POMEN VODNEGA REŽIMA IN VSEBNOSTI SILICIJA NA RAZGRADNJO IN SESTAVO MIKROBNIH ZDRUŽB OPADA NAVADNEGA TRSTA

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE

Tijana SAMARDŽIĆ

POMEN VODNEGA REŽIMA IN VSEBNOSTI SILICIJA NA RAZGRADNJO IN SESTAVO MIKROBNIH ZDRUŽB OPADA NAVADNEGA

TRSTA

MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja

Ljubljana, 2022

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE

Tijana SAMARDŽIĆ

POMEN VODNEGA REŽIMA IN VSEBNOSTI SILICIJA NA RAZGRADNJO IN SESTAVO MIKROBNIH ZDRUŽB OPADA

NAVADNEGA TRSTA

MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja

THE EFFECT OF SILICON CONTENT AND WATER REGIME ON DEGRADATION AND MICROBIAL COMMUNITIES ON COMMON

REEDS' LITTER

M. SC. THESIS Master Study Programmes

Ljubljana, 2022

Mojoj baki Ljubici

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Molekulska in funkcionalna biologija na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Delo je bilo opravljeno na Katedri za fiziologijo rastlin na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani in na odseku za fiziko nizkih in srednjih energij na Inštitutu Jožef Štefan.

Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala doc. dr. Matevža Likarja in somentorico prof. dr. Katarino Vogel Mikuš ter recenzentko prof. dr. Marjano Regvar.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednica: prof. dr. Mateja GERM

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Član: doc. dr. Matevž LIKAR

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Član: prof. dr. Katarina VOGEL MIKUŠ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Marjana REGVAR

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Datum zagovora:

Tijana Samardžić

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Du2

DK UDK 579:582.542(043.2)

KG silicij, vodni režim, razgradnja, mikrobne združbe, navadni trst AV SAMARDŽIĆ, Tijana, dipl. biol. (UN)

SA LIKAR, Matevž (mentor), VOGEL MIKUŠ, Katarina (somentorica), REGVAR, Marjana (recenzentka)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Magistrski študijski program druge stopnje Molekulska in funkcionalna biologija

LI 2022

IN POMEN VODNEGA REŽIMA IN VSEBNOSTI SILICIJA NA RAZGRADNJO IN SESTAVO MIKROBNIH ZDRUŽB OPADA NAVADNEGA TRSTA TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja)

OP XI, 68 str., 12 pregl., 16 sl., 14 pril., 118 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Ker imajo glive in bakterije ključno vlogo med procesom razgradnje, smo preučevali, kako vsebnost silicija (Si) in sprememba vodnega režima vplivata na strukturo in pestrost mikrobnih združb. Za določanje vpliva vodnega režima na potek razgradnje, smo liste navadnega trsta različne starosti in iz različnih geografskih lokacij izpostavili razgradnji na suhi in mokri mikrolokaciji. Nato smo z uporabo visokozmogljivega sekvenciranja analizirali strukturo in diverziteto mikrobov ter ugotovili, da glivne operacijske taksonomske enote (ang. operational taxonomic unit–OTU) večinoma sodijo v deblo Ascomycota (95,7 %) in da so med njimi najbolj številni OTU s saprotrofskim načinom prehranjevanja (48,6%). Pokazali smo, da na pestrost mikrobnih združb najbolj vpliva vodni režim. Pestrost bakterijskih združb se z razgradnjo poveča. Ugotovili smo pozitivno korelacijo (R=0,75; p<0,001) med vsebnostjo Si in pestrostjo združb gliv v vzorcih, ne pa tudi združb bakterij. S rezultati, pridobljeni z uporabo metode XRF smo pokazali, da na vsebnost Si v vzorcih vplivajo: starost listov, geografska lokacija in vodni režim. Pokazali smo tudi težnjo upada vsebnosti makronutrientov po razgradnji. Nasprotno se je vsebnost Fe zvišala pri vzorcih, izpostavljenih razgradnji na mokri mikrolokaciji. Vsebnost Zn in Mn se je razlikovala med vzorci iz različnih geografskih lokacij, izpostavljenih razgradnji na suhi mikrolokaciji. S spektroskopsko metodo FTIR smo ugotovili značilen upad celuloznih komponent pri vzorcih, izpostavljenih razgradnji na mokri mikrolokaciji. Z vidika biokemijske sestave opada po razgradnji je razvidno, da je bila razgradnja pospešena na mokri mikrolokaciji, ki je sovpadla z večjo diverziteto bakterijskih združb.

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2

DC UDC 579:582.542(043.2)

CX silicon, water regime, decomposition, microbial communities, common reed AU SAMARDŽIĆ, Tijana

AA LIKAR, Matevž (supervisor), VOGEL MIKUŠ, Katarina (co-adviser), REGVAR, Marjana (reviewer)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Molecular and Functional Biology

PY 2022

TI THE EFFECT OF SILICON CONTENT AND WATER REGIME ON

DEGRADATION AND MICROBIAL COMMUNITIES ON COMMON REEDS' LITTER

DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO XI, 68 p., 12 tab., 16 fig., 14 ann., 118 ref.

LA sl AL sl/en

AB Since fungi and bacteria play major role during the decomposition process, we analyzed silicon (Si) content and water regime as factors affecting microbial structure and diversity. To assess how water regime affects decomposition, we exposed common reed's leaf samples varying in age and originating from two different geographical locations to decomposition process in wet and dry microlocations.

Using high throughput sequencing we analyzed microbial structure and diversity and showed that most of the fungal operational taxonomic units (OTU) are saprotrophs (48,6%) belonging to the phylum Ascomycota (95,7%). We showed that the water regime significantly affects microbial diversity. Bacterial diversity increases during the decomposition. Also we displayed positive correlation (R=0,75; p<0,001) between Si content and fungal diversity, which was not the case for bacterial diversity. Results obtained using XRF method showed significant effect of leaf age, geographical location and water regime on Si content. Additionally we showed macronutrient content decrease during the decomposition. On the other side, Fe content increased in samples exposed in wet microlocation while we displayed distinctive pattern of Zn and Mn content between samples from different geographical locations exposed to decomposition in dry microlocation. Using FTIR method we measured sample organic compound content and showed cellulose components decrease in samples exposed to decomposition in wet microlocation.

From the aspect of biochemical properties, decomposition was promoted in wet microlocation, which is consistent with higher bacterial diversity.

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VII KAZALO SLIK ... VIII KAZALO PRILOG ... X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... XI

1 UVOD ... 1

1.1NAMEN DELA ... 2

1.2DELOVNE HIPOTEZE ... 2

2 PREGLED OBJAV ... 4

2.1 CERKNIŠKO JEZERO ... 4

2.1.1 Navadni trst (Phragmites australis (Cav.) Trin. Ex Steud.) ... 4

2.2 RAZGRADNJA RASTLINSKEGA OPADA ... 5

2.2.1 Vpliv vodnega režima na razgradnjo... 6

2.2.2 Vpliv lastnosti rastlinskih tkiv na razgradnjo ... 7

2.2.3 Pomen mikrobov in mikrobnih združb med procesom razgradnje ... 8

3 MATERIAL IN METODE ... 11

3.1 VZORČENJE IN IZPOSTAVITEV RAZGRADNJI ... 11

3.1.1 Vzorčne lokacije in nabiranje rastlinskega materiala... 11

3.1.2 Izpostavitev rastlinskega materiala razgradnji ... 11

3.1.2.1 Metoda z mrežastimi vrečkami... 12

3.2 RENTGENSKA FLUORESCENČNA SPEKTROMETRIJA (X-RAY FLUORESCENCE SPECTROMETRY-XRF) ... 13

3.2.1 Priprava tabletk za XRF in meritev ... 14

3.3 INFRARDEČA SPEKTROSKOPIJA (FOURIER TRANSFORM INFRARED SPECTROSCOPY – FTIR) ... 15

3.3.1 Priprava vzorcev za FTIR in meritev ... 15

3.4 MOLEKULARNE METODE ... 16

3.4.1 Priprava vzorcev za izolacijo DNA ... 16

3.4.2 Izolacija DNA in prečiščevanje ... 16

3.4.3 Kvantifikacija DNA z uporabo NanoDrop-a ... 16

3.4.4 Sekvenciranje naslednje generacije (Next generation sequencing-NGS) ... 17

3.5 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV ... 18

4 REZULTATI ... 19

4.1 GLIVNE ZDRUŽBE NA LISTIH NAVADNEGA TRSTA ... 19

4.2 RAZLIKE V SESTAVI GLIVNIH ZDRUŽB PRI RAZGRADNJI ... 24

4.2.1 Identifikacija prisotnih indikatorskih gliv na ravni rodu ... 25

4.3 BAKTERIJSKE ZDRUŽBE NA LISTIH NAVADNEGA TRSTA ... 27

4.4 RAZLIKE V SESTAVI BAKTERIJSKIH ZDRUŽB PRI RAZGRADNJI ... 31

4.5 RAZLIKE V ELEMENTNI SESTAVI LISTOV PRI RAZGRADNJI ... 33

4.6 SPREMEMBE V ORGANSKI SESTAVI LISTOV PRI RAZGRADNJI ... 36

5 RAZPRAVA ... 39

5.1 GLIVNE ZDRUŽBE LISTOV NAVADNEGA TRSTA ... 39

5.1.1 Struktura in biodiverziteta glivnih združb ... 39

5.1.2 Način prehranjevanja glivnih kolonizatorjev ... 40

5.2 BAKTERIJSKE ZDRUŽBE LISTOV NAVADNEGA TRSTA ... 41

5.2.1 Struktura in biodiverziteta bakterijskih združb ... 41

5.3 VPLIV VODNEGA REŽIMA IN VSEBNOSTI SILICIJA NA MIKROBNE ZDRUŽBE IN SESTAVO LISTOV NAVADNEGA TRSTA ... 43

5.3.1 Vpliv vodnega režima in vsebnosti silicija na sestavo mikrobnih združb ... 43

5.3.2 Vpliv vodnega režima na elementno sestavo listov po razgradnji ... 45

5.3.3 Vpliv vodnega režima na organsko sestavo listov po razgradnji ... 48

6 SKLEPI ... 51

7 VIRI ... 54 ZAHVALA

PRILOGE

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Razlike v sestavi glivnih združb, med pari obravnav, in sicer med izvornimi vzorci in vzorci, izpostavljenimi razgradnji na mokri mikrolokaciji, med izvornimi in izpostavljenimi razgradnji na suhi mikrolokaciji in nazadnje med vzorci izpostavljenimi razgradnji na mokri in suhi mikrolokaciji. ... 25 Preglednica 2: Razlike v sestavi glivnih združb v vzorcih glede na starost listov in

