in je enostavna za gojenje. Je fakultativni fototrof, kar pomeni, da lahko na svetlobi izvaja fotosintezo in fiksira CO₂, če ima na voljo primeren vir ogljika (na primer acetat), pa lahko

(23)

Tanja Peric

2

preživi tudi v temi. Če C. reinhardtii gojimo v dnevno-nočnem ciklu, bodo celice sinhronizirale fazo rasti. C. reinhardtii ima haploiden genom, kar olajša številne genomske raziskave in uvajanje mutacij. Ima tudi sposobnost zaznavanja svetlobe s pomočjo specializiranih domen v kloroplastnih membranah in rodopsinskih kanalov. Zaradi tega se je v preteklosti C. reinhardtii uporabljal za raziskave na področju celičnih ciklov, fotosinteze, rodopsinskih kanalov in biogeneze kloroplastov ter bičkov [4].

Leta 2007 je bil sekvenciran celoten genom seva CC-503 [5].

1.2 Regulirana celična smrt pri rastlinah in zelenih algah

Regulirana celična smrt, RCS, (angl. regulated cell death) je pomembna prilagoditev organizmov, pri kateri posamična celica umre, da izboljša preživetvene sposobnosti ostalih celic populacije. Čw se to dogaja v fizioloških pogojih, lahko ta proces imenujemo tudi programirana celična smrt [6]. Obstaja več vrst RCS, med katerimi je najbolj raziskana apoptoza, ki je značilna za živali.

Pri apoptozi se celica razdeli na manjše dele, imenovane apoptotska telesa, ki jih druge celice lahko fagocitirajo.

Pri rastlinah apoptoza ne poteka, vendar poznamo kljub temu več oblik RCS:

vakuolarno, nekrotično in mešano RCS. Pri vakuolarni celični smrti se po prejemu signala za celično smrt tvorijo vakuole s proteazami, ki razgradijo celične komponente. Ta način RCS poteka tekom normalnega razvoja rastline.

Nekrotična smrt je podobna nekrozi pri živalih: mitohondriji se povečajo in prepustnost celične membrane se zveča. Navadno je posledica abiotskega stresa. Mešana celična smrt vključuje lastnosti vakuolarne in nekrotične ter je značilna za probčutljivostni odziv (angl. hypersensitive response). To je odziv rastline na napad patogenih organizmov, pri katerem rastlina izolira vir okužbe od zdravih celic s pasom umrlih celic [7].

Tudi pri enoceličnih organizmih poznamo RCS. To je na prvi pogled morda nenavadno, saj celična smrt v tem primeru pomeni smrt celotnega organizma.

Ena od možnih razlag je, da smrt posameznega organizma lahko izboljša celokupno preživetveno sposobnost kolonije. Tudi pri regulirani celični smrti enoceličnih fotosintetskih organizmov pride do značilnih sprememb: celica se skrči, membrana se naguba, vakuole razpadejo in celica se razdeli na manjše dele, podobne apoptotskim telesom. Regulirana celična smrt pri enoceličnih organizmih je morda pomemben korak proti večceličnosti [8].

(24)

Tanja Peric

3 1.2.1 Kaspaze in kaspazni homologi

Pomembni encimi apoptoze pri živalih so kaspaze. Le-teh v drugih organizmih ni, pojavljajo pa se njihovi strukturni homologi: metakaspaze, ortokaspaze in parakaspaze (tabela 1). Njihova natančna vloga pri regulirani celični smrti in drugih celičnih procesih še ni temeljito raziskana [9].

Glede na podatkovno bazo peptidaz MEROPS spadajo kaspaze in kaspazni homologi v klan CD in družino C14 [10]. Za kaspaze in metakaspaze je značilno zvitje iz dveh delov: domene p20 in domene p10. Številke v njunih poimenovanjih predstavljajo njuno približno velikost v kDa. Parakaspaze in ortokaspaze nimajo domene p10. Kaspazno zvitje je dobro ohranjeno in sestavljeno iz beta ploskve, obdane z obeh strani z alfa vijačnicami. Katalitična diada kaspaz in kaspaznih homologov sta histidin in cistein, vendar se njihova specifičnost razlikuje.

Kaspaze cepijo večinsko za aspartatom, njihovi homologi pa za argininom ali lizinom [9].

Tabela 1: Osnovne lastnosti kaspaz in kaspaznih homologov.

Kaspaze lahko po funkciji ločimo na vnetne, iniciatorske in efektorske. Vnetne kaspaze sodelujejo v procesu vnetja, iniciatorske in efektorske pa v procesu apoptoze. Signal, ki sproži apoptozo, aktivira iniciatorske kaspaze, ki nato aktivirajo efektorske kaspaze, ki imajo proteolitično vlogo pri apoptozi. Ti trije tipi kaspaz se med seboj razlikujejo tudi po strukturi: za vnetne in iniciatorske kaspaze je značilna dolga N-končna prodomena, ki vsebuje motive CARD ali DED, medtem ko imajo efektorske kaspaze krajše N-končne prodomene.

Prodomene kaspaz so bogate z aspartati, kar omogoča intra- ali

(25)

Tanja Peric

4

inter-molekularno avtokatalitično cepitev. Aktivacija vnetnih in iniciatrskih kaspaz poteče preko vezave N-končnih prodomen na adaptorske proteine in nastanka antiparalelnega homodimera. Efektorske kaspaze so v celici prisotne v obliki dimerov in se aktivirajo z odcepitvijo prodomene ali cepitvijo med domenama p20 in p10 [11].

Kot že prej omenjeno, kaspaze najdemo samo pri živalih. Pri ostalih evkariontih pa najdemo metakaspaze. V nasprotju s kaspazami so metakaspaze aktivne v monomerni obliki, njihova aktivnost pa je pogosto odvisna od prisotnosti Ca²⁺

ionov. Metakaspaze ločimo na tri tipe, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, načinu aktivacije in glede na organizme, v katerih so prisotni (tabela 1 in slika 1).

Zadnje smernice o nomenklaturi metakaspaz svetujejo označevanje tipa metakaspaze z rimsko številko (I, II ali III), ki ji po potrebi sledi črka za označevanje specifične metakaspaze v organizmu [12]. Vse metakaspaze imajo dve vezavni mesti za kalcijeve ione. Prvo, ki veže Ca²⁺ z večjo afiniteto (nekaj µM), tvorijo štirje aspartatni ostanki v domeni p20. Drugo vezavno mesto z nižjo afiniteto do Ca²⁺ (nekaj mM) pa sestavljajo aminokislinski ostanki tako domene p20, kot tudi p10. Vezava kalcija v nizkoafinitetno vezavno mesto verjetno poteče le ob sočasni vezavi substrata in pripomore h konformacijskim spremembam, ki so potrebne za katalizo [13].

Slika 1: Kristalna struktura človeške kaspaze 3 (A), metakaspaze tipa I iz praživali Trypanosoma brucei (B) in metakaspaze tipa II iz rastline Arabidopsis thaliana (C). Domena p20 je označena z rdečo barvo, domena p10 z modro barvo, N-končna domena metakaspaze tipa I z rumeno barvo in dolga povezovalna regija metakaspaze tipa II z rožnato. Do struktur teh proteinov smo dostopali preko podatkovne baze Protein Data Bank. Identifikacijske kode proteinov: 3GJQ, 4AFR in 6W8S. Strukture smo pripravili s programom UCSF ChimeraX.

