AERUGINOSA PA01

PEDAGOŠKA FAKULTETA

MELISA TRŠAN

IZBRIS GENA ZA EGEROLIZIN V BAKTERIJSKEM SEVU PSEUDOMONAS

AERUGINOSA PA01

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2016

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA

DVOPREDMETNI UČITELJ: BIOLOGIJA, GOSPODINJSTVO

MELISA TRŠAN

Mentor: doc. dr. Matej BUTALA

IZBRIS GENA ZA EGEROLIZIN V BAKTERIJSKEM SEVU PSEUDOMONAS AERUGINOSA PA01

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2016

Zahvaljujem se svojim staršem, ki so mi omogočili študij in me pri tem spodbujali. Velika zahvala gre mojemu možu Anžetu za vso podporo, pomoč, pomirjujoče besede in nasvete tekom vseh študijskih let. Prav tako se zahvaljujem svoji hčerki Kiari, ki mi je s prespanimi nočmi in veselimi, razigranimi dnevi pomagala, da sem diplomsko delo lahko dokončala. Na koncu bi se zahvalila še kolegicam iz fakultete, ki so mi stale ob strani in mi pomagale v vseh naših skupnih letih.

Zahvaljujem se seveda tudi mentorju doc. dr. Mateju Butali za namenjeni čas in pomoč pri izvedbi diplomske naloge.

V diplomskem delu predstavim proteine iz družine egerolizinov in se osredotočim na protein RahU bakterije Pseudomonas aeruginosa. Bakterija P. aeruginosa je oportunistični patogen, ki izkorišča šibkost gostiteljevega imunskega sistema in povzroča številne okužbe. Predstavim pomen produkta gena pri obrambi bakterije.

Osredotočim se na pripravo delecijske mutante bakterije P. aeruginosa. Deletirala sem gen rahU v genomu bakterije P. aeruginosa, tako da je v mutanti zamenjan z genom za odpornost proti antibiotiku kanamicinu. Zamenjavo genov sem izvedla s homologno rekombinacijo z rekombinaznim sistemom Lambda Red. Namen uporabe omenjenega molekularnega orodja je uspešna pridobitev delecijske mutante, ki nam v nadaljnjih analizah služi za prepoznavo funkcije proučevanega proteina z neznano funkcijo, naprimer proteina RahU.

KLJUČNE BESEDE: egerolizini, proteini RahU, Pseudomonas aeruginosa, oportunistični patogen, kanamicinska kaseta, delecija, homologna rekombinacija.

The dissertation discusses the proteins from the aegerolysin family, specifically the RahU protein of the opportunistic pathogen bacteria, Pseudomonas aeruginosa. The biology of P.

aeruginosa, which exploits its host’s weak immune system to cause numerous infections, is described.

The main focus of the dissertation was the preparation of the deletion mutants. The rahU gene was deleted from the P. aeruginosa genome by replacing it with the kanymicin cassette. The gene replacement was carried out by using the Lambda Red recombinase system.

The purpose of this molecular tool was to gain the rahU deletion mutants, which enable us to obtain new insights into the biology of the RahU protein.

KEY WORDS: aegerolysins, Pseudomonas aeruginosa, proteins RahU, opportunistic pathogen, kanamycin cassette, deletion, homologous recombination.

1. UVOD...1

2. TEORETIČNE OSNOVE...3

2.1 BAKTERIJA PSEUDOMONAS AERUGINOSA ...3

2.2 DRUŽINA EGEROLIZINOV ...5

2.2.1 STRUKTURA IN FUNKCIJA EGEROLIZINOV ...5

2.2.2 PROTEIN RahU (UniProt številka PA0122), EGEROLIZIN BAKTERIJE P. AERUGINOSA...6

2.3 UPORABA DELECIJSKIH MUTANT...8

2.4 HOMOLOGNA REKOMBINACIJA...8

2.5 TRANSFORMACIJA...9

2.6 ELEKTROPORACIJA ...9

2.7 REKOMBINAZNI SISTEM LAMBDA RED ...10

2.8 DELECIJA GENA rahU V BAKTERIJI P. AERUGINOSA...11

3. MATERIALI IN METODE...12

3.1 MATERIALI ...12

3.1.1 BAKTERIJSKI SEV ...12

3.1.2 ZAČETNI OLIGONUKLEOTIDI ...12

3.1.3 PLAZMID pUCP18-RedS...12

3.1.4 KANAMICINSKA KASETA ...13

3.1.5 BAKTERIJSKA GOJIŠČA, UPORABLJENA V ŠTUDIJI...14

3.1.6 RAZTOPINE, UPORABLJENE PRI DELU ...14

3.2 METODE...15

3.2.1 PRIPRAVA KOMPETENTNIH CELIC BAKTERIJE P. AERUGINOSA...15

3.2.2 TRANSFORMACIJA KOMPETENTNIH CELIC P. AERUGINOSA...15

3.2.3 RAST TRANSFORMANT IN PRIPRAVA ELEKTROKOMPETENTNIH CELIC ...15

3.2.4 ELEKTROPORACIJA...16

3.2.5 POLIMERAZNA VERIŽNA REAKCIJA ZA PREVERJANJE DELECIJE GENA rahU16 3.2.6 AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA ...17

3.2.7 SHRANITEV CELIC ...17

4. REZULTATI...18

4.1 USPEŠNOST TRANSFORMACIJE ...18

4.2 RAST TRANSFORMANTE P. AERUGINOSA PA01 ...19

4.3 PREVERJANJE USPEŠNOSTI ELEKTROPORACIJE IN REKOMBINACIJE ...20

4.4 PREVERJANJE USPEŠNOSTI DELECIJE GENA rahU S PCR NA KOLONIJAH MUTANT...21

5. ZAKLJUČEK IN SKLEPI ...24

6. VIRI IN LITERATURA ...25

Slika 2: Elektronski mikroskopski posnetek biofilma bakterije P. aeruginosa (MEIAF, University of California) 4 Slika 3: Tridimenzionalna struktura egerolizina RahU (Miklavič, 2015) ... 6 Slika 4: Priprava PCR-produkta v enem (B) in treh korakih (A), uporabnega za editiranje bakterijskih genomov (Lesic in Rahme, 2008)... 11 Slika 5: Shematska mapa plazmida pUCP18-RedS... 13 Slika 6: Bakterijske kolonije seva P. aeruginosa PA01, rasle na ploščah LB s karbenicilinom, brez vstavljenega plazmida (K)... 18 Slika 7: Prekonočna kultura bakterije P. aeruginosa PA01 s pUCP18-RedS ... 19 Slika 8: Elektroporirane celice P. aeruginosa PA01 na kanamicinskih ploščah, razmazane do posameznih kolonij... 21 Slika 9: Analiza pomnožitve kanamicinske kasete iz genomov mutant P. aeruginosa PA01. L+1 - velikostna lestvica v baznih parih in linija 1, linije 1-4 so pomnožki, pridobljeni s paroma začetnih oligonukleotidov p11 + p8 na mutantah 1-4, linije 4-8 pa pomnožki iz mutant 1-4, pridobljeni z začetnimi oligonukleotidi p11 + p50... 22