geografsko lokacijo listov. ... 25 Preglednica 3: Identificirani indikatorski rodovi gliv v skupini izvornih vzorcev. A – verjetnost, da je v preiskovanem vzorcu določen rod, B – verjetnost, da bomo v določenem tipu vzorca našli ta rod... 25 Preglednica 4: Identificirani indikatorski rodovi gliv v skupini izvornih vzorcev in v vzorcih izpostavljenih razgradnji na suhi mikrolokaciji. A – verjetnost, da je v

preiskovanem vzorcu določen rod, B– verjetnost, da bomo v določenem tipu vzorca našli ta rod. ... 26 Preglednica 5: Identificiran indikatorski rod gliv v vzorcih iz geografske lokacije Zadnji Kraj. A – verjetnost, da je v preiskovanem vzorcu določeni rod, B – verjetnost, da bomo v določenem tipu vzorca našli ta rod. ... 26 Preglednica 6: Razlike v sestavi bakterijskih združb, med pari obravnav, in sicer med izvornimi vzorci in vzorci, izpostavljenimi razgradnji na mokri mikrolokaciji, med izvornimi in izpostavljenimi razgradnji na suhi mikrolokaciji in nazadnje med vzorci izpostavljenimi razgradnji na mokri in suhi mikrolokaciji. ... 32 Preglednica 7: Razlike v sestavi bakterijskih združb v vzorcih glede na starost listov in geografsko lokacijo listov. ... 33 Preglednica 8: Primerjava vsebnosti elementov glede na obravnavo oz. med izvornimi listi in listi, ki so izpostavljeni razgradnji na mokri ter suhi mikrolokaciji. ... 34 Preglednica 9: Razlike v elementni sestavi med pari obravnav, in sicer med izvornimi vzorci in izpostavljenimi razgradnji na mokri mikrolokaciji, med izvornimi vzorci in izpostavljenimi razgradnji na suhi mikrolokaciji in nazadnje med vzorci izpostavljenimi razgradnji na mokri in suhi mikrolokaciji. ... 34 Preglednica 10: Prikaz statistično značilnih razlik vsebnosti elementov vzorcev

izpostavljenih razgradnji glede na starost listov (spodnji, zgornji), geografsko lokacijo (Gorenje Jezero in Zadnji Kraj) in vodni režim (mokro, suho). Rezultati so pridobljeni s ThreeWay ANOVO. ... 35 Preglednica 11: Razlike v elementni sestavi vzorcev glede na starost listov in geografsko lokacijo listov. ... 36 Preglednica 12: Prikaz valovnih številk vrhov absorpcij z organskimi komponentami, ki jih predstavljajo (Regvar in sod., 2013; Fahey in sod., 2017). ... 38

KAZALO SLIK

Slika 1: Shema poskusa: izhodiščno stanje (levo) – štiri skupine izvornih vzorcev iz

različnih geografskih lokacij: GJ (Gorenje Jezero) in ZK (Zadnji Kraj) ter različne starosti:

zgornji (ZG) in spodnji (SP); po poskusu (desno) – osem skupin vzorcev iz različnih geografskih lokacij: GJ (Gorenje Jezero) in ZK (Zadnji Kraj), različne starosti: zgornji (ZG) in spodnji (SP), izpostavljeni razgradnji na dve različni mikrolokaciji: mokri in suhi.

... 13 Slika 2: Prikaz pestrosti gliv v treh obravnavah in sicer v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho) glede na geografsko lokacijo, in sicer Gorenje Jezero (GJ) in Zadnji Kraj (ZK). Pestrost je prikazana z vidika treh cenilk: cenilka Chao1 – bogatost OTU, cenilka Shannon – enakomernost razporeditve OTU in cenilka Simpson – pestrost in dominantnost prisotnih OTU. ... 20 Slika 3: Pestrost gliv v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho) glede na starost listov na rastlini (spodnji listi – SP in zgornji listi – ZG). Pestrost je prikazana z vidika treh cenilk: cenilka Chao1-bogatost OTU, cenilka Shannon-enakomernost razporeditve OTU in cenilka Simpson-pestrost in dominantnost prisotnih OTU. ... 21 Slika 4: Skupni prikaz prisotnosti redov gliv v posameznih vzorcih glede na obravnavo, in sicer v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho). ... 22 Slika 5: Prisotnost rodov gliv v vseh obravnavah glede na način prehranjevanja oz.

trofičnost. ... 23 Slika 6: Prikaz korelacije med vsebnostjo Si in bogatostjo (cenilka Chao1) glivnih združb z uporabo Spearmanovega R. ... 23 Slika 7: Nemetrično večrazsežnostno lestvičenje (Non-metric multidimensional scaling- NMDS) za glivne taksonomske razrede na podlagi Bray-Curtis matrike raznolikosti za 20 najbolj prisotnih družin gliv v vseh obravnavah. ... 24 Slika 8: Pestrost bakterij v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho) glede na geografsko lokacijo, in sicer Gorenje Jezero (GJ) in Zadnji Kraj (ZK). Pestrost je prikazana z vidika treh cenilk: cenilka Chao1 – bogatost OTU, cenilka Shannon – enakomernost razporeditve OTU in cenilka Simpson – pestrost in dominantnost prisotnih OTU. ... 27 Slika 9: Pestrost bakterij v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho) glede na starost listov (spodnji listi – SP in zgornji listi – ZG). Pestrost je prikazana z vidika treh cenilk: cenilka Chao1 – bogatost OTU, cenilka Shannon – enakomernost razporeditve OTU in cenilka Simpson – pestrost in dominantnost prisotnih OTU. ... 28 Slika 10: Prvi del – Skupni prikaz relativne prisotnosti redov bakterij v posameznih

vzorcih glede na obravnavo in sicer v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho). ... 29 Slika 11: Drugi del – Skupni prikaz relativne prisotnosti redov bakterij v posameznih vzorcih glede na obravnavo in sicer v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho). ... 30 Slika 12: Prikaz korelacije med vsebnostjo Si in bogatostjo (Cenilka Chao1) bakterijskih združb z uporabo Spearmanovega R. ... 31

Slika 13: Nemetrično večrazsežnostno lestvičenje (Non-metric multidimensional scaling- NMDS) za bakterijske taksonomske razrede, na podlagi Bray-Curtis matrike raznolikosti za 20 najbolj prisotnih družin bakterij v vseh obravnavah. ... 32 Slika 14: Vsebnost in prerazporejenost elementov v vzorcih glede na obravnavo (suhi, izvorni in mokri), geografsko lokacijo (Gorenje Jezero – GJ in Zadnji Kraj – ZK) in starost listov (spodnji in zgornji). ... 33 Slika 15: Grupiranje vzorcev glede na obravnavo na podlagi podobnosti vzorcev v

organski sestavi določeni s FTIR. Okrajšave za geografsko lokacijo: ZK-Zadnji Kraj in GJ- Gorenje Jezero, okrajšave za starost listov: ZG-zgornji, SP-spodnji, okrajšave za

obravnavo: I-izvorni vzorci, M-vzorci izpostavljeni razgradnji na mokri mikrolokaciji in S-vzorci izpostavljeni razgradnji na suhi mikrolokaciji. ... 36 Slika 16: Prikaz delnega območja spektrov vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu. Okrajšave za geografsko lokacijo: ZK-Zadnji Kraj in GJ-Gorenje Jezero, okrajšave za starost listov: ZG-zgornji, SP-spodnji, okrajšave za vodni režim: M- vzorci izpostavljeni razgradnji na mokri mikrolokaciji in S- vzorci izpostavljeni razgradnji na suhi mikrolokaciji. ... 37

KAZALO PRILOG

PRILOGA A: Pojavnost določenih razredov gliv iz debla Ascomycota PRILOGA B: Pojavnost določenih družin gliv iz debla Ascomycota PRILOGA C: Pojavnost določenih razredov gliv iz debla Basidiomycota PRILOGA D: Pojavnost določenij družin gliv iz debla Basidiomycota PRILOGA E: Hkratna prisotnost določenih skupin gliv v izvornih vzorcih

PRILOGA F: Hkratna prisotnost določenih skupin gliv v vzorcih, izpostavljenih dekompoziciji na suhem

PRILOGA G: Hkratna prisotnost določenih skupin gliv v vzorcih, izpostavljenih dekompoziciji na mokrem

PRILOGA H: Prikaz razlik med skupinami za posamezen element izvornih vzorcev oz.

vzorcev pred izpostavitvijo dekompoziciji glede na starost listov (spodnji, zgornji) in geografsko lokacijo (Gorenje Jezero in Zadnji Kraj)

