DOLOČANJE KAKOVOSTI PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI BAKTERIJAMI Z MASNO SPEKTROMETRIJO (MALDI-TOF)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Joži OMAHEN

DOLOČANJE KAKOVOSTI PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI BAKTERIJAMI Z MASNO

SPEKTROMETRIJO (MALDI-TOF)

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo

Ljubljana, 2021

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Joži OMAHEN

DOLOČANJE KAKOVOSTI PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI BAKTERIJAMI Z MASNO SPEKTROMETRIJO (MALDI – TOF)

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo

QUALITY ASSESSMENT OF DIETARY SUPPLEMENTS CONTAINING VIABLE BACTERIA BY MASS SPECTROMETRY

(MALDI-TOF)

M. SC. THESIS

Master Study Programmes: Field Food Science and Technology

Ljubljana, 2021

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Živilstvo. Delo je bilo opravljeno na Katedri za mlekarstvo Oddelka za zootehniko Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala znan. svet.

dr. Bojano Bogovič Matijašić, za somentorico dr. Matejo Kramer in za recenzentko izr. prof.

dr. Jasno Bertoncelj.

Mentorica: znan. svet. dr. Bojana BOGOVIČ MATIJAŠIĆ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Somentorica: dr. Mateja KRAMER

Lek d.d., Globalni Razvoj Zdravil / Tehnični razvoj & raziskave, Razvoj bioloških zdravil Mengeš

Recenzentka: izr. prof. dr. Jasna BERTONCELJ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik:

Član:

Član:

Član:

Datum zagovora:

Joži Omahen

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2

DK UDK 579.67:615.372:577.2.083(043)=163.6

KG prehranska dopolnila, žive bakterije, označevanje živil, identifikacija bakterij, PCR, masna spektrometrija z MALDI-TOF, Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus

AV OMAHEN, Joži, dipl. inž. živ. in preh. (UN)

SA BOGOVIČ MATIJAŠIĆ, Bojana (mentorica), KRAMER, Mateja (somentorica), BERTONCELJ, Jasna (recenzentka)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021

IN DOLOČANJE KAKOVOSTI PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI

BAKTERIJAMI Z MASNO SPEKTROMETRIJO (MALDI-TOF) TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo)

OP XII, 63 str., 9 pregl., 7 sl., 1 pril., 59 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Pri sedemnajstih prehranskih dopolnilih z živimi bakterijami, naprodaj v slovenskih lekarnah, smo preverili skladnost navedb na označbi z dejansko mikrobiološko sestavo. Število živih bakterij v izdelkih smo ugotavljali s standardno metodo štetja na selektivnih gojiščih, prisotnost označenih vrst pa z metodama PCR in MALDI- TOF MS. PCR smo izvedli na skupni DNA iz izdelka ter na DNA iz konzorcija kolonij, MALDI-TOF MS pa na posameznih kolonijah. Odkrili smo več pomanjkljivosti pri označevanju. Pri osmih izdelkih je bila navedena beseda

»probiotik«, ki v EU ni dovoljena. Večinoma proizvajalci navajajo le skupno število vseh mikroorganizmov v izdelku, ne pa tudi števila posameznih sevov (neustreznih 15 od 17 vzorcev). Pri petih izdelkih je bila navedena le vrsta bakterij, ne pa tudi oznaka seva. Skupno število kolonijskih enot v enoti izdelka (KE) je bilo ustrezno v štirinajstih izdelkih, v treh (18 %) pa prenizko. Metoda MALDI-TOF MS in identifikacija z MALDI Biotyper (Bruker Daltonics) se je izkazala kot hitra in enostavna metoda, ki je dovolj zanesljiva za identifikacijo večine vrst, z izjemo vrst skupine Lacticaseibacillus (L. casei, L. zeae, L. rhamnosus). Šestnajst od 292 pregledanih kolonij (5 %) ni bilo mogoče identificirati zaradi odsotnosti spektra (11 kolonij) ali neprepoznanega spektra (5 kolonij). Z metodo PCR smo pri enajstih izdelkih uspešno identificirali vse bakterijske vrste, ki so bile navedene na označbi izdelka. Prednost PCR je zmožnost identifikacije na nivoju podvrst: Bif. animalis subsp. lactis, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Bif. longum subsp.

longum, Bif. longum subsp. infantis.

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2

DC UDK 579.67:615.372:577.2.083(043)=163.6

CX dietary supplements, viable bacteria, food labeling, bacteria identification, PCR, MALDI-TOF mass spectrometry, Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus AU OMAHEN, Joži

AA BOGOVIČ MATIJAŠIĆ, Bojana (supervisor), KRAMER, Mateja (co-advisor), BERTONCELJ, Jasna (reviewer)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology

PY 2021

TI QUALITY ASSESSMENT OF DIETARY SUPPLEMENTS CONTAINING VIABLE BACTERIA BY MASS SPECTROMETRY (MALDI-TOF)

DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Food Science and Technology) NO XII, 63 p., 9 tab., 7 fig., 1 ann., 59 ref.

LA sl AL sl/en

AB For seventeen dietary supplements containing viable bacteria sold in Slovenian pharmacies, we checked the consistency of the information on the label with the actual microbiological compositions. The number of live bacteria in the products was determined by the standard method of colony counting on selective media, and the presence of the labeled bacterial species by the PCR and MALDI-TOF MS methods. PCR was performed on total DNA from the product and on DNA from a consortium of colonies, and MALDI-TOF MS on individual colonies. We found several labeled irregularities. In eight cases, the labeled of the product mentioned the word "probiotic", which is not allowed for food supplements in the EU. In most cases, the labels only included the total number of all microorganisms in the product, but not the number of individual strains (incorrect in 15 out of 17 samples). In five products only the type of bacteria was indicated, the strain was not labeled. The total number of colony units per product unit (KE) was appropriate for fourteen products and too low for three products (18 %). The MALDI-TOF MS method and identification with the MALDI Biotyper (Bruker Daltonics) proved to be a rapid and simple method, reliable enough to identify most species, with the exception of the species Lacticaseibacillus (L. casei, L. zeae, L. rhamnosus). Sixteen of the 292 colonies examined (5 %) could not be identified due to missing spectrum (11 colonies) or unrecognized spectrum (5 colonies). Using the PCR method, we successfully identified all bacterial species listed on the product labeled for eleven products. The advantage of the PCR method is the ability to identify at the subspecies level: Bif. animalis subsp. lactis, Streptococcus salivarius subsp.

thermophilus, Bif. longum subsp. longum, Bif. longum subsp. infantis.

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III

KEY WORDS DOCUMENTATION IV

KAZALO VSEBINE V

KAZALO SLIK VII

KAZALO PREGLEDNIC VIII

KAZALO PRILOG IX

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X

1 UVOD 1

1.1 NAMEN IN CILJ RAZISKAVE 1

1.2 DELOVNE HIPOTEZE 2

2 PREGLED OBJAV 3

2.1 PREHRANSKA DOPOLNILA 3

2.2 PROBIOTIKI 4

2.3 ČREVESNA MIKROBIOTA 5

2.4 KAKOVOST PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI BAKTERIJAMI 6

2.5 UGOTAVLJANJE KAKOVOSTI PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI

BAKTERIJAMI 7

2.5.1 Ugotavljanje števila bakterij 7

2.5.1.1 Štetje na ploščah 8

2.5.2 Ugotavljanje bakterijskih vrst 9

2.5.2.1 PCR 9

2.5.2.2 MALDI-TOF MS 10

3 MATERIAL IN METODE 13

3.1 NAČRT POSKUSA 13

3.2 MATERIAL 14

3.2.1 Vzorci 14

3.2.2 Gojišča 17

3.2.2.1 YGC 17

3.2.2.2 M17 17

3.2.2.3 TOS 17

3.2.2.4 Rogosa 17

3.2.2.5 MRS pH 6,2 18

3.2.2.6 MRS/CL/CIP 18

3.2.2.7 CATC 18

3.2.3 Raztopine 19

3.2.3.1 Puferirana peptonska voda 19

3.2.3.2 Peptonska voda 19

3.2.4 Reagenti za izolacijo DNA in za PCR 19

3.3 METODE 20

3.3.1 Ugotavljanje števila MO v vzorcih 20

3.3.1.1 Priprava primarne raztopine 20

3.3.1.2 Razredčevanje vzorcev 20

3.3.1.3 Nacepljanje na gojišča 20

3.3.1.4 Inkubacija 20

3.3.1.5 Štetje kolonij in izračun števila kolonijskih enot 21 3.3.2 Ugotavljanje prisotnosti MO z metodo MALDI-TOF MS 21 3.3.3 Izolacija DNA in vrstno-specifična analiza PCR 22