Metakaspaze tipa I so najpogostejši tip metakaspaz. Poleg domen p20 in p10 ima večina metakaspaz tipa I na N-koncu s prolinom bogato regijo ali motiv cinkovega prsta. Ta motiv je verjetno pomemben za interakcijo z nekaterimi drugimi proteini. Aktivnost TbMCA-Ib, metakaspaze tipa I iz Trypanosoma bruceii, narašča z večanjem koncentracije Ca²⁺ ionov. Ob dovoljšni koncentraciji

(26)

Tanja Peric

5

Ca²⁺ poteče avtokataliziran odcep N-končne regije. Odstranitev le-te ni nujna za aktivnost encima, vendar pa njen odcep omogoči dostop večjih substratov. Pri TbMCA-1b N-končna regija ovira dostop substrata v aktivno mesto encima in njena odstranitev poveča aktivnost encima. Poleg cisteina v aktivnem mestu so pri tej metakaspazi identificirali še en dobro ohranjen cistein na N-končnem delu domene p20, ki vpliva na avtokatalitično cepitev in koordinacijo substrata [13].

Metakaspaze tipa II najdemo le pri zelenih algah in rastlinah. Strukturno je zanje značilna dolga povezovalna regija med domenama p20 in p10. Pri AtMCA-IIa, metakaspazi tipa II iz Arabidopsis thaliana, je strukturna analiza pokazala, da ta povezovalna regija sega v aktivno mesto in ovira dostop substrata. Ob 0,2 mM koncentraciji Ca²⁺ poteče avtokatalitična cepitev povezovalne regije za ohranjenimi lizinskimi ostanki, kar aktivira AtMCA-IIa. Teh lizinskih ostankov ni pri AtMCA-IIf, metakaspazi tipa II, za katero je znano, da njena aktivacija ni odvisna od koncentracije Ca²⁺ [14].

Metakaspaze tipa III so odkrili samo pri algah, ki so nastale s sekundarno endosimbiozo in imajo obratni vrstni red domen – z N-konca si sledita najprej domena p10 in nato domena p20. Funkcionalno so sorodne metakaspazam tipa I in njihova aktivacija poteče z od kalcija odvisno odstranitvijo N-končne regije [13].

Parakaspaze so prisotne pri živalih in glivah sluzavkah. Strukturno jih ločimo na dva tipa: parakaspaze tipa I imajo poleg domene p20 še domeno smrti in več imunoglobulinskih domen, medtem ko teh domen pri parakaspazah tipa II ni. Od metakaspaz jih loči tudi aminokislinski motiv v okolici aktivnega mesta. Njihova aktivacija ni odvisna od Ca²⁺ ionov [9].

Homologe kaspaz pri prokariontih imenujemo ortokaspaze. Samo ortokaspaze imajo lahko poleg domene p20 različne druge domene, nimajo po domene p10.

Pri prokariontih je prisotnih tudi veliko katalitično neaktivnih različic [9].

1.2.2 Metakaspaze pri Arabidopsis thaliana

Navadni repnjakovec, Arabidopisis thaliana, je dobro raziskan rastlinski modelni organizem. Zaradi njegove uveljavljene vloge v rastlinski biokemiji so tudi metakaspaze pri A. thaliana relativno dobro opisane. A. thaliana v svojem genomu vsebuje zapise za devet metakaspaz: tri metakaspaze tipa I in šest metakaspaz tipa II.

Vse tri metakaspaze tipa I imajo na N-končnem delu regijo s cinkovimi prsti, podobnimi cinkovim prstom v proteinu LSD1. Preko te N-končne regije poteka tudi interakcija med AtMCA-Ia in LSD1. Izbitje gena za LSD1 povzroči, da se meja med mrtvimi in živimi celicami pri preobčutljivostnem odzivu ne vzpostavi in

(27)

Tanja Peric

6

se signal za celično smrt nekontrolirano širi od mesta okužbe. LSD1 je torej v rastlinah pomemben negativni regulator celične smrti. Vezava LSD1 na N-končno domeno AtMCA-Ia namreč preprečuje aktivacijo AtMCA-Ia, ki je pozitivni regulator s preobčutljivostnim odzivom povezane celične smrti. Ugotovili so, da AtMCA-Ib negativno regulira delovanje AtMCA-Ia, vendar za to ne potrebuje katalitične aktivnosti [15]. Tudi AtSerpin1, ki je sicer znan inhibitor serinskih proteaz, inhibira AtMCA-Ia s tvorbo kovalentne vezi, ki onemogoči procesiranje proteaze [16].

Delovanje AtMCA-Ia ni povezano s procesom avtofagije, čeprav tako inhibicija delovanja encima kot tudi inhibicija avtofagije povzročita fenotip, ki je podoben prezgodnji senescenci. Opaženo je bilo, da se s starostjo rastline AtMCA-Ia vedno pogosteje lokalizira ob netopnih proteinskih agregatih v rastlinskih celicah in morda pripomore k njihovi odstranitvi [17].

Med metakaspazami tipa II sta najbolj raziskani AtMCA-IIa in AtMCA-IIf.

AtMCA-IIa je najbolj razširjena metakaspaza tipa II v A. thaliana in se konstitutivno izraža v večini tkiv. Njegov pH optimum je v šibko bazičnem območju, med pH 7 in 8. Okvara gena za AtMCA-IIa zmanjša občutljivost celic na signale za celično smrt, ki so povezani z okužbo oziroma oksidativnim stresom, vendar glede na relativno šibkost te spremembe verjetno obstaja redundanca med metakaspazami tipa II [18]. Aktivacija AtMCA-IIa poteka z avtokatalizo ob milimolarni prisotnosti Ca²⁺, vendar se encim po aktivaciji kmalu sam cepi in s tem inaktivira [19].

Eden izmed naravnih substratov AtMCA-IIa je PROPEP1, propeptid, ki je vsidran v citosolno stran membrane vakuole. Ob cepitvi z AtMCA-IIa se odcepljeni del, imenovan Pep1, sprosti iz celice in deluje kot signalna molekula, ki v bližnjih celicah sproži nekakšen imunski odziv, ki celice pripravi na obrambo pred patogeni. Do te cepitve in vivo pride ob poškodbi celice. Pri tem se prepustnost membrane poveča in vdor Ca²⁺ v celico aktivira AtMCA-IIa [20].

AtMCA-IIf ima v nasprotju z drugimi metakaspazami tipa II pri A. thaliana pH optimum v rahlo kislem, med pH 5 in 6, in njegova aktivacija ni odvisna od Ca²⁺

ionov [21]. Njegovo aktivnost zavirata S-nitrozilacija, ki se in vivo pojavi ob prisotnosti dušikovega monoksida, in inhibitor serinskih proteaz, Serpin1. Eden izmed naravnih substratov AtMCA-IIf je fosfoenolpiruvat karboksikinaza 1, ki sodeluje v procesu glukoneogeneze. To kaže na morebitno vlogo AtMCA-IIf pri regulaciji metabolizma [22]. Funkcionalno je AtMCA-IIf povezan s specifično vrsto razvojne vakuolarne RCS in sicer z nastankom trahealnih elementov. To so specializirane celice, ki umrejo, pri čemer se tvori ksilem. AtMCA-IIf je pri tem regulator avtofagije in preprečuje, da bi se signal za celično smrt razširil na sosednje celice [21].