PRILOGA I: Spektri vseh vzorcev, pridobljenih z uporabo metode FTIR z označenimi pomembnimi vrhovi

PRILOGA J: Seznam označenih značilnih vrhov spektrov (Priloga J) z organskimi komponentami, ki jih predstavljajo (Regvar in sod. 2013)

PRILOGA K: Zgornji del – spektri regije prstnega odtisa za spodnje liste z lokacije Zadnji Kraj (ZK) pred in po dekompoziciji pri suhih in mokrih pogojih. Spodnji del slike – diferencialni spektri, ki prikazujejo razliko med spodnjimi listi, izpostavljenimi razgradnji na mokrem in suhem z lokacije ZK

PRILOGA L: Zgornji del – spektri regije prstnega odtisa za spodnje liste z lokacije Gorenje Jezero (GJ) pred in po dekompoziciji pri suhih in mokrih pogojih. Spodnji del slike – diferencialni spektri, ki prikazujejo razliko med spodnjimi listi izpostavljenimi razgradnji na mokrem in suhem iz lokacije GJ

PRILOGA M: Zgornji del – spektri regije prstnega odtisa za zgornje liste z lokacije Zadnji Kraj (ZK) pred in po dekompoziciji pri suhih in mokrih pogojih. Spodnji del slike – diferencialni spektri, ki prikazujejo razliko med spodnjimi listi izpostavljenimi razgradnji na mokrem in suhem z lokacije ZK

PRILOGA N: Zgornji del – spektri regije prstnega odtisa za zgornje liste z lokacije Gorenje Jezero (GJ) pred in po dekompoziciji pri suhih in mokrih pogojih. Spodnji del slike – diferencialni spektri, ki prikazujejo razliko med zgornjimi listi izpostavljenimi razgradnji na mokrem in suhem iz lokacije GJ

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

FTIR – Infrardeča spektroskopija (ang. Fourier Transform Infrared Spectroscopy) NGS – Sekvenciranje naslednje generacije (ang. Next generation sequencing) DNA – Deoksiribonukleinska kislina

PCR – Polimerazna verižna reakcija (ang. Polymerase chain reaction) OTU – Operacijska taksonomska enota (ang. Operational taxonomic unit) XRF – Rentgenska fluorescenčna spektrometrija (ang. X-ray fluorescence) ZK – Zadnji kraj

GJ – Gorenje Jezero SP – spodnji listi ZG – zgornji listi M – mokri S – suhi

BSi – biogeni silicij

1 UVOD

Razgradnja rastlinskih tkiv je z vidika kroženja snovi eden najbolj pomembnih procesov v mokriščih (Dolinar in sod., 2016). Ker imajo poglavitno vlogo med procesom razgradnje mikrobi, je pomembno raziskati diverziteto ter njihovo funkcijo (Kelley in Jack, 2002).

Kolonizacija listov z mikrobi in stopnja razgradnje v vodnih ekosistemih je pod vplivom notranjih dejavnikov, kot so biokemijske lastnosti listov in različnih zunanjih okoljskih dejavnikov.

Cerkniško jezero je dober primer naravnega, heterogenega in sezonsko spreminjajočega se okolja, ki vpliva na procese, npr. razgradnjo rastlin, značilne za ta ekosistem (Dolinar in sod., 2016). Sprememba vodnega režima je glavna lastnost izbrane lokacije, saj je jezero presihajoče. Številni raziskovalci poročajo o vplivu prisotnosti vode na mikrobne združbe in vsebnost mineralnih hranil v rastlinah med procesom razgradnje rastlinskega materiala (Brinson in sod., 1981; Middleton in sod., 1992; Neckles in Neill, 1994; Wallis in Raulings, 2011; Sun in sod., 2012; Dolinar in sod., 2016; Likar in sod., 2018). Analizirali smo vpliv vodnega režima in vsebnosti silicija (Si) na prisotnost mikrobnih združb ter spremembe v elementni in organski sestavi listnega opada med procesom razgradnje listov navadnega trsta (Phragmites australis (Cav.) Trin. Ex Steud.). Sprememba vodnega režima je lahko omejujoči dejavnik za proces razgradnje, saj lahko na več načinov vpliva na mikrobno aktivnost, zato smo skladno s tem vzorce izpostavili razgradnji v dve različni mikrolokaciji, in sicer v suhi in vlažni mikrolokaciji. Odgovor rastlin na heterogene okoljske razmere se razlikuje v posameznih rastlinskih tkivih, saj se ta razlikujejo glede na sestavo in vsebnost elementov ter raven plastičnosti (Schaller in sod., 2014). Privzem in nalaganje nutrientov, ki prispevajo k premagovanju stresnih dejavnikov, omogoča rastlinam preživetje v spreminjajočem se okolju. Pomembna lastnost navadnega trsta je privzem in nalaganje Si, ki se akumulira v obsežnem rezervoarju biogenega silicija (BSi) oz. amorfnih silicijevih depozitov t.i. fitolitov (Xia in sod., 2020). Kljub temu, da Si za večino rastlinskih vrst ni esencialen element, je zelo koristen in ima več funkcij. Spodbuja rast in razvoj rastlin, blaži stres ter povečuje strukturno trdnost (Alfredsson in sod., 2016). Čeprav je raven privzema Si odvisen od vrste rastline, so vse trave akumulatorji Si. Dostop Si med rastjo rastlin spreminja koncentracijo tega elementa v tkivih kot tudi druge vidike tkivne kemije in vsebnosti

organskih molekul, npr. vsebnost celuloze (Schoelynck in Struyf, 2016; Kostic in sod., 2017). Ker se Si postopoma nalaga v listih, obstajajo razlike v stopnji inkrustacije med mladimi in starimi listi (Klančnik in sod., 2014). Vse strategije rastlin premagovanja stresnega okolja, ki spreminjajo tkivno kemijo, lahko vplivajo na potek razgradnje rastlinskega tkiva (Świerk in sod., 2018).

1.1 NAMEN DELA

Raziskava je bila narejena na vzorcih listov navadnega trsta z območja Cerkniškega jezera.

Izbrane geografske lokacije za vzorčenje so priobalno Gorenje Jezero in litoralni Zadnji Kraj. Namen analiz je bil ugotoviti vpliv vsebnosti Si in vodnega režima na diverziteto in strukturo mikrobnih združb listnega opada navadnega trsta ter posledično na razgradnjo.

Nabrali smo liste (Phragmites australis (Cav.) Trin. Ex Steud.), ki so se razlikovali glede na starost in geografsko lokacijo. Nato smo del vzorcev izpostavili razgradnji na dveh različnih mikrolokacijah (suha in mokra), in sicer z uporabo metode z mrežastimi vrečkami (ang. litter bag method). Analizirali smo prisotnost in pestrost mikrobnih združb, elementno ter organsko sestavo izvornega materiala, ki ni bil izpostavljen razgradnji, kot tudi vzorce, izpostavljene razgradnji pri različnem vodnem režimu. Zanimal nas je torej vpliv dostopnosti vode in vsebnosti Si, ki omogoča bolj strukturno trdnost rastlinskega tkiva, na strukturo in diverziteto mikrobov, dinamiko mineralnih hranil in potek dekompozicije, zanimale pa so nas tudi razlike analiziranih parametrov med listi pred in po izpostavljenosti razgradnji pri različnem vodnem režimu (iz suhe in mokre mikrolokacije), z različnih geografskih lokacij in različne starosti.

1.2 DELOVNE HIPOTEZE

Hipoteza 1: Predvidevamo, da se bosta diverziteta in struktura mikrobnih združb razlikovali glede na izvorno geografsko lokacijo listov navadnega trsta.

Hipoteza 2: Predvidevamo, da se bosta diverziteta in struktura mikrobnih združb po razgradnji razlikovali glede na starost listov na rastlini.

Hipoteza 3: Predvidevamo, da se bosta diverziteta in struktura mikrobnih združb razlikovali med vzorci, izpostavljenimi razgradnji pri različnih vodnih režimih.

Hipoteza 4: Predvidevamo, da se bosta elementna in organska sestava listov navadnega trsta po razgradnji razlikovali, kar bo posledica razlik v mikrobnih združbah in/ali vodnem režimu okolja.

2 PREGLED OBJAV

2.1 CERKNIŠKO JEZERO

Cerkniško jezero se nahaja na dnu kraške doline Cerkniško polje (Dolinar in sod., 2010).

Jezero je presihajoče in ni uvrščeno ne med jezera in ne med terestrične ekosisteme.

Izmenjava suhega in poplavljenega obdobja ter ekstremne spremembe vodnega režima vplivajo na bioto in proces mineralizacije (Gaberščik in Urbanc-Berčič, 2003). Raven vode je odvisna od količine in razporeditve letnih padavin v regiji (Urbanc-Berčič in Gaberščik, 2001). Sušna sezona se običajno začne s poletjem in traja do jeseni, ko se jezero znova napolni z vodo med jesenskim dežjem in lahko doseže okoli 550 m nadmorske višine in površino do 26 km² (Dolinar in sod., 2016).

Sprememba vodnega režima je pomemben dejavnik, ki uravnava kroženje snovi in pretok energije (Gaberščik in sod., 2003). Najbolj pomembni procesi v jezeru so produkcija biomase, razgradnja snovi, vključitev v kroženje vode in mineralizacija (Dolinar in sod., 2010). Kompleksnost teh procesov je odvisna od raznolikosti prisotnih organizmov, ki dopolnjujejo ekosistem ter prispevajo k njegovi trajnosti in značilnostim jezera, ki so uravnane s spremembami ravni vode (Gaberščik in Urbanc-Berčič, 2003; Costanza in sod., 2007). Procesi v presihajočem jezeru so značilni za naravne sisteme, klasificirane kot ekosistemi s spremembami vodnega režima in začasne vode ali mokrišča (Gaberščik in sod., 2003). Zaradi heterogenih lastnosti območja je primerno raziskovati proces razgradnje rastlin, ki je pod vplivom spreminjajočih se okoljskih razmer.

