PROTIBAKTERIJSKA UČINKOVITOST ETANOLNIH IZVLEČKOV SPOMLADANSKE RESE (Erica carnea)

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Taja Vita PETROVIĆ

PROTIBAKTERIJSKA UČINKOVITOST

ETANOLNIH IZVLEČKOV SPOMLADANSKE RESE (Erica carnea)

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana

Ljubljana, 2022

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Taja Vita PETROVIĆ

PROTIBAKTERIJSKA UČINKOVITOST ETANOLNIH IZVLEČKOV SPOMLADANSKE RESE (Erica carnea)

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ETHANOLIC EXTRACTS OF SPRING HEATH (Erica carnea)

B. SC. THESIS

Academic Study Programmes: Food Science and Nutrition

Ljubljana, 2022

(3)

Petrović T. V. Protibakterijska učinkovitost etanolnih izvlečkov spomladanske rese (Erica carnea).

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2022 II

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Živilstvo in prehrana. Delo je bilo opravljeno v Laboratoriju za živilsko mikrobiologijo Katedre za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil na Oddelku za živilstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za živilstvo je za mentorico diplomskega dela imenovala prof. dr. Sonjo Smole Možina in za recenzentko doc. dr. Nežo Čadež.

Mentorica: prof. dr. Sonja SMOLE MOŽINA

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Recenzentka: doc. dr. Neža ČADEŽ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik:

Mentorica:

Recenzentka:

Datum zagovora:

Taja Vita Petrović

(4)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2022 III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1

DK UDK 579.24/.26:547.9(043)=163.6

KG spomladanska resa, Erica carnea, protibakterijski učinek, minimalna inhibitorna koncentracija, minimalna baktericidna koncentracija, protiadhezijska aktivnost AV PETROVIĆ, Taja Vita

SA SMOLE MOŽINA, Sonja (mentorica), ČADEŽ, Neža (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2022

IN PROTIBAKTERIJSKA UČINKOVITOST ETANOLNIH IZVLEČKOV SPOMLADANSKE RESE (Erica carnea)

TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana) OP VIII, 26 str., 6 pregl., 1 sl., 1 pril., 67 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Spomladanska resa (Erica carnea) je zimzelena rastlina, ki ji pripisujejo številne biološke aktivnosti, med njimi tudi protibakterijsko delovanje. V diplomski nalogi smo preverili protibakterijsko in protiadhezijsko delovanje etanolnih izvlečkov spomladanske rese in kemijsko čistih učinkovin na izbrane testne mikroorganizme.

Uporabili smo grampozitivni bakteriji Staphylococcus aureus in Listeria innocua ter gramnegativni bakteriji Escherichia coli in Pseudomonas fragi. Določili smo minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK) in minimalno baktericidno koncentracijo (MBK) etanolnih izvlečkov in nekaterih kemijsko čistih učinkovin, ki jih vsebujejo etanolni izvlečki spomladanske rese. Rezultati so pokazali najboljši protibakterijski učinek etanolnih izvlečkov proti bakteriji S. aureus, MIK je znašala 1 mg/ml. Najboljši protibakterijski učinek kemijsko čiste učinkovine je imel kvercetin, z najnižjimi vrednostmi proti grampozitivnim bakterijam (MIK 0,25 mg/ml; MBK 1 mg/ml). Ugotovili smo tudi relativno nizke vrednosti MIK etanolnih izvlečkov proti bakteriji P. fragi (1-2 mg/ml). Te vrednosti so primerljive, ali v primeru kemijsko čistih učinkovin celo nižje od tistih za grampozitivne bakterije, na kar predvidoma vpliva specifična encimska aktivnost bakterij P. fragi. Določili smo tudi dobro protiadhezijsko aktivnost etanolnega izvlečka spomladanske rese, ki je adhezijo bakterije P. fragi na polistiren statistično značilno zmanjšal, povprečno za 52,5 %. Na podlagi rezultatov smo potrdili protibakterijsko delovanje etanolnih izvlečkov spomladanske rese proti izbranim testnim bakterijam, pri čemer so dobljene vrednosti MIK in protiadhezijske aktivnosti na bakterijo P. fragi zanimiva tema nadaljnjih študij.

(5)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2022 IV

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1

DC UDC 579.24/.26:547.9(043)=163.6

CX spring heath, Erica carnea, antibacterial activity, minimal inhibitory concentration, minimal bactericidal concentration, antiadhesion activity

AU PETROVIĆ, Taja Vita

AA SMOLE MOŽINA, Sonja (supervisor), ČADEŽ, Neža (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology

PY 2022

TI ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ETHANOLIC EXTRACTS OF SPRING HEATH (Erica carnea)

DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes: Food Science and Nutrition) NO VIII, 26 p., 6 tab., 1 fig., 1 ann., 67 ref.

LA sl AL sl/en

AB Spring heath (Erica carnea) is an evergreen plant, with many biological activities, including antibacterial activity. In this thesis we checked the antibacterial and antiadhesion effect of ethanolic extracts of spring heath and some chemically pure active ingredients of these ethanolic extracts on selected target microorganisms. We used two gram positive target bacteria, Staphylococcus aureus and Listeria innocua, and two gram negative bacteria, Escherichia coli and Pseudomonas fragi. We determined the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) of ethanolic extracts and some of their chemically pure active ingredients. The results showed the best antibacterial effect of ethanolic extracts against S. aureus (MIC 1 mg/ml) and the best antibacterial effect of quercetin, the chemically pure active substance, with the lowest values for gram positive bacteria (MIC 0,25 mg/ml; MBC 1 mg/ml). The results for gram negative P. fragi are interesting, due to relatively low MIC values (1-2 mg/ml), which are comparable or, in case of chemically pure active compounds, even lower than the values obtained for gram positive bacteria. Presumably, this is influenced by specific enzymatic activity of P. fragi. We also determined a statistically significant reduction (52,5 %) in the adhesion of P. fragi to polystyrene, after the addition of ethanol extract. We have confirmed the antibacterial effect of spring heath extract on selected target microorganisms and found that the obtained MIC values and antiadhesion activity for P. fragi are an interesting topic for additional studies.

(6)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2022 V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III

KEY WORDS DOCUMENTATION IV

KAZALO VSEBINE V

KAZALO PREGLEDNIC VII

KAZALO SLIK VII

KAZALO PRILOG VII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI VIII

1 UVOD 1

1.1 CILJI DIPLOMSKE NALOGE 1

1.2 DELOVNE HIPOTEZE 1

2 PREGLED OBJAV 2

2.1 SPOMLADANSKA RESA (Erica carnea) 2

2.1.1 Sistematika in botanični opis 2

2.2 PROTIMIKROBNO DELOVANJE RASTLINSKIH IZVEČKOV 3

2.2.1 Fenolne spojine 3

2.2.2 Arbutin 6

2.2.3 Terpenoidi 7

2.2.4 Tradicionalna uporaba in potencialni novi načini uporabe 7

2.3 IZBRANE TESTNE BAKTERIJE 8

2.3.1 Grampozitivne bakterije 8

2.3.2 Gramnegativne bakterije 8

3 MATERIAL IN METODE 9

3.1 MATERIAL 9

3.1.1 Rastlinski material 9

3.1.2 Delovni mikroorganizmi 9

3.1.3 Laboratorijska oprema in naprave 9

3.1.4 Mikrobiološka gojišča 10

3.1.5 Raztopine in druge kemikalije 10

3.1.6 Kemijsko čiste učinkovine 10

3.2 METODE 10

3.2.1 Priprava inokuluma 10

3.2.2 Določanje koncentracije celic v inokulumu 10 3.2.3 Določanje vrednosti MIK in MBK z mikrodilucijsko metodo 11 3.2.3.1 Priprava delovnih in založnih raztopin izvlečkov 11

3.2.3.2 Priprava mikrotitrske ploščice 11

3.2.3.3 MIK in MBK 12

3.2.4 Protiadhezijska aktivnost izvlečka 12

3.2.4.1 Priprava delovne raztopine izvlečka 12

3.2.4.2 Priprava mikrotitrske ploščice 12

(7)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2022 VI

3.2.4.3 Določanje protiadhezijske aktivnosti izvlečka 12

4. REZULTATI 13

4.1 PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST ETANOLNIH IZVLEČKOV 13

4.2 PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST KEMIJSKO ČISTIH UČINKOVIN

14

4.3 PROTIADHEZIJSKA AKTIVNOST 14

5 RAZPRAVA 15

5.1 PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST ETANOLNIH IZVLEČKOV 15

16

5.3 PROTIADHEZIJSKA AKTIVNOST 17

6 SKLEPI 18

7 POVZETEK 19

8 VIRI 20

PRILOGE

(8)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2022 VII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Vzorci spomladanske rese (E. carnea) z oznakami izvlečkov. 9 Preglednica 2: Inhibitorna učinkovitost (MIK) etanolnih izvlečkov (mg/ml). 13 Preglednica 3: Baktericidna učinkovitost (MBK) etanolnih izvlečkov (mg/ml). 13 Preglednica 4: Inhibitorna učinkovitost (MIK) kemijsko čistih učinkovin

(mg/ml).