3.3.3.1 Priprava vzorcev za izolacijo DNA 22

3.3.3.2 Izolacija DNA 22

3.3.3.3 Priprava agaroznega gela 22

3.3.3.4 Analiza PCR 22

3.3.3.5 Detekcija pomnožkov z gelsko elektroforezo 26

4 REZULTATI 27

4.1 USTREZNOST OZNAČB 27

4.2 PREVERJANJE USTREZNOSTI ŠTEVILA KE V VZORCU 33

4.3 PREVERJANJE PRISOTNOSTI OZNAČENIH SEVOV 36

4.3.1 Ugotavljanje označenih vrst MO z metodo MALDI-TOF MS 36 4.3.2 Ugotavljanje označenih vrst MO z metodo PCR 41

5 RAZPRAVA 46

5.1 USTREZNOST OZNAČB VZORCEV PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI

BAKTERIJAMI 46

5.2 SKLADNOST SKUPNEGA ŠTEVILA BaKTERIJ GLEDE NA NAVEDBE NA

OZNAČBAH TER REZULTATI ANALIZE 47

5.3 UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI OZNAČENIH BAKTERIJSKIH VRST 49 5.3.1 Identifikacija izolatov iz izdelkov z metodo MALDI-TOF MS 49 5.3.2 Ugotavljanje prisotnosti označenih vrst z metodo PCR 52

6 SKLEPI 55

7 POVZETEK 56

8 VIRI 58

ZAHVALA PRILOGE

KAZALO SLIK

Slika 1: Princip metode MALDI-TOF MS (Pavlovic in sod., 2013) 11 Slika 2: Identifikacija bakterij z metodo MALDI-TOF MS (Pavlovic in sod., 2013) 12 Slika 3: Shematski prikaz poteka analiziranja vzorcev 13 Slika 4: Izgled kolonij na gojiščih Rogosa (laktobacili), TOS (bifidobakterije), CATC

(enterokoki) in MRS (laktobacili) 33

Slika 5: Skupno število kolonijskih enot, glede na označeno vrednost in analizirano

vrednost (KE/enoto izdelka) 35

Slika 6: Primer prikaza rezultatov identifikacije bakterij z metodo MALDI-TOF MS in

orodjem Biotyper 36

Slika 7: Primer detekcije pomnožkov na agaroznem gelu pod UV svetlobo 41

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Prehranska dopolnila in zdravila, vključena v našo analizo, označeno število in vrste MO in rok uporabnosti posameznega izdelka. Str., Streptococcus; Bif., Bifidobacterium; Lc., Lactococcus; E., Enterococcus;

L. Lactobacillus (po novi taksonomski razvrstitvi od aprila 2020, Zheng in sod. (2020), tudi Lactocaseibacillus, Lactiplantibacillus,

Limosilactobacillus, Ligilactobacillus). 14

Preglednica 2: Zanesljivost rezultata v programu MALDI Biotyper 3.1 21 Preglednica 3: Začetni oligonukleotidi, ki so značilni za posamezno bakterijsko vrsto in

pričakovana velikost nastalih pomnožkov po reakciji PCR. 24 Preglednica 4: PCR program za posamezno bakterijsko vrsto. 25 Preglednica 5: Podatki, navedeni na označbah vzorcev prehranskih dopolnil in zdravil z

živimi bakterijami. Str., Streptococcus; Bif., Bifidobacterium; Lc., Lactococcus; E., Enterococcus; L. Lactobacillus (po novi taksonomski razvrstitvi od aprila 2020, po Zheng in sod. (2020), tudi Lactocaseibacillus, Lactiplantibacillus, Limosilactobacillus,

Ligilactobacillus). 28

Preglednica 6: Ustreznost analiziranih vzorcev prehranskih dopolnil in zdravil z živimi

bakterijami 34

Preglednica 7: Rezultati ugotavljanja prisotnost označenih bakterijskih vrst v vzorcih prehranskih dopolnil in zdravil z živimi bakterijami z metodo MALDI-

TOF MS 37

Preglednica 8: Rezultati ugotavljanja prisotnosti označenih bakterijskih vrst v vzorcih prehranskih dopolnil in zdravil z živimi bakterijami z metodo PCR. Str., Streptococcus; Bif., Bifidobacterium; Lc., Lactococcus; E., Enterococcus;

L. Lactobacillus (po novi taksonomski razvrstitvi od aprila 2020, po Zheng in sod. (2020), tudi Lactocaseibacillus, Lactiplantibacillus,

Limosilactobacillus, Ligilactobacillus). 42

Preglednica 9: Novo poimenovanje nekaterih vrst bakterij iz preteklega rodu

Lactobacillus (Zheng in sod., 2020) 47

KAZALO PRILOG Priloga A: Rezultati metode MALDI-TOF MS

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

ATP adenozin trifosfat

B. Bacillus

Bif. Bifidobacterium

BPW puferirana peptonska voda (angl. buffered peptone water)

CATC gojišče za enterokoke

KE število kolonijskih enot

DNA deoksiribonukleinska kislina (angl. deoxyribonucleic acid) dNTP deoksiribonukleotid trifosfat (mešanica nukleotidov)

E. Enterococcus

EFSA Evropska agencija za varnost hrane (angl. European Food Safety Authority)

ESPGHAN Evropsko združenje za pediatrično gastroenterologijo, hepatologijo in prehrano (angl. The European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition)

FAO Organizacija združenih narodov za prehrano in kmetijstvo (ang.

Food and Agriculture Organisation)

FDA Uprava za hrano in zdravila (angl. Food and Drug Administration)

GRAS splošno priznan kot varen (angl. Generally Recognized As Safe)

KE kolonijske enote

L. Lactobacillus (tudi Lactocaseibacillus, Lactiplantibacillus, Limosilactobacillus, Ligilactobacillus – novi rodovi, od aprila 2020)

LBP živi bioterapevtski izdelki (angl. live biotherapeutic products)

Lc. Lactococcus

M17 gojišče za streptokoke in laktokoke

MALDI-TOF MS masna spektrometrija z ionizacijo v matriksu z lasersko desorpcijo ter analizo časa potovanja molekul (angl. matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry)

Mg²⁺ magnezijevi ioni

MO mikroorganizmi

MRS gojišče za laktobacile po De Man, Rogosa in Sharpe (1960) MRS/CL/CIP gojišče MRS s klindamicinom in ciprafloksacinom

NaCl natrijev klorid

NGP probiotiki naslednje generacije (angl. next-generation probiotics)

OTC zdravila brez recepta (angl. over-the-counter)

PCR verižna reakcija s polimerazo (angl. Polymerase Chain Reaction)

PV peptonska voda

Rogosa gojišče za laktobacile po Rogosa

Sacch. Saccharomyces

Str. Streptococcus

subsp. podvrsta (angl. subspecies) TOS gojišče za bifidobakterije

UV ultravijolično

UVHVVR Uprava RS za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin WHO Svetovna zdravstvena organizacija (angl. World Health

Organisation)

YGC gojišče za kvasovke

ZIRS Zdravstveni Inšpektorat Republike Slovenije

1 UVOD

Prehranska dopolnila spadajo v kategorijo živil in so namenjena dopolnjevanju običajne prehrane posameznika. Gre za koncentriran vir posameznih ali kombiniranih hranil ali drugih snov s hranilnim ali fiziološkim učinkom. Vsebujejo lahko vitamine, minerale, aminokisline, maščobne kisline, mikroorganizme (MO) in druge snovi (Pravilnik o prehranskih dopolnilih, 2013).

Na slovenskem trgu najdemo mnogo prehranskih dopolnil z živimi bakterijami in število se iz leta v leto še povečuje. Kakovost teh izdelkov pa je lahko za potrošnika vprašljiva, saj so predhodne raziskave pokazale, da številni ne dosegajo označene kakovosti (Mohar Lorbeg in Bogovič Matijašić, 2017).

Leta 2006 je v EU v veljavo stopila uredba, ki je bistveno zaostrila pogoje za uporabo zdravstvenih in prehranskih trditev, tako na živilih kot tudi na prehranskih dopolnilih (Uredba (ES) št. 1924/2006). Uredba je bistveno vplivala tudi na »probiotike«, saj zanje ni bilo nobene veljavne zdravstvene trditve, ki bi omogočila označevanje, oglaševanje in predstavljanje izdelkov. Uprava RS za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin (UVHVVR) je novembra 2018 objavila dodatno pojasnilo, da beseda »probiotik«

predstavlja zdravstveno trditev in je njena uporaba prepovedana na živilih, prav tako tudi na prehranskih dopolnilih. Izven EU je zakonodaja po različnih državah neusklajena in praviloma manj omejujoča.