2.1.1 Navadni trst (Phragmites australis (Cav.) Trin. Ex Steud.)

Zaradi obsega in frekvence poplavljenosti je vegetacija Cerkniškega jezera zonalno prerazporejena (Dolinar in sod., 2016) in je značilna po prisotnosti tipičnih makrofitov, med katere sodi tudi navadni trst (Phragmites australis (Cav.) Trin. Ex Steud.), in sicer kot najbolj številen (Gaberščik in sod., 2020). Rastline v takih ekosistemih so razvile različne strategije za premagovanje biotskih in abiotskih stresnih dejavnikov, ki olajšajo vnos hranil,

ter zmanjšujejo učinke vodnega stresa (Longhi in sod., 2008; Šraj Kržič in sod., 2006; Šraj Kržič in sod., 2009).

Phragmites australis subsp. australis (Cav.) Trin. Ex Steud., trajnica iz družine trav, s poreklom iz evrazijskih mokriščih (Meyerson in Cronin, 2013; Soares in sod., 2016), velja za najbolj dominantno in uspešno kozmopolitsko vrsto, ki raste v kopenskih vodah, na priobalnih področjih in presihajočih habitatih (Saltonstall, 2002; Seregin, 2010; Packer in sod., 2017, Świerk in sod., 2018). Navadni trst je ena najbolj razširjenih enokaličnic na svetu in sodi med sto najbolj pogostih rastlinskih vrst zmernega pasu Evrope (Seregin, 2010). Znan je po značilnem vplivu na globalno kroženje snovi, zlasti kroženje Si (Schaller in Struyf, 2013). To so taksoni, katerih predstavniki so prisotni v zelo različnih habitatih in se lahko prilagodijo stresnim okoljem (Dolinar in Gaberščik, 2010). Genetske razlike med ekotipi navadnega trsta jim omogočajo potencial za razvoj različnih mehanizmov odpornosti proti suši, slanosti ali nizki temperaturi (Świerk in sod., 2018).

2.2 RAZGRADNJA RASTLINSKEGA OPADA

Razgradnja je dinamičen proces, ki zajema vse spremembe organskih snovi, ki so rezultat staranja in smrti rastline (Brinson in sod., 1981). Proces poteka v več stadijih in vključuje tri poglavitne dogodke, in sicer razkroj, iztekanje in imobilizacijo. Razkroj predstavlja izgubo organskih snovi kot posledica aktivnosti oz. respiracije in asimilacije s strani mikrobov.

Iztekanje je proces izgube raztopljenih snovi iz organskih komponent skozi proces mobilizacije tako organskih kot tudi neorganskih komponent s fizičnimi procesi ali z aktivnostjo prisotnih dekompozitorjev. Imobilizacija je akumulacija anorganskih ionov preko selektivnega privzema mineralnih hranil s strani mikrobov med njihovo rastjo, kar rezultira s sočasno izgubo organske snovi, ki jim služi kot vir energije.

Razgradnja listov P. australis je dolgotrajen proces, ki traja več tednov ali mesecev in poteka v več fazah, ki vključujejo začetno fazo razgradnje, ko so listi še pritrjeni na steblu, nato pa nadaljevanje procesa razgradnje, ko listi padejo na tla (Voříšková in Baldrian, 2013).

Začetna stopnja razgradnje se začne od baze lista proti vrhu, kar rezultira v postopni senescenci in odmiranju listov vzdolž poganjka.

Kot je že omenjeno, je razgradnja rastlinskih tkiv z vidika doprinosa in kroženja organskih in anorganskih snovi eden najbolj pomembnih procesov v mokriščih (Dolinar in sod., 2016;

Rejmánková in Houdková, 2006). Čeprav imajo organizmi, ki so vključeni v proces razgradnje, pomembno vlogo pri samemu procesu, poteka razgradnje rastlin v vodnih ekosistemih pod vplivom notranjih dejavnikov, kot so različne lastnosti listov, in zunanjih okoljskih dejavnikov, kot so temperatura vode, slanost, pH, vsebnost mineralnih hranil ter lokalne lastnosti kot so klima in solarna radiacija (Rejmánková in Houdková, 2006; M.

Bertoli in sod., 2016; Yang in sod., 2021). V mokriščih je vodni režim zelo pomemben dejavnik, ki vpliva na kolonizacijo in aktivnost mikrobnih dekompozitorjev in posledično na razgradnjo listnega opada (Yang in sod., 2021; Serna in sod., 2013; Sun in sod., 2012;

Brinson in sod., 1981).

2.2.1 Vpliv vodnega režima na razgradnjo

Prisotnost vode lahko vpliva na trajanje posameznih stopenj razgradnje (Neckles in Neill, 1994), ter na sestavo mikrobnih združb opada listov navadnega trsta v vsaki fazi (Likar in sod., 2018) in posledično stopnjo razgradnje. V študiji so Likar in sodelavci (2018) pokazali, da je raznolikost mikrobnih združb večja pri bolj stabilnih suhih ali potopljenih pogojih kot pa v spreminjajočih se vodnih režimih. Dolinar in sodelavci (2016) so pokazali tudi, da je stopnja razgradnje odvisna od sprememb vodnega režima, in sicer da je stopnja razgradnje višja pri dlje časa potopljenih rastlinah, kar je verjetno posledica konstantne vlažnosti in občasnega prezračevanja, kar pospešuje mikrobno aktivnost. Razlog pospešene razgradnje v vodi je lahko tudi iztekanje mineralov in pospešena fragmentacija rastlinskega materiala zaradi fizičnega vpliva vode ter konstantnega vlaženja. V raziskavi so tudi ugotovili, da je stopnja razgradnje višja pri listih kot pri steblih, kar je dokaz vpliva lastnosti tkiv na sam proces. Podobno sta tudi avtorja Wallis in Raulings (2011) potrdila pospešeno dekompozicijo rastlinskega tkiva, in sicer P. australis v potopljenem okolju.

Stebla navadnega trsta tekom senescence ostanejo navpična dlje časa. V takih primerih se razgradnja začne že v zraku s številnimi mikrobnimi združbami, predvsem glivnimi (Kuehn in Suberkropp, 1998). Razgradnja pri nestabilnih suho/vlažnih pogojih je specifičen primer, ki se lahko spreminja v tem smislu, da lahko pospeši razgradnjo zaradi favorizacije oksičnih

pogojev, ki stimulirajo aerobni mikrobni metabolizem (Dolinar in sod., 2016). In obratno lahko poplavljanje zmanjša raven glivne kolonizacije in vpliva na spremembe sestave glivnih združb zaradi pospeševanja anoksičnih razmer (Brinson on sod., 1981; Dolinar in sod., 2016).

V študiji Kelley and Jack (2002) sta z uporabo metode z mrežastimi vrečkami analizirala razgradnjo listnega opada in ugotovila, da se je v potopljenih vrečkah količina ogljika (C) hitro zmanjšala. Ugotovila sta tudi, da se je masa opada pri suhih pogojih zmanjševala postopoma in počasneje kot pri potopljenih pogojih, ter dokazala, da potopljenost listov lahko značilno vpliva na stopnjo razgradnje. Vodni režim se v jezeru Chaney (Kentucky, ZDA), kjer je bila izvedena raziskava, hitro spreminja, kar vpliva na fragmentacijo listov.

Ko so listi potopljeni, je mikrobna aktivnost večja, iztekanje mineralov in organskih snovi v vodo pa bolj intenzivno. V času poplavljenega obdobja oz. v času, ko je jezero popolnoma napolnjeno, se razgradi več opada kot v času suhega obdobja. Spremembe v vzorcih precipitacije, povezane z globalnimi klimatskimi spremembami, lahko vplivajo tudi na razgradnjo opada v jezeru, kar ima velik pomen za mokriščne ekosisteme, odvisne od količine padavin.

Vodni režim oz. prisotnost vode torej neposredno vpliva na potek razgradnje z uravnavanjem iztekanja, vlaženja substrata in posledično posrednega spreminjanja drugih okoljskih dejavnikov, ki vplivajo na mikrobno aktivnost (npr. pH, temperatura, raven kisika in raztopljenih nutrientov) (Neckles in Neill, 1994).

2.2.2 Vpliv lastnosti rastlinskih tkiv na razgradnjo

Višje rastline se soočajo z variabilno dostopnostjo mineralov, ki jih privzemajo iz podlage.

Uravnavanje vsebnosti in privzema mineralov sta zelo pomembna procesa za rast in razvoj rastlin. Za normalno fiziologijo rastlin so pomembni makronutrienti, med katere sodijo ogljik, vodik, kisik, dušik, fosfor, kalij, kalcij, magnezij in žveplo (C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S) in mikronutrienti železo, baker, mangan, cink, bor, molibden, klor in nikelj (Fe, Cu, Mn, Zn, B, Mo, Cl, Ni) (De Carvalho in sod., 2018). Med koristne elemente za rastline sodijo natrij in silicij (Na in Si), saj pospešujejo rast in preživetje rastline v stresnem okolju.