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Začetni oligonukleotidi, uporabljeni v študiji... 12

1. UVOD

Bakterija Pseudomonas aeruginosa je prostoživeča bakterija. Poseljuje številne habitate, najdemo jo na ljudeh, živalih, v vodi in zemlji. Je po Gramu negativen, aeroben mikroorganizem, ki je odporen na številne za bakterijo neugodne fizikalne pogoje. Sposoben je preživeti in rasti že ob minimalnih hranilih v okolju. Bakterija je oportunistični patogen, ki izkorišča oslabljenost gostiteljevega imunskega sistema, tako da povzroči okužbe (Todar, 2012). Danes je mikrob postal eden izmed glavnih razlogov za bolnišnične okužbe po vsem svetu (de Bentzmann in Plesiat, 2011).

Leta 2008 so v bakteriji P. aeruginosa odkrili in identificirali produkt gena rahU, ki ga uvrščamo v družino egerolizinov (Rao idr., 2008). Egerolizini so družina visoko homolognih proteinov, ki so kisli, majhni, veliki okoli 15 kDa in grajeni predvsem iz β-ploskev.

Homologe teh proteinov najdemo tako med rastlinskimi in glivnimi vrstami kot tudi med bakterijami. Kljub veliki zastopanosti med organizmi pa je vloga egerolizinov v organizmih slabo poznana (Berne, Lah in Sepčić, 2009). Protein RahU izkazuje pomembno vlogo pri vnetjih in interakcijah med bakterijo P. aeruginosa in gostiteljem. Je eden izmed možnih kandidatov za protimikrobno tarčo in kot biomarker, predvsem v povezavi z bolniki z boleznimi pljuč (Rao idr., 2011).

Ključna raziskovalna težava je nepoznavanje biološke vloge egerolizinov, specifično proteina RahU. V diplomski nalogi bom predstavila postopek delecije gena rahU iz bakterije P.

aeruginosa. Način, kako raziskati funkcijo produkta določenega gena, je, da ga odstranimo iz genoma bakterije in opazujemo njegov vpliv na producirajoči organizem. Morfološke/

fiziološke lastnosti bakterij, ki nosijo zapis za gen rahU, primerjamo s tistimi, ki zapisa nimajo.

V diplomskem delu bom opisala teorijo homologne rekombinacije, ki nam omogoči delecijo genov v bakterijah in temelji na rekombinaznem sistemu Lambda Red (Datsenko in Wanner, 2000).

V svoji diplomski nalogi sem si zastavila naslednje cilje:

- s pregledom literature predstaviti protein RahU iz družine egerolizinov in opisati lastnosti bakterije P. aeruginosa,

- s homologno rekombinacijo pripraviti derivat bakterijskega seva P. aeruginosa z izbrisanim genom za egerolizin,

- preveriti uspešnost delecije in vstavitve kanamicinske kasete na ustrezno mesto v genomu bakterije,

- shraniti delecijske mutante za nadaljnje analize in teste.

Diplomska naloga bo temeljila na hipotezah:

- v genomu bakterije P. aeruginosa lahko gen za egerolizin RahU zamenjamo s kanamicinsko kaseto,

- bakterija z izbrisanim genom rahU bo usabilna.

2. TEORETIČNE OSNOVE

2.1 BAKTERIJA PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Deblo: Proteobacteria

Razred: Gammaproteobacteria Red: Pseudomonadales

Družina: Pseudomomadaceae Rod: Pseudomonas

Vrsta: P. aeruginosa

Slika 1: Bakterija Pseudomonas aeruginosa, posnetek z elektronskim

mikroskopom (Potera, 2012)

Bakterija P. aeruginosa je po Gramu negativna, fakultativno anaerobna, prostoživeča bakterija, ki jo izoliramo iz številnih habitatov. Za rast preferira vlažno okolje. Z vrstami iz rodu Pseudomonas se pogosto srečujejo rastlinski mikrobiologi, saj so bakterijske vrste tega rodu pogosti povzročitelj bolezni rastlin. Bakterija je široka od 0,5 do 0,8 µm in dolga od 1,5 do 3,0 µm in ima polarni flagel za gibanje. Bakterija lahko preživi tudi ob pomanjkanju kisika, če je na voljo nitrat ali nitrit kot akceptor elektronov (Todar, 2012). Bakterija P.

aeruginosa izloča številne v vodi topne pigmente, ki so lahko v pomoč pri njeni identifikaciji.

Piocianin (modrozeleni pigment) in pioverdin (rumenozeleni pigment) sta odgovorna za značilno svetlo zeleno barvo kolonij. Izloča pa tudi rdeč pigment piorubin (Fojkar, 2014).

Bakterija je v naravi lahko v obliki biofilma pritrjena na površino ali substrat, lahko pa jo najdemo v planktonski obliki kot enocelični organizem (Todar, 2012). Biofilm je navadno večcelična heterogena združba bakterij, ki je ovita z zunajceličnim matriksom, ki nastaja na različnih biotskih in abiotskih površinah (Flemming in Wingender, 2010). Na sliki 2 je mikroskopski posnetek bakterije, rasle v obliki biofilma, gojene na poliestrski membrani in prekrite z bogatim gojiščem LB, ki mu je dodan agar. Bakterija P. aeruginosa je ena izmed zelo hitro plavajočih bakterij. Najpreprostejši medij za rast te bakterije lahko v laboratoriju sestavimo iz acetata, ki je vir ogljika in amonijevega sulfata, ki predstavlja vir dušika.

Optimalna temperatura za rast te bakterije je 37 °C, preživi pa tudi temperature do 42 °C.