Nadzor nad prehranskimi dopolnili je precej ohlapen, saj v primerjavi z zdravili le teh ni potrebno registrirati, ker spadajo med živila. Za kakovost izdelka je odgovoren sam proizvajalec, kar lahko pomeni precej vprašljivo kakovost. Zato smo se odločili, da preverimo kakovost prehranskih dopolnil z živimi bakterijami, ki se nahajajo na slovenskem trgu. Želeli smo preveriti skladnost navedb na označbah in dejanskim izdelkom. Z nacepljanjem na gojišča smo želeli preveriti število živih bakterij v izdelku, s pomočjo vrstno - specifične verižne reakcije s polimerazo (PCR) in masne spektrometrije z ionizacijo v matriksu z lasersko desorpcijo ter analizo časa potovanja molekul (MALDI-TOF MS) pa prisotnost označenih vrst.

1.1 NAMEN IN CILJ RAZISKAVE Cilji magistrske naloge so bili:

- preveriti kakovost prehranskih dopolnil in zdravil z živimi bakterijami na našem trgu - preveriti skladnost navedb in prisotnost posameznih vrst, ki so navedene na označbi

izdelkov.

1.2 DELOVNE HIPOTEZE

V magistrski nalogi smo zastavili naslednje hipoteze:

- Predvidevamo, da kakovost prehranskih dopolnil z živimi bakterijami ne bo vedno ustrezna, kar se tiče števila in pravilnosti navedenih vrst bakterijskih sevov.

- Predvidevamo, da je s pomočjo masne spektrometrije MALDI-TOF mogoče dovolj zanesljivo ugotoviti vrsto izolatov mlečnokislinskih bakterij in bifidobakterij iz prehranskih dopolnil z živimi bakterijami.

2 PREGLED OBJAV

2.1 PREHRANSKA DOPOLNILA

V Pravilniku o prehranskih dopolnilih (2013) so prehranska dopolnila opredeljena kot živila, ki so namenjena dopolnjevanju običajne prehrane posameznika. Gre za koncentriran vir posameznih ali kombiniranih hranil ali drugih snovi s hranilnim ali fiziološkim učinkom. V prodaji so običajno v obliki kapsul, pastil, tablet, vrečkah s praškom ali pa so v tekoči obliki v ampulah ali kapalnih stekleničkah. Prehranska dopolnila se najpogosteje prodajajo predvsem v živilskih in specializiranih trgovinah, lekarnah, trgovinah s športno prehrano ter preko spletnih trgovin (Napotki glede področja prehranskih dopolnil…, 2014). Prehranska dopolnila lahko vsebujejo vitamine, minerale, aminokisline, maščobne kisline, prehranske vlaknine, rastline in rastlinske izvlečke, mikroorganizme ter druge snovi s hranilnim ali fiziološkim učinkom, pod pogojem, da je njihova varnost v prehrani ljudi znanstveno utemeljena (Pravilnik o prehranskih dopolnilih, 2013).

Vse pogosteje se prehranska dopolnila uporabljajo za nadomeščanje neustrezne prehrane, izboljšanje imunske obrambe, preprečevanje bolezni ter povečanje telesne zmogljivosti.

Svetovno tržišče močno promovira in podpira njihovo uporabo, čeprav za nemalo sestavin še ni dovolj znanstvenih dokazov, ki bi podpirali domnevne koristne učinke. Uporaba dopolnil se iz leta v leto povečuje, tako pri mladostnikih, kot tudi pri starejših generacijah (Šterlinko Grm in sod., 2012; Kotnik Zdešar in sod., 2017).

Kot je zapisano v Zakonu o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili (2000), je živilom prepovedano pripisovati zdravilne lastnosti v smislu preprečevanja, zdravljenja ali ozdravljenja bolezni. Prav tako je prepovedano zavajanje potrošnika z različnimi označbami oziroma oglaševanjem, ki bi potrošnika zavedli v zmotno prepričanje o delovanju in uporabi takšnih izdelkov. Drugače pa je z izdelki iz kategorije zdravil, zdravil brez recepta, medicinskih pripomočkov, izdelkov za osebno nego, ki ne sodijo v domeno živilske zakonodaje.

Prehranska dopolnila s koristnimi bakterijami so edinstvena po tem, da zagotavljajo zdravju koristne žive MO končnemu uporabniku. Za razliko od drugih sestavin prehranskih dopolnil predstavljajo živi MO precejšen izziv na področju oblikovanja, razvoja, proizvodnje ter prilagajanja uporabnosti izdelka. Poleg tega je ohranjanje sposobnosti preživetja koristnih bakterij v izdelkih velik izziv, tako med proizvodnjo kot tudi med skladiščenjem. Na izdelke vplivajo številni dejavniki, med drugim nosilni material, temperatura, vodna aktivnost in čas skladiščenja (Jackson in sod., 2019).

V raziskavi, ki so jo opravili Kotnik Zdešar in sod. (2017) med mladostniki starimi od 14 do 19 let, so pokazali, da je uporaba splošnih prehranskih dopolnil precej razširjena (69 %).

Večja uporaba je opazna pri fantih, ki jih uživajo za izboljšanje športne uspešnosti, boljšega

razvoja in delovanja mišic. Dekleta pa jih uživajo predvsem za izboljšanje delovanja imunskega sistema.

2.2 PROBIOTIKI

Sredina devetdesetih let prejšnjega stoletja se označuje kot začetek množičnega vključevanja probiotikov v fermentirane mlečne izdelke in prehranska dopolnila. Od takrat pa do danes priljubljenost in raznolikost probiotičnih izdelkov v svetu opazno raste (Vinderola in sod., 2019).

Po definiciji kot probiotike štejemo žive MO, ki jih je potrebno zaužiti v zadostni količini, da imajo koristen učinek na zdravje (Hill in sod., 2014). Večina sevov prvotnih industrijskih probiotikov je bila izbrana zaradi njihove sposobnosti prilagajanja nizki vrednosti pH želodca, zaradi česar je bilo na trgu veliko sevov s slabo poznanimi funkcionalnimi lastnostmi. Takšna raznovrstna združenja MO otežujejo primerjave, kar daje vtis o učinkih zdravil in vodi do neustreznega predpisovanja probiotikov, premalo neodvisnih študij pa zakriva možne fiziološke učinke (Wieërs in sod., 2020). Koncept probiotikov izhaja iz modrosti prednikov, ki so že dolgo nazaj verjeli, da je redno uživanje fermentiranih mlečnih izdelkov povezano z boljšim zdravstvenim stanjem in daljšo življenjsko dobo. Z razvojem znanosti pa so pridobivali številne dokaze o dejanskem učinkovanju probiotikov na gostitelja. Vse več je znanstveno podprtih dokazov, da probiotiki lahko sistematično vplivajo na metabolizem, fiziologijo in imunski sistem ter preprečujejo ali blažijo bolezni, kar vodi do ohranjanja zdravja gostitelja. Tradicionalni probiotiki niso bili namenjeni za zdravljenje določenih bolezni, ampak za krepitev zdravja nasploh. Značilni probiotični organizmi so večinoma pridobljeni iz črevesja, materinega mleka ali pa iz tradicionalnih fermentiranih živil, kot sta jogurt in kefir. V izdelkih so najpogosteje prisotne vrste iz rodov Lactobacillus (po stari klasifikaciji) in Bifidobacterium, manj pogosto pa tudi iz rodov Bacillus, Streptococcus, Saccharomyces in Escherichia (O’Toole in sod., 2017). Potrebno je upoštevati, da se je taksonomska uvrstitev laktobacilov v letu 2020 spremenila, saj so rod Lactobacillus razdelili na 23 rodov (Zheng in sod., 2020).

Probiotiki se uporabljajo predvsem na dveh področjih – prvo je področje živil, kamor sodijo tudi prehranska dopolnila, drugo pa je področje medicine. V zadnjih letih je opazen razvoj predvsem na medicinskem področju, kjer v kliničnih raziskavah pridobivajo nove dokaze o učinkovitosti skrbno izbranih probiotičnih sevov za zdravljenje različnih bolezni, tako da se v naslednjih letih obeta razvoj novih zdravil s probiotiki. Poleg živil, prehranskih dopolnil in zdravil so na trgu tudi številni izdelki s probiotiki za vaginalno uporabo, kozmetične namene, kot so kreme, suspenzije za čiščenje kože, ter izdelki za ustno higieno (Lee in sod., 2019; Chang in sod., 2019; O’Toole in sod., 2017).