Stopnja razgradnje se pri različnih rastlinskih vrstah (Li Q. in sod., 2020) kot tudi na ravni rastlinskih organov in ravni tkiv razlikuje (Brinson in sod., 1981). Razgradnja rastline je delno kontrolirana z biokemijsko sestavo listnega opada, in sicer vsebnostjo ogljikovih snovi kot so lignin, celuloza in fenoli, ter z elementno stehiometrijo oz. razmerjem med C, N in P (Xia in sod., 2020). Pogosto so študije poteka razgradnje opada pristranske, saj obravnavajo dobro znane lastnosti tkiv, kot so vsebnost N ali lignina (Emsens in sod., 2016). Glede vpliva na razgradnjo, je vsebnost Si v listih zelo pomembna, saj dodatno vpliva na trdnost tkiva (Cornelissen in Thompson, 1997; Emsens in sod., 2016). Dostopnost Si vpliva na razgradnjo opada na način, da lahko vpliva na površinsko kemijsko sestavo opada, vsebnost mineralnih hranil in elementno stehiometrijo (Schaller in Struyf, 2013; Marxen in sod., 2016).

Mehanizmi, kako biogeni Si (BSi) uravnava vsebnost hranil v rastlini in strukturne ogljikove komponente v mokriščnih makrofitih ter posledično stopnjo dekompozicije in biogeokemijski cikel, niso dovolj jasni. V študiji sta Cooke in Leishman (2011) pokazala, da se je trend vsebnosti BSi povečeval v smeri, da ga je najmanj v steblih in nato listih, največ pa ga je v listnemu ovoju, kar kaže na to, da se P. australis ne more izogniti prevzemu Si in transpiracijskemu transportu v nadzemne dele rastline. V študiji Cornelissen in Thompson (1997) predpostavljata, da je uspešnost razgradnje tudi posledica adaptivnih lastnosti živih listov, ki vplivajo na fragmentacijo oz. na trdnost in okus z vidika organizmov, ki se prehranjujejo z listi. Torej so glavne lastnosti tkiv, ki bi lahko vplivale na razgradnjo, trdnost, hranilna vrednost in kemijska obramba. Trdnost pospešuje odpornost proti herbivorom, patogenom in fizičnimi poškodbami. Lignin je verjetno najbolj pomembna sestavina, ki vpliva na trdnost listov, medtem ko je vse več dokazov, da ima tudi Si v celični steni pomembno vlogo pri obrambi proti mikrobom in herbivorom (Cornelissen in Thompson , 1997; Świerk in sod., 2018). Vsebnost Si je bolj odvisna od genetskih lastnosti kot pa dostopnosti Si v podlagi (Cornelissen in Thompson, 1997).

2.2.3 Pomen mikrobov in mikrobnih združb med procesom razgradnje

Zgornji deli rastline, t. i. filosfera, predstavlja heterogen habitat, ki ga kolonizirajo kompleksne mikrobne združbe (Zhan in sod., 2021; Lindow and Brandl, 2003). Kolonizacija mikrobnih združb je odvisna od kemijskih in fizikalnih lastnosti listov med procesom razgradnje, ki definirajo dostopnost in kakovost nutrientov mikrobom (Murphy in sod.,

1998). Različne stopnje razgradnje listov zagotavljajo številne potencialne niše za mikrobe (Mercier in Lindow, 2000). Nekatere skupine gliv, ki so še prisotne na živih listih, preživijo tudi na razkrajajočem listnem tkivu (Osono, 2006). Skladno s tem glive, ki kolonizirajo žive liste, pogosto poleg simbiontskih sodijo tudi med latentne parazite in saprofite, ki po senescenci že v prvih fazah razgradnje začnejo opravljati saprotrofno funkcijo (Osono, 2006). Glive so ključni mikroorganizmi med razgradnjo in transformacijo rastlinskega opada, saj izločajo hidrolitične in oksidativne encime, ki jim omogočajo učinkovito razgradnjo lignoceluloznega matriksa, drugače nedostopnega drugim organizmom (Osono, 2007; Schneider in sod., 2012; Voříšková in Baldrian, 2013; Reuter in sod., 2020). Proces dekompozicije, in sicer depolimerizacije rastlinskih strukturnih komponent z aerobnimi glivami, se začne z razgradnjo že v vertikalnem položaju rastline (Yarwood, 2018). Nato sledi kolaps opada ter nadaljevanje razgradnje rastlinskih ostankov z glivami in bakterijami.

Razgradnja rastlinskega tkiva pred senescenčno fragmentacijo in kolapsom, je zelo pomembna, čeprav je pogosto zanemarjena, saj je to proces obsežne kolonizacije rastlinskih organov in tkiv z glivami, ter začetek razgradnje najbolj obstojnih komponent rastlinskega tkiva, in sicer celuloze in lignina.

Posebnost mikrobov v mokriščnih ekosistemih je prilagajanje na spreminjajoče se okolje in opravljanje več trofičnih funkcij (Yarwood, 2018). Temu rečemo metabolna plastičnost, kar se nanaša na zmožnost posamezne taksonomske skupine opravljati več trofičnih funkcij, in sicer v odvisnosti od okoljskih dejavnikov (Comte in sod., 2013).

Glive so dobro prilagojene na cirkadiane spremembe vodnega režima (na plavljenje in sušo), ki so prisotne v okolju v času začetne faze senescence in razgradnje rastline (Van Ryckegem in sod., 2006). Skladno s tem je v mokriščnih predelih pričakovana velika diverziteta glivnih združb navadnega trsta kot tudi drugih rastlin. Številni raziskovalci so pokazali, da je okoli 600 glivnih vrst na trstiščih v mokriščih predvsem iz debla Ascomycota, nato iz Basidiomycota (Gessner in sod., 2007). Glivne združbe gredo skozi stopnje oz. spremembe v času procesa razgradnje in se glede na aktivnost v določeni fazi razgradnje lahko razdelijo v tri skupine: zgodnja, srednja in pozna stopnja (Tang in sod., 2005). V študiji Tanga in sodelavcev (2005) so opažene filosferne glivne združbe na listih v začetni oz. zgodnji fazi dekompozicije predvsem iz debla Ascomycota. Nekatere skupine askomicet, npr. iz razreda

Dothidiomycetes, so najbolj raznovrstne v ekološkem smislu, saj so življenjske oblike lahko patogeni, saprotrofi in lišaji (Hansen in sod., 2013). Zhan in sodelavci (2021) so v študiji poskušali ugotoviti prisotnost glivnih in bakterijskih taksonov v času vseh stopenj razgradnje S. tabernaemontani. Ugotovili so, da so med najbolj prisotnimi glivami med začetnimi fazami razgradnje glive iz debel Ascomycota in Basidiomycota, se pa v zadnjih fazah ta struktura nekoliko spreminja in vključuje poleg že omenjenih debel še skupini Ciliophora in Rozellomycota, kar nakazuje na kompleksno sestavo glivnih združb in njihovo sukcesijo v času napredovanja procesa razgradnje.

Bakterijski kolonizatorji listov rastlin so enako kot glive, dobro prilagojeni na posebnosti pogojev v filosferi (Tláskal in sod., 2016). Poleg okoljskih abiotskih dejavnikov na strukturo bakterijske združbe vplivajo tudi biotski dejavniki, kot so vrsta rastline, starost listov in interakcije z drugimi mikroorganizmi (Kembel in sod., 2014; Frey-Klett in sod., 2011; Mille- Lindblom in Tranvik, 2003). Dosedanje študije so identificirale najbolj številne skupine bakterij, ki so prisotne med razgradnjo listnega opada, in sicer Actinobacteria, Acidobacteria, Bacteroides, Proteobacteria in Verrucomicrobia. Najbolj številne prisotne bakterije sodijo v debla: Proteobacteria, Firmicutes in Bacteroidetes, na ravni rodu pa so najbolj prisotne bakterije Pantoea, Acinetobacter, Sphingomonas, Pseudomonas, v poznejših fazah razgradnje pa iz rodu Serratia in Planomicrobium (Zhan in sod., 2021).

3 MATERIAL IN METODE

Izolacija in prečiščevanje DNA ter analiza vzorcev z metodo XRF so opravljeni na Katedri za botaniko in fiziologijo rastlin, Oddelka za biologijo, medtem ko je analiza vzorcev z metodo FTIR opravljena na Odseku za fiziko nizkih in srednjih energij na Inštitutu Jožef Štefan. Sekvenciranje DNA je opravljeno pri komercialnem ponudniku Macrogen Inc.

(Južna Koreja).

3.1 VZORČENJE IN IZPOSTAVITEV RAZGRADNJI

3.1.1 Vzorčne lokacije in nabiranje rastlinskega materiala

Vzorci – listi navadnega trsta (Phragmites australis) so bili nabrani 25. 10. 2018 na Cerkniškem jezeru na dveh različnih geografskih lokacijah, in sicer v Zadnjem Kraju (ZK) s koordinatami vzorčenja 45̊ 44̍ 27.60̎ N, 14̊ 22̍ 12.62̎ E in 551 m nadmorske višine ter v Gorenjem Jezeru (GJ) s koordinatami 45̊ 43̍ 38.07̎ N, 14̊ 24̍ 16.64̎ E in 549 m nadmorske višine. Listi so na obeh geografskih lokacijah vzorčenja nabrani naključno znotraj trstišča. Potek nabiranja je bil tak, da so bili listi trgani v predelu listne nožnice, ki smo jih kasneje odstranili in za analize uporabili samo listne ploskve. Na vsaki geografski lokaciji smo nabrali zgornje (ZG) in spodnje (SP) liste na posamezni rastlini ter na ta način pripravili štiri skupine vzorcev, ki so se med seboj razlikovali glede na geografsko lokacijo in starost listov na rastlini, pri čemer so vsi skupaj predstavljali skupino izvornih vzorcev (ZK ZG, ZK SP, GJ ZG, GJ SP) (Slika 1). Zgornje liste so predstavljali prvi štirje najbolj zgornji listi (najmlajši), spodnje pa štirje najbolj spodnji (najstarejši) listi na rastlini.