Bakterija je odporna na različne fizikalne pogoje, kot so na primer visoka koncentracija soli in barvil ali šibki antiseptiki. Pogosto so sevi te bakterije odporni proti številnim klinično uporabljanim antibiotikom. Mikroorganizem je oportunistični patogen, ki se pojavlja pri ranljivih, imunokomprimiranih bolnikih, kot so na primer bolniki s cistično fibrozo, pri bolnikih, hospitaliziranih na oddelkih za intenzivno nego, pri bolnikih s hujšimi oblikami opeklin, pri osebah, zdravljenih zaradi raka, ter bolnikih, okuženih z AIDS-om, ki prejemajo imunosupresive (Todar, 2012).

Slika 2: Elektronski mikroskopski posnetek biofilma bakterije P. aeruginosa (MEIAF, University of California)

Zaradi zgoraj opisanih lastnosti so sevi bakterije P. aeruginosa eni od glavnih razlogov za bolnišnične okužbe po vsem svetu. Ti sevi so odgovorni za kar 10 odstotkov vseh okužb v bolnišnicah Evropske unije (de Bentzmann, 2011). Povzročajo okužbe sečil, dihal, kosti in sklepov, želodčno-črevesne okužbe, različne sistemske okužbe in dermatitise (Todar, 2012).

Predoziranje in napačna uporaba antibiotikov sta vodila v večjo odpornost določenih sevov P.

aeruginosa, proti katerim obstaja le malo možnih terapevtskih rešitev (de Bentzmann, 2011).

Zdravljenje okužb je zaradi povečane odpornosti močno oteženo, dolgotrajnejše in dražje (Fojkar, 2014), poleg tega pa je še dodatno oteženo zaradi zmožnosti bakterije, da tvori biofilm.

Molekularni mehanizmi interakcije bakterije P. aeruginosa z gostiteljem še niso povsem pojasnjeni kljub visokemu napredku znanosti v zadnjih desetletjih na področju biologije te

bakterije. Zaradi edinstvenih fizioloških, genetskih in patogenih značilnosti je P. aeruginosa postal bakterijski model za številne raziskave. Zaradi porasta razvoja odpornosti proti antibiotikom med sevi in povzročanja težko ozdravljivih okužb znanstveniki poudarjajo, da je treba iznajti nove načine zdravljenja ob okužbi s to bakterijo (de Bentzmann, 2011).

2.2 DRUŽINA EGEROLIZINOV

Egerolizini so družina homologov, ki so jih do zdaj našli pri glivah, rastlinah, virusih in bakterijah. Kljub veliki razširjenosti teh proteinov pa je vloga egerolizinov za organizme slabo poznana. Leta 2002 je bila prvič definirana družina egerolizinskih proteinov (PF06355;

IPR 009413), katerih nekaj predstavnikov je bilo izoliranih. Družino sestavljajo proteini z molekulsko maso ~ 15-20 kDa (Berne idr., 2009).

Proteinska družina je poimenovana po egerolizinu iz gobe Agrocybe aegerita, ki je kodiran na genu aa-PriA1 (Novak, Kraševec, Skočaj, Maček, Anderluh in Sepčić, 2014). Prvi izoliran in sekvenciran protein z egerolizinsko domeno je Asp-hemolizin, kardiotoksična komponenta patogene glive Aspergillus fumigatus. Ta oportunistični patogen povzroča širok spekter resnih bolezni, vključno z invazivno aspergilozo, njegova patogeneza pa je posledica toksičnih substanc, ki delujejo na celice. Razvoj genomike je omogočil odkritje podobnih proteinov tudi iz organizmov (Berne idr., 2009).

2.2.1 STRUKTURA IN FUNKCIJA EGEROLIZINOV

V podatkovni bazi Pfam (Pfam06355, egerolizinska naddružina cl05705) je trenutno 43 članov s proteinsko domeno egerolizina iz 21 različnih vrst. Proteini iz družine egerolizinov si delijo številne skupne lastnosti. Bioinformatske analize in predikcije za egerolizine nakazujejo večinsko sekundarno strukturo β-ploskve in 10-odstotnega α-heliksa, kar potrjuje tudi spektroskopska analiza cirkularnega dikroizma teh proteinov. Domena egerolizina je bogata z aromatskimi aminokislinskimi ostanki. Druga lastnost te domene je ohranjanje cisteinskih in določenih triptofanskih ostankov, kar nakazuje na njihovo morebitno strukturno in/ali funkcionalno vlogo. Vsi egerolizini imajo zelo nizke izoelektrične točke okoli 4.5, podobne molekulske mase in so toplotno labilni, izkazujejo pa stabilnost v širokem obsegu pH (Berne idr., 2009).

Biološka vloga egerolizinov je le delno raziskana. Poročali so o njihovih hemolitičnih, protitumorskih, antiproliferativnih in virulenčnih lastnostih, domnevali pa so tudi, da

sodelujejo pri razvoju plodnih teles. Rezultati eksperimentov nakazujejo na to, da imajo egerolizini pomembno vlogo v rastnem ciklu organizma, ki jih sintetizira. Nekateri glivni egerolizini tvorijo pore v bioloških membranah ob tvorbi proteinskih kompleksov iz dveh enot. Drugi, kot je Asp-hemolizin iz plesni Aspergillus fumigatus, pa tvorijo vezavo z vnetnimi fosfolipidi. Protein Asp-hemolizin povzroča invazivno aspergilozo, ki se pogosto pojavi pri posameznikih z oslabljenim imunskim sistemom (Berne idr., 2009).

Živalski modeli so pokazali zaščitno vlogo protiteles IgG anti-Asp-hemolizin pri miših, pred okužbo nastalih s sporami glive. Uporaba anti-Asp-hemolizina bi lahko postala ena izmed strategij za zaščito bolnikov z oslabljenim imunskim sistemom pred okužbami z glivo A.

fumigatus (Berne idr., 2009).

2.2.2 PROTEIN RahU (UniProt številka PA0122), EGEROLIZIN BAKTERIJE P.

AERUGINOSA

Slika 3: Tridimenzionalna struktura egerolizina RahU (Miklavič, 2015)

Leta 2008 so odkrili in identificirali egerolizin bakterije P. aeruginosa z UniProt številko PA0122, ki so ga pozneje poimenovali RahU. Njegova struktura je prikazana na sliki 3.