Da bi razvili probiotike za medicinsko uporabo, potrebujemo nove seve s specifičnim delovanjem, ki bo dobro raziskano. V teku so številne raziskave za prepoznavanje novih probiotičnih organizmov, ki bodo poleg skrbi za varno uporabo pri ljudeh morali vključevati tudi celovito razumevanje ciljnih bolezni ter bakterijskih genetskih značilnosti in fizioloških lastnosti. Te organizme so poimenovali probiotiki naslednje generacije (NGP) ali pa živi bioterapevtski izdelki (LBP). Ameriška uprava za hrano in zdravila (FDA) je termin živi bioterapevtiki (LBP) opredelila kot »biološki proizvod, ki vsebuje žive organizme, kot so bakterije; se uporablja za preprečevanje ali zdravljenje bolezni ter ne gre za cepivo. Novi sevi so izolirani iz človeške mikrobiote – blata zdravih dojenih dojenčkov, lahko so tudi gensko modificirani MO. V intenzivnem razvoju so izdelki z naslednjimi vrstami, ki jih kot probiotike do sedaj niso uporabljali: Prevotella copri, Akkermansia muciniphila, Bacteroides fragilis, Christensenella minuta, Faecalibacterium prausnitzii, Parabacteroides goldsteinii ter številne druge (Chang in sod., 2019; O’Toole in sod., 2017).

2.3 ČREVESNA MIKROBIOTA

Črevesna mikrobiota človeka se izoblikuje v zgodnjih letih življenja, saj je njena sestava odvisna od številnih dejavnikov, kot so način poroda, način hranjenja (dojenje ali hranjenje z mlečno formulo) in zunanji dejavniki. Številni zunanji dejavniki, med katerimi so najpomembnejši neuravnotežena prehrana, stres, staranje, bolezni, uporaba zdravil (predvsem antibiotikov) vse življenje vplivajo na sestavo mikrobiote. Vsak človek ima edinstven vzorec črevesne mikrobiote, ki ima pomembno funkcijo pri presnovi hranil, vzdrževanju črevesne sluznice, imunskem sistemu in zaščiti pred patogeni. Črevesna mikrobiota je sestavljena iz številnih mikroorganizmov, vključno z bakterijami, kvasovkami in virusi, ki medsebojno vplivajo na gostitelja in med seboj, da vplivajo na fiziologijo in zdravje gostitelja. Sprememba sestave je lahko za gostitelja škodljiva. Če je črevesje podvrženo hudim nenormalnim spremembam, lahko to povzroči številne bolezni. Črevesne bakterije imajo pomembno vlogo pri vzdrževanju človekovega zdravja, vključno s prebavo, s sintezo vitamina B ter spodbujanjem delovanja živčevja (Azad in sod., 2018; Rinninella in sod., 2019).

Sestava in aktivnost črevesne mikrobiote gostitelja dokazano vpliva na zdravje in bolezni gostitelja, saj vpliva na številne organske sisteme, vključno z živčnim, imunskim, srčno- žilnim ter presnovnim sistemom. Dokazano je, da se sestava mikrobiote spremeni ob mnogih bolezenskih stanjih, med drugim pri bolezni srca in ožilja, raku, debelosti, sladkorni bolezni, astmi ter drugimi. Prav tako poročajo, da različne probiotične bakterije preprečujejo degenerativne bolezni, vključno z debelostjo, diabetesom, rakom, boleznimi srca in ožilja, boleznimi jeter ter drugimi (Azad in sod., 2018).

2.4 KAKOVOST PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI BAKTERIJAMI

V okviru nadzora kakovosti prehranskih dopolnil morajo izdelki ustrezati Pravilniku o prehranskih dopolnilih (2013) in standardom, ki vsebujejo zahteve, specifikacije in smernice, ki jih je mogoče dosledno upoštevati za zagotovitev ustreznega materiala, procesa ter izdelka. Kakovost prehranskih dopolnil s koristnimi MO se nekoliko razlikuje od drugih dopolnil, saj je potrebno zagotoviti varnost izdelka z živimi bakterijami ter navedeno količino živih MO do konca roka uporabe.

Smernice, ki sta jih leta 2002 izdali organizaciji FAO in WHO, poudarjajo pomen navajanja informacij o probiotikih na označbi izdelkov, saj so le te ob nakupu pomembne za potrošnika. Na označbi mora biti navedeno:

- imena rodov in vrst, ki morajo biti v skladu z veljavno znanstveno nomenklaturo, - označbe sevov, saj le ta omogoča sledenje in povezavo z objavljenimi raziskavami, - količina živih MO,

- rok uporabnosti,

- primerni pogoji skladiščenja ter

- podatki o proizvajalcu (Pravilnik o prehranskih dopolnilih, 2013; FAO/WHO, 2002).

Koristne bakterije morajo biti identificirane na nivoju rodu in vrste, na podlagi trenutno veljavne nomenklature, ter vključevati oznako seva, ko je to mogoče. Pogosto je na označbah izdelkov napačno navedena Bifidobacterium lactis, saj je pravilno poimenovanje Bifidobacterium animalis subsp. lactis. Bifidobacterium infantis je zdaj priznana kot podvrsta Bifidobacterium longum. Oznake komercialnih izdelkov in komunikacije morajo biti v skladu s trenutno nomenklaturo (Jackson in sod., 2019). Skladno z nedavno spremenjeno taksonomijo laktobacilov (Zheng in sod., 2020), ki so zelo razširjeni v probiotičnih izdelkih, bodo proizvajalci morali preimenovati seve Lactobacillus v svojih izdelkih. Da bi bil prehod lažji in preimenovanje ne bi negativno vplivalo na prepoznavnost posameznih probiotikov pri potrošnikih, je dopuščeno uporabiti okrajšavo L. za imena novih rodov laktobacilov, saj se vsa imena teh 23 novih rodov začenjajo z začetnico L.

Definicija za probiotike pravi, da mora izdelek vsebovati žive MO, zato je ključna lastnost sposobnost preživetja med proizvodnjo in skladiščenjem. Proizvajalec je odgovoren za zagotavljanje zadostne stabilnosti izdelka v celotni proizvodnji in distribuciji, da se zagotovi označena količina aktivnih celic do konca roka uporabnosti. V večini primerov to dosežejo s kombinacijo tehnologij, ki zaščitijo mikroorganizme v izdelku, in s povečano koncentracijo bakterij v izdelku (predoziranju). Povečano število kolonijskih enot v izdelku omogoči, da skupno število KE ne pade pod označeno število vse do konca roka uporabnosti (Jackson in sod., 2019).

V preglednem članku de Simone (2019) izpostavlja problem, da se pri prehranskih dopolnilih preverja le skladnost z zakonsko določenimi zahtevami, medtem ko nadzor učinkovitosti, varnosti in kakovosti izdelkov ni ustrezno urejen. Pri zagotavljanju varnosti obstajata dva pomembna vidika: varnost proizvodov kot takšnih (ugotavljanje škodljivih učinkov izdelka) ter zagotavljanje, da izdelki izpolnjujejo stroge standarde kakovosti, tako da se preveri prisotnost vseh sevov in da izdelek ni kontaminiran. Ocene varnosti bi morale upoštevati tudi pričakovane fiziološke funkcije koristnih MO (de Simone, 2019). V raziskavi Jackson in sod. (2019) in v preglednem članku de Simone (2019) navajajo, da še vedno opažajo nezadovoljivo kakovost probiotičnih izdelkov, pri katerih ne ustreza število aktivnih MO, ne vsebujejo vseh označenih sevov ali pa vsebujejo mikroorganizme, ki niso navedeni na označbi.

Znani so redki primeri domnevne vpletenosti probiotičnih bakterij pri infekcijah oziroma drugih zdravstvenih zapletih. Znani so primeri bakterijske sepse, ki so jo povezali z uživanjem probiotikov, ki vsebujejo laktobacile, ter smrt nedonošenčka, ki je užival probiotično prehransko dopolnilo, kontaminirano s plesnijo. Medtem ko pri zdravih ljudeh uživanje probiotikov ne predstavlja nobene nevarnosti, pa je potrebna določena previdnost pri ranljivih skupinah, kot so pacienti s poškodovano črevesno sluznico, ki se pojavlja pri bolnikih z vnetnimi črevesnimi boleznimi, jetrnimi boleznimi, nedonošenčki in drugimi kritično bolnimi. Določitev varnosti probiotičnih sevov zahteva strogo presojo v nadzorovanem okolju. Potencialna tveganja ob zaužitju probiotikov predstavljajo bakterijska translokacija, ki lahko povzroči sistemsko okužbo, prenos genov za protimikrobno odpornost na bolj patogene bakterije, nepravilna imunska spodbuda pri občutljivi populaciji ter nezaželene presnovne aktivnosti (de Simone, 2019; Van den Nieuwboer in Claassen 2019).

2.5 UGOTAVLJANJE KAKOVOSTI PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI BAKTERIJAMI

Mikrobiološka sestava komercialnih probiotičnih izdelkov je lahko preprosta, če vsebuje en sev ali pa zapletena, ko izdelek vsebuje več sevov, lahko tudi več kot 10 različnih vrst.

Kompleksnost mikrobioloških analiz takih izdelkov narašča s številom različnih sevov (Vinderola in sod., 2019).