3.1.2 Izpostavitev rastlinskega materiala razgradnji

Potek poskusa je prikazan na shemi poskusa (Slika 1). Nabrani listi so bili že ob vzorčenju precej suhi. Do postavitve poskusa so se dodatno sušili v laboratoriju, in sicer na zraku na sobni temperaturi (okrog 22°C). Poskus je bil postavljen 10. 9. 2019. Zgornje – ZG in spodnje – SP liste z obeh vzorčnih geografskih lokacij: Gorenje Jezero zgornji listi (GJ ZG), Gorenje Jezero spodnji listi (GJ SP), Zadnji Kraj zgornji listi (ZK ZG), Zadnji Kraj spodnji

listi (ZK SP) smo izpostavili razgradnji pri različnem vodnem režimu oz. na dveh mikrolokacijah na Gorenje Jezeru, in sicer na suhem in vlažnem rastišču, kjer pa je bila suha mikrolokacija večinoma suha in občasno poplavljena v odvisnosti od padavin, mokra pa je bila ves čas poplavljena. Na mokri mikrolokaciji je bila višina vodostaja v času postavitve poskusa okoli 33 cm. Koordinate geografske lokacije na Gorenje Jezeru, kjer smo na suhi in mokri mikrolokaciji postavili poskus, so 45°43' 38,29188''N in 14° 24' 16,71984''E ter 636 m nadmorske višine. Količina izpostavljenih vzorcev oz. število vrečk se je razlikovalo v odvisnosti od količine izhodiščnega posušenega materiala in se zato število vzorcev med posameznimi obravnavanji vzorcev izpostavljenih razgradnji razlikuje (Slika 1). Poskus je potekal do 25. 10. 2019, in sicer 45 dni. Ob koncu poskusa je bila višina vodostaja na mokri mikrolokaciji okoli 15 cm.

3.1.2.1 Metoda z mrežastimi vrečkami

Za proces razgradnje smo pri postavitvi poskusa uporabili metodo z mrežastimi vrečkami, saj nam ta metoda omogoča analizo kolonizatorjev na listih, kot tudi spremembe sestave listov med razgradnjo. Posušene liste smo narezali na manjše kose in jih po 4 g pakirali v mrežaste vrečke premera približno 17 x 22 cm, z luknjicami velikosti 1 x 1 mm. Končnih osem obravnavanj (GJ ZG M, GJ SP M, GJ ZG S, GJ SP S, ZK ZG M, ZK SP M, ZK ZG S, ZK SP S) smo določili šele ob postavitvi poskusa z vzorci, izpostavljenimi razgradnji pri različnem vodnem režimu oz. na mokri in suhi mikrolokaciji in sicer vsaka posamezna vrečka je predstavljala en vzorec (Slika 1). Vrečke smo zaprli s pomočjo spenjača s kovinskimi sponkami. Za vsako od osmih obravnavanj smo v tla zabili lesen količek z odrezanim kolobarjem plastične cevi, na katerega smo z žico navezali vse vrečke, ki so vsebovale liste trsta posamezne obravnave. Ob koncu poskusa smo vrečke pobrali in rastlinski material posušili v laboratoriju na sobni temperaturi.

Slika 1: Shema poskusa: izhodiščno stanje (levo) – štiri skupine izvornih vzorcev iz različnih geografskih lokacij: GJ (Gorenje Jezero) in ZK (Zadnji Kraj) ter različne starosti: zgornji (ZG) in spodnji (SP); po poskusu (desno) – osem skupin vzorcev iz različnih geografskih lokacij: GJ (Gorenje Jezero) in ZK (Zadnji Kraj), različne starosti: zgornji (ZG) in spodnji (SP), izpostavljeni razgradnji na dve različni mikrolokaciji: mokri in suhi.

3.2 RENTGENSKA FLUORESCENČNA SPEKTROMETRIJA (X-RAY

FLUORESCENCE SPECTROMETRY-XRF)

XRF spektrometrija je zanesljiva, hitra in ekonomična tehnika za analizo elementne sestave različnih tipov vzorcev, saj predstavlja analitski sistem, ki vsebuje natančnost, ponovljivost ter minimalno obdelavo vzorcev (Tezotto in sod., 2013). Konvencionalne metode analize vsebnosti določenih elementov na podlagi rastlinskih ekstraktov so zahtevne in pogosto nezanesljive ter predstavljajo omejitev pri zanesljivi in natančni analizi rastlinskih mineralnih hranil.

Osnovo XRF naprave predstavljajo: vir za ekscitacijo, optični elementi za oblikovanje ali usmeritev X žarkov k vzorcu in sistem detekcije za analizo, shranjevanje ter zaznavanje XRF spektra (Towett in sod., 2015; Stankey in sod., 2015). Načelo delovanja metode je proces, v

katerem elektron določenega energetskega obsega interreagira s kovinsko anodo (vir X žarkov) in producira spekter X žarkov (primarni rentgenski žarki) (Towett in sod., 2015). Ti fotoni interreagirajo z atomi v vzorcu, ki nato emitirajo fotone specifične za vsak posamezen element. Nato fotoni (sekundarni X žarki) potujejo skozi atmosfero do detektorja in se na ta način identificirajo kot številke v določenem kanalu, ki se lahko konvertirajo v energetski spekter, kjer elemente identificiramo kot vrhove spektra. Emitirana radiacija je specifična za vsak element (prstni odtis elementa, ang. fingerprint) (Stankey in sod., 2015). Izmerjena radiacija se na računalniku ob uporabi ustreznega programa vidi v obliki spektra. Z uporabo XRF metode je omogočeno boljše razumevanje mehanizmov privzema mineralnih hranil v rastline in spremembe vsebnosti elementov v času različnih procesov.

3.2.1 Priprava tabletk za XRF in meritev

Za XRF analizo smo z uporabo hidravlične stiskalnice iz uprašenih vzorcev, približno 100–

500 mg, naredili tabletke. Posamezne tabletke so stehtane in shranjene v ustrezno označene plastične škatlice. Vsebnost elementov smo merili v vzorcih iz skupine pred poskusom oz.

v izvornih vzorcih, ki je vsebovala dvajset vzorcev (GJZG, GJSP, ZKZG, ZKSP), in iz skupine vzorcev, izpostavljenih dekompoziciji, v kateri se je število vzorcev v posameznih obravnavah razlikovalo zaradi količine dostopnega materiala.

Z rentgensko fluorescenčno spektrometrijo (XRF) smo določili koncentracije elementov: Si, Cl, K, Ca, Ti, Mn, Fe, Zn, Br, Rb, Sr v vzorcih na napravi PDZ-02T, IJS. Kot vir primarne ekscitacije je uporabljena Rh anoda (Moxtek, ZDA). Za natančnejše določanje koncentracije lahkih elementov, predvsem silicija pa je bil kot vzbujevalni vir uporabljen radioizotopski vir Fe⁵⁵ (25 mCi; Isotope Products Laboratories, Valencia, PA, USA). Emitirano fluorescenco smo detektirali s silicijevim (Si) diodnim detektorjem (Amptek, Inc., Bedford, MA, USA), z berilijevim (Be) oknom debeline 12 µm. Energijska zmogljivost spektrometra pri stopnji štetja <1000cps je bila 140eV pri 5.9keV. XRF spektrometerska analiza je opravljena v vakuumu, kjer so vzorci obsevani 5000s, za pridobitev spektrov primernih za statistično obdelavo (Nečemer in sod., 2008). Vizualizacija pridobljenih spektrov je omogočena z programom Peduzo.

3.3 INFRARDEČA SPEKTROSKOPIJA (FOURIER TRANSFORM INFRARED SPECTROSCOPY – FTIR)

Infrardeča spektroskopija (FTIR) je učinkovita, hitra in neinvazivna metoda za strukturno analizo kemijskih lastnosti bioloških materialov (Durak in Depciuch, 2020; Dufour, 2009).

Glavna lastnost metode je ta, da uporablja elektromagnetni del spektra nizke energije, in sicer infrardečo radiacijo (Dence, 1992). Omogoča identifikacijo najpomembnejših funkcionalnih skupin in kemijskih vezi ter zaznavanje biokemijskih komponent, ki se nahajajo v vzorcu (Durak in Depciuch, 2020). Z uporabo srednjega dela valovnih dolžin infrardeče svetlobe (ang. middle infrared-MIR) se analizirajo vibracijske in rotacijske lastnosti molekul oz. lastnosti kemijskih vezi v molekuli, ki se kot rezultat absorpcije infrardeče (IR) radiacije gibljejo in naredijo kemijski profil vzorca oz. t. i. prstni odtis (ang.

fingerprint) (Dufour, 2009; Baker in sod., 2014). Z uporabo ustrezne regije elektromagnetnega spektra, v tem primeru regije 4000–400 cm⁻¹, lahko verodostojno ovrednotimo zelo majhne razlike v sestavi vzorcev (Dence, 1992). Spektralna analiza vzorcev iz iste skupine omogoča vpogled v razlike njihovih kemijskih profilov (Durak in Depciuch, 2020). Za analizo bioloških materialov najbolj pomembne spektralne regije so t.

i. fingerprint regije (600–1,450 cm⁻¹) in amidi I ter amidi II (amidi I/II) regija (1,500–1,700 cm⁻¹) (Baker in sod., 2014). Skupaj te regije predstavljajo biokemijski odtis strukture in funkcije preiskovanega vzorca. Analogni signal, ki ga detektor sprejme, se digitalizira preko analogno-digitalnega pretvornika (ang. analog-digital converter-ADC) in se shrani na računalniku (Dence, 1992). Rezultat merjenja dobimo v obliki spektra.