14 Preglednica 5: Baktericidna učinkovitost (MBK) kemijsko čistih učinkovin

(mg/ml).

14 Preglednica 6: Protiadhezijska aktivnost etanolnega izvlečka spomladanske

reseproti bakteriji P. fragi.

15

KAZALO SLIK

Slika 1: Spomladanska resa (E. carnea) (Foto: Smole Možina, 2019). 2

KAZALO PRILOG

Priloga A: Rezultat analize LC-PDA-ESI-MS etanolnega izvlečka spomladanske rese (G. Brdo 20.02.19).

(9)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2022 VIII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

CFU kolonijske enote oz. število kolonij (ang. Colony Forming Units)

DMSO dimetil sulfoksid

E. carnea Erica carnea E. coli Escherichia coli

FR fiziološka raztopina

INT 2-p-jodofenil-3-p-nitrofenil-5-fenil tetrazolijev klorid L. innocua Listeria innocua

L. monocytogenes Listeria monocytogenes

LPS lipopolisaharidi

MBK minimalna baktericidna koncentracija MIK minimalna inhibitorna koncentracija

MTP mikrotitrska ploščica

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa P. fragi Pseudomonas fragi

QS zaznavanje kvoruma (ang. quorum sensing) S. aureus Staphylococcus aureus

TSA gojišče triptični sojin agar (ang. Tryptic Soy Agar) TSB gojišče triptični sojin bujon (ang. Tryptic Soy Broth)

ŽM, ŽMJ Mikrobiološka zbirka Laboratorija za živilsko mikrobiologijo na Oddelku za živilstvo, Biotehniške fakultete

(10)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2022 1

1 UVOD

Rastline so že od nekdaj pomemben del človeške kulture zaradi številnih razlogov. Vedno znova se vračamo k njim zaradi videza, vonja, okusa, predvsem pa zaradi njihovih hranilnih in zdravilnih učinkov. Zaradi slednjih jih tudi v času napredne medicine uporabljamo v domačem gospodinjstvu in tradicionalni medicini. Imajo skoraj neomejeno sposobnost sinteze aromatičnih učinkovin, večina med njimi so sekundarni metaboliti, fenoli ali njihovi derivati. Te snovi so odgovorne tudi za lastnosti rastlin, kot so vonj, okus, barva, in tudi za obrambni mehanizem pred plenilci ter mikroorganizmi (Cowan, 1999).

Razvoj novih protimikrobnih sredstev je izjemno pomemben zaradi povečane mikrobne odpornosti in posledično neučinkovitosti protimikrobnih zdravil (Santos in sod., 2018), kot tudi filmotvornosti bakterij, kar predstavlja globalni problem živilsko-predelovalne verige (Bai in Vittal, 2014). Zaradi biološko aktivnih učinkovin so velike pozornosti deležne zdravilne rastline, ki se že dolgo uporabljajo v tradicionalni medicini. Med zdravilnimi rastlinami najdemo tudi spomladansko reso (Erica carnea) iz družine vresovk (Ericaceae), ki se pogosto uporablja za zdravljenje okužb sečil (Vučić in sod., 2013).

Najpogosteje so za bioaktivne učinke rastlin zaslužne fenolne spojine, ki so sekundarni metaboliti in naravna obramba rastlin proti mikroorganizmom. So med najbolj raziskanimi naravnimi snovmi zaradi bioloških aktivnosti, kot so antioksidativna, protimikrobna, protivnetna, citotoksična, protivirusna aktivnost (Veličković in sod., 2017). Različne aktivne spojine vsebujejo tudi rastline iz rodu Erica, pri katerih najdemo učinkovine, kot so flavonoidi, antocianini, kumarini in terpenske spojine (Vučić in sod., 2013).

1.1 CILJI DIPLOMSKE NALOGE

Cilj naloge je bil ugotoviti minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK) in minimalno baktericidno koncentracijo (MBK) ter protiadhezijsko aktivnost etanolnih izvlečkov spomladanske rese (Erica carnea) proti bakterijam, ki povzročajo s hrano prenosljive bolezni ali pa so kvarljivci živil: Staphylococcus aureus, Listeria innocua, Escherichia coli in Pseudomonas fragi.

1.2 DELOVNE HIPOTEZE

H1: Vrednosti MIK in MBK so odvisne od tarčne bakterije in kemijske sestave izvlečkov.

H2: Vrednosti MIK in MBK etanolnih izvlečkov in kemijsko čistih učinkovin bodo tako nizke, da bodo pripravki zanimivi za raziskave protiadhezijske aktivnosti, predvsem pri gramnegativnih bakterijah Pseudomonas.

H3: Protibakterijske učinkovine etanolnega izvlečka spomladanske rese bodo vplivale na zmanjšanje adhezije bakterije P. fragi na polistirensko površino.

(11)

2 PREGLED OBJAV

2.1 SPOMLADANSKA RESA (Erica carnea)

Kraljestvo: Plantae Deblo: Tracheophyta Razred: Magnoliopsida Red: Ericales

Družina: Ericaceae Rod: Erica

Vrsta: Erica carnea Slika 1: Spomladanska resa (E. carnea) (Foto:

Smole Možina, 2019).

2.1.1 Sistematika in botanični opis

Spomladanska resa (Erica carnea) je zimzeleni grm, ki spada v botanično družino Ericaceae (Veličković in sod., 2017). To je velika družina kritosemenk, v katero spadajo zelišča, pritlikavi grmi, grmi in drevesa več kot 4000 znanih vrst, razporejenih v 124 rodov in 9 poddružin (Stefănescu in sod., 2019).

Spomladanska resa je ena izmed 500 vrst rodu Erica. Razvejan zimzelen polegli grmiček v višino zraste do 30 cm. Ima igličaste liste s spodvihanim robom, ki rastejo v vretencih, ter dvospolne cvetove, združene v dvojna grozdasta socvetja, ki se lahko po barvi razlikujejo od bele, rožnate do rdeče. Plod te vrste je mnogosemenska glavica, ki se odpre na 4 dele in vsebuje drobna rjava semena. Kot že samo ime pove, zacveti zgodaj spomladi, kar omogoča čebelam zgodnjo spomladansko pašo. Spomladanska resa je zelo medovita vrsta (Brus, 2008).

Navadno porašča bazične površine na dolomitu in apnencu, lahko pa jo najdemo tudi na nekarbonatni podlagi. Ustrezajo ji predvsem svetle in tople lege, kljub temu dobro prenaša mraz, vendar lahko v brezsnežnih zimah tudi pozebe. Najdemo jo lahko v redkih borovih gozdovih, kot pionirska vrsta pa zelo na gosto porašča tudi revna tla. Značilna je za gorovja južnih predelov srednje Evrope, kjer raste v Alpah in njihovem predgorju, v Sloveniji jo najdemo vse od nižin do alpskega pasu. Na jugu sega vse do Španije, srednje Italije in Makedonije (Brus, 2008). Značilna je tudi za gorato pokrajino južne Afrike (Veličković in sod., 2017).

Spomladanska resa se uporablja za zdravljenje okužb sečil, pa tudi kot antirevmatik, diuretik, odvajalo (Vučić in sod., 2013). Zdravilne lastnosti te vrste so pripisali predvsem vsebnosti različnih fenolnih spojin (Santos in sod., 2018).

(12)

2.2 PROTIMIKROBNO DELOVANJE RASTLINSKIH IZVLEČKOV

Vrste rodu Erica vsebujejo veliko bioaktivnih snovi, kot so flavonoidi, antocianini, kumarini in triterpenske spojine (Vučić in sod., 2013), znane pa so tudi po vsebnosti 1,9 diarilnonanoidov, fenilpropanoida, triterpenoidov in taninov (Bitchagno in sod., 2016).

Potrdili so tudi vsebnost rutina, ki je derivat kvercetina in znan po svoji antioksidativni aktivnosti. Vučić in sod. (2013) pa kot glavne protibakterijske učinkovine navajajo fenolne spojine, predvsem flavonoide. Zaradi visoke vsebnosti fenolnih spojin se številne vrste iz družine Ericaceae uporabljajo tudi v terapevtske namene (Stefănescu in sod., 2019).