2.5.1 Ugotavljanje števila bakterij

Za ugotavljanje skupnega števila živih bakterij poznamo dva pristopa. Prvi temelji na gojitvenih metodah, drugi na metodah, ki so neodvisne od gojenja. Najbolj razširjena je standardna gojitvena metoda z nacepljanjem na plošče. Od metod, ki so neodvisne od gojenja, pa so se na področju probiotikov najbolj uveljavile pretočna citometrija in verižna reakcija s polimerazo (PCR). Pretočna citometrija je hitra, od kultivacije neodvisna metoda za ugotavljanje števila bakterijskih celic, ki uporablja kombinacijo sipanja svetlobe ter

oddane fluorescenčne svetlobe. V mednarodnih standardih je pretočna citometrija opredeljena kot standardizirana metoda za kvantificiranje števila koristnih bakterij v mlečnih izdelkih (ISO 19344: 2015). Verižna reakcija s polimerazo (PCR) temelji na pomnoževanju DNA, pri čemer se določen genski fragment v vzorcu DNA ojača, izmerjeni fluorescentni signal pa je neposredno povezan s številom tarčnih celic v vzorcu. Z izboljšano metodo lahko s pomočjo reagentov, kot sta etidijev in propidijev monoazid, preprečimo pomnoževanje DNA iz neživih celic (Kramer in sod., 2009). Od kultivacije neodvisne metode zagotavljajo zanesljivost s hkratnim odkrivanjem več genov ali njihovih prepisanih produktov, te metode imajo pogosto večjo natančnost, občutljivost in enostavnost izvedbe v primerjavi s tehnikami, ki so odvisne od kultur. Vendar pa so te metode hkrati lahko drage in preveč zahtevne za rutinsko uporabo, ker lahko zahtevajo dobro usposobljeno osebje za opravljanje analiz (Wilkinson, 2018; Vinderola in sod., 2019).

2.5.1.1 Štetje na ploščah

Za ugotavljanje števila kolonijskih enot, ki je pomemben parameter kakovosti, se v rutinskih laboratorijih uporablja standardna gojitvena metoda štetja na ploščah, kjer ustrezno pripravljen in razredčen vzorec nanesemo na selektivno trdno gojišče in ga inkubiramo v ustreznih razmerah, da zrastejo kolonije. Štejemo celice, ki tvorijo kolonije in jih lahko vidimo na gojišču, rezultat pa podamo kot število kolonijskih enot (KE) v ml ali g izdelka.

Enota KE se uporablja od poznega 19. stoletja in je še vedno zlata standardna metoda za ugotavljanje skupnega števila MO. Ker je pričakovana koncentracija MO v izdelkih višja od 10⁶-10⁷ KE g^-1 ali ml^-1, samo zaznavanje ne predstavlja težav. Gre za metodo, s katero ugotovimo število tistih bakterij v izdelku, ki so se zmožne razmnoževati in tvoriti kolonije.

Ne zajamemo pa neživih bakterij in celic, ki imajo kljub nezmožnosti za rast v določenih pogojih lahko številne pomembne funkcije tako kot žive celice (Jackson in sod., 2019;

Vinderola in sod., 2019). Slednje imenujemo žive nekultivabilne (angl. VBNC – viable but nonculturable).

Prednosti metode štetja na ploščah so tehnična preprostost in enostavnost izvedbe (Jackson in sod., 2019). Hkrati pa ta metoda predstavlja tudi številne izzive, saj ni enotne metodologije, ki bi bila uporabna za vse bakterije, zaradi velike variabilnosti med vrstami in sevi. Metoda je zahtevna z vidika obremenitev v laboratorijih, zaradi velikega pretoka vzorcev in dolgotrajnega postopka. Začetna priprava vzorca (rehidracija liofiliziranega izdelka) lahko znatno vpliva na rezultate. Pri tem je pomembnih več parametrov, kot so osmotska koncentracija, vrednost pH, puferska zmogljivost in intenzivnost homogenizacije, ki lahko pomembno vplivajo na skupno število zraslih kolonij. Precejšen izziv metode je tudi medlaboratorijska ponovljivost in ponovljivost znotraj laboratorija. Ponovljivost analize se lahko precej razlikuje zaradi zahtevne priprave vzorcev, različne opreme ali pristranskosti pri analizi (Jackson in sod., 2019). Kot pomanjkljivosti standardne metode ugotavljanja števila živih MO pa Vinderola in sod. (2019) navajajo tudi:

- dolga in zamudna priprava gojišč, - težko razlikovanje posameznih vrst, - dolga inkubacijska doba,

- pomanjkljiva selektivnost ob večjem številu različnih vrst MO in - štetje združenih celic kot eno kolonijo in posledično prenizek rezultat.

2.5.2 Ugotavljanje bakterijskih vrst

Za ugotavljanje prisotnosti posameznih bakterijskih vrst in podvrst v vzorcih obstaja več metod: metoda verižne reakcije s polimerazo (PCR), ugotavljanje količine ATP z merjenjem bioluminiscence, encimsko imunski test (angl. enzyme-linked immunosorbent assay;

ELISA), pretočna citometrija, masna spektrometrija z ionizacijo v matriksu z lasersko desorpcijo ter MALDI-TOF MS, itn. (Ziyaina in sod., 2020; Jeršek, 2009).

2.5.2.1 PCR

Verižna reakcija s polimerazo (angl. Polymerase Chain Reaction; PCR) je molekularna metoda, ki so jo pričeli razvijati v zgodnjih osemdesetih in se uporablja za ugotavljanje prisotnosti in količine MO v različnih vzorcih (Jalali in sod., 2017; Jeršek, 2009).

Analiza vzorca z metodo PCR je sestavljena iz treh ključnih korakov: priprava DNA, priprava in izvedba PCR analize ter ugotavljanje nastalih pomnožkov. Za preiskavo je zelo pomemben prvi korak priprave DNA, kjer z različnimi fizikalno kemijskimi in encimskimi postopki dobimo čimbolj čisto suspenzijo DNA vzorca za nadaljnjo analizo PCR. Z lizo celičnih sten bakterijskih celic iz notranjosti sprostimo molekule DNA. Po celični lizi lahko dobljeno suspenzijo uporabimo za analizo ali pa DNA še dodatno osamimo in očistimo. Pri drugem koraku izvedbe reakcije PCR gre za in vitro pomnožitev dela tarčne DNA, podoben procesu podvajanja genskega materiala, ki se dogaja v celici pred delitvijo. Reakcija poteka v cikličnem termostatu, kjer se v ponavljajočih ciklih reakcijska zmes segreva in ohlaja (Jeršek, 2009).

Vsak cikel PCR je sestavljen iz treh stopenj:

1. Denaturacija DNA: segrevanje reakcijske zmesi na več kot 90 °C, kar povzroči porušenje vodikovih vezi med baznimi pari komplementarnih DNA verig, zato dobimo ločeni komplementarni verigi.

2. Prilagajanje oligonukleotidnih začetnikov: Prileganje začetnih oligonukleotidov na komplementarno mesto tarčne molekule DNA, pri temperaturi 45 – 70 °C.

3. Podaljševanje DNA: reakcijsko zmes se ponovno segreje na 72 °C, ki je optimalna temperatura za encimsko aktivnost termostabilne DNA-polimeraze.

Po podaljšanju DNA se reakcija vrne v stopnjo denaturacije in pomnoževanje se nadaljuje.

Količina DNA se v vsakem ciklu podvoji. Dobljene pomnožke po zaključeni analizi PCR

najlažje ugotavljamo z agarozno gelsko elektroforezo, tako da velikost pomnožkov primerjamo z molekularnim označevalcem z znanimi velikostmi odsekov (Jalali in sod., 2017; Jeršek 2009).

Za analizo PCR pripravimo reakcijsko mešanico, ki mora poleg tarčnih molekul DNA vsebovati tudi ustrezen par začetnih oligonukleotidov, specifičnih za vrsto, termostabilno DNA-polimerazo, mešanico deoksinukletid trifosfatov (dNTP), ione Mg²⁺ in reakcijski pufer. Vsako analizo PCR je potrebno pred izvedbo optimizirati glede na tarčni odsek DNA oziroma uporabljene začetne oligonukleotide. Optimizacija vključuje sestavo reakcijske mešanice, temperaturo in čas posameznega cikla ter število ponovitev ciklov (Jeršek, 2009).

2.5.2.2 MALDI-TOF MS

Masna spektrometrija z ionizacijo v matriksu z lasersko desorpcijo ter analizo časa potovanja molekul (MALDI-TOF MS) je v zadnjih letih postalo pomembno orodje za rutinsko identifikacijo bakterij, predvsem v kliničnih laboratorijih. Pokazalo se je, da je identifikacija bakterij z MALDI-TOF MS hitrejša, natančnejša in stroškovno učinkovitejša od običajnih fenotipskih tehnik ali molekularnih metod (Treven in sod., 2019). Hitro in zanesljivo prepoznavanje bakterij, povezanih z živili, je ključnega pomena za zagotavljanje kakovosti izdelkov. Metoda je bila prvotno razvita za področje akademskih raziskav, za pridobivanje molekularnih prstih odtisov določenega MO, sedaj pa je že široko razširjena na različnih področjih, kot so zdravje ljudi in živali, okolje, farmacija (Nacef in sod., 2017; Singhal in sod., 2015).