3.3.1 Priprava vzorcev za FTIR in meritev

Iz vzorcev listov, posušenih na sobni temperaturi, je pripravljenega od 200 mg do 500 mg materiala v obliki finega prahu. Meritev smo opravili na napravi ALPHA-P (Bruker), in sicer po navodilih proizvajalca. Vsak vzorec smo merili v dveh ponovitvah. Na vsakih pet izmerjenih vzorcev smo opravili tudi meritev ozadja z namenom kompenzacije razlik v sestavi atmosfere v prostoru ter odstranjevanja šuma.

Naprava je povezana z računalnikom, kjer v programu OPUS vidimo spektre. Parametri, ki smo jih uporabili v določenem modulu za meritve, so: 126 skeniranj, ločljivost 4 cmˉ¹ in obseg spektralne regije 4000–400 cmˉ¹. Pridobljeni spektri so obdelani z ustreznimi korekcijami, in sicer je opravljena atmosferska kompenzacija celega spektra zaradi odstranjevanja šuma, ATR (ang. Attenuated total reflection) korekcija celega spektra, off- set korekcija ter rezanje regije prstnega odtisa (ang. fingerprint) (1860–700 cmˉ¹). Zaradi natančne primerjave med različnimi spektralnimi domenami in intenzitetami je opravljena tudi normalizacija spektrov (Regvar in sod., 2013).

3.4 MOLEKULARNE METODE

3.4.1 Priprava vzorcev za izolacijo DNA

Vzorci oz. koščki listov so fino zmleti z uporabo tekočega dušika in terilnic. Za vsak posamezen vzorec je bila uporabljena čista terilnica. Listi so se mleli toliko časa, dokler ni bil pridobljen fini prah, ki je bil nato zmerjen na analitski tehtnici na 50 mg in shranjen v ustrezno označene mikrocentrifugirke.

3.4.2 Izolacija DNA in prečiščevanje

Izolacija in čiščenje DNA sta bili opravljeni z uporabo komercialnega kompleta Gen Elute Plant Genomic DNA MiniPrep Kit (Sigma-aldrich) po navodilih proizvajalca. Prisotnost gliv smo preverili z uporabo metod PCR (MJ Research, Biorad) in agarozno gelsko elektroforezo (Hoefer).

Prečiščena DNA je bila do nadaljnje uporabe shranjena v 1,5 ml ustrezno označene mikrocentrifugirke na -20 °C.

3.4.3 Kvantifikacija DNA z uporabo NanoDrop-a

Prečiščene DNA izvlečke smo kvantificirali z napravo NanoDrop (TermoFisher) po navodilih proizvajalca. Pred vsako uporabo naprave smo jo kalibrirali z meritvijo vode.

Pridobljena razmerja 260/280 nm, 260/230 nm in koncentracijo vzorca smo uporabili za izračun potrebne koncentracije DNA za sekvenciranje.

3.4.4 Sekvenciranje naslednje generacije (Next generation sequencing-NGS)

Strategija sekvenciranja shotgun omogoča analizo celotne prisotne DNA v vzorcu in je zaradi tega v prednosti, saj lahko zaznamo prisotnost organizmov brez pristranskosti PCR metode (Yoshitake in sod., 2021). V metodi shotgun sekvenciranja se izolirana DNA molekula naključno fragmentira, nato se ti fragmenti sekvencirajo in na koncu se pridobljeni podatki analizirajo ter rekonstruirajo kontigije. Po sestavljanju fragmentov se proces analize nadaljuje z povezovanjem fragmentov oz. kontigijev v taksonomske skupine (ang.

operational taxonomic units-OTU), ki lahko predstavljajo posamezen organizem. OTU identificiramo na podlagi pridobljenih sekvenc te pa se lahko definirajo v več ravneh, kot so debla, razredi, družine, rodovi in vrste (Kim in sod., 2017).

Za identifikacijo mikrobnih združb smo vzorce poslali na analizo v podjetje Macrogen Inc.

(Južna Koreja). Izbrali smo 24 vzorcev z ustreznimi koncentracijami DNA, in sicer 8 vzorcev iz skupine izvornega materiala in 16 vzorcev, ki so bili izpostavljeni dekompozicji pri različnem vodnem režimu (8 vzorcev izpostavljenih razgradnji na suhi mikrolokaciji in 8 vzorcev izpostavljenih razgradnji na mokri mikrolokaciji). Analiza je zajemala sekvenciranje nove generacije na sekvenatorju Illumina HiSeqX s TruSeq Nano DNA PCR- free reagenčnim kompletom.

Pridobljene sekvence smo obdelali na MG-RAST serverju (v 4.0.3, https://www.mg- rast.org), ki je javni strežnik za filogenetsko in funkcionalno anotacijo ter analizo metagenoma (Meyer in sod., 2008). Gre za strežnik, ki z visokozmogljivimi orodji omogoča bioinformatične analize kot so avtomatske dodelitve sekvenc v metagenomu s primerjavo nukleotidnih tudi proteinskih podatkovnih baz.

3.5 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV

Za heatmap vizualizacijo ionoma vzorcev smo v programu R uporabili funkcijo 'heatmap' iz paketa ComplexHeatmap v2.7.10.90 (Gu, 2016). Dendrogrami vrstic oz. kolon so narejeni z uporabo hierarhičnega združevanja z metodo popolnega povezovanja na podlagi evklidskih razdalj. Za prikaz razlik ionomov med izvornimi vzorci in vzorci po dekompoziciji ter razlike v sestavi glivnih in bakterijskih združb smo uporabili splošni perMANOVA test z p<0.001 s funkcijo adonis iz knjižnice Vegan (v2.5-7). Za razlike med pari skupin vzorcev pa funkcijo pairwiseAdonis (https://github.com/pmartinezarbizu/) z 999 permutacijami. Za analize strukture mikrobnih združb in vpliva vodnega režima na diverziteto gliv in bakterij glede na lokacijo in starost listov smo uporabili knjižnico phyloseq (v1.34.0). Za analizo diverzitete med vzorcih in primerjavo med skupinami smo določili alfa diverziteto z tremi cenilkami, in sicer cenilko Chao1, ki ocenjuje pestrost mikrobnih taksonov (Unterscher in sod., 2008), cenilko Shannon, ki poda relativno pestrost posamezne vrste, ter cenilko Simpson, ki prikazuje diverziteto mikrobov na podlagi pestrosti in dominantnosti taksonov (Kim et al., 2017). Cenilka Simpson je prikazana v obsegu od 0 do 1, kjer pri vrednosti 0 diverzitete ni, pa pri vrednosti 1 je diverziteta neskončna. Trofičnost gliv smo določili s podatkovno bazo FUNGuild (http://www.funguild.org). Za identifikacijo indikatorskih vrst smo uporabili Legendreʼs INDVAL v R z uporabo paketa indispecies (v1.7.9), z p<0.05. Spearmanov R količnik je bil uporabljen za določanje korelacije med vsebnostjo Si in bogatostjo mikrobnih združb. Za prikaz mrež hkratne prisotnosti glivnih OTU smo uporabili psych R paket. Konstrukcija mrež je narejena na podlagi Spearmanovega R med pari OTU, z upoštevanjem prisotnost vrednosti R>0,6 s statistično značilnostjo p>0,05. Slike mrež smo pridobili z uporabo knjižnic igraph, tidygraph in ggraph. Vozlišča v mrežah predstavljajo OTU, povezave pa predstavljajo pozitivno korelacijo med njimi. Povprečje dolžine povezav, obsega mreže, radiusa, centralizacije in gostote smo pridobili z uporabo paketa igraph programa R 4.1.2. Za primerjave vsebnosti elementov in razlik med različnimi parametri oz. skupinami, smo uporabili program R in JASP in v njem opravili teste ANOVA, post hoc Tukey in t-teste. PCA (ang. Principal component analysis) in klasterska analiza FTIR spektrov je pridobljena z dodatkom XLSTAT v programu Microsoft Excel.

4 REZULTATI

4.1 GLIVNE ZDRUŽBE NA LISTIH NAVADNEGA TRSTA

Pri analiziranih listih navadnega trsta je bila ugotovljena prisotnost gliv, ki sodijo v več debel, med katerimi so predvideno najbolj številne iz debla Ascomycota (95,7 %) in Basidiomycota (4,1 %). Preostale pripadajo debloma Chytridiomycota in Glomeromycota ter nedodeljenim deblom, in sicer približno 0,1 % vseh glivnih OTU. S profiliranjem prisotnih gliv v vseh vzorcih skupaj smo pridobili 18,325,318 sekvenc v razponu med 53,209 in 1,931,444 sekvenc po vzorcu za 180 glivnih operacijskih taksonomskih enot (ang. operational taxonomic units – OTUs) na ravni rodu.

Pestrost mikrobnih združb smo analizirali z vidika treh cenilk. Različne cenilke (indeksi) diverzitete mikrobnih združb prikazujejo vrstno pestrost v vzorcih iz različnih vidikov.

Cenilka Chao1 ocenjuje pestrost in bogatost glivnih taksonov ter temelji na predpostavki, da redke vrste najbolj prispevajo h končnemu številu vrst (Unterscher in sod., 2008). Njena prednost je, da je pri večjem številu vzorcev relativno neodvisna od obsega vzorčenja (Hughes et al., 2001). Cenilka Shannon poda relativno pestrost posamezne vrste in temelji na prisotnosti in enakomernosti razporeditve taksonov. Njena vrednost narašča z naraščanjem števila taksonomskih enot in njihove pogostosti. Občutljiva je na razlike v prisotnosti taksonomskih enot, primerna pa je za primerjavo vrstne pestrosti med posameznimi vzorčnimi mesti (Nolan in Callahan, 2005). Cenilka Simpson prikazuje diverziteto gliv na podlagi pestrosti in dominantnosti taksonov prisotnih v vzorcih (Kim et al., 2017).