2.2.1 Fenolne spojine

Fenolne spojine so največja skupina rastlinskih sekundarnih metabolitov. Znana je njihova uporaba v terapevtske namene, kot antioksidanti, antimutageni, antikarcinogeni in za preprečevanje srčno-žilnih bolezni. Samo rastlino pa ščitijo pred plenilci, UV svetlobo in bakterijami ter glivami, sodelujejo pri komunikaciji s simbionti ter obarvanju cvetov (Gutiérrez-Lomelí in sod., 2012). Številne fenolne spojine pa so obetavna protimikrobna sredstva proti patogenim bakterijam (Khan in sod., 2021). Protimikrobno delovanje fenolnih spojin, kot so polifenoli, je odvisno od njihove strukture in okoljskih dejavnikov, vključno s pH in koncentracijo natrijevega klorida, ki povzročajo fiziološke spremembe v mikroorganizmih, zaradi česar so celice bolj občutljive na polifenole (Almajano in sod., 2007). Protimikrobno delovanje nekaterih fenolnih spojin je mogoče pripisati tudi neposrednemu zaviranju rasti bakterij zaradi blokiranja sinteze nukleinskih kislin in presnove energije (Myszka in sod., 2014).

Fenolne kisline so enostavne fenolne spojine, v katerih je na aromatski obroč vezana karboksilna skupina. Karboksilna skupina je lahko vezana neposredno (hidroksibenzojske kisline) ali posredno preko etilenske skupine (hidroksicimetne kisline). Med hidroksibenzojske kisline spadajo galna, protokatehujska, vanilinska in siringinska kislina, med hidroksicimetne pa p-kumarna, kavna, ferulna, sinapinska kislina (Abramovič, 2011).

Kavna kislina

O prisotnosti kavne kisline v izvlečkih rastlin iz družine Ericaceae so poročale nekatere študije (Guendouze-Bouchefa in sod., 2015; Stefănescu in sod., 2019), prav tako pa so prisotnost te kisline v izvlečku spomladanske rese dokazali Veličković in sod. (2017). Kavna kislina je najbolj razširjena hidroksicimetna kislina, z antioksidativnimi lastnostmi. V rastlinah ima kavna kislina pomembno vlogo pri vnosu hranil, sintezi beljakovin, encimski aktivnosti in fotosintezi (Stojković in sod., 2013). Sekundarni rastlinski metaboliti, kot je kavna kislina, kažejo protivirusne, protibakterijske, vazoaktivne, antiaterogene, antiproliferativne in protivnetne lastnosti (Rajan in sod., 2001). Kavna kislina skupaj z nekaterimi drugimi spojinami lahko zavira rast bakterij, vključno z E. coli, S. aureus,

(13)

Bacillus cereus, Listeria monocytogenes in nekaterih kvasovk (Almajano in sod., 2007).

Protibakterijska aktivnost kavne kisline se pojavlja s spreminjanjem prepustnosti membrane in izgubo celičnih sestavin, zaviranjem in inaktivacijo aktivnosti encimov ter poškodbami strukture beljakovin in uničenjem ali inaktivacijo funkcionalnega genskega materiala.

Protimikrobni učinki so posledica prisotnosti enega ali več hidroksilnih skupin na fenolnem obroču kisline (Khan in sod., 2021).

Klorogenska kislina

Klorogenska kislina je polifenolna spojina, ki jo v naravi najdemo v sadju, zelenjavi in ostalih rastlinah. O vsebnosti klorogenske kisline v nekaterih predstavnikih družine Ericaceae so poročali Guendouze-Bouchefa in sod. (2015), Veličković in sod. (2017) pa so poročali o vsebnosti klorogenske kisline v nekaterih izvlečkih spomladanske rese. Glede na študijo, ki so jo objavili Wen in sod. (2003), ima poleg kavne, ferulne ter p-kumarne kisline tudi klorogenska kislina učinke, ki segajo od zaviranja rasti bakterij vse do učinkovanja tudi na spore. Nekatere študije so poročale, da ima klorogenska kislina aktivnosti, kot so delovanje proti raku, izboljšanje imunskega sistema, sposobnost zmanjšanja toksičnih učinkov kemoterapevtskih zdravil, vpliv na cikel spanja in budnosti ter antioksidativno sposobnost (Cui in sod, 2005). Prav tako lahko klorogenska kislina in vitro zavira poškodbe DNK (Olthof in sod., 2001). Poleg močnih protivnetnih sposobnosti so Naveed in sod.

(2018) klorogenski kislini pripisali zmožnost zmanjšanja izražanja adhezijskih molekul, kar lahko prepreči okužbo s hepatitisom. Ima tudi inhibitorni učinek na nekatere grampozitivne rezistentne bakterije in njihovo zmožnost tvorbe biofilma. Čeprav je do zdaj malo raziskano, pa kaže klorogenska kislina tudi močne protimikrobne učinke, saj se lahko veže in ireverzibilno vpliva na prepustnost membrane, zaradi česar celice izgubijo sposobnost vzdrževanja membranskega potenciala in makromolekul citoplazme (Lou in sod., 2011). Do podobnih zaključkov so prišli Kabir in sod. (2014), ki so zapisali, da so njeni baktericidni učinki povezani s fiziološkimi spremembami na mikrobni celični membrani in sčasoma povzročijo celično smrt. Prednost klorogenske kisline je dejstvo, da se lahko varno uporablja v živilski industriji (Myszka in sod., 2014). Klorogenska kislina deluje protimikrobno in bi jo lahko vključili v različne prehrambene izdelke, za katere je zaželen protimikrobni učinek (Kabir in sod., 2014).

p-kumarna kislina

p-kumarna kislina (4-hidroksicimetna kislina) je hidroksilni derivat cimetne kisline, ki je eden od najpogostejših izomerov v naravi. Pomembna je v sekundarni presnovi, ker se lahko pretvori v fenolne kisline, kot sta kavna kislina in klorogenska kislina, flavonoide, predhodnike lignina in druge sekundarne presnovke (Pei in sod., 2015). Več študij je poročalo o njeni prisotnosti pri rastlinah iz družine Ericaceae, kot tudi pri sami spomladanski resi (Guendouze-Bouchefa in sod., 2015; Stefănescu in sod., 2019; Veličković in sod., 2017).

Khatkar in sod. (2017) povzemajo, da imajo p-kumarna kislina in njeni derivati širok spekter bioloških aktivnosti, kot so antioksidativne, antimutagene, antikarcinogene, protivirusne in

(14)

protivnetne lastnosti, delujejo proti neplodnosti in zmanjšujejo peroksidacijo lipoproteinov nizke gostote ter blažijo aterosklerozo, poškodbe nevronov in oksidativne poškodbe srca.

Poleg vsega naštetega je p-kumarna kislina pokazala tudi protimikrobne učinke (Pei in sod., 2015). p-kumarna kislina protibakterijsko deluje proti grampozitivnim bakterijam, kot je S.

aureus, in gramnegativnim bakterijam, kot je E. coli. Prav tako so protibakterijsko delovanje te kisline ocenjevali Lou in sod. (2012) in ugotovili, da je p-kumarna kislina eliminirala sev patogenih bakterij Shigella dysenteriae zaradi povzročitve nepopravljive spremembe v prepustnosti celične membrane in vezave na DNK, s čimer je inhibirala celične funkcije.

Protimikrobni mehanizem p-kumarne kisline deluje na nivoju dvojnih poškodb, s povečanjem membranske prepustnosti bakterij ter vezavo na fosfatni anion DNK in na ta način vpliva na podvajanje, prepisovanje in izražanje DNK bakterije (Pei in sod., 2015).

Flavonoidi so velika skupina polifenolnih spojin, ki v rastlinah predstavljajo največjo skupino sekundarnih metabolitov s številnimi in raznolikimi funkcijami. Nekateri na primer privabljajo opraševalce in vzpodbujajo rast nekaterih mikroorganizmov, drugi odganjajo insekte (Gutiérrez-Lomelí in sod., 2012). Strukturno se delijo v številne skupine, med njimi so antocianidini, flavanoli, flavanoni, flavoni, flavonoli, halkoni in izoflavoni (Lakhanpal in Rai, 2007). V rastlinah so najpogosteje v glikozilirani obliki, kjer sladkorni del predstavljajo glukoza, galaktoza ali ramnoza (Lakhanpal in Rai, 2007). Veliko je poročil o protimikrobnih aktivnostih fenolnih spojin, vključno s flavonoidi, pri katerih aktivnost izhaja iz encimske interakcije, pomanjkanja kovinskih ionov ali motenj mikrobnih membran (Kabir in sod., 2014). Tako je za protibakterijsko funkcijo flavonoidov pomembna njihova interakcija s celično membrano mikroorganizmov, pri čemer lahko, če prehajajo membrano, inhibirajo sintezo DNK, RNK in sorodnih molekul, odvisno od lastnosti ciljnega mikroorganizma (Mori in sod., 1987).