Masna spektrometrija (MS) je analitska tehnika, pri kateri se kemijske spojine ionizirajo, nabitim molekulam pa lahko izmerimo razmerje med maso in nabojem (m/z). V začetku je bila v uporabi le v kemijskih vedah, kasneje se je z lasersko ionizacijsko desorpcijo (MALDI) uporabnost razširila tudi na večje biološke molekule, kot so beljakovine. Metoda temelji na tako imenovani »mehki ionizaciji«, pri kateri nastajanje ionov ne povzroči pomembne izgube celovitosti molekule (Singhal in sod., 2015).

MALDI-TOF MS zazna veliko različnih biomolekul, kot so nukleinske kisline, peptidi, beljakovine, sladkorji in druge majhne molekule. Ta metoda omogoča razlikovanje mikroorganizmov na podlagi masnih spektrov - prstnih odtisov, ki jih primerjajo s spektri referenčnih mikroorganizmov v bazi podatkov. Osnovno načelo vseh masno- spektrometričnih metod je ionizacija nevtralne molekule, nadaljnje natančno zaznavanje nastalih ionov in njihovih produktov razpadanja v visokem vakuumu. Tipični sistem za MS je sestavljen iz treh komponent: ionskega vira, masnega analizatorja in detektorja (Pavlovic in sod., 2013). Eno izmed prvih baz podatkov za mikrobiološko identifikacijo imenovano

»MALDI Biotyper« je razvilo podjetje Bruker Daltonics. Nenehno dopolnjevanje baz

podatkov pripomore k pravilnosti identifikacije (Pavlovic in sod., 2013; Singhal in sod., 2015).

Vzorec za analizo z MALDI-TOF MS prevlečemo z raztopino organske spojine, ki absorbira energijo, imenovano matrica. Matrica ob sušenju kristalizira, prav tako tudi v matrico zajeti vzorec. Vzorec znotraj matrice se ionizira v avtomatiziranem načinu z laserskim žarkom.

Majhna organska spojina absorbira sevanje laserja in energijo prenaša na beljakovine.

Beljakovine postanejo ionizirane, brez da bi se razgradile (Slika 1).

Slika 1: Princip metode MALDI-TOF MS (Pavlovic in sod., 2013)

V idealnem primeru energijo laserskega impulza absorbira matrica. Matrica se upari in na analit prenese ione, ustvarjene z obsevanjem, kar vpliva na desorpcijo analita. Z nežno ionizacijo iz vsake molekule nastane le enojno nabit ion. Ko se nabite molekule v plinski fazi pospešijo v električnem polju, se ločijo v analizatorju ena od druge na podlagi njihovega razmerja med maso in nabojem (m/z). Molekule izmerimo z uporabo različnih tipov masnih analizatorjev. Za mikrobiološke aplikacije se uporablja predvsem masni analizator časa letenja (TOF). Analizatorji TOF izkoriščajo dejstvo, da imajo vsi ioni, pospešeni v istem električnem polju, enako kinetično energijo. Ko zapustijo električno polje, pa imajo različne hitrosti, glede na njihovo maso. Veliki ioni potrebujejo več časa, da preletijo cev za letenje kot manjši ioni. Med MALDI-TOF MS se razmerje m/z meri tako, da se izmeri čas, ki je potreben za prehod dolžine leta. Na podlagi informacije TOF se za analite v vzorcu ustvari značilen spekter, imenovan tudi prstni odtis.

Ključni dejavnik za natančnost in ponovljivost metode je priprava vzorcev. Postopek priprave vzorcev je odvisen od vrste mikroorganizmov. Čiste kulture običajno s standardnimi metodami gojenja namnožimo, da aktiviramo mirujoče celice. Delček posamezne kolonije se v tanki plasti razmaže na ciljno mesto na ploščici. Vzorec se nato posuši in pokrije z matrico. Po kristalizaciji matrice in analita se kovinska ploščica vstavi v instrument MALDI-TOF MS in po nekaj minutah je analiza končana (Slika 2). Prstni odtisi

beljakovin preiskovanega bakterijskega seva računalniški program primerja z referenčnimi spektri v bazi podatkov. Kakovost baze podatkov je pomemben dejavnik, ki vpliva na natančnost identifikacije. Integrirana programska oprema prikaže seznam referenčnih sevov, ki imajo podobne spektre kot preiskovani sev, pri čemer je podobnost izražena z vrednostjo ujemanja (angl. »score value«). Program MALDI-Biotyper^TM rezultate z vrednostmi višjimi od 2.3 označuje za zelo verjetno identifikacijo do vrste, rezultati z vrednostmi od 2 do 2.299 označujejo verjetno identifikacijo do vrste, medtem ko vrednost med 1.7 in 2.0 zadostuje za zanesljivo identifikacijo rodu. Pri vrednostih ujemanja pod 1.7 pa je identifikacija nezanesljiva (Pavlovic in sod., 2013; Singhal in sod., 2015).

Slika 2: Identifikacija bakterij z metodo MALDI-TOF MS (Pavlovic in sod., 2013)

3 MATERIAL IN METODE

3.1 NAČRT POSKUSA

Glavni cilj našega poskusa je bil preveriti kakovost prehranskih dopolnil z živimi bakterijami na slovenskem trgu, saj najdemo že več kot 60 različnih izdelkov. Za poskus smo izbrali 17 različnih vzorcev, večinoma so bila to prehranska dopolnila, nekaj pa tudi zdravil. S klasičnimi gojitvenimi tehnikami smo preverili dejansko število živih bakterijskih celic v vzorcih ter preverili skladnost z navedbami na označbah izdelkov. Prisotnost bakterijskih vrst, ki so bile navedene na označbah vzorcev, pa smo preverili z metodama MALDI-TOF MS in PCR. Potek dela je podrobneje prikazan na Slika 3.

Slika 3: Shematski prikaz poteka analiziranja vzorcev

3.2 MATERIAL 3.2.1 Vzorci

Po pregledu ponudbe prehranskih dopolnil in zdravil z živimi bakterijami, ki so naprodaj v slovenskih lekarnah, smo izbrali 17 izdelkov (Preglednica 1). Izbrane izdelke smo kupili v lekarnah in spletnih trgovinah in jih do analize hranili po navodilih proizvajalca, večino na suhem mestu, pri sobni temperaturi v originalnem pakiranju. En izdelek pa smo hranili v hladilniku, kot je bilo navedeno na označbi.

Preglednica 1: Prehranska dopolnila in zdravila, vključena v našo analizo, označeno število in vrste MO in rok uporabnosti posameznega izdelka. Str., Streptococcus; Bif., Bifidobacterium; Lc., Lactococcus; E., Enterococcus; L. Lactobacillus (po novi taksonomski razvrstitvi od aprila 2020, Zheng in sod. (2020), tudi Lactocaseibacillus, Lactiplantibacillus, Limosilactobacillus, Ligilactobacillus).

Oznaka izdelka

Označeno število

(KE/enoto) Bakterijska vrsta Vrsta

izdelka

Uporabno najmanj do

A 1 kapsula (0,35 g):

2,5 × 10¹⁰ KE

L. acidophilus La-14 L. plantarum Lp-115 L. casei LC-11 L. rhamnosus Lr-32 L. paracasei Lpc-37 L. salivarius Ls-33 Str. thermophilus St-21 Bif. breve BB-03 Bif. longum Bl-05 Bif. lactis Bl-04

Prehransko

dopolnilo 5/2020

B 1 vrečka (3 g):

7,5 × 10⁹ KE

L. casei W56 Lc. lactis W 19 L. acidophilus W22 L. paracasei W20 L. plantarum W62 L. salivarius W24 Bif. lactis W51 Bif. lactis W52 Bif. bifidum W23

Prehransko

dopolnilo 4/2020

C 1 tableta (0,4 g):

1 × 10⁹ KE

L. acidophilus L. casei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus Bif. longum Str. thermophilus

Prehransko

dopolnilo 12/2019

Se nadaljuje…

Nadaljevanje preglednice 1: Prehranska dopolnila in zdravila, vključena v našo analizo, označeno število in vrste MO in rok uporabnosti posameznega izdelka. Str., Streptococcus; Bif., Bifidobacterium; Lc., Lactococcus; E., Enterococcus; L. Lactobacillus (po novi taksonomski razvrstitvi od aprila 2020, Zheng in sod. (2020), tudi Lactocaseibacillus, Lactiplantibacillus, Limosilactobacillus, Ligilactobacillus).