(28)

Tanja Peric

7

Razlika med od kalcija odvisnimi in od kalcija neodvisnimi metakaspazami tipa II je v aspartatnem ostanku v domeni p20, ki je verjetno vključen v vezavo kalcija.

Domena p10 je bolj ohranjena med tema podtipoma metakaspaz, vendar ortologna zamenjava domen zelo zmanjša aktivnost encimov. Kakršnakoli ortologna zamenjava domen ali povezovalnih regij med AtMCA-IIa in AtMCA-IIf je pri slednjem encimu pripeljala do dviga pH optimuma [23].

1.2.3 Metakaspaze pri Chlamydomonas reinhardtii

Chlamydomonas reinhardtii vsebuje zapisa za dve metakaspazi: metakaspazo tipa I (CrMCA-I) in metakaspazo tipa II (CrMCA-II). Njuna natančna vloga ni znana, raziskave pa nakazujejo, da bi lahko bili obe vpleteni v odziv na oksidativni stres. Izražanje CrMCA-I se namreč poveča ob večkratnem oksidativnem stresu, medtem ko se izražanje CrMCA-II inducira ob povečani koncentraciji dehidroaskorbata (DHA), oksidirane oblike askorbinske kisline, ki je pomemben antioksidant v fotosintetskih organizmih. DHA morda deluje kot signalna molekula, ki opozarja na nekontroliran oksidativni stres in sproži alternativno obliko celične smrti, v kar je morda vključen tudi CrMCA-II [24].

Triklosan, protibakterijsko sredstvo in problematičen polutant vodnih okolij, tudi poveča izražanje CrMCA-II v C. reinhardtii, čemur sledi represija izražanja 24 h po izpostavitvi triklosanu. Izpostavitev triklosanu ne poveča izražanja CrMCA-II, vodi pa v delno represijo izražanja po 24 h. Te spremembe v izražanju metakaspaz so odvisne od koncentracije Ca²⁺ ionov, ki se zaradi povečane permeabilnosti celične membrane kot posledice oksidativnega stresa poveča ob stiku s triklosanom. Ob kelaciji dvovalentnih ionov ne pride do sprememb v izražanju metakaspaz [25].

(29)

(30)

Tanja Peric

8

2 Namen dela in hipoteze

V sklopu tega dela smo želeli izraziti in izolirati rekombinantne proteaze CrMCA-I, AtMCA-Ia in AtMCA-Ib. To bi nam omogočalo njihovo karakterizacijo in vitro.

Poleg tega smo želeli pripraviti sev Chlamydomonas reinhardtii, v katerem bi se prekomerno izražal CrMCA-I.

Zanimalo nas je tudi, ali prisotnost metakaspaz C. reinhardtii lahko spremljamo z uporabo protiteles, ustvarjenih proti algni metakaspazi GtMCA-III. V ta namen smo v divjemu tipu C. reinhardtii in sevu, ki je imel okvarjen gen za CrMCA-I, povzročili oksidativni stres in s protitelesi želeli določiti prisotnost metakaspaz.

Pri tem smo izhajali iz naslednjih hipotez:

CrMCA-I, AtMCA-Ia in AtMCA-Ib so, podobno kot ostale metakaspaze tipa I, neaktivne proteaze v odsotnosti kalcijevih ionov in dosežejo največjo aktivnost v nizkih milimolarnih koncentracijah kalcijevih ionov.

pH optimum CrMCA-I, AtMCA-Ia in AtMCA-Ib je, podobno kot pri ostalih metakaspazah tipa I, v rahlo kislem oziroma nevtralnem območju.

Pri oksidativnem stresu se poveča vsebnost CrMCA-I, kar lahko zaznamo s protitelesi proti algni metakaspazi GtMCA-III.

(31)

(32)

Tanja Peric

9

3 Materiali in metode

3.1 Reagenti

3.1.1 Kemikalije

Pri delu smo uporabljali naslednje kemikalije:

agar (Fluka, ZDA), agaroza (Sigma-Aldrich, ZDA), akrilamid/bis-akrilamid 37,5:1 (Sigma-Aldrich, ZDA), ampicilin sulfat (Fisher Bioreagents, ZDA), APS (Acros Organics, ZDA), β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich, ZDA), bromfenol modro (Sigma-Aldrich, ZDA), CaCl₂ˣH₂O (Sigma-Aldrich, ZDA), CAPS (Apollo Scientific, Združeno kraljestvo), CoCl₂ˣ6H₂O (Sigma-Aldrich, ZDA), Coomassie Brilliant Blue G- 250 (Molekula Group, Združeno kraljestvo), Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma- Aldrich, ZDA), CuSO₄ˣ5H₂O (Merck, Nemčija), EDTA (Sigma-Aldrich, ZDA), etanol (ECP, Slovenija), etidijev bromid (Sigma-Aldrich, ZDA), FeSO₄ˣ7H₂O (Sigma-Aldrich, ZDA), glicerol (Fisher Chemical, ZDA), glicin (Fisher Bioreagents, ZDA), glukoza (Sigma-Aldrich, ZDA), H₃BO₄ (Sigma-Aldrich, ZDA), HEPES (OmniPur, ZDA), hidrolizat N-Z amin (Fluka, ZDA), imidazol (Sigma-Aldrich, ZDA), kanamicin sulfat (Fisher Bioreagents, ZDA), K₂HPO₄ (Sigma-Aldrich, ZDA), KH₂PO₄ (Thermo Fisher Scientific, ZDA), kvasni ekstrakt (Biolife, Italija), laktoza (Sigma-Aldrich, ZDA), MES (Sigma-Aldrich, ZDA), metanol (Honeywell, ZDA), MgCl₂ (Thermo Fisher Scientific, ZDA), MgSO₄ˣ7H₂O (Honeywell, ZDA), MnCl₂ˣ4H₂O (Sigma-Aldrich, ZDA), Na₂HPO₄ (Sigma-Aldrich, ZDA), Na₂SO₄ (Fluka, ZDA), NaCl (Gram-Mol, Hrvaška), NaDS (Sigma-Aldrich, ZDA), NH₄Cl (PanReac, Španija), (NH₄)₆Mo₇O₂₄ˣ4H₂O (Merck, Nemčija), ocetna kislina (Gram-Mol, Hrvaška), paromomicin sulfat (Apollo Scientific, Združeno kraljestvo), pepton (Sigma-Aldrich, ZDA), saharoza (Fisher Chemical, ZDA), TEMED (Invitrogen, ZDA), Tris (Sigma-Aldrich, ZDA), ZnSO₄ˣ7H₂O (Sigma-Aldrich, ZDA).