Kvercetin

Kvercetin je naravni flavonoid, najbolj razširjen flavonol v prehrani ljudi (Vipin in sod., 2019). Na splošno je najbolj razširjen flavonoid v naravi, kjer je prisoten predvsem v glikozilirani obliki, kot je kvercitrin ali rutozid. V glikozilirani ali prosti obliki so kvercetin našli v številnih zdravilnih rastlinah, sadju in zelenjavi (Dimitrienko in sod., 2012). V spomladanski resi so potrdili vsebnost kvercetin-3-rutinozida (rutina) v majhnih koncentracijah, a z značilno antioksidativno aktivnostjo (Vučić in sod., 2013). Razen antioksidativne aktivnosti ima kvercetin tudi protivnetne lastnosti, antikarcinogene, protivirusne in protimikrobne lastnosti (Jaisinghani, 2017).

Kvercetin omejuje tudi delovanje adhezijskih molekul na endotelijskih celicah (Lakhanpal in Rai, 2007). Ouyang in sod. (2016) so v svoji raziskavi dokazali tudi protiadhezivni učinek kvercetina pri tvorbi biofilma bakterij Pseudomonas aeruginosa. Kot protibakterijski mehanizem so bile dokazane motnje membrane bakterije in inaktivacija zunajceličnih beljakovin z oblikovanjem nepovratnih kompleksov (Shu in sod., 2011). Razlog za

(15)

protibakterijsko aktivnost pa lahko leži tudi v hidroksilnih skupinah, ki so vezane na aromatski obroč kvercetina. Na podlagi tega so Nitiema in sod. (2012) v študiji zapisali domnevo, da imajo fenolne spojine brez prisotnosti hidroksilnih skupin večjo protibakterijsko aktivnost od tistih, pri katerih so hidroksilne skupine prisotne, saj bi naj to povečalo njihovo afiniteto do mikrobne lipidne membrane. Vipin in sod. (2019) so poročali o tem, da kvercetin zavira celično signalizacijo, tvorbo biofilma in virulentnost bakterij P.

aeruginosa.

Hiperozid

Med flavonoide spada tudi hiperozid, ki ima kot pomembna bioaktivna komponenta protivirusno delovanje ter protivnetni, kardioprotektivni, hepatoprotektivni učinek in zaščitni učinek na sluznico želodca (Wu in sod., 2007). Ker prepreči citotoksičnost, ki jo povzročajo reaktivne oksidativne zvrsti, je znan antioksidant (Park in sod., 2016). Piao in sodelavci (2008) so ugotovili, da hiperozid zmanjšuje koncentracijo znotrajceličnih reaktivnih oksidativnih zvrsti in povečuje antioksidativno encimsko aktivnost, tako da permeira celično membrano ter zavira tvorbo prostih radikalov in širjenje reakcij prostih radikalov s keliranjem prehodnih kovinskih ionov v celicah. Sun in sod. (2017) pa so dokazali šibko protibakterijsko delovanje proti grampozitivnim bakterijam, poleg tega pa ugotovili tudi zaviralni učinek hiperozida na adhezijo celic bakterije P. aeruginosa ter s tem tudi zaviralni učinek tvorbe biofilma.

(+)-Katehin

Ena od fenolnih spojin, ki je prav tako omenjena v študijah družine Ericaceae (Guendouze- Bouchefa in sod., 2015), je katehin ((+)-katehin). Katehin je široko razširjen v rastlinskem svetu, pogosto se nahaja v živilih rastlinskega izvora (Díaz-Gómez in sod., 2014). Avtorji so v svoji študiji z in vitro opazovanji dokazali protibakterijsko aktivnost (+)-katehina z inhibicijo E. coli. (+)-Katehin kaže srednje močni antagonistični učinek proti bakterijam E.

coli in S. aureus (John in sod., 2012). Matsunaga in sod. (2010) menijo, da baktericidno delovanje temelji na mehanizmu reakcije, pri kateri katehini reagirajo z raztopljenim kisikom v bazični raztopini, kar povzroči nastanek aktivnega kisika. Razen protibakterijskih učinkov pa (+)-katehin kaže tudi antioksidativne učinke, ki jih v študiji opisujeta Janeiro in Brett (2004).

2.2.2 Arbutin

Nekatere dele spomladanske rese se uporablja kot sestavino v zeliščnih mešanicah za zdravljenje okužb urogenitalnega trakta, zaradi vsebnosti arbutina – fenolnega glikozida, ki razpade na hidrokinon (farmakološko aktivno sestavino) in glukozo. Več študij kaže, da ima arbutin antioksidativno, protibakterijsko, protiglivno, diuretično in protivnetno aktivnost, tudi Vučić in sod. (2013) sklepajo, da je protibakterijsko delovanje izvlečkov spomladanske rese povezano z vsebnostjo arbutina.

(16)

2.2.3 Terpenoidi

Preiskave so pokazale, da so rastline iz družine Ericaceae bogat vir terpenoidov, vključno s triterpenoidi, meroterpenoidi, diterpenoidi, zlasti grayananskimi diterpenoidi (Li in sod., 2019). Terpenoidi so snovi, ki nastanejo iz izoprena, zato jih imenujemo tudi izoprenoidi (Graßmann, 2005). V naravi v interakcijah z različnimi organizmi delujejo kot fitoaleksini, obrambna sredstva, feromoni ali signalne molekule (Wagner in Elmadfa, 2003).

Terpenoidi imajo tudi močan protibakterijski učinek (Yang in sod., 2020) s širokim spektrom proti grampozitivnim in gramnegativnim patogenim bakterijam. Imajo pomembno vlogo pri interakcijah rastlin z žuželkami, patogeni ter ostalimi rastlinami (Cheng in sod., 2007). Ker so lipofilni, zlahka prodrejo skozi celično steno in celično membrano in tako povzročijo motnje na membrani, uhajanje celične vsebine, denaturacijo citoplazemskih proteinov in inaktivacijo celičnih encimov ter na koncu celično smrt. Terpenoidi z najvišjo biološko aktivnostjo imajo fenolno strukturo (Ludwiczuk in sod., 2017) in imajo boljšo protimikrobno aktivnost kot drugi ogljikovodiki (Guimarães in sod., 2019).

Grajanoidi so značilni sekundarni metaboliti te družine. Večina jih je dobro znana po širokem spektru bioaktivnosti, kot so toksične, analgetične, insekticidne, protitumorne, protivirusne, antinociceptivne, protivnetne ter imunomodulatorne aktivnosti, zaviranje rasti in vpliv na delovanje natrijevih ionskih kanalov. Predvsem so znani po svoji toksičnosti (Li in sod., 2019).

2.2.4 Tradicionalna uporaba in potencialni novi načini uporabe

Rastline iz družine Ericaceae so znane po svojem širokem spektru bioloških aktivnost in se zaradi njihovih učinkovin pripravki uporabljajo kot antioksidanti, diuretiki, protibakterijski ter protivnetni agensi, antirevmatiki. Bolj specifično pa se vrste Erica v tradicionalni medicini uporabljajo za zdravljenje ran in opeklin (Santos in sod., 2018) ali kot tretma za zdravljenje okužbe sečil (Vučić in sod., 2013). Zdravilne lastnosti povezujejo s prisotnostjo fenolnih spojin (Santos in sod., 2018). Na podlagi njihove tradicionalne uporabe in fenolnih sestavin, zlasti flavonoidov, proantocianidinov in fenolnih kislin, so te rastline lahko tudi potencialni vir novih, klinično relevantnih antioksidativnih in/ali protibakterijskih snovi (Guendouze-Bouchefa in sod., 2015). V okviru raziskav novih načinov uporabe že poznanih rastlinskih pripravkov in njihovih učinkovin pa smo želeli preizkusiti protimikrobno in protiadhezijsko delovanje izvlečkov spomladanske rese na nekatere najpomembnejše indikatorske bakterije v živilski mikrobiologiji, patogene bakterije, prenosljive s hrano ali povzročiteljice kvarjenja živil. Pri tem smo testne bakterije izbrali iz skupine grampozitivnih in gramnegativnih bakterij.