Oznaka izdelka

Označeno število (KE/enoto)

Bakterijska vrsta Vrsta izdelka

Uporabno najmanj do

D 1 kapsula (0,5 g):

3 × 10¹⁰ KE

L. paracasei A234 L. casei A 179 L. reuteri A 113 L. lactis A 328 L. gasseri A237 L. rhamnosus A 119 L. rhamnosus A 11993 L. acidophilus A118 L. plantarum A138 Bif. longum subsp. longum Bif. bifidum A 058 Bif. animalis subsp.lactis Bif. breve A055

Bif. longum subsp. infantis

Prehransko

dopolnilo 8/2020

E 1 trda kapsula (0,31 g):

4 × 10⁹ KE

L. acidophilus La-14 L. plantarum Lp-115 Bif. lactis La-14 Bif. breve Bb-03

Prehransko

dopolnilo 7/2020

F 1 kapsula (0,4 g):

2 × 10⁹ KE B. coagulans Prehransko

dopolnilo 6/2020

G 1 kapsula (0,2 g):

2 × 10¹⁰ KE

L. acidophilus DDS-1 L. plantarum

L. rhamnosus L. casei Bif. lactis Bif. longum Str. thermophilus

Prehransko

dopolnilo 5/2020

H 1 vrečka (4,4 g):

≥ 4,5 × 10¹¹ KE

Str. thermophilus Bif. breve DSM 24732 Bif. longum DSM 24736 Bif. infantis

L. acidophilus

L. plantarum DSM 24730 L. paracasei DSM 24733 L. delbrueckii subsp.

bulgaricus DSM 24734

Prehransko

dopolnilo 4/2020

I 1 kapsula (0,49 g):

≥ 1 x10¹⁰ KE

L. rhamnosus GG (ATCC 53103)

Prehransko

dopolnilo 6/2020

Se nadaljuje…

Nadaljevanje preglednice 1: Prehranska dopolnila in zdravila, vključena v našo analizo, označeno število in vrste MO in rok uporabnosti posameznega izdelka. Str., Streptococcus; Bif., Bifidobacterium; Lc., Lactococcus; E., Enterococcus; L. Lactobacillus (po novi taksonomski razvrstitvi od aprila 2020, Zheng in sod. (2020), tudi Lactocaseibacillus, Lactiplantibacillus, Limosilactobacillus, Ligilactobacillus).

Oznaka izdelka

Označeno število (KE/enoto)

Bakterijska vrsta Vrsta izdelka

Uporabno najmanj do

J

1 žvečljiva tableta (0,45 g):

≥ 1 × 10⁸ KE

L. reuteri protectis (DSM 17938)

Prehransko

dopolnilo 3/2020

K

1 kapsula (0,56 g):

bakterije: 1,5 × 10⁹ KE Sacch. boulardii:

5 × 10⁹ KE

Sacch. boulardii L. acidophilus Bif. breve Bif. infantis Bif. longum

Prehransko

dopolnilo 11/2020

L 1 vrečka (3 g):

3 × 10⁹ KE

Bif. animalis W53 L. acidophilus W55 L. salivarius W57 E. faecium W 54 Lc. lactis W58 L. casei W56

Prehransko

dopolnilo 09/2021

M 1 vrečka (5g):

5 × 10⁹ KE

L. acidophilus W55 L. acidophilus W37 L. paracasei W72 L. rhamnosus W71 E. faecium W54 L. salivarius L. plantarum W62 Bif. bifidum W23 Bif. lactis W18 Bif. longum W51

Prehransko

dopolnilo 03/2020

N 1 kapsula (0,17g):

1 × 10¹⁰ KE L. rhamnosus GG Prehransko

dopolnilo 10/2020

O 1 kapsula (0,28g): 1,2 × 10⁷ KE

L. gasseri Bif. infantis E. faecium

Zdravilo 11/2019

P 1 kapsula (0,24g):

2 × 10⁹ KE

L. acidophilus LA-5

Bif. animalis subsp. lactis Zdravilo 01/2021

Q 1 kapsula (0,53g): 1,8 × 10⁹ KE

L. fermentum L. acidophilus L. reuteri L. rhamnosus L. plantarum Bif. bifidum

Prehransko

dopolnilo 01/2021

3.2.2 Gojišča

Vzorce smo nacepljali na različna selektivna gojišča za štetje MO. Pripravljena gojišča smo v mikrobiološki komori razlili v sterilne petrijeve plošče. Do uporabe smo pripravljene plošče shranili v hladilniku. Uporabili smo naslednja gojišča: YGC, M17, TOS, Rogosa, MRS pH 6,2, MRS/CL/CIP in CATC, ki so spodaj podrobneje opisani.

3.2.2.1 YGC

Gojišče YGC smo pripravili po navodilih proizvajalca (Merck, Darmstadt, Nemčija).

Zatehtali smo 40 g dehidriranega gojišča YGC agar ter ga raztopili v 1 l destilirane vode.

Gojišče smo avtoklavirali 15 minut pri 121 °C. Selektivno gojišče YGC smo uporabili za ugotavljanje števila kvasovk. YGC agar vsebuje antibiotik kloramfenikol, ki zavira rast bakterij na gojišču.

3.2.2.2 M17

Za gojišče M17 smo najprej po navodilih proizvajalca (Merck, Darmstadt, Nemčija) pripravili tekoče gojišče M17 tako, da smo 42,5 g prahu raztopili v 1 l destilirane vode ter umerili pH na 6,8. Ko smo umerili pH, smo 1 l tekočega gojišča po navodilih proizvajalca dodali še 10 g agar-agarja (Carl Roth, Karlsruhe, Nemčija) in avtoklavirali 15 minut pri 121

°C. Gojišče M17 smo uporabili za ugotavljanje števila bakterij vrst Lactococcus lactis in Streptococcus thermophilus.

3.2.2.3 TOS

Gojišče TOS smo pripravili po navodilih proizvajalca (Yakult, Tokio, Japonska), tako da smo 62,5 g dehidriranega gojišča TOS (TOS propionate agar) raztopili v 1 l destilirane vode.

Gojišče smo dobro raztopili v vodni kopeli (95 °C) in ohladili na 45 °C nato pa umerili pH na 6,3. Sledilo je 15 minutno avtoklaviranje pri 115 °C in nato ohlajanje v vodni kopeli na 45 °C. Pred razlivanjem smo gojišču dodali še 500 µl raztopine antibiotika mupirocina (AppliChem, Darmstadt, Nemčija) ter razlili v sterilne petrijevke. Raztopino mupirocina smo pripravili tako, da smo v 2 ml etanola raztopili 40 mg mupirocina (AppliChem, Darmstadt, Nemčija). Končna koncentracija mupirocina v gojišču je bila 50 mg/l.

Preostanek raztopine mupirocina pa smo zamrznili do naslednje uporabe. Gojišče TOS smo uporabili za selektivno gojenje bakterij rodu Bifidobacterium.

3.2.2.4 Rogosa

Gojišče Rogosa smo pripravili po navodilih proizvajalca (Merck, Darmstadt, Nemčija) tako, da smo zatehtali 74,5 g dehidriranega gojišča Rogosa in dodali 1 l miliQ vode ter raztopili v vodni kopeli (95 °C) in nato še na hitro segreli v mikrovalovni pečici, da se je popolnoma

raztopilo. Raztopljeno gojišče smo nato ohladili v vodni kopeli na 45 °C ter v laminariju dodali 1,3 ml/l 96 % ocetne kisline (Merck, Darmstadt, Nemčija), da smo uravnali pH na 5,5. Gojišče smo uporabili za ugotavljanje števila laktobacilov.

3.2.2.5 MRS pH 6,2

Gojišče MRS smo pripravili tako, da smo po navodilih proizvajalca (Merck, Darmstadt, Nemčija) v 1 l destilirane vode raztopili 52,2 g dehidriranega bujona MRS. Pred avtoklaviranjem smo umerili pH vrednost na 6,8, da je končni pH gojišča po avtoklaviranju znašal 6,2. Nato smo dodali še 10 g agar-agarja v 1 l tekočega gojišča in avtoklavirali 15 minut pri 115 °C. Gojišče MRS s pH 6,2 smo uporabili za ugotavljanje števila Bacillus coagulans in laktobacilov v izdelkih, ki so vsebovali samo laktobacile.

3.2.2.6 MRS/CL/CIP

Za pripravo gojišča MRS z dodatkom klindamicina in ciprofloksacina (MRS/CL/CIP) smo gojišču MRS pH 6,2 dodali 0,5 ml založne raztopine klindamicina in 5 ml založne raztopine ciprofloksacina na 1 l gojišča. Končna koncentracija klindamicina v gojišču je bila 0,1 mg/l, ciprofloksacina pa 10 mg/l gojišča (ISO 20128:2006). Gojišče MRS z dodatkom klindamicina in ciprofloksacina smo uporabili za selektivno rast laktobacilov skupine L.

acidophilus.