Bakterijo so izolirali iz sputuma bolnikov s cistično fibrozo (Rao idr., 2008). Iz rezultatov študije je razvidna razlika v izražanju gena rahU. Primerjali so nemukozni in mukozni sev P.

aeruginosa, ki so ju izolirali v razmiku dveh dni iz bolnika s cistično fibrozo. Ugotovili so več kot osemkratno povečanje izražanja gena rahU v nemukoznem sevu v primerjavi z mukoznim sevom. S tem so predstavili prvi dokaz o pomenu produkta gena rahU za bakterijo ob okužbah (Rao idr., 2008).

Poročali so tudi, da RahU veže oksidiran lipoprotein, in sicer LDL (angl. low density lipoprotein), in lizofosfatidilholin, ne pa tudi neoksidiranega lipoproteina LDL (Rao idr., 2008). Pozneje so dokazali, da poleg teh molekul interagira tudi z ramnolipidi. Ramnolipidi so specifični lipidi bakterije P. aeruginosa, ki so pomembni za tvorbo biofilma in vplivajo na rojenje bakterije (Miklavič, 2015). Posledično naj bi imel bakterijski egerolizin RahU vlogo pri tvorbi biofilma in odgovoru na gostiteljev imunski sistem (Rao idr., 2011).

Bakterijski egerolizini so v primerjavi z glivnimi slabše raziskani. Biološka vloga produkta gena rahU še ni pojasnjena, znano pa je, da je njegovo izražanje odvisno od zaznavanja celične gostote (Miklavič, 2015). V bakteriji P. aeruginosa sistem zaznavanja gostote bakterijskih celic igra pomembno vlogo pri sintezi virulentnih dejavnikov, razvoju biofilma in modulaciji imunskega odziva gostitelja pri kroničnih obolenjih pljuč. RahU je citoplazemski protein, ki pa so ga identificirali tudi v membranah. Močno se izraža v začetni fazi stacionarne rasti, nato pa njegova količina naglo upade. Do sedaj še ni znano, kateri mehanizmi prispevajo k tako hitremu zmanjšanju količine RahU v stacionarni fazi (Rao idr., 2008).

Bakterija P. aeruginosa je oportunistični patogen, ki povzroča kronične okužbe pljuč pri bolnikih s cistično fibrozo (Rao idr., 2011). Pojavlja se tudi pri poškodovancih z opeklinami, ranjencih in pri osebah z ogroženim imunskim sistemom. Odgovor gostiteljskih celic proti okužbam s to bakterijo vključuje lokalne celice imunskega odziva, kot so makrofagi, monociti, neutrofilci in limfociti, ki začnejo sproščati mediatorje, da omogočijo napad in odstranitev bakterije. V procesu destrukcije bakterije se sprostijo reaktivne kisikove zmesi, kot so dušikovi oksidi in vodikov peroksid (Rao idr., 2011).

Eksperimenti so pokazali globalni vpliv produkta gena rahU na izražanje genov v makrofagih v povezavi s protivnetnimi spojinami. Rekombinantni RahU zavira sintezo dušikovih oksidov in kemotakso monocitov in/ali makrofagov. Protein RahU lahko torej predstavlja potencialno protimikrobno tarčo ali pa vpliva kot biomarker vnetnih procesov bakterije P. aeruginosa (Rao idr., 2011).

2.3 UPORABA DELECIJSKIH MUTANT

Delecija pomeni odstranitev enega ali več baznih parov v genomu nekega organizma (Gasparič in Komel, 1996). Fenotipski učinki izbrisov so odvisni od velikosti in lokacije izbrisanih sekvenc na genomu (Clancy in Shaw, 2008). Odstranitev ali inaktivacija gena je pomembna pri proučevanju in določanju njegove funkcije, saj tako lahko opazujemo razlike med organizmom, v katerem je gen prisoten, ter organizmom, ki gena nima. Pogosto se za izbris ali zamenjavo specifičnega odseka na genomu uporabljajo metode, ki izkoriščajo homologno rekombinacijo (Berg, Tymoczko in Stryer, 2002).

2.4 HOMOLOGNA REKOMBINACIJA

Rekombinacija je proces premeščanja homolognih odsekov med dvema zaporedjema DNA (Gasparič idr., 1996). Iz dveh molekul DNA, med katerima poteče rekombinacija, lahko nastane nova molekula DNA, ki vsebuje segmente iz obeh izhodnih molekul (Berg idr., 2002). Rekombinacija je eden ključnih procesov, ki je s premeščanjem genov skozi evolucijo poskrbel za obstoj novih organizmov ali razvoj organizmov s specifičnimi lastnostmi (Gasparič idr., 1996). Rekombinacija se kaže v izmenjavi genov med homolognimi kromosomi, kar je močno pripomoglo k povečanju genetske raznolikosti. Je eden izmed pomembnih mehanizmov pri popravljanju poškodovane DNA. Vloga rekombinacije je pomembna tudi zato, ker gre za preureditve specifičnih odsekov DNA, ki lahko spremenijo ekspresijo ali funkcijo nekaterih genov (Cooper, 2000).

Pri homologni rekombinaciji bakterij ima ključno vlogo rekombinaza RecA. Ta encim za svoje delovanje potrebuje ATP, Mg²⁺ in enoverižno DNA (Gasparič idr., 1996). Pri evkariontih je za to funkcijo ključen protein Rad51 (Berg idr., 2002).

Homologna rekombinacija poteka med dvema homolognima sekvencama DNA na podlagi Hollidayevega modela. Rekombinacija se začne s prekinitvijo obeh starševskih molekul DNA na enakih mestih. Prekinjeni verigi se delno razpreta in pride do enoverižne izmenjave. Kot rezultat nastane molekula dveh popolnih dvojnih vijačnic DNA, povezanih z enojno verigo DNA, ki se začenja v eni in končuje v drugi dvojni vijačnici DNA (Gasparič idr., 1996). »Za njen nastanek pa je potrebna homologija na koncu 3'-invazivne verige. Ključen korak je izomerizacija. Po njej se položaj vsake posamezne verige obeh dvojnih vijačnic obrne. Gre za zelo preprosto rotacijo DNA okoli longitudinalne osi sparjenih dvojnih vijačnic. Ključna je

končna struktura, Hollidayeva struktura, v kateri se izmenjata obe verigi DNA.« (Gasparič idr., 1996, str. 190.)

2.5 TRANSFORMACIJA

Poznamo več načinov izmenjave in vnosa genetskega materiala pri bakterijah. Najbolj poznani so trandukcija, konjugacija in transformacija. V procesu transformacije celica sprejme, in tako lahko sproži prepis tuje DNA. Da bi se prosta DNA vključila v genom recipienta, ni potrebno, da so celice v medsebojnem stiku, prenaša se lahko le prosta DNA.