(17)

2.3 IZBRANE TESTNE BAKTERIJE 2.3.1 Grampozitivne bakterije

Grampozitivne bakterije imajo debelo, homogeno, večplastno celično steno, sestavljeno predvsem iz peptidoglikana, ki poveča njeno rigidnost, daje bakterijski celici obliko in uravnava osmotski tlak na citoplazemski membrani (Murray in sod., 2002). Razen peptidoglikana so v celični steni tudi polimeri glicerola ali orbitola, fosfatne skupine, kompleksni polisaharidi in teihojske kisline, ki so povezane s samim peptidoglikanom, ali lipoteihojske kisline, ki so povezane z lipidi plazemske membrane.

Staphylococcus aureus

Stafilokoki so grampozitivni nesporogeni, negibljivi koki, so fakultativni anaerobi, ki bolje rastejo v aerobnem okolju. Imajo encim katalazo. V literaturi so največkrat uporabljene testne bakterije za ugotavljanje protimikrobne aktivnosti različnih kemijskih učinkovin.

Listeria innocua

Listerije so grampozitivne bakterije s širokim temperaturnim območjem rasti med 1-45 °C (Ihan in sod., 2020). Z vidika higiene živil prisotnost nepatogenih vrst, kot je L. innocua, kaže na potencialno kontaminacijo z L. monocytogenes (Gasanov in sod., 2005).

2.3.2 Gramnegativne bakterije

Celične stene teh bakterij so strukturno in kemijsko bolj kompleksne (Murray in sod., 2002).

Tanka plast peptidoglikana predstavlja največ 5-10 % teže stene in ne vsebuje teihojskih ali lipoteihojskih kislin. Imajo pa še lipopolisaharidno zunanjo membrano (LPS) s številnimi lastnostmi, med drugim z vlogo dodatne zaščitne pregrade, zaradi katere te bakterije običajno izkazujejo večjo odpornost proti kemijskim učinkovinam.

Escherichia coli

Je največkrat uporabljena indikatorska bakterija v živilski mikrobiologiji, predvsem kot indikator fekalne kontaminacije, običajno pa se uporablja tudi kot gramnegativna bakterija pri testiranju protimikrobne učinkovitosti.

Pseudomonas fragi

Je aerobna bakterija, ki dobro tvori biofilme in je pomemben povzročitelj kvarjenja živil (Hebraud in sod., 1994). Uspeva pri temperaturah hladilnika in spada med psihrotrofne bakterije. Bilo je ugotovljeno, da lahko nizka temperatura celo poveča odpornost bakterij P.

fragi na protimikrobna sredstva, kljub običajnim poročilom o boljši protimikrobni aktivnosti pri nizkih temperaturah (Sterniša in sod., 2020b).

(18)

3 MATERIAL IN METODE

3.1 MATERIAL

3.1.1 Rastlinski material

Zbran rastlinski material (cvetoče vršičke, nabrane na dveh različnih lokacijah v februarju in marcu 2019) smo posušili na zraku v temnem, zračnem prostoru pri sobni temperaturi ter ga po končanem sušenju shranili v zaprtih steklenih kozarcih do nadaljnje analize. Etanolni izvlečki fenolnih spojin so bili pripravljeni na Inštitutu za farmacevtske vede na Oddelku za farmakognozijo Univerze v Gradcu v Avstriji. Dodani etanol so po ekstrakciji odparili z vakuumskim rotacijskim uparjevalnikom. Tako pripravljeni suhi etanolni izvlečki so bili do uporabe shranjeni v hladilniku na temperaturi 4 °C.

Preglednica 1: Vzorci spomladanske rese (E. carnea) z oznakami izvlečkov.

Vzorec Oznaka

Trava_2502 A

Trava_1003 B

G. Brdo_0502 C

G. Brdo_2002 D

Prav tako je bila na istem Oddelku Univerze v Gradcu opravljena kemijska analiza izvlečkov (primer je dodan v Prilogi A).

3.1.2 Delovni mikroorganizmi

Uporabili smo bakterijske seve L. innocua ŽM 39, S. aureus ŽMJ 72, E. coli ŽM 370 in P. fragi ŽM 648, ki so bili trajno shranjeni pri – 80 °C v Zbirki laboratorija za živilsko mikrobiologijo Katedre za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Inkubacija vseh bakterij je potekala pri 37 °C na gojišču TSA, razen P. fragi pri 30 °C na gojišču TSA.

3.1.3 Laboratorijska oprema in naprave

Laboratorijska oprema in pribor, ki smo ga uporabili pri delu, so vključevali plinski gorilnik, vžigalnik, razkužila, rokavice, mikrocentrifugirke, kivete, epruvete, stojalo za epruvete in mikrocentrifugirke, pokrovčke za epruvete, avtomatske pipete, multikanalne pipete, nastavke za pipete, petrijevke, vatirane palčke, mikrotitrske ploščice s 96 luknjicami (MTP), laboratorijske steklenice in plastične posodice. Za določanje protiadhezijske aktivnosti izvlečka smo uporabili še parafilm, sterilno folijo za prekrivanje MTP in ustrezne MTP z

(19)

globjimi vdolbinicami (Nunc, Thermo Scientific). Poleg splošne laboratorijske opreme smo uporabili tudi naprave, kot so spektrofotometer, digestorij, inkubator, stresalnik za mikrotitrske ploščice, hladilnik, zamrzovalnik, vrtinčni mešalnik in ultrazvočno kopel.

3.1.4 Mikrobiološka gojišča

Za analize smo uporabljali tekoče gojišče triptični soja bujon (TSB) in agarsko gojišče triptični soja agar (TSA), ki smo ju pripravili po navodilih proizvajalca, avtoklavirali 15 minut na temperaturi 121 °C in tlaku 1,1 bar. Gojišča smo po sterilizaciji do uporabe hranili na temperaturi hladilnika pri 4 °C.

3.1.5 Raztopine in druge kemikalije

Pri delu smo uporabljali tudi etanol (70 %) za razkuževanje rok in delovne površine, fiziološko raztopino za pripravo inokuluma (FR; 0,9 % NaCl) ter raztopino INT (2 mg/ml), ki smo jo zaradi sposobnosti sprejemanja elektronov iz dehidrogenaze in reduciranja reagenta v rdeče obarvan INT-formazan uporabili kot indikatorsko barvilo za odčitavanje MIK na MTP.

3.1.6 Kemijsko čiste učinkovine

Za določanje protibakterijskega učinka kemijsko čistih učinkovin proti izbranim mikroorganizmom smo uporabili kvercetin, kavno kislino, klorogensko kislino, (+)-katehin in p-kumarno kislino.

3.2 METODE

3.2.1 Priprava inokuluma

Z vatirano palčko smo prenesli kulturo iz petrijevke v epruveto s 4 ml FR in premešali. Iz epruvete smo odpipetirali 1 ml vsebine in jo prenesli v kiveto. S pomočjo spektrofotometra, ki smo ga prej umerili, smo izmerili optično gostoto (OD) pri 600 nm. Redčili ali koncentrirali smo do vrednosti OD_600nm med 0,900 in 0,110, kar za bakterije pomeni približno koncentracijo 10⁷ CFU/ml. Nato smo 50 µl te suspenzije odpipetirali v 4,95 ml bujona (TSB), da bi dobili inokulum s koncentracijo 10⁵ CFU/ml.

3.2.2 Določanje koncentracije celic v inokulumu

Pripravljen inokulum smo redčili po Kochu, redčitve prenesli 3-krat po 10 µl na gojišče TSA in inkubirali 24 ur pri ustreznih temperaturah za izbrane bakterije. Po inkubaciji smo za vsako bakterijsko kulturo prešteli zrasle kolonije in po enačbi (1) izračunali koncentracijo

(20)

celic v inokulumu (CFU/ml), pri čemer smo upoštevali le redčitve s števnimi kolonijami, t.j.

tiste redčitve, kjer je zraslo med 3 in 30 kolonij.

N = ^∑c

(n1+0,1×n2)×R …(1)

c vsota vseh kolonij

n1 število paralelk pri prvi upoštevani razredčitvi n2 število paralelk pri drugi upoštevani razredčitvi R razredčitveni faktor prve števne razredčitve N število bakterijskih kolonij [CFU/ml]

3.2.3 Določanje vrednosti MIK in MBK z mikrodilucijsko metodo

3.2.3.1 Priprava delovnih in založnih raztopin izvlečkov

Suhe etanolne izvlečke smo najprej zatehtali v mikrocenrifugirke in jih raztopili v ustreznem volumnu DMSO, da smo dobili založno raztopino izvlečka. Delovno raztopino smo pripravili z redčenjem založne raztopine. Vedno smo jo najprej pripravili v 2-krat večji koncentraciji (8 mg/ml) od željene najvišje uporabljene koncentracije (4 mg/ml), saj se kasneje v MTP, ob dodatku inokuluma v razmerju 1:1, razredči.