Alfa diverziteta (Slika 2) prikazuje razlike v pestrosti glivnih združb glede na geografsko lokacijo v treh obravnavah, in sicer pri izvornih vzorcih (izvorni) in vzorcih, izpostavljenih razgradnji na mokri (mokro) ter suhi mikrolokaciji (suho). Razlike v pestrosti glivnih združb glede na geografsko lokacijo listov med različnimi obravnavanji ni. Pri indeksu Chao1 je opazna nižja diverziteta pri listih, ki so bili izpostavljeni razgradnji na mokri mikrolokaciji.

Bogatost vrst v izvornih listih in listih, izpostavljenih razgradnji na suhi mikrolokaciji, je podobna. Cenilka Shannon prikazuje višjo pestrost oz. bolj enakomerno razporeditev vrst v

vzorcih izpostavljenim razgradnji na mokrem enako kot cenilka Simpson, ki prikazuje pestrost v prid dominantnih vrst v vzorcu.

Slika 2: Prikaz pestrosti gliv v treh obravnavah in sicer v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho) glede na geografsko lokacijo, in sicer Gorenje Jezero (GJ) in Zadnji Kraj (ZK). Pestrost je prikazana z vidika treh cenilk: cenilka Chao1 – bogatost OTU, cenilka Shannon – enakomernost razporeditve OTU in cenilka Simpson – pestrost in dominantnost prisotnih OTU.

Na sliki 3 je razvidno, da med skupinami izpostavljenimi razgradnji pri različnem vodnem režimu in izvorno skupino vzorcev ni razlike v pestrosti glivnih združb glede na starost listov. Starost listov na rastlini torej ne vpliva na pestrost gliv. Pestrost z vidika posameznih cenilk je podobna rezultatom prikazanim na sliki 2. Pri indeksu Chao1 je opazna nižja diverziteta pri listih, ki so bili izpostavljeni razgradnji na mokri mikrolokaciji. Bogatost vrst v izvornih listih in listih, izpostavljenih razgradnji na suhi mikrolokaciji, je podobna. Cenilka Shannon prikazuje višjo pestrost oz. bolj enakomerno razporeditev vrst v vzorcih izpostavljenim razgradnji na mokrem enako kot cenilka Simpson, ki prikazuje pestrost v prid dominantnih vrst v vzorcu.

Slika 3: Pestrost gliv v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho) glede na starost listov na rastlini (spodnji listi – SP in zgornji listi – ZG). Pestrost je prikazana z vidika treh cenilk: cenilka Chao1-bogatost OTU, cenilka Shannon-enakomernost razporeditve OTU in cenilka Simpson-pestrost in dominantnost prisotnih OTU.

Osnovna struktura glivnih združb v vseh obravnavah skupaj je prikazana nasliki 4. Razvidno je, da v vseh obravnavah glede na jakost intenzitete barve ločujemo štirinajst najbolj prisotnih oz. najbolj številnih redov gliv, in sicer: Agaricales, Capnodiales, Eurotiales, Helotiales, Hypocreales, Magnaporthales, Onygenales, Pezizales, Phyllachorales, Pleosporales, Saccharomycetales, Sordariales, Tremellales in Ustilaginales.

Slika 4: Skupni prikaz prisotnosti redov gliv v posameznih vzorcih glede na obravnavo, in sicer v skupini izvornih vzorcev in vzorcev izpostavljenih razgradnji pri različnem vodnem režimu (mokro in suho).

Na sliki 5 je v odstotkih prikazana relativna prisotnost glivnih skupin v vseh obravnavah skupaj na ravni rodu glede na njihov način prehranjevanja. Najbolj številne so saprotrofne glive, ki predstavljajo 48,6 % vseh prikazanih tipov trofičnosti, nato pa patotrofi 22,5 %, ki so lahko še nekaj časa preživeli v času dekompozicije, ter simbiotrofi, in sicer 12,6 %.

Prisotnost preostalih glivnih rodov je kombinacija dveh ali več tipov trofičnosti, kar govori o njihovi prilagojenosti in metabolni plastičnosti med življenjskim ciklom.

Slika 5: Prisotnost rodov gliv v vseh obravnavah glede na način prehranjevanja oz. trofičnost.

Slika 6: Prikaz korelacije med vsebnostjo Si in bogatostjo (cenilka Chao1) glivnih združb z uporabo Spearmanovega R.

Analizirali smo korelacijo med vsebnostjo Si in cenilko Chao1 oz. pestrostjo glivnih združb v vzorcih ter ugotovili pozitivno korelacijo R=0,75 s statistično značilnostjo p<0,001.

Povečano diverziteto glivnih OTU vidimo pri višjih koncentracijah Si v vzorcih (Slika 6).

4.2 RAZLIKE V SESTAVI GLIVNIH ZDRUŽB PRI RAZGRADNJI

Na sliki 7 je prikazano grupiranje vzorcev glede na obravnavo in sicer izvorni vzorci in vzorci, izpostavljeni razgradnji na suhi ter mokri mikrolokaciji. Na levi strani slike vidimo razlike v sestavi glivnih združb med procesom razgradnje glede na obravnavo. Razvidna je tudi raznolikost skupin glede na prisotnost določenih OTU na ravni razreda, med katere sodi dvajset najbolj prisotnih družin gliv.

Slika 7: Nemetrično večrazsežnostno lestvičenje (Non-metric multidimensional scaling-NMDS) za glivne taksonomske razrede na podlagi Bray-Curtis matrike raznolikosti za 20 najbolj prisotnih družin gliv v vseh obravnavah.

V preglednici 1 je prikazana statistično značilna razlika v sestavi glivnih združb, s p vrednostjo <0.001 med primerjavami skupin vzorcev glede na obravnave, pri čemer

geografska lokacija in starost listov nimata vpliva na pojavnost in prisotnost glivnih združb v vzorcih, kar je prikazano v preglednici 2.

Rezultati, ki prikazujejo statistično značilne razlike v sestavi glivnih združb glede na obravnavo, sovpadajo z rezultati, ki so vizualno predstavljeni na sliki 7.

Preglednica 1: Razlike v sestavi glivnih združb, med pari obravnav, in sicer med izvornimi vzorci in vzorci, izpostavljenimi razgradnji na mokri mikrolokaciji, med izvornimi in izpostavljenimi razgradnji na suhi mikrolokaciji in nazadnje med vzorci izpostavljenimi razgradnji na mokri in suhi mikrolokaciji.

Pari Df Vsota

kvadratov F. model R2 p. vrednost

izvorni : mokri 1 5.6782624 148.85463 0.8322660 0.001

izvorni : suhi 1 0.9216378 36.41884 0.5483209 0.001

mokri : suhi 1 4.3184410 110.31613 0.7861971 0.001

Preglednica 2: Razlike v sestavi glivnih združb v vzorcih glede na starost listov in geografsko lokacijo listov.

Df Vsota

kvadratov R2 F Pr (>F)

vzorci: starost listov 1 0.025582 0.0058105 0.1285775 0.9084 vzorci: geografska lokacija 1 0.1010271 0.229464 0.5166776 0.5826

4.2.1 Identifikacija prisotnih indikatorskih gliv na ravni rodu

Preglednica 3: Identificirani indikatorski rodovi gliv v skupini izvornih vzorcev. A – verjetnost, da je v preiskovanem vzorcu določen rod, B – verjetnost, da bomo v določenem tipu vzorca našli ta rod.

Rod A B stat p. vrednost

Exophiala 0.9762 1.0000 0.988 0.001

Capnodium 0.9579 1.0000 0.979 0.002

Chrysomyxa 0.9189 1.0000 0.959 0.001

Preglednica 4: Identificirani indikatorski rodovi gliv v skupini izvornih vzorcev in v vzorcih izpostavljenih razgradnji na suhi mikrolokaciji. A – verjetnost, da je v preiskovanem vzorcu določen rod, B– verjetnost, da bomo v določenem tipu vzorca našli ta rod.

Rod A B stat p. vrednost

Phakopsora 0.9984 1.0000 0.999 0.001

Tilletia 0.9977 1.0000 0.999 0.001

Lentithecium 0.9976 1.0000 0.999 0.001

Montagnula 0.9970 1.0000 0.998 0.001

Aliquandostipite 0.9952 1.0000 0.998 0.001

Myriangium 0.9940 1.0000 0.997 0.001

Friedmanniomyces 0.9937 1.0000 0.997 0.001

Trametes 0.9925 1.0000 0.996 0.001

Metarhizium 0.9871 1.0000 0.994 0.001

Dothidea 0.9865 1.0000 0.993 0.001

Pleurotus 0.9852 1.0000 0.993 0.001

Bombardia 0.9798 1.0000 0.990 0.001

Leucostoma 0.9711 1.0000 0.985 0.001

Barssia 0.9621 1.0000 0.981 0.002

Falciformispora 0.9986 0.9375 0.968 0.001

Leptosphaerulina 0.9892 0.9375 0.963 0.001

Phoma 0.8963 1.0000 0.947 0.006

Preglednica 5: Identificiran indikatorski rod gliv v vzorcih iz geografske lokacije Zadnji Kraj. A – verjetnost, da je v preiskovanem vzorcu določeni rod, B – verjetnost, da bomo v določenem tipu vzorca našli ta rod.

Rod A B Stat p. vrednost

Capnodium 0.9234 1.0000 0.961 0.005