3.1.2 Kompleti regentov

Pri delu smo uporabljali naslednje komplete reagentov:

(33)

Tanja Peric

10

- E.Z.N.A. Gel Extraction Kit (Omega Bio-Tek, ZDA) za izolacijo DNA iz agaroznega gela,

- GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific, ZDA) za izolacijo plazmidov iz E. coli,

- CloneJet PCR Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific, ZDA) za ligacijo v vektor pJet1.2/blunt,

- Clarity Western ECL Substrate (BioRad, ZDA) za imunodetekcijo.

3.1.3 Gojišča

Pri delu smo uporabljali naslednja gojišča:

- Gojišče LB:

Gojišča LB smo uporabljali za gojenje E. coli v postopkih molekulskega kloniranja.

Uporabljali smo vnaprej pripravljena in avtoklavirana gojišča LB, ki smo jim po potrebi dodali antibiotik (ampicilin ali kanamicin) do končne koncentracije 50 µg/mL. Ampicilin (LBA) smo uporabljali za gojenje E. coli, transformirane z vektorjem pJet ali pOpt, kanamicin (LBK) pa za gojenje E. coli, transformirane z vektorjem pET28b(+).

Sestava tekočega gojišča LB: 10 g peptona, 10 g NaCl, 5 g kvasnega ekstrakta, dH₂O do 1 L. Pred uporabo smo gojišča avtoklavirali. Za pripravo trdnega gojišča smo tekočemu gojišču dodali 15 g agarja in ponovno avtoklavirali ter nato aseptično vlili v plastične petrijevke ali pa smo uporabili že pripravljena trdna gojišča.

- Gojišče ZYM:

Avtoindukcijsko gojišče ZYM smo uporabljali za izražanje proteinov z ekspresijskega vektorja pET28b(+). Gojišče smo pripravili iz založnih raztopin, ki smo jih vnaprej avtoklavirali ali sterilno filtrirali.

Sestava gojišča ZYM: 400 mL gojišča ZY, 0,8 mL 1 M MgSO₄, 8 mL 50× M, 8 mL 50× 5052, 0,42 mL kanamicina.

Sestava gojišča ZY: 10 g proteinskega hidrolizata N-Z amin, 5 g kvasnega ekstrakta, dH₂O do 1 L. Založno raztopino smo avtoklavirali.

(34)

Tanja Peric

11

Sestava 1 M MgSO₄: 24,65 g MgSO₄ˣ7H₂O, dH₂O do 100 mL. Založno raztopino smo avtoklavirali.

Sestava 50× M: 17,75 g Na₂HPO₄, 17 g KH₂PO₄, 13,4 g NH₄Cl, 3,55 g Na₂SO₄, dH₂O do 100 mL. Založno raztopino smo avtoklavirali.

Sestava 50× 5052: 25 g glicerola, 2,5 g glukoze, 10 g α-laktoze monohidrata, dH₂O do 100 mL. Založno raztopino smo sterilno flitrirali.

- Gojišče TAP:

Gojišče TAP smo uporabljali za gojenje C. reinhardtii. Gojišče smo pripravili iz založnih raztopin in ga nato avtoklavirali. Po potrebi smo po avtoklaviranju dodali antibiotik paromomicin do končne koncentracije 10 µg/mL.

Sestava tekočega gojišča TAP: 20 mL 1 M Tris, 1 mL fosfatnega pufra II, 10 mL raztopine A, 1 mL elementov v sledeh po Hunterju, 1 mL ledene ocetne kisline, dH₂O do 1 L, pH umerjen na 7,0. Za trdno gojišče smo tekočemu gojišču dodali 15 g agarja in ponovno avtoklavirali ter nato aseptično vlili v plastične petrijevke.

Sestava 1 M Tris: 60,57 g Tris, dH₂O do 500 mL.

Sestava fosfatnega pufra II: 10,8 g K₂HPO₄, 5,6 g KH₂PO₄, dH₂O do 100 mL.

Sestava raztopine A: 20 g NH₄Cl, 5 g MgSO₄ˣ7H₂O, 2,5 g CaCl₂ˣ2H₂O, dH₂O do 500 mL.

Sestava elementov v sledeh po Hunterju: 50 g EDTA, raztopljenega v 250 mL dH₂O;

22 g ZnSO₄ˣ7H₂O, raztopljenega v 100 mL dH₂O; 11,4 g H₃BO₄, raztopljenega v 200 mL dH₂O; 5,06 g MnCl₂ˣ4H₂O, raztopljenega v 50 mL dH₂O; 1,61 g CoCl₂ˣ6H₂O, raztopljenega v 50 mL dH₂O; 1,57 g CuSO₄ˣ5H₂O, raztopljenega v 50 mL dH₂O; 1,10 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄ˣ4H₂O, raztopljenega v 50 mL dH₂O in 4,99 g FeSO₄ˣ7H₂O, raztopljenega v 50 mL dH₂O, dH₂O do 1L.

- Gojišče TAP s 40 % saharozo:

Gojišče TAP s 40 % saharozo smo uporabljali za elektroporacijo C. reinhardtii in gojenje po elektroporaciji. Gojišče smo pripravili tako, da smo 40 g saharoze raztopili v 100 mL gojišča TAP, nato pa raztopino sterilno filtrirali.

(35)

Tanja Peric

12 3.1.4 Pufri in ostale raztopine

Pri delu smo uporabljali naslednje pufre in raztopine:

- reakcijski pufri za verižno reakcijo s polimerazo (PCR): 10-kratni reakcijski pufer za DNA polimerazo Taq (Thermo Fisher Scientific, ZDA), 10-kratni reakcijski pufer za DNA polimerazo DreamTaq (Thermo Fisher Scientific, ZDA), 5-kratni reakcijski pufer za DNA polimerazo Phusion (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- 10 mM mešanica dNTP-jev za PCR (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- 50-kratni pufer TAE: 242,2 g Tris, 18,7 g EDTA, 57,1 mL ocetne kisline, dH₂O do 1 L;

- 6-kratni nanašalni pufer za agarozno gelsko elektroforezo (AGE) (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- reakcijski pufri za rezanje z restriktazami: 10-kratni pufer Tango (Thermo Fisher Scientific, ZDA), 10-kratni pufer O (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- 10-kratni reakcijski pufer za ligacijo z DNA-ligazo T4 (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- pufri za pripravo poliakrilamidnih gelov: 4-kratni pufer za ločevalni gel: 18,17 g Tris, dH₂O do 100 mL, pH 8,8; 4-kratni pufer za koncentracijski gel: 6,06 g Tris, dH₂O do 100 mL, pH 6,8;

- 10-kratni pufer za poliakrilamidno gelsko elektroforezo ob prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS-PAGE): 30 g Tris, 144 g glicina, 10 g NaDS, dH₂O do 1 L;

- 5-kratni nanašalni pufer za NaDS-PAGE: 5 % β-merkaptoetanol, 0,02 % bromfenol modro, 30 % glicerol, 10 % NaDS, 250 mM Tris/NaCl, pH 6,8;

- raztopina za barvanje poliakrilamidnih gelov: 125 mg Coomassie Brilliant Blue R-250, 150 mL etanola, 35 mL ocetne kisline, dH₂O do 500 mL;