Transformacija je lahko naravna, izvedena pri normalnih fizioloških procesih tistih bakterij, ki so naravno zmožne transformacije. Za raziskave na molekularno genetskem področju pa je zelo pomembna izzvana transformacija. Pripravimo kompetentne celice, da lahko sprejmejo tujo DNA. Kompetentne celice pripravimo z različnimi kemijskimi, fizičnimi ali encimskimi obdelavami (Gasparič idr., 1996). V bakterijsko celico tako s transformacijo v laboratoriju vnašamo tujo DNA, ki nosi gene za proteine, ki jih proučujemo. Pri tem kot vektor najpogosteje uporabimo plazmid. Vektorji so molekule DNA, sposobne samopodvojevanja, ki omogočajo selekcijo med gostiteljskimi celicami in vsebujejo restrikcijska mesta, kamor se lahko vključi odsek tuje DNA. Ekspresijski vektorji pa lahko omogočijo tudi sintezo rekombinaz (Erjavec, 2012). Pri našem delu smo uporabili plazmid pUC18-RedS z genom za rekombinazo RedS.

2.6 ELEKTROPORACIJA

Elektroporacija je pojav, pri katerem postane celična membrana zaradi izpostavljenosti električnim pulzom visoke polske napetosti za kratek čas nestabilna in posledično močno prepustna za vse molekule, ki so v njeni okolici. V primeru, da so celične membrane v času destabilizacije v stiku, pride do njihovega zlitja. Zadnje imenujemo elektrofuzija (Gasparič idr., 1996). Zaradi povečane prepustnosti membrane lahko v celico vstopijo ioni, zdravila in molekule različnih velikosti, ki jim sicer membrana predstavlja nepremagljivo oviro. Potek elektroporacije je odvisen od številnih dejavnikov. Eden izmed njih je električno polje oziroma so parametri, ki električno polje določajo. Sem spadajo jakost električnega polja, čas trajanja posameznega pulza ter frekvenca in število pulzov. Pomembni pa so tudi fizikalni dejavniki, kamor štejemo temperaturo, osmotski tlak, prevodnost medija in stanje celičnega skeleta (Lebar, Serša, Čemažar in Miklavčič, 1998).

Elektroporacija je pomembna in široko uporabna laboratorijska tehnika, saj s preprostim ravnanjem omogoča dobre rezultate. Ima prednost pred drugimi biokemijskimi metodami, saj jo lahko uporabimo na vsaki celici in pri uporabi ustrezne jakosti električnega polja ne ogroža celičnega preživetja. Je neinvazivna nekemična metoda, s katero lahko v celice vnašamo eksogene molekule (Lebar idr., 1998).

2.7 REKOMBINAZNI SISTEM LAMBDA RED

Rekombinazni sistem Lambda Red je učinkovita, hitra, mestospecifična metoda za uvedbo mutacij, ki sta jo razvila Datsenko in Wanner (2000). Uporaba metode omogoči inaktivacijo genov na različnih lokacijah v genomu v različnih bakterijah.

Leta 2004 so Beamish in sodelavci prvič uspešno uporabili metodo za inaktivacijo kromosomskega gena lacI tudi v patogenih sevih Escherichia coli, ki so ga nadomestili z genom za odpornost proti kanamicinu. V članku so opisali vzroke za neuspeh prejšnjih metod, uporabnih za editiranje genov. Testirali so, ali je bil neuspeh posledica popolnoma tehničnih težav, kot je na primer oblikovanje primerjav, ali pa je vzrok v lastnostih bakterije. Ena izmed slabosti takrat uporabljenih metod je bila vnos nemetilirane DNA v bakterijo E. coli.

Posledično so preoblikovali začetne oligonukleotide. Naslednja sprememba, ki so jo izpostavili, je bila povečanje koncentracije L-arabinoze, ki sproži prepis rekombinaznih proteinov na plazmidu. Tretji vzrok pa so našli v pogojih za elektroporacijo, in sicer v podaljšanju časa elektroporacije. Rezultati so bili boljši pri času 5,7-5,9 ms kot pa pri določenem idealnem časovnem območju, ki je pod 4,6 ms (Beamish, Greenwood, Petty in Preston, 2004).

Lesic in Rahme (2008) sta v članku predstavila uporabo tehnike, odvisne od rekombinaznega sistema Lambda Red, ki je bil prilagojen za delo z bakterijo P. aeruginosa. Postopek poteka z elektroporacijo PCR-produkta (polimerazna verižna reakcija; angl. PCR - polymerase chain reaction), pridobljenega v enem ali treh korakih, ki vsebuje kaseto za odpornost proti antibiotiku. Začetni oligonukleotidi, s katerimi pomnožimo gen za selekcijo, nalegajo na homologna zaporedja, ki so na koncih tarčnega gena navzgor in navzdol, kar zagotavlja homologijo s tarčnim genom (slika 4). PCR-produkt se vnese v bakterijo, ki izraža rekombinazni sistem Lambda Red. Zadnje sproži zamenjavo genov, homologno rekombinacijo med tarčnim genom na kromosomu in prej pripravljenim odsekom DNA s kanamicinsko kaseto. Ugotovili so, da zadošča 100 homolognih nukleotidov med

pomnoženim odsekom DNA in tarčnim genom, da rekombinacija poteče. Za povečanje učinkovitosti pridobivanja delecijskih mutant je najbolj optimalna uporaba pridobivanja PCR- produkta v treh korakih, tako razširitev homologije s tarčnim genom na 400 do 600 nukleotidov. Gre za zelo učinkovito tehniko, katere velika prednost je njena hitrost, saj omogoča pridobitev mutant v manj kot enem tednu pri postopku v treh korakih ter manj kot treh dneh pri postopku, ki poteka v enem koraku. Pomembna pa je tudi zato, ker lahko služi za spremembo večjih kromosomskih področij (Lesic in Rahme, 2008).