Založno raztopino klindamicina smo pripravili tako, da smo v 10 ml destilirane vode raztopili 2 mg klindamicin hidroklorida (Sigma, Steinheim, Nemčija) in raztopino sterilizirali s pomočjo filtracije preko mikrofiltra z velikostjo por 0,22 µm. Založno raztopino ciprofloksacina smo pripravili tako, da smo v 10 ml raztopili 20 mg ciprofloksacin hidroklorida (Fluka, Buchs, Švica) in raztopino smo prefiltrirali preko mikrofiltra z velikostjo por 0,22 µm. Preostanek pripravljenih dodatkov smo shranili v zamrzovalniku do naslednje uporabe.

3.2.2.7 CATC

Gojišče CATC smo pripravili po navodilih proizvajalca, tako da smo zatehtali 58,4 g dehidriranega gojišča CAE (HiMedia, Indija) in ga v vodni kopeli raztopili v 990 ml destilirane vode. Raztopljeno gojišče smo nato ohladili in umerili pH na 7,2. Umerjeno gojišče smo avtoklavirali. Pred razlivanjem na plošče smo ohlajenemu gojišču dodali še 10 ml 0,1 % raztopine TTC v 1 l gojišča. Gojišče smo uporabili za ugotavljanje števila bakterij rodu Enterococcus.

Raztopino TTC smo pripravili tako, da smo v 100 ml merilno bučko zatehtali 1 g TTC (Merck, Darmstadt, Nemčija) ter bučko napolnili z destilirano vodo do polovice. S pomočjo

mešala smo TTC popolnoma raztopili in nato dopolnili do oznake. Potem smo raztopino prefiltrirali skozi 0,22 μm filter v sterilno epruveto.

3.2.3 Raztopine

3.2.3.1 Puferirana peptonska voda

Puferirano peptonsko vodo (BPW) smo uporabili za pripravo primarnih raztopin. Pripravili smo jo po navodilih proizvajalca (Merck, Darmstadt, Nemčija), tako da smo na mešalniku v 1 l destilirane vode raztopili 25,5 g dehidrirane mešanice za pripravo BPW (Merck, Darmstadt, Nemčija). BPW smo 15 minut avtoklavirali pri 121 °C.

3.2.3.2 Peptonska voda

Peptonsko vodo (PV) (ISO 6887-1:1999) smo pripravili, tako da smo s pomočjo magnetnega mešala v 1 l destilirane vode raztopili 1 g peptona iz kazeina (Merck, Darmstadt, Nemčija) in 8,5 g NaCl (Merck, Darmstadt, Nemčija). Nato smo umerili pH na 7,0 in raztopino razdelili v epruvete po 9 ml ter avtoklavirali 15 minut pri 121 °C.

3.2.4 Reagenti za izolacijo DNA in za PCR Izolacija DNA

DNA smo izolirali s pomočjo komercialnega seta Maxwell^® 16 Tissue DNA Purification Kit (Promega, Madison, ZDA). V setu so vključene kartuše z reagenti za izolacijo DNA magnetna mešala in elucijski pufer.

Poleg tega smo potrebovali še: TE pufer, lizocim (Sigma, Steinheim, Nemčija) in raztopino mutanolizina (2500U/ml) (Sigma, Steinheim, Nemčija).

Reakcija PCR

Za reakcije PCR smo potrebovali naslednje reagente:

- deionizirano vodo, - pufer GoTaq flexi, - MgCl2,

- začetne oligonukleotide, - dNTP,

- Taq polimerazo.

Pri gelski elektroforezi pa smo potrebovali naslednje reagente:

- agaroza (Sigma, Steinheim, Nemčija),

- Gene Ruler, 1kb DNA Ladder (Fermentas, Vilna, Litva), - TAE pufer,

- raztopina barvila SYBR Safe.

3.3 METODE

Vzorce smo analizirali v maju in juniju 2019. Število prisotnih MO smo ugotavljali z metodo štetja na ploščah, prisotnost označenih bakterijskih vrst pa smo preverjali z metodama MALDI-TOF MS in PCR.

3.3.1 Ugotavljanje števila MO v vzorcih

3.3.1.1 Priprava primarne raztopine

Primarno raztopino smo pripravili tako, da smo na napravi Dilumat v sterilno vrečko natehtali 10 g vzorca. Vzorce, ki so bili v obliki kapsul, smo odprli in vsebino stresli v sterilno vrečko. Tablete smo v terilnici zdrobili v fin prah ter nato zatehtali. Zatehtanemu vzorcu smo s pomočjo dilumata dodali 90 g BPW. Pripravljeno raztopino smo nato 3 min mešali s pomočjo gnetilnika in pustili pri sobni temperaturi 30 min, da se je vzorec dobro rehidriral.

3.3.1.2 Razredčevanje vzorcev

Glede na podatke, navedene na označbah o skupnem številu MO v vzorcu, smo določili ciljno redčitev, da bi po inkubaciji dobili števne plošče (do 300 kolonij na plošči). Primarno razredčitev smo ponovno premešali s pomočjo gnetilnika (3 min) ter jo redčili v PV po Kochu do predhodno določene ciljne redčitve.

3.3.1.3 Nacepljanje na gojišča

Za nacepljanje na gojišča smo izbrali pri vsakem vzorcu po 3 redčitve, pri katerih smo po inkubaciji pričakovali števne plošče. Na predhodno pripravljena in osušena gojišča smo prenesli 0,1 ml posamezne redčitve vzorca in ga s pomočjo sterilne plastične palčke razmazali po celotni površini gojišča.

3.3.1.4 Inkubacija

Plošče smo inkubirali pri pogojih, ki ustrezajo posameznim bakterijskim skupinam:

 kvasovke (gojišče YGC), 72 h pri 25 °C v aerobnih pogojih,

 bifidobakterije (gojišče TOS), 72 h pri 37 °C v anaerobnih pogojih,

 laktobacili (gojišča ROGOSA, MRS pH 6,2 ali MRS/CL/CIP), 72 h pri 37 °C v anaerobnih pogojih,

 streptokoki (gojišče M17), 24/48 h pri 37 °C v aerobnih pogojih,

 laktokoki (gojišče M17), 72 h pri 30 °C v aerobnih pogojih,

 Bacillus coagulans (gojišče MRS pH 6,2), 5 dni pri 37 °C v aerobnih pogojih,

 enterokoki (CATC), 72 h pri 37 °C v aerobnih pogojih.

3.3.1.5 Štetje kolonij in izračun števila kolonijskih enot

Po zaključeni inkubaciji smo si podrobneje pogledali zrasle kolonije na petrijevih ploščah in prešteli število kolonij s pomočjo elektronskega števca. Kot števne plošče smo upoštevali vse plošče na katerih je zraslo do 300 kolonij. Število kolonijskih enot (KE) v 1 g vzorca smo izračunali po formuli (1):

𝑁 = ∑ 𝐶

(𝑛₁+ 0,1 × 𝑛₂) × 𝑅

…(1) Legenda:

N število kolonijskih enot v vzorcu (KE/g)

∑C vsota vseh kolonij na števnih ploščah n1 število plošč prve razredčitve n2 število plošč druge razredčitve R prva razredčitev vzorca, ki smo jo šteli

3.3.2 Ugotavljanje prisotnosti MO z metodo MALDI-TOF MS

Glede na podatke, katere vrste MO vsebuje posamezni vzorec, smo na ploščah izbrali za posamezno vrsto po 3 kolonije. V sterilnih pogojih smo s palčko zajeli del kolonije in jo prenesli na označeno mesto na ploščico za MALDI-TOF MS (MSP 96 target polished steel BC, Bruker, Nemčija). Nadaljnjo analizo kolonij so izvedli na Veterinarski fakulteti v Ljubljani na sistemu Microflex LF (Bruker Daltonics, Nemčija). Rezultate je avtomatsko generiral program MALDI Biotyper 3.1. Po pregledu smo dobili podatke, katera bakterijska vrsta je bila zaznana na določenem mestu na ploščici ter kakšna je zanesljivost dobljenega podatka. Glede na zanesljivost identifikacije bakterijske vrste so bili rezultati razvrščeni v štiri kategorije, kakor je prikazano v Preglednici 2.

Preglednica 2: Zanesljivost rezultata v programu MALDI Biotyper 3.1

Vrednost ujemanja Opis Simbol Barva

2.300 ... 3.000 Zelo verjetna identifikacija vrste ( +++ ) Zelena 2.000 ... 2.299 Verjetna identifikacija vrste ( ++ ) Zelena 1.700 ... 1.999 Verjetna identifikacija rodu ( + ) Rumena 0.000 ... 1.699 Nezanesljiva identifikacija ( - ) Rdeča