- raztopina za razbarvanje poliakrilamidnih gelov: 150 mL etanola, 50 mL ocetne kisline, 300 mL dH₂O;

- pufri za nikljevo afinitetno kromatografijo: vezavni pufer: 4,77 g HEPES, 29,22 g NaCl, dH₂O do 1 L; elucijski pufer: 2,38 g HEPES, 14,61 g NaCl, 17,02 g imidazola, dH₂O do 500 mL, pH 7,5;

(36)

Tanja Peric

13

- pufri za ionsko-izmenjevalno kromatografijo: vezavni pufer: 4,77 g HEPES, dH₂O do 1 L; elucijski pufer: 2,38 g HEPES, 29,22 g NaCl, dH₂O do 500 mL, pH 8,0;

- pufer za gelsko filtracijo: 4,77 g HEPES, dH₂O do 1 L, pH 7,5;

- pufer Towbin: 3 g Tris, 14,4 g glicina, 200 mL metanola, dH₂O do 1 L;

- pufer za imunodetekcijo: 5,844 g NaCl, 4,776 g HEPES, dH₂O do 1 L;

- blokirna raztopina: 100 mL pufra za imunodetekcijo, 5 g mleka v prahu in 100 µL Tween 20;

- raztopina za inkubacijo s primarnimi protitelesi: 10 mL pufra za imunodetekcijo, 0,2 g mleka v prahu, 10 µL Tween 20 in 10 µL primarnih protiteles;

- raztopina za inkubacijo s sekundarnimi protitelesi: 10 mL pufra za imunodetekcijo, 0,2 g mleka v prahu, 10 µL Tween 20 in 2 µL sekundarnih protiteles;

- pufer za lizo celic C. reinhardtii: 0,60 g HEPES, 10 mL glicerola, 1,5 mL CHAPS, 0,015 g EDTA, dH₂O do 50 mL;

- 5-kratni Bradfordov reagent: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250, 50 mL 95 % etanola, 100 mL 85 % ortofosforne kisline in 50 mL dH₂O.

3.1.5 Protitelesa

Za imunodetekcijo smo uporabljali naslednja protitelesa:

- zajčja poliklonska protitelesa pred imunizacijo (Agrisera, Švedska);

- zajčja poliklonska protitelesa proti 6×His (antibodies-online, Nemčija);

- zajčja poliklonska protitelesa proti GtMCA-III (Agrisera, Švedska);

- kozja protitelesa proti zajčjim protitelesom, konjugirana s hrenovo peroksidazo (antibodies-online, Nemčija).

(37)

Tanja Peric

14 3.1.6 Encimi in ostali proteini

Pri delu smo uporabljali naslednje proteine:

- DNA polimeraza: Taq (5 U/µL) (Thermo Fisher Scientific, ZDA), DreamTaq (5 U/µL) (Thermo Fisher Scientific, ZDA), Phusion (2 U/µL) (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- DNA ligaza: T4 (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- restrikcijske endonukleaze: AanI (10 U/µL), BglII (10 U/µL), EcoRI (10 U/µL), NcoI (10 U/µL) in XhoI (10 U/µL) (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- goveji serumski albumin (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- metakaspaza tipa I iz Guillardia theta, GtMCA-I (doc. dr. Marina Klemenčič).

3.1.7 Standardi velikosti

Za izvajanje elektroforez smo uporabljali naslednje standarde velikosti:

- GeneRuler 1000 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, ZDA) za AGE;

- Pierce Unstained Protein Marker (Thermo Fisher Scientific, ZDA) za PAGE;

- PageLadder Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher Scoentific, ZDA) za PAGE z namenom prenosa western.

(38)

Tanja Peric

15 3.1.8 Začetni oligonukleotidi

Začetni oligonukleotidi, ki smo jih uporabljali pri PCR, so opisani v tabeli 2.

Tabela 2: Oligonukleotidi, ki smo jih uporabljali pri PCR. Z rdečo so označeni previsni konci, ki niso bili upoštevani pri računanju temperature tališča (Tm). Tm smo izračunali s spletnim programom Oligo Calc [26].

(39)

Tanja Peric

16 3.1.9 Vektorji

Pri delu smo kot ogrodja za molekulsko kloniranje uporabljali vektorje pJet1.2/blunt (ThermoFisher Scientific, ZDA), pET28b(+) (Novagen, Nemčija), pOpt_mVenus_Paro (CeBiTec, Nemčija) in pOpt_cCA_mVenus_Paro (CeBiTec, Nemčija), ki smo jih nadalje modificirali za namene naše uporabe.

Vektor pJet1.2/blunt je klonirni plazmid, ki je že rezan z restrikcijskim encimom EcoRV, ki ustvari tope konce, med katere lahko z ligacijo vstavimo želeni vključek. Pri tem se prekine zapis za restrikcijski encim Eco47IR na vektorju, katerega izražanje je smrtno za celico. Tako lahko izvajamo pozitivno selekcijo, saj ta restrikcijski encim prepreči rast celicam z vektorjem brez vključka. Vektor vsebuje tudi zapis za odpornost na ampicilin, ki omogoča negativno selekcijo z antibiotikom. Ta vektor smo uporabljali za pomnoževanje vključkov v E. coli (slika 2).

Slika 2: Shematski prikaz vektorja pJet1.2/blunt. Vektor vsebuje bakterijsko mesto ori (rumena), zapis za protein, ki omogoča odpornost proti ampicilinu (svetlo zelena) in zapis za restrikcijski encim Eco47IR, na katerem je tudi MCS, ki je prekinjen z restrikcijskim mestom za cepitev z EcoRV (vijolična).

Na vsaki strani cepitvenega mesta z EcoRV je označen tudi začetni oligonukleotid, namenjen sekvenciranju vključka. Slika je bila narejena z računalniškim progamom SnapGene Viewer.

(40)

Tanja Peric

17

Vektor pET28b(+) je ekspresijski fagmid, namenjen induciranemu prekomernemu izražanju proteinov v E. coli. Želeni vključek smo v vektor vstavili preko restrikcijskih mest NcoI in XhoI. Vstavljen zapis je s tem pod kontrolo lac operona in ima dodano oznako 6×His, ki omogoča lažjo izolacijo proteina. Vsebuje zapis za protein, ki naredi celice odporne proti kanamicinu, kar omogoča negativno selekcijo, in zapis za protein lacI, represor operona lac, pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku laktoze ali IPTG, se lacI ne more vezati na operon lac. S tem omogočimo izražanje vstavljenega zapisa pod kontrolo operona lac (slika 3).

Slika 3: Shema vektorja pET28b(+). Vektor vsebuje bakterijski in fagni (f1) ori (rumena), zapis za protein, ki omogoča odpornost proti kanamicinu (svetlo zelena), zapis za lacI (temno vijolična) pod konstitutivnim promotorjem, MCS za vstavitev vključka pod kontrolo operatorja lac, mesto za vezavo ribosoma RBS (modra) in več heksahistidinskih oznak (svetlo vijolična). Slika je bila narejena z računalniškim programom SnapGene Viewer.