Slika 4: Priprava PCR-produkta v enem (B) in treh korakih (A), uporabnega za editiranje bakterijskih genomov (Lesic in Rahme, 2008)

2.8 DELECIJA GENA rahU V BAKTERIJI P. AERUGINOSA

Sevi bakterij P. aeruginosa imajo na genomu zapis za protein RahU. S pomočjo homologne rekombinacije smo v naši raziskavi želeli ta gen zamenjati z zapisom za odpornost proti antibiotiku kanamicinu. Za pripravo delecijske mutante smo uporabili rekombinazni sistem Lambda Red. V bakterijo smo s transformacijo vnesli plazmid, v našem primeru pUCP18- RedS, ki nosi zapis za rekombinazo RedS. V transformanto smo z elektroporacijo vnesli produkt verižne reakcije s polimerazo (PCR) oziroma kanamicinsko kaseto, ki je imela na 5' in 3' koncih vstavljeni regiji, homologni s tarčnim genom rahU. Tako rekombinaza v bakteriji izvede zamenjavo gena rahU ter na njegovo mesto na kromosomu homologno integrira PCR- produkt. Natančen postopek dela bo opisan v metodah.

3. MATERIALI IN METODE 3.1 MATERIALI

3.1.1 BAKTERIJSKI SEV

Pri delu smo uporabili bakterijski sev bakterije P. aeruginosa PA01, ki je eden bolje okarakteriziranih sevov te bakterije. Sev so nam poslali avtorji članka Schuster in Greenberg (2007).

3.1.2 ZAČETNI OLIGONUKLEOTIDI

Za preverjanje uspešnosti delecije gena rahU smo uporabili dva seta začetnih oligonukleotidov p8 + p11 in p8 + p50 (preglednica 1). S setom začetnih oligonukleotidov p8 + p11 smo pomnožili kodirajoči odsek, promotorsko področje gena rahU. S setom p8 + p50 pa smo preverili ustrezno vstavitev kanamicinske kasete in zamenjavo gena rahU.

Preglednica 1: Začetni oligonukleotidi, uporabljeni v študiji Imena začetnih oligonukleotidov Oznaka Zaporedje nukleotidov (5’‒^3’)

PaCDS-r p8 CCCCTCGAGGGAGAAGCGGCCGAGGGTCA

PaProm-f p11 CCCCTCGAGGCCCTGCTCGATGCCCTGGA

lasR-r p48 CCGATATCTCCCAACTGGTCTTG

rhlR-f p49 AACGCGAGATCCTGCAATG

kan_R p50 CCCCCTGCGTGCAATCCATCTTG

3.1.3 PLAZMID pUCP18-RedS

Plazmid, ki smo ga uporabljali pri delu in je potreben za delecijo gena na genomu pUCP18- RedS (slika 5), so nam poslali avtorji članka Use of the Lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa (Lesic, 2008). Plazmid ima zapis za odpornost proti ampicilinu in karbenicilinu. Za ta plazmid se uporabljajo antibiotiki v koncentraciji 100 ng/µl za ampicilin in 275 ng/µl za karbenicilin.

Zagotavlja odpornost proti karbenicilinu/ampicilinu, araC-represor, ara C, gam, bet, exo-geni sistema Lambda Red pod kontrolo arabinoznega promotorja.

Slika 5: Shematska mapa plazmida pUCP18-RedS

3.1.4 KANAMICINSKA KASETA

Za svoje delo sem prejela že pripravljeno kanamicinsko kaseto s konci, komplementarnimi s 5' in 3' gena rahU. Kaseta je bila pomnožena s PCR iz bakterije E. coli dcm iz kolekcije Keio (Baba idr., 2006) z začetnim oligonukleotidom p48 + p49 (preglednica 1).

Pomnožek je bil v koncentraciji 112,6 ng/µl in velik 1303 baznih parov.

3.1.5 BAKTERIJSKA GOJIŠČA, UPORABLJENA V ŠTUDIJI - Tekoče gojišče LB (Luria

Bertani)

10 g/l kazeinski hidrolizat 5 g/l kvasni ekstrakt 10 g/l NaCl

Po potrebi dodamo antibiotike:

50 mg/ml kanamicin 50 mg/ml karbenicilin

Avtoklaviramo. Antibiotike dodamo v ohlajen medij tik pred uporabo.

- Trdni medij

Pred avtoklaviranjem dodamo 15 g agarja na liter medija LB. V ohlajen medij LB po potrebi dodamo

antibiotike ter ga vlijemo v sterilne petrijevke.

- Gojišče SOB 20 g Bacto tripton

5 g Bacto kvasni ekstrakt 0,5 g NaCl

10 ml 250 mM KCl 5 ml 2M MgCl2

3.1.6 RAZTOPINE, UPORABLJENE PRI DELU - Raztopine za agarozno

elektroforezo Pufer TBE (10 x) 0,9 M Tris-borat 20 mM EDTA pH 8

Nanašalni pufer (6 x)

0,25 % bromfenol modro (m/v) 30 % glicerol (m/v)

0,25 % ksilen cianol FF (m/v)

Pufer TE 1 mM EDTA

10 mM Tris-Cl (pH 8)

‒ Raztopine za pripravo kompetentnih celic CaCl2 Tris-glicerol 50 mM CaCl2

10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 10 % (m/v) glicerol

3.2 METODE

3.2.1 PRIPRAVA KOMPETENTNIH CELIC BAKTERIJE P. AERUGINOSA

Kompetentne celice smo pripravili iz bakterijske kulture v eksponentni fazi rasti. Bakterijo smo 2-krat sprali v raztopini za pripravo kompetentnih celic in z vmesnim centrifugiranjem pri 4000 x g. Celice smo shranili po 100 µl pri -80 °C do uporabe.

3.2.2 TRANSFORMACIJA KOMPETENTNIH CELIC P. AERUGINOSA

Kompetentne celice smo odtalili na ledu (5 min). Naredili smo dve transformaciji. V 50 µl kompetentnih celic smo dodali 1 µl plazmidne DNA pUCP18-RedS. V drugi vzorec pa smo inkubirali samo 50 µl kompetentnih celic kot kontrolo. Zmesi smo inkubirali na ledu eno uro, da se plazmidna DNA s pomočjo Ca²⁺ pritrdi na celico. Sledila je inkubacija v vodni kopeli na 42 °C (90 sekund), da se celična stena razpre in DNA vstopi. Nato pa smo zmes dali za 2 min na led, da se celice zaprejo. Potem smo dodali 1 ml LB-gojišča in stresali 1 h pri 37 °C in 250 obratih na minuto. Celice smo zbrali s centrifugiranjem (1 min) pri 12.000 obratih na minuto, odstranili vse gojišče ter jih razmazali na prej pripravljene LB-plošče s karbenicilinom (50 mg/ml). Plošče smo inkubirali čez noč pri 37 °C, da so zrasle posamezne kolonije.