3.2.3.2 Priprava mikrotitrske ploščice

Najprej smo narisali shemo MTP. V luknjice prve vrstice smo odpipetirali 100 µl delovne raztopine izvlečka, medtem ko smo v luknjice ostalih vrstic odpipetirali 50 µl gojišča TSB.

Pri naslednjem koraku smo z multikanalno pipeto prenesli po 50 µl delovne raztopine izvlečka iz prve vrstice v drugo vrstico in premešali. Iz druge vrstice smo, spet z multikanalno pipeto, prenesli 50 µl razredčenega bujona v tretjo vrstico in zopet premešali.

Ta proces smo nadaljevali do zadnje vrstice, iz katere smo z multikanalno pipeto odpipetirali 50 µl razredčenega bujona in ga zavrgli. S tem smo dosegli, da se je koncentracija izvlečka v vsaki vrstici zmanjšala za polovico. V tako pripravljeno MTP smo s pomočjo multikanalne pipete v vse luknjice odpipetirali 50 µl pripravljenega inokuluma.

Za vsako bakterijsko kulturo posebej smo naredili tudi pozitivno in negativno kontrolo. Za pozitivno kontrolo smo odpipetirali 50 µl bujona ter 50 µl inokuluma, za negativno kontrolo pa smo odpipetirali le 100 µl bujona. Pripravljene ploščice smo prenesli na stresalnik mikrotitrskih ploščic za 1 min pri 600 rpm in tako premešane prenesli v inkubator, kjer so se 24 ur inkubirale pri ustreznih temperaturah v aerobni atmosferi. Po inkubaciji smo v vsako polje odpipetirali 20 µl indikatorskega barvila INT in ploščico premešali na stresalniku ter inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi.

(21)

3.2.3.3 MIK in MBK

MIK je najmanjša koncentracija protimikrobnega sredstva, ki preprečuje rast mikrobov.

Vrednosti MIK smo zaradi dodatka indikatorskega barvila INT lahko določili direktno na MTP, tako da smo opazovali, kje pride do spremembe barve. Iz vsakega polja, kjer smo določili MIK, ter vse višje koncentracije izvlečka, smo z avtomatsko pipeto prenesli 10 µl vsebine na trdno gojišče TSA in inkubirali 24 ur pri ustreznih temperaturah. Po inkubaciji smo glede na preživelost bakterij določili še vrednost MBK, t.j. najnižja koncentracija vzorca, pri kateri na trdnem gojišču TSA ni vidne bakterijske rasti.

3.2.4 Protiadhezijska aktivnost izvlečka

3.2.4.1 Priprava delovne raztopine izvlečka

Delovno raztopino izvlečka smo pripravili na podlagi določene vrednosti MIK za bakterijo P. fragi, tako da je koncentracija enaka ¼ vrednosti MIK (0,25 mg/ml). Zato smo najprej založno raztopino redčili z gojiščem TSB, da smo dobili 2-krat večjo koncentracijo od želene, kar smo kasneje razredčili z dodatkom inokuluma v razmerju 1:1 in s tem dobili želeno koncentracijo.

3.2.4.2 Priprava mikrotitrske ploščice

Najprej smo narisali shemo MTP s 96 reakcijskimi mesti. Praktični poskus pa smo izvedli v 6 tehničnih in 2 bioloških ponovitvah. V vsako od 12 luknjic smo odpipetirali 100 µl izvlečka in dodali 100 µl inokuluma P. fragi. Pripravili smo tudi pozitivno kontrolo, tako da smo dodali 100 µl gojišča TBS in 100 µl inokuluma, ter negativno kontrolo z 200 µl gojišča TBS.

Tako pripravljeno MTP smo pokrili s pokrovom in jo na mešalniku stresali 1 min pri 600 obratov/min, nato pa prenesli na inkubacijo 24 ur pri 30 °C.

3.2.4.3 Določanje protiadhezijske aktivnosti izvlečka

Po inkubaciji smo iz luknjic MTP odstranili le planktonske celice in vsako luknjico 3-krat sprali z 200 µl FR. Po tretjem spiranju smo luknjice napolnili z 200 µl FR, prelepili luknjice MTP s sterilno folijo, pokrili s pokrovom in na koncu oblepili še s parafilmom. Tako zaščiteno MTP smo dali v ultrazvočno kopel, kjer je potekala ultrasonifikacija 10 min pri sobni temperaturi.

Pripravili smo si ploščice z globokimi luknjicami, kjer smo izvedli serijske 10-kratne redčitve. Vse luknjice smo najprej napolnili z 900 µl FR, nato smo v prvo vrstico prenesli 100 µl tehnične ponovitve iz MTP in premešali s pomočjo multikanalne pipete. Iz prve vrstice smo nato prenesli 100 µl v naslednjo vrstico in ponovno premešali. To smo

(22)

nadaljevali vse do zadnje vrstice. Iz vsake redčitve smo prenesli 3-krat po 10 µl na plošče s trdnim gojiščem TSA. Te smo na koncu prenesli v inkubator, kjer je inkubacija potekala 24 ur pri 30 °C.

Po inkubaciji smo na ploščah prešteli zrasle kolonije in izračunali koncentracijo celic (CFU/ml) za števne redčitve, t.j. za redčitve, kjer je zraslo med 3 in 30 kolonij. Glede na izračunano koncentracijo celic smo iz povprečnih vrednosti izračunali odstotek zmanjšanja adheriranih celic in s tem protiadhezijsko aktivnost etanolnega izvlečka. Statistično značilnost rezultatov smo preverili v programu SPSS (IBM Corp., Armonk, ZDA) s Student t-testom, kjer je p<0,05 statistično značilen rezultat.

4 REZULTATI

4.1 PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST ETANOLNIH IZVLEČKOV

Rezultati v preglednici 2 kažejo primerljive vrednosti MIK za etanolne izvlečke vseh testiranih vzorcev spomladanske rese. Nizke vrednosti MIK so bile za bakterijo P. fragi pri 1-2 mg/ml in S. aureus pri 1 mg/ml. Za bakteriji L. innocua in E. coli pa je MIK znašala 4 mg/ml, z izjemo vzorca A, kjer je bila MIK več kot 4 mg/ml. Iz rezultatov je razvidno, da so izvlečki spomladanske rese najbolje inhibirali bakteriji S. aureus in P. fragi.

Preglednica 2: Inhibitorna učinkovitost (MIK) etanolnih izvlečkov (mg/ml).

Izvleček MIK (mg/ml)

Staphylococcus

aureus ŽMJ 72 Listeria innocua

ŽM39 Escherichia coli

ŽM 370 Pseudomonas fragi ŽM 648

A 1 >4 4 2

B 1 4 4 1

C 1 4 4 2

D 1 4 4 1

Iz preglednice 3 je razvidno, da so bili rezultati MBK enaki za vse izvlečke, z izjemo vzorca B, kjer je MBK za bakterijo S. aureus znašala 4 mg/ml, za ostale vzorce pa 2 mg/ml.

Največjo MBK rezultati kažejo za bakteriji L. innocua in E. coli, kjer je bila več kot 4 mg/ml.

Za bakterijo P. fragi pa je MBK znašala 4 mg/ml. Iz rezultatov je razvidno, da so izvlečki imeli naboljši baktericidni učinek na bakterijo S. aureus.

Preglednica 3: Baktericidna učinkovitost (MBK) etanolnih izvlečkov (mg/ml).

Izvleček MBK (mg/ml)

Staphylococcus

A 2 >4 >4 4

B 4 >4 >4 4

C 2 >4 >4 4

D 2 >4 >4 4

(23)

MIK smo določali tudi za glavne kemijsko čiste učinkovine, ki so bile s kemijsko analizo ugotovljene v etanolnih izvlečkih spomladanske rese (Priloga A). V preglednici 4 rezultati kažejo MIK, ki je najmanjša v primeru inhibicije bakterij S. aureus in L. innocua s kvercetinom, saj znaša 0,25 mg/ml. Najnižjo MIK za bakterijo E. coli sta imeli protimikrobni učinkovini kvercetin in p-kumarna kislina, 1 mg/ml, ki sta kazali najnižjo MIK tudi v primeru inhibicije P. fragi, 0,5 mg/ml. Najslabši inhibitorni učinek je kazala klorogenska kislina, ki je v primeru vseh bakterij imela največjo MIK, medtem ko je najboljši inhibitorni učinek pokazal kvercetin, ki je imel za vse bakterije najnižjo MIK.