Vektorja pOpt_mVenus_Paro in pOpt_cCA_mVenus_Paro sta ekspresijska vektorja iz skupine vektorjev pOptimized, ki so specifično namenjeni prekomernemu izražanju proteinov v C. reinhardtii. Vsebujeta zapisa za proteina, ki omogočata odpornost proti

(41)

Tanja Peric

18

ampicilinu in proti paromomicinu, kar omogoča negativno selekcijo tako v E. coli, kot v C. reinhardtii. Prav tako vsebujeta zapis za mVenus, rumen fluorescenčni protein, ki se uporablja kot reporterski gen. Zapisa za protein, ki omogoča odpornost proti paromomicinu, in mVenus sta pod kontrolo dvojnega konstitutivnega evkariontskega promotorja HSP70AP in RBCS2P. Kombinacija teh dveh promotorjev je pokazala močnejše izražanje od uporabe enojnega promotorja [27]. Pred zapisoma za mVenus in protein, ki omogoča odpornost proti paromomicinu, je zapis za prvi intron proteina RBCS2, na sredi zapisa za mVenus pa zapis za drugi intron proteina RBCS2. Zapisi za introne so dodani za izboljšanje izražanja, vendar niso nujni za delovanje vektorja [29]. Za zapisom za mVenus je oznaka Strep-tag, ki omogoča izolacijo označenega proteina z afinitetno kromatografijo. Vektor pOpt_cCA_mVenus_Paro se od vektorja pOpt_mVenus_Paro razlikuje po dodanem signalnem zaporedju iz karbo-anhidraze iz C. reinharditii (cCA) med zapisoma za prvi intron proteina RBCS2 in mVenus. To signalno zaporedje omogoča izločanje proteina v gojišče [29]. Zapis za CrMCA-I smo v vektorja pOpt vstavili preko restrikcijskih mest BglII in EcoRI, pri čemer smo iz vektorja odstranili zapis za mVenus, ohranili pa smo prvi intron proteina RBCS2 in na vektorju pOpt_cCA_mVenus_Paro signalno zaporedje za izločanje v gojišče (slika 4).

(42)

Tanja Peric

19

Slika 4: Shema vektorjev pOpt_mVenus_Paro in pOpt_cCA_mVenus_Paro. Vektor vsebuje bakterijski in fagni ori (temno modra), zapisa za proteina, ki omogočata odpornost proti ampicilinu in paromomicinu (rdeča) in zapis za reporterski gen mVenus (rumena) z oznako Strep-tag (vijolična).

Bakterijski promotorji so označeni z zeleno, evkariontski pa s svetlo modro. Označeni so tudi introni (RBCS2i1 in RBCS2i2) in neprevajajoče se regije ne 3'-koncu (3'-UTR). Na vektorju pOpt_cCA_mVenus_Paro je označeno tudi signalno zaporedje cCA (temno zelena) za izločanje v gojišče. Slika je narejena z računalniškim programom SnapGene Viewer.

(43)

Tanja Peric

20

3.2 Sevi E. coli in C. reinhardtii

Za pomnoževanja plazmidov smo uporabljali klonirni sev E. coli XL-1 Blue. Za prekomerno izražanje proteinov v E. coli smo uporabljali ekspresijski sev BL21 [DE3].

Kompetentne celice obeh sevov so bile pred uporabo alikvotirane in shranjene pri -80 °C.

Za delo s C. reinhardtii smo uporabljali divji tip (wt) CC-4533. Zanj so značilni dobra odpornost na zamrzovanje, dobra dovzetnost za elektroporacijo in dobra gibljivost v tekoči kulturi [30]. Uporabljali smo tudi sev (insercijska mutanta CrMCA-I, CrMCA-I::AphVII), ki je imel v zapisu za CrMCA-I vstavljeno kaseto z zapisom za protein, ki omogoča odpornost proti paromomicinu.

3.3 Aparature in oprema

Pri delu smo uporabljali nasledje aparature in naprave:

- aparaturi za PCR: Veriti 96-Well Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, ZDA) in GeneAmp PCR System 2700 (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- centrifuge: Eppendorf 5424 (Eppendorf, Nemčija), PicoFuge Stratagene (Agilent, ZDA), Eppendorf 5702 R (Eppendorf, Nemčija), Eppendorf 5415 R (Eppendorf, Nemčija), Eppendorf 5810 R (Eppendorf, Nemčija), Sorvall RC6+ (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- sistema za PAGE: Bio-Rad Mini-Protean Tetra System (Bio-Rad, ZDA) in Bio-Rad Mini-Protean II System (Bio-Rad, ZDA);

- napajalnika: Hoefer MightySlim SX250 Power Supply (Hoefer Presstechink, Avstrija) in Biometra Power Pack P25 (Biometra, Nemčija);

- sistem za AGE: Owl Seperation Systems (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- aparaturi za slikanje gelov: MiniBis Pro (DNR Bio-Imaging Systems, Izrael) in ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad, ZDA);

- stresalniki: Labnet Orbit LS (Labnet International, ZDA), Labnet Benchtop Shaking Incubator 222DS (Labnet Internatioan, ZDA), StarLab TubeRoller (StarLab, Nemčija),

(44)

Tanja Peric

21

Kambič IS-200K (Kambič, Slovenija), Sanyo Orbital Incubator (Sanyo, Japonska), MaxQ 4339 (Thermo Fisher Scientific), Eppendorf Thermomixer comfort (Eppendorf, Nemčija);

- vibracijski mešalnik: Tehtnica Vibromix10 (Domel, Slovenija);

- elektroporator: BioRad GenePulser Xcell (Bio-Rad, ZDA);

- peristaltični črpalki: VWR Compact Tubing Pump (VWR, ZDA), Fh10 Pump System (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- aparatura za FPLC: Äkta UPC-900 Frc-920 (Amersham Biosciences, Združeno kraljestvo);

- biološko varni kabinet: MC12-3 (Iskra PIO, Slovenija);

- digestorij: Scala Secuflow (Waldner, Nemčija);

- tehtnice: Radwag WLC2/A2 (Radwag, Združeno kraljestvo), Mettler Toledo PL83-S (Mettler Toledo, ZDA), Radwag XA 60/220/X (Radwag, Združeno kraljestvo);

- pH meter: Mettler Toledo SevenEasy (Mettler Toledo, ZDA);

- mikroskop: Zeiss Primo Star (Zeiss, Nemčija);

- spektrofotometri: NanoDrop 200c (Thermo Fisher Scientific, ZDA), UV-1600PC (VWR, ZDA), Tecan Infinite M200 Pro (Tecan Group, Švica);

- termoblok: Mini Dry Bath Incubator (Starlab, Nemčija);

- magnetna mešalnika: AGE Magnetic Stirrer (Velp Scientifica, Italija), Stirrer FB15045 (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

- ultrazvočni homogenizator: Hielscher UP100H (Hielcher, Nemčija);

- sistem za ultra čisto vodo: Millipore Direct 8 (Merck, Nemčija);

- kromatografske kolone: HisTrap HP (Cytiva, Združeno kraljestvo), HiTrap Q FF (Cytiva, Združeno kraljestvo), Superdex 75 (Cytiva, Združeno kraljestvo);

- elektronske pipete: eLINE (Sartorius, Nemčija);

- komora za štetje celic: Petroff-Hausser Counting Chamber (Thermo Fisher Scientific, ZDA);

(45)

Tanja Peric

22

- filtri za sterilno filtriranje: Minisart Syringe Filter (Sartorius, Nemčija);

- nitrocelulozna membrana: Nitrocellulose Blotting Membrane (Sartorius, Nemčija);

- filtri za koncentriranje proteinov: Amicon Ultra 4 mL/10 kDa NMWL (Merck, Nemčija);

- mikrotitrske plošče: CELLSTAR Cell Culture Microplates (Greiner Bio-One, Avstrija);

- elektroporacijske kivete: Bio-Rad GenePulser Cuvette, 0.4 mm gap (Bio-Rad, ZDA).