3.2.3 RAST TRANSFORMANT IN PRIPRAVA ELEKTROKOMPETENTNIH CELIC Eno kolonijo transformiranih bakterij P. aeruginosa PA01 pUCP18-RedS smo nacepili v 5 ml tekočega gojišča SOB, v katerega smo dodali še 20 µl antibiotika karbenicilina (50 mg/ml), in čez noč dali stresati pri 30 °C in 180 obratih na minuto. T. i. prekonočno kulturo smo nato nacepili v sveže tekoče gojišče. V 50 ml SOB-gojišča smo dodali 300 µl karbenicilina, 400 µl prekonočne kulture P. aeruginosa ter 250 µl 40% L-arabinoze (tako smo dobili 0,2% L- arabinoso, ki inducira sintezo rekombinaze iz plazmida pUCP18-RedS). Kulturo smo stresali pri 30 °C in 180 obratih na minuto, da je kultura zrasla do optične gostote pri 600 nm 0.3. Ko je kultura zrasla do OD600 0,3, smo jo ohladili na ledu (30 min).

Sledila je priprava elektrokompetentnih celic. Zraslo kulturo v tekočem gojišču smo centrifugirali 10 min pri 7000 x g in 4 °C. Nato smo odlili supernatant. Bakterijski pelet smo resuspendirali v 50 ml 300 mM saharoze. Vnovič smo centrifugirali 10 min na 7000 g in 4 °C ter odlili supernatant. Peletu smo dodali polovično prostornino 300 mM saharoze (25 ml). Še enkrat smo ponovili centrifugiranje in odlivanje supernatanta. Na koncu pa smo pelet resuspendirali v eni stotinki začetne prostornine (1 ml saharoze). Tako smo dobili

elektrokompetentne celice, ki smo jih alikvotirali v 4 epice po 50 µl. Ves postopek smo izvajali pri 4 °C.

3.2.4 ELEKTROPORACIJA

V vsako izmed epic smo poleg 50 µl kompetentnih celic dodali DNA, ki smo jo želeli v bakterijo elektroporirati (PCR-produkt – kanamicinska kaseta), vendar v različnih koncentracijah. Dodali smo 1 µl, 2 µl, 4 µl ter 6 µl PCR-produkta. Vsebino vsake izmed epic smo prenesli v kiveto, ki je bila hladna, jo zmešali in dali v elektroporator Eppendorf.

Uporabili smo jakost 1600 V za 5 ms ter takoj zatem dodali 1 ml toplega gojišča (37 °C) SOB, v katerega smo že predhodno dodali L-arabinozo (0,2%). Nato pa smo celice prenesli v novo epico ter dali stresati 2 uri pri 37 °C. Ta postopek smo ponovili za vse 4 izhodiščne epice, v katerih so bile različne koncentracije DNA.

Elektroporirane celice smo po dveh urah rasti razmazali na plošče LB z 200 µg/ml kanamicina in jih inkubirali čez noč pri 37 °C ob stresanju.

3.2.5 POLIMERAZNA VERIŽNA REAKCIJA ZA PREVERJANJE DELECIJE GENA rahU

Uspešnost delecije gena rahU oziroma preverjanje prisotnosti inserta smo naredili s pomočjo reakcije verižne polimerizacije. PCR je metoda za hitro sintezo DNA s termostabilno DNA- polimerazo, pri kateri lahko pomnožimo izbrane odseke DNA v več milijon kopijah.

Reakcijska zmes mora vsebovati tarčno DNA, en ali več parov začetnih oligonukleotidov, vse štiri dNTP-je, DNA-polimerazo in ustrezen pufer z optimalno koncentracijo magnezijevih ionov.

Reakcija poteka v treh fazah:

- denaturacija dvoverižne DNA,

- vezava oligonukleotidov na specifična komplementarna nukleotidna zaporedja DNA, - podaljševanje verige DNA s termostabilno polimerazo

(Črešnar, Dolžan, Hudler, Plemenitaš in Žakelj-Mavrič, 2011).

Naredili smo dve reakcijski zmesi s končno prostornino 125 µl. V vsako zmes smo dali 62,5 µl master mixa, 52,5 µl destilirane vode in po 5 µl ustreznih primerjev ter sterilno z zobotrebcem v vsako zmes vnesli bakterijsko kulturo. Nato pa smo zmes alikvotirali v 8 epic

po 25 µl, kjer so prve 4 vsebovale prvi set primerjev (p8 + p11), druge 4 pa drugi set primerjev (p8 + p50). Pomnoževanje različnih odsekov DNA je potekalo pri enakih pogojih za vse reakcije: denaturacija pri 94 °C (3 min), ki ji je sledilo 30 ciklov 94 °C (30 sekund), 55

°C (30 sekund), 72 °C (1,5 min) in zaključno podaljševanje pri 72 °C (7 min). Vzorce smo do analize shranili pri 4 °C.

3.2.6 AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA

Velikost pridobljenih PCR-produktov smo preverjali v agaroznem gelu, ki smo mu dodali barvilo, interkalator DNA, etidijev bromid. Gelska elektroforeza ločuje molekule DNA in RNA glede na njihovo velikost. Večji odseki DNA potujejo skozi gel počasneje, manjši pa hitreje. To smo dosegli tako, da smo PCR-produkte izpostavili električnemu toku. V gel smo vnesli 8 vzorcev po 3,5 µl ter lestvico znanih velikosti fragmentov DNA - 100 bp ladder plus Thermo Scientific (6 µl). Napetost je bila 110 V. Elektroforeza je tekla v 1 x pufru TBE. Tok negativno nabito DNA nosi proti pozitivno nabiti anodi. DNA same po sebi ne moremo videti, zato smo dodali etidijev bromid, ki se vgradi in sveti na mestih, kjer se interkalira v DNA, ko jo slikamo pod UV-žarki z aparatom GeneSnap (Syngene).

3.2.7 SHRANITEV CELIC

10 ml uspešnim delecijskim mutantam smo dodali 15% glicerol, ki služi krioprotekciji, in LB- gojišče ter jih shranili na -80 °C.