Preglednica 4: Inhibitorna učinkovitost (MIK) kemijsko čistih učinkovin (mg/ml).

Čista učinkovina MIK (mg/ml)

Staphylococcus

Kvercetin 0,25 0,25 1 0,5

Kavna kislina 2 4 2 1

(+)-katehin 2 2 4 1

Klorogenska kislina 2 4 4 4

p-kumarna kislina 1 1 1 0,5

Rezultati v preglednici 5 kažejo minimalno koncentracijo učinkovin, ki je v 99,9 % uničila bakterije. Iz rezultatov je razvidno, da je kvercetin, tako kot pri merjenju MIK, imel pri bakterijah S. aureus in L. innocua najmanjšo MBK, v obeh primerih 1 mg/ml. Med rezultati izstopa še p-kumarna kislina, z MBK za bakterije S. aureus, L. innocua in P. fragi 2 mg/ml.

Prav tako je MBK (+)-katehina za P. fragi znašala 2 mg/ml. Največjo MBK so imele učinkovine za E. coli, ki je v vseh primerih znašala 4 mg/ml ali več. Najslabšo zmožnost uničenja bakterij je glede na rezultate imela klorogenska kislina, saj je v primeru vseh bakterij MBK klorogenske kisline znašala več kot 4 mg/ml.

Preglednica 5: Baktericidna učinkovitost (MBK) kemijsko čistih učinkovin (mg/ml).

Čista učinkovina MBK (mg/ml)

Staphylococcus

Kvercetin 1 1 >4 4

Kavna kislina 4 >4 4 4

(+)-katehin >4 >4 >4 2

Klorogenska kislina >4 >4 >4 >4

p-kumarna kislina 2 2 >4 2

4.3. PROTIADHEZIJSKA AKTIVNOST

Z dodatkom izvlečka s koncentracijo ¼ vrednosti MIK se je adhezija bakteriji P. fragi na polistirensko površino glede na povprečne vrednosti adheriranih celic zmanjšala za 52,5 %.

(24)

Tretiranje bakterije P. fragi z ¼ MIK spomladanske rese je statistično značilno (p < 0,001) zmanjšalo število adheriranih celic, kar je razvidno iz preglednice 6.

Preglednica 6: Protiadhezijska aktivnost etanolnega izvlečka spomladanske rese proti bakteriji P. fragi.

Tretiranje Pseudomonas fragi

Število adheriranih celic (CFU/ml)

Kontrola 6,39 ± 2,32

¼ MIK spomladanske rese 3,36 ± 2,26

5 RAZPRAVA

Vrste rodu Erica, iz družine Ericaceae, vsebujejo številne bioaktivne spojine, kot so flavonoidi, antocianini, kumarini in triterpenske spojine (Vučić in sod., 2013). Zato je bil namen te naloge pregledati in analizirati potencialne protimikrobne učinkovine etanolnih izvlečkov spomladanske rese s ciljem določiti njihovo MIK in MBK proti grampozitivnim bakterijam S. aureus in L. innocua ter gramnegativnim bakterijam E. coli in P. fragi.

Dodatno pa smo želeli določiti protiadhezijsko aktivnost etanolnih izvlečkov spomladanske rese proti bakteriji P. fragi.

5.1 PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST ETANOLNIH IZVLEČKOV

V eksperimentalnem delu smo določali protibakterijsko učinkovitost etanolnih izvlečkov spomladanske rese, ki smo jih uporabili za določitev MIK in MBK za izbrane seve grampozitivnih in gramnegativnih bakterij. Najboljši inhibitorni in baktericidni učinek so imeli vzorci etanolnih izvlečkov proti bakteriji S. aureus. Podobne vrednosti MIK so vzorci kazali tudi proti bakteriji P. fragi, kar pa je v nasprotju z rezultati, ki so jih v svoji študiji predstavili Santos in sod. (2018). Opazili so protimikrobno aktivnost izključno proti grampozitivnim bakterijam, kar so pripisali razlikam v strukturi celične stene med grampozitivnimi in gramnegativnimi bakterijami. Slednje so znane po večji odpornosti, ki je povezana s kompleksnejšo strukturo celične ovojnice oz. dodatno lipopolisaharidno plastjo gramnegativnih bakterij (Guendouze-Bouchefa in sod., 2015).

Nizke vrednosti MIK, ki smo jih dobili v primeru delovanja etanolnih izvlečkov na P. fragi v primerjavi z učinkovitostjo, ugotovljeno proti drugim testnim bakterijam, lahko glede na študijo, ki so jo zapisali Sterniša in sod. (2020a), povežemo z zmožnostmi bakterij rodu Pseudomonas, da proizvajajo encime, ki imajo potencial za deglikoliziranje fenolnih spojin in s tem sproščanje fenolnih spojin z boljšim protimikrobnim učinkom. Znano je, da glikolizacija zmanjša protibakterijsko delovanje (Sterniša in sod., 2020a). Skladno s to teorijo so tudi eksperimentalni podatki o vsebnosti čistih spojin v etanolnih izvlečkih, kar kaže analiza LC-PDA-ESI-MS, ki je pokazala nizko vsebnost kavne kisline in katehina, ki sicer imata dober učinek proti bakterijam Pseudomonas.

(25)

Določili smo tudi MIK in MBK nekaterih kemijsko čistih učinkovin, ki so bile v etanolnih izvlečkih ugotovljene z analizo LC-PDA-ESI-MS. To smo uporabili za primerjalno analizo protimikrobne aktivnosti izvlečkov in njihovih fenolnih sestavin, ker je analiza LC-PDA- ESI/MS v literaturi opisana kot analitski pristop, ki omogoča identifikacijo fenolnih spojin v etanolnih izvlečkih rastlinskih pripravkov, kot so bili analizirani izvlečki spomladanske rese (Lin in Harnly, 2012).

Jaisinghani (2017) je v svoji študiji opisal protibakterijske lastnosti kvercetina. Te smo v eksperimentalnem delu tudi potrdili, saj je kvercetin izmed vseh opazovanih kemijsko čistih učinkovin, ki so bile prisotne v analiziranih izvlečkih spomladanske rese, pokazal najboljšo inhibitorno in baktericidno učinkovitost. Predvsem se je izkazal kot učinkovit inhibitor rasti bakterij S. aureus in L. innocua z vrednostjo MIK, ki je znašala 0,25 mg/ml. Prav tako je bila najnižja tudi MBK (1 mg/ml) za omenjeni bakteriji. Primerljive rezultate so za delovanje kvercetina proti S. aureus dobili tudi Júnior in sod. (2018), ki so v eksperimentalnem delu svoje študije dobili vrednosti MIK od 0,25 do 1 mg/ml. Mehanizem protibakterijskega delovanja kvercetina je verjetno povezan z motnjami funkcionalnosti membrane in inaktivacije zunajceličnih beljakovin z oblikovanjem ireverzibilnih kompleksov (Shu in sod., 2011).

(+)-katehin je glede na zbrane rezultate najbolje inhibiral gramnegativno bakterijo P. fragi z vrednostjo MIK 1 mg/ml. Poleg inhibicijskega ima (+)-katehin tudi najboljši baktericidni učinek proti P. fragi (MBK - 1 mg/ml). Najslabšo inhibitorno funkcijo je (+)-katehin imel v primeru bakterije E. coli, saj je bila vrednost MIK 4 mg/ml. In vitro opazovanja, ki so jih opravili Díaz-Gómez in sod. (2014), kažejo, da katehini sicer inhibitorno učinkujejo na E. coli, vendar so učinki neposredno odvisni od odmerka polifenola, vrste polifenola in časa izpostavljenosti. V nasprotju z našimi rezultati, Kajiya in sod. (2004) v svoji študiji niso zaznali aktivnosti proti gramnegativnim bakterijam, kar so pripisali membranskim strukturam, ki so značilne za gramnegativne bakterije. Protibakterijsko delovanje je tako domnevno povezano z afiniteto (+)-katehina in njegovih derivatov do lipidnega dvosloja ter z motnjami delovanja membrane in na podlagi tega domnevamo, da je mehanizem protibakterijskega delovanja adsorbcija fenolnih spojin na membransko površino bakterij in s tem poslabšanje funkcionalnosti le-teh (Kajiya in sod., 2004).