3.4 Izražanje in izolacija metakaspaz tipa I v E. coli

Za prekomerno izražanje metakaspaz tipa I (CrMCA-I, AtMCA-Ia in AtMCA-Ib) v E. coli smo zapise zanje vstavili v ekspresijski vektor pET28b(+). Z vektorjem smo nato transformirali celice seva BL21 [DE3] in inducirali prekomerno izražanje teh proteinov.

Rekombinantne proteine smo nato izolirali z različnimi kromatografijami.

3.4.1 Priprava zapisov za metakaspaze tipa I

Pri pripravi zapisov za metakaspaze tipa I v E. coli smo izhajali iz sinteznih genov, pri katerih je bila raba kodona optimizirana za izražanje v E. coli. S tremi zaporednimi reakcijami PCR in z uporabo različnih začetnih oligonukleotidov smo tem zapisom odstranili N-končno domeno in zanko 360 (slika 5). V prvi reakciji smo uporabili smerni oligonukleotid, ki se je sinteznemu genu prilegal tik za N-končno domeno, s previsnim koncem, ki je na N-končni del zapisa dodal cepitveno mesto za restrikcijski encim NcoI (tabela 2, oligonukleotid 1). Protismerni oligonukleotid, ki smo ga uporabili v prvi reakciji, se je sinteznemu genu prilegal tik pred zanko 360 s previsnim koncem, ki je dodal del zapisa po zanki 360 (tabela 2, oligonukleotid 2). V drugi PCR reakciji smo uporabili enak smerni oligonukleotid kot v prvi in protismerni oligonukleotid, ki se je prilegal previsnemu koncu prvega protismernega oligonukleotida in je imel previsni konec z nadaljnjim delom zapisa po zanki 360 (tabela 2, oligonukleotid 3). V tretji PCR reakciji smo uporabili enak smerni oligonukleotid kot v prvih dveh in protismerni oligonukleotid, ki se je prilegal previsnemu koncu drugega protismernega oligonukleotida in je imel previsni konec z zadnjim delom sinteznega gena ter cepitvenim mestom za restrikcijski encim XhoI (tabela 2, oligonukleotid 4).

(46)

Tanja Peric

23

Slika 5: Prikaz postopka za pripravo zapisa za izražanje metakaspaz v E. coli. Domene metakaspaz so shematsko prikazane z različno obarvanimi pravokotniki. Na 3'-koncu za zanko 360 so dodatno barvno označeni trije deli DNA, ki so enaki 3'-koncu v končnem produktu, ki ga dobimo ob uporabi enako obarvanih previsnih koncev protismernih oligonukleotidov. Začetni oligonukleotidi, ki smo jih uporabili v PCR reakcijah, so označeni s puščicami nad in pod DNA. Z rdečo barvo je označen smerni oligonukleotid. Trije protismerni začetni oligonukleotidi so označeni z naslednjimi barvami: za prvo reakcijo – svetlo modra/temno modra; za drugo reakcijo – temno modra/zelena; za tretjo reakcijo – zelena/rjava.

3.4.2 Verižna reakcija s polimerazo

Verižno reakcijo s polimerazo smo uporabili za pomnoževanje fragmentov DNA (termostabilna DNA-polimeraza Phusion) in preverjanje uspešnosti transformacije v posamičnih kolonijah E. coli (termostabilna DNA-polimeraza DreamTaq ali Taq).

Reakcijske mešanice smo pripravili po navodilih proizvajalca, kot je prikazano v tabeli 3 in reakcije izvajali v aparaturi za PCR, kot je prikazano v tabeli 4.

(47)

Tanja Peric

24

Tabela 3: Sestava reakcijskih mešanic za reakcijo PCR.

Količina [µL]

vrsta polimeraze: Phusion DreamTaq Taq

dH2O 12,4 14,9 14,7

reakcijski pufer 4 2 2

dNTP (10 mM) 0,4 1 0,2

MgCl2 - - 2

smerni oligonukleotid 1 1 1

protismerni oligonukleotid 1 1 1

matrična DNA 1 - -

polimeraza 0,2 0,1 0,2

celokupen volumen 20 20 20

Tabela 4: Protokol za izvajanje reakcij PCR.

Phusion DreamTaq ali Taq

T [°C] t T [°C] t

Začetna denaturacija 98 30 s 95 3 min

Denaturacija 98 10 s 95 30 s

25 ciklov

Prileganje 60 30 s 60 30 s

Podaljševanje 72 30 s/kb 72 1 min/kb

Končno podaljševanje 72 7 min 72 7 min

3.4.3 Rezanje z restrikcijskimi endonukleazami

Restrikcijo smo izvedli, ko smo želeli zapise za metakasaze tipa I prestaviti iz enega vektorja v drugega. Restrikcijo DNA smo izvajali z dvema restrikcijskima encimoma hkrati. Pri tem smo pazili na kompatibilnost obeh encimov s pufrom, kar smo preverili s spletnim orodjem Thermo-Fischer Double Digest Calculator [31]. Za rezanje zapisov za izražanje metakaspaz tipa I v E. coli smo uporabili restrikcijska encima NcoI (0,5 µL) in XhoI (0,5 µL) v pufru Tango. Za rezanje zapisa za izražanje CrMCA-I v C.

reinhardtii smo uporabili restrikcijska encima BglII (0,5 µL) in EcoRI (0,5 µL) v pufru O.

Reakcijske mešanice smo inkubirali pri 37 °C tri ure. Restrikcijsko mešanico smo nato nanesli na agarozni gel ter po elekroforezi izolirali DNA ustrezne velikosti iz gela.

Za namen linearizacije vektorjev pOpt smo uporabili restrikcijsko endonukleazo AanI.

Reakcijo smo izvajali v pufru Tango pri 37 °C. Po reakciji smo reakcijsko mešanico

(48)

Tanja Peric

25

nanesli na agarozni gel in po elektroforezi liso, ki je ustrezala lineariziranemu vektorju, izolirali iz gela.

3.4.4 Agarozna gelska elektroforeza

Količino potrebne agaroze smo preračunali glede na želeno gostoto gela in volumen kadičke. Uporabljali smo 1 % gel. Agarozo smo v pufru TAE raztopili s segrevanjem v mikrovalovni pečici. Nato smo raztopino nekoliko ohladili in ji dodali 3-10 µL 10 mg/µL etidijevega bromida (odvisno od volumna kadičke). Raztopino smo vlili v kadičko in vstavili glavniček s žepki. Pred izvedbo elektroforeze smo počakali vsaj 20 min oziroma dokler se gel ni strdil. Na gel smo nato nanesli vzorce in kadičko priklopili na napetost približno 110 V. Kot standard za velikost fragmentov smo na gelu uporabili GeneRuler, kot nanašalni pufer pa DNA Gel Loading Dye (6×), ki vsebuje barvili bromfenol modro in ksilen cianol. Elektroforezo smo izvajali, dokler ni ksilen cianol iz nanašalnega pufra prepotoval približno dve tretjini dolžine gela. Gel smo nato slikali z aparaturo za slikanje gelov MiniBis Pro.

3.4.5 Izolacija DNA iz agaroznega gela in ligacija

Liso ustrezne velikosti smo z modelirnim nožem izrezali iz agaroznega gela. Izolacijo DNA iz gela smo izvajali po navodilih proizvajalca kompleta reagentov E.Z.N.A Gel Extraction Kit, Omega Bio-Tek.

Ligacijo v vektor pJet1.2/blunt smo izvajali s kompletom reagentov CloneJet PCR Cloning Kit. Zmešali smo 7 µL reakcijskega pufra, 0,5 µL plazmida pJet, 7 µL fragmenta, ki smo ga želeli vstaviti v vektor, in 1 µL DNA-ligaze T4. Reakcijsko mešanico smo inkubirali pri sobni temperaturi 30 min.

Za ligacijo v vektorje pET28b(+) in pOpt smo zmešali 10 µL izolirane DNA z zapisom za metakaspazo, 3 µL vektorja, ki smo ga rezali z enakimi restrikcijskimi endonukleazami kot vključek, 1,5 µL ligacijskega pufra in 1 µL DNA-ligaze T4.

Reakcijsko mešanico smo inkubirali čez noč na stresalniku pri 16 °C.

(49)

Tanja Peric

26 3.4.6 Transformacija celic E. coli

Kompetentne celice smo do uporabe hranili v alikvotih po 100 µL pri -80 °C, nato pa smo jih odtalili na ledu. Odtaljenim celicam smo dodali 1 µL plazmida (oziroma celotno ligacijsko mešanico, če smo transformacijo izvajali po ligaciji) in inkubirali na ledu eno uro. Nato smo izvedli toplotni šok tako, da smo mikrocentrifugirko s celicami za 45 sekund prestavili v termoblok pri 42 °C. Celice smo nekaj minut inkubirali na ledu, nato pa smo jim dodali 600 µL gojišča LB, ter jih inkubirali eno uro s stresanjem pri 37 °C.

Transformacijsko mešanico smo nato centrifugirali 5 minut pri 3000 g, supernatant oddekantirali in usedlino resuspendirali v preostanku supernatanta. Celice smo razmazali na ploščo LBA, če so vsebovale vektorje pJet ali pOpt oziroma na ploščo LBK, če so vsebovale vektor pET28b(+). Plošče smo nato inkubirali preko noči pri 37

°C ter naslednji dan posamične kolonije s sterilnim nastavkom za pipetiranje precepili v tekoče gojišče z ustreznim antibiotikom. Plošče smo nato hranili pri 4 °C, tekočo kulturo pa gojili preko noči v stresalniku pri 37 °C.

3.4.7 Izolacija plazmidov iz celic E. coli in preverjanje nukleotidnih zaporedij

Za izolacijo plazmidov iz prekonočne tekoče celične kulture smo uporabili komplet reagentov GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Najprej smo 6 mL tekoče celične kulture E.

coli centrifugirali 3 min pri 10.000 g in odstranili supernatant. Nato smo sledili navodilom za uporabo kompleta reagentov.

Nukleotidno zaporedje vključkov smo preverili s sekvenciranjem. Reakcijsko mešanico (5 µL vzorčne DNA, 2,5 µL dH₂O in 2 µL začetnega oligonukleotida) smo poslali v analizo podjetju GATC Biotech Sequencing (Nemčija). Če je bilo pričakovano zaporedje daljše od 1500 bp, smo ga sekvencirali s smernim in protismernim nukleotidom, v nasprotnem primeru pa je zadostovalo sekvenciranje s smernim začetnim oligonukleotidom.

3.4.8 Izražanje proteinov in priprava vzorca za nikljevo afinitetno kromatografijo

Proteine smo izražali v avtoindukcijskem gojišču ZYM. V dvolitrske erlenmajerice smo prenesli 400 mL gojišča in sterilno dodali 400 µL prekonočne celične kulture (sev

(50)

Tanja Peric

27

E. coli BL21 in plazmid pET28b(+) z vstavljenim želenim vključkom). Tako pripravljeno kulturo smo nato gojili v stresalniku pri 37 °C, dokler ni optična gostota, merjena pri valovni dolžini 600 nm, dosegla 0,8. Nato smo celično kulturo prenesli v stresalnik pri 16 °C in inkubirali preko noči. Naslednji dan smo odvzeli 1 mL kulture in preostale celice posedli z 10 min centrifugiranjem pri 4 °C in 5000 g. Supernatant smo odstranili, celice pa resuspendirali v 40 mL pufra za nikljevo afinitetno kromatografijo in po potrebi shranili pri -20 °C. Odtaljenim celicam smo nato razbili celično steno z ultrazvočnim homogenizatorjem (3× 5 min, na ledu). Ostanke liziranih celic smo posedli s centrifugiranjem (30 min, 30.000 g, 4 °C). Supernatant smo shranili za nanos na nikljevo afinitetno kromatografijo, usedlino pa zavrgli.

Mililitrskemu vzorcu, ki smo ga odvzeli pred centrifugiranjem, smo odvzeli 50 µL in ga shranili pri -20 °C, preostanku pa smo razbili celične membrane z ultrazvočnim homogenizatorjem (3× 30 s, na ledu). Lizirane celice smo nato centrifugirali 3 min pri 10.000 g. Odvzeli smo 50 µL supernatanta in ga shranili pri -20 °C, preostanek supernatanta pa zavrgli. Usedlino smo resuspendirali v 900 µL dH₂O in shranili pri -20 °C. Tako pridobljene vzorce smo kasneje uporabili za elektroforezo na poliakrilamidnem gelu, da smo preverili izražanje želenjega proteina v topni in netopni frakciji vzorca.

3.4.9 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS

Uporabljali smo 12,5 % gele, ki smo jih pripravili tako, kot je napisano v tabeli 5. Takoj po tem, ko smo dodali APS in TEMED, smo ločevalni gel vlili med stekelci do približno dva centimetra od roba. Čez tako vlit gel smo nakapali izopropanol, da se je fronta izravnala in se gel ni izsušil. Počakali smo, dokler se ob nagibanju stekelc gel ni več premikal. Nato smo izopropanol popivnali in čez ločevalni gel vlili koncentracijski gel ter med stekelci vtaknili glavniček za oblikovanje žepkov. Čez približno pol ure smo glavničke odstranili in gele uporabili ali shranili zavite v mokrih papirnatih brisačkah in v plastični vrečki pri 4 °C.