Kavna kislina lahko zavira rast bakterij, vključno z E. coli in S. aureus (Magnani in sod., 2014), glede na rezultate zbrane v preglednici 4 pa vidimo, da inhibira tudi seve bakterij L. innocua in P. fragi. V primeru seva S. aureus, uporabljenega v eksperimentalnem delu, je MIK kavne kisline 2 mg/ml, medtem ko so Kępa in sod. (2018), ki so prav tako določili protibakterijsko delovanje kavne kisline proti njihovem sevu bakterije S. aureus, poročali o nekoliko nižjih vrednostih MIK (0,512 mg/ml - 1,024 mg/ml). Podobne vrednosti MIK

(26)

(0,625 mg/ml - >1,024 mg/ml) so določili tudi Khan in sod. (2021), ki so iz različnih virov zbrali podatke o vrednosti MIK in protibakterijsko delovanje kavne kisline proti S. aureus pripisali poškodbi celične membrane, povečani permeabilnosti celične membrane, prekomernemu zakisanju celice in inhibiciji encima RNK polimeraze. Protimikrobno aktivnost kavne kisline so opisali tudi za bakterije rodu Pseudomonas (Almeida in sod., 2006), kar smo potrdili tudi z našimi ugotovitvami, saj smo v primeru bakterije P. fragi dobili najnižjo vrednost MIK (1 mg/ml). Zaradi prisotnosti visoke stopnje hidroksilacije pa ima kavna kislina zmanjšano sposobnost zaviranja listerije v primerjavi z drugimi derivati hidroksicimetne kisline (Magnani in sod., 2014), kar sovpada tudi z našimi rezultati, ki kažejo boljšo inhibitorno aktivnost p-kumarne kisline na sev L. innocua.

Pei in sod. (2015) so v svoji študiji primerjali podatke o protimikrobnem delovanju p- kumarne kisline iz različnih študij in prišli do zaključka, da prosta p-kumarna kislina ni močno protimikrobno sredstvo. V našem primeru je glede na rezultate v preglednicah 4 in 5 imela p-kumarna kislina v primerjavi z ostalimi kemijsko čistimi učinkovinami relativno dobro inhibitorno in baktericidno aktivnost na izbrane bakterije. Imela je boljšo inhibitorno aktivnost proti gramnegativnim bakterijam, predvsem v primeru vrednosti MIK za bakterijo P. fragi, ki je znašala 0,5 mg/ml. Protibakterijski mehanizem površinsko negativno nabite p- kumarne kisline so Lou in sod. (2012) opisali kot sposobnost vezave le-te na zunanjo membrano gramnegativne bakterije z elektrostatičnimi interakcijami in keliranjem magnezijevih kationov, kar moti zunanjo membrano in posledično vodi v izgubo njene funkcije selektivne prepustnosti hranil.

Več študij (Li in sod., 2014; Lou in sod., 2011) poroča o protimikrobnem mehanizmu klorogenske kisline, ki deluje na podlagi spremembe prepustnosti celične membrane bakterij in posledičnega sproščanja sestavin citoplazme ter izgubo membranskega potenciala. V eksperimentalnem delu je klorogenska kislina pokazala slabe inhibitorne in baktericidne učinke za vse izbrane seve (MIK 2 - 4 mg/ml). Do podobnih vrednosti so v svoji študiji prišli Li in sod. (2014), kjer so rezultati MIK klorogenske kisline na pet od osmih sevov bakterije S. aureus znašali 2,5 mg/ml.

5.3 PROTIADHEZIJSKA AKTIVNOST

Wang in sod. (2021) so v svoji študiji označili bakterije Pseudomonas spp. kot hitre proizvajalce debelega biofilma. Ker smo že pri določanju vrednosti MIK in MBK pričakovali zanimive rezultate za gramnegativne bakterije P. fragi, in ker bakterije iz rodu Pseudomonas predstavljajo problem v živilski industriji, saj zaradi adhezije na površino in tvorbe biofilma lahko preživijo tudi v težkih pogojih (Sterniša in sod., 2019), smo za omenjen sev določili tudi protiadhezivno aktivnost etanolnega izvlečka spomladanske rese.

Z dodatkom etanolnega izvlečka smo zmanjšali sposobnost adhezije P. fragi na polistirensko podlago za povprečno 52,5 %. O protiadhezijskem potencialu sekundarnih metabolitov

(27)

rastlin in njihovem potencialu za zmanjšanje števila kvarljivih bakterij, kot je Pseudomonas so v študiji pisali tudi Sterniša in sod. (2018). Za oprijem na površine so pomembne lastnosti bakterijskih celic in okoljski pogoji (Sterniša in sod., 2019) zlasti lastnosti kontaktne površine, hidrofobnost celične površine (CSH) in sposobnost gibljivosti bakterij (Rossi in sod., 2018). Nastajanje biofilma bakterij Pseudomonas je mogoče regulirati z mehanizmom zaznavanja kvoruma (QS) (Wang in sod., 2021). QS ima pomembno vlogo v različnih fazah tvorbe biofilma v bakterijah, tako se lahko za preprečevanje kvarjenja hrane in tvorbe biofilma zaradi bakterij, povezanih s hrano, uporabijo inhibitorji zaznavanja kvoruma, ki lahko bodisi ciljajo na sintezo celičnih signalnih molekul ali blokirajo te signalne sisteme (Bai in Vittal, 2014). Upoštevati moramo tudi, da ima večina patogenov gene, ki kodirajo več kot eno vrsto adhezina, prav tako pa lahko adhezija vključuje tudi druge dejavnike kot le interakcije adhezinskih receptorjev, kot so hidrofobne in druge nespecifične interakcije pod različnimi strižnimi silami (Ofek in sod., 2003).

6 SKLEPI

V hipotezi H1 smo predpostavili, da bodo vrednosti MIK in MBK odvisne od tarčne bakterije in kemijske sestave izvlečkov, kar smo v eksperimentalnem delu tudi potrdili.

Etanolni izvlečki in nekatere kemijsko čiste učinkovine kažejo relativno nizke vrednosti MIK in MBK za gramnegativno bakterijo P. fragi v primerjavi z ostalimi testiranimi bakterijami. S tem smo potrdili hipotezo H2.

Etanolni izvleček spomladanske rese je v koncentraciji ¼ MIK za povprečno 52,5 % statistično značilno zmanjšal adhezijo bakterije P. fragi na polistiren, s čimer smo potrdili hipotezo H3.

(28)

7 POVZETEK

Spomladanska resa (Erica carnea) je v tradicionalni medicini dobro poznana rastlina, ki ji zdravilne lastnosti pripisujejo zaradi številnih fenolnih spojin v njenih pripravkih. V diplomski nalogi smo analizirali protimikrobno učinkovitost etanolnih izvlečkov spomladanske rese in nekaterih kemijsko čistih učinkovin, ki jih ti izvlečki vsebujejo, proti izbranim grampozitivnim in gramnegativnim bakterijam. Cilj je bil določiti in primerjalno analizirati rezultate MIK in MBK etanolnih izvlečkov in kemijsko čistih učinkovin s primerljivimi študijami ter določiti protiadhezijsko aktivnost etanolnih izvlečkov proti bakteriji P. fragi.

Vsi analizirani vzorci izvlečkov spomladanske rese so pokazali najboljšo inhibitorno in baktericidno aktivnost proti grampozitivni bakteriji S. aureus. To lahko pripišemo odsotnosti zunanje membrane grampozitivnih bakterij, ki jo imajo gramnegativne bakterije. Kljub temu pa smo ugotovili relativno nizke vrednosti MIK za gramnegativno bakterijo P. fragi, za kar je lahko odgovorna bakterijska proizvodnja encimov s sposobnostjo deglikozilacije fenolnih spojin in s tem povečanja njihovega protimikrobnega učinka proti tem bakterijam.

Protibakterijsko aktivnost pripravkov spomladanske rese pripisujemo fenolnim spojinam, ki jih vsebujejo. Med kemijsko čistimi učinkovinami, uporabljenimi v eksperimentalnem delu, je izstopal kvercetin z najmanjšimi vrednostmi MIK za vse testne bakterije (od 0,25 mg/ml do 1 mg/ml).

Relativno dober protibakterijski učinek etanolnih izvlečkov na bakterijo P. fragi smo uporabili kot izhodišče za določanje protiadhezijske aktivnosti izvlečka spomladanske rese na to bakterijo. V koncentraciji 0,25 mg/ml je ta pripravek statistično značilno zmanjšal adhezijo bakterij P. fragi na polistirensko površino, v povprečju za 52,5 %. Rezultati so dobro izhodišče za nadaljnje študije protimikrobnega učinka in protiadhezijske aktivnosti fenolnih spojin na bakterijo P. fragi.