4. REZULTATI

4.1 USPEŠNOST TRANSFORMACIJE

Celice bakterije P. aeruginosa PA01 smo naredili kompetentne, tako da so bile sposobne sprejeti tujo DNA. S transformacijo smo v bakterijo vnesli plazmidno DNA. Selekcijo za bakterije, ki so sprejele vstavljeni plazmid, smo izvedli na agarnih ploščah LB, ki smo jim dodali antibiotik karbenicilin (50 mg/ml). Razmazane plošče smo inkubirali čez noč pri 37

°C, da so zrasle do posameznih kolonij. Odpornost proti antibiotiku je pomemben selekcijski marker, ki ga navadno uporabljamo za razlikovanje med transformiranimi in netransformiranimi celicami. Kompetentne celice P. aeruginosa PA01 niso odporne na karbenicilin. Plazmid, ki smo ga vnesli v kompetentne celice, pa je odporen na antibiotik ampicilin in karbenicilin. Izvenkromosomalna plazmidna DNA tako omogoči bakteriji, da zraste na karbenicilinu. Na sliki 6 je s K označena kontrola, transformirane celice pa s TRANF. Na sliki lahko vidimo, da so na agarjevi plošči LB s kanamicinom celice zrasle.

Poleg pa je še kontrolna plošča, na kateri celice niso zrasle, saj niso imele vstavljenega plazmida. Torej je bila transformacija uspešna.

Slika 6: Bakterijske kolonije seva P. aeruginosa PA01, rasle na ploščah LB s karbenicilinom, brez vstavljenega plazmida (K)

Plazmidna DNA, ki smo jo v bakterijo vnesli s transformacijo, nosi zapis za proteine sistema Lambda Red med drugim za encim, ki izvede homologno rekombinacijo. Geni sistema Lambda Red so pod kontrolo promotorja pBAD, ki ga sprožimo z 0,2% L-arabinozo, zato ta sladkor dodamo v gojišče bakterijske kulture.

4.2 RAST TRANSFORMANTE P. AERUGINOSA PA01

Po uspešni transformaciji je sledila rast kulture čez noč. Prekonočna kultura transformant se je obarvala zeleno, ker P. aeruginosa PA01 sintetizira barvilo piocianin, ki deluje protimikrobno (slika 7). Nato pa smo kulturo precepili v sveže gojišče in jo pustili rasti do OD600 0.3. V gojišče SOB smo še vedno dodajali L-arabinozo, ki je inducirala nastanek rekombinaze, od katere je odvisen potek rekombinacije in posledično ves nadaljnji postopek delecije. Namesto karbenicilina smo tokrat vnesli antibiotik kanamicin (50 mg/ml), ker želimo, da bakterije na koncu, po elektroporaciji, izgubijo plazmid pUCP18-RedS z odpornostjo na karbenicilin, saj bo namen plazmida v tej fazi že izpolnjen. Optično gostoto celic smo merili z UV- spektrometrom in rast celic ustavili, ko so dosegle OD600 0.3. Ko so celice dosegle eksponentno fazo rasti, smo jih v rasti ustavili, saj so celice takrat najbolj žive in pripravljene, da vanje vnesemo tujo DNA.

Slika 7: Prekonočna kultura bakterije P. aeruginosa PA01 s pUCP18-RedS

4.3 PREVERJANJE USPEŠNOSTI ELEKTROPORACIJE IN REKOMBINACIJE

Pred vstavitvijo kanamicinske kasete z elektroporacijo je bilo treba transformante narediti elektrokompetentne. To smo dosegli s spiranjem transformant v 300mM saharozi. Z elektroporacijo smo v celice vnesli PCR-pomnožke, pridobljene s polimerazno verižno reakcijo v enem koraku (slika 4). Produkt PCR je bila dvoverižna DNA, ki ima na sredini gen za odpornost proti kanamicinu, na njenih koncih pa zaporedji, ki sta homologni z zaporedji 5' in 3' gena rahU, ki ga želimo izbrisati iz genoma. Uporabili smo 4 različne koncentracije DNA, da zmanjšamo tveganje pokanja celic zaradi morebiti prebitne koncentracije DNA.

Po elektroporaciji smo elektroporirane celice pustili rasti v gojišču z 0,2% L-arabinozo pri 37

°C ob stresanju. V tej fazi poteka sinteza proteina RedS, ki je potreben za homologno rekombinacijo in posledično delecijo gena za egerolizin. Protein RedS poveže in zamenja kanamicinsko kaseto z genom za protein rahU, sosednji geni pa ostanejo enaki. DNA, ki smo jo vnesli (kanamicinska kaseta), je fragment in ni krožna molekula, ki jo bakterija sama razgradi, preživi le, če se vgradi oziroma integrira v genom. Uspešnost elektroporacije smo preverili s pomočjo selekcije na kanamicinskih ploščah. Bakterijski sev P. aeruginosa PA01 naravno ni odporen proti kanamicinu. Tako mutantam vstavljena kanamicinska kaseta omogoča rast ob prisotnosti kanamicina. Iz slike 8 je razvidno, da se je integracija na genom zgodila, saj so bakterije zrasle na kanamicinskih ploščah. To pomeni, da je potekla zamenjava med genoma rahU in genom za odpornost proti kanamicinu.

Slika 8: Elektroporirane celice P. aeruginosa PA01 na kanamicinskih ploščah, razmazane do posameznih kolonij

4.4 PREVERJANJE USPEŠNOSTI DELECIJE GENA

S PCR NA KOLONIJAH MUTANT

Po elektroporaciji smo fragmente DNA pomnožili z metodo PCR. Uporabili smo dva seta začetnih oligonukleotidov, p11 + p8 in p11 + p50 (preglednica 1), in kot matrično DNA uporabili direktno bakterijsko kolonijo. Začetni oligonukleotid p50 se nalega na začetku 5', p8 pa na koncu 3' kanamicinske kasete. Začetni oligonukleotid p11 nalega na začetku

promotorske regije gena rahU. V enem setu začetnih oligonukleotidov eden vedno nalega zunaj, drugi pa na kanamicinsko kaseto. Z dobljenim produktom tako vemo, da je kanamicinska kaseta vstavljena na točno določeno, tarčno mesto v genomu.

Uporabili smo gelsko elektroforezo (1,2% gel) za analizo ustreznosti mutant. S primerjavo z DNA-lestvico, ki vsebuje linearne DNA-fragmente znanih dolžin, lahko ocenimo koncentracijo DNA v vzorcu in presodimo, ali je prave velikosti, ter tako določimo, če se je kanamicinska kaseta pravilno vstavila. S to analizo smo torej ugotovili, katere celice vsebujejo pravilno vstavljeno kanamicinsko kaseto. Analiza produktov PCR, pomnoženih iz mutant, je prikazana na sliki 9.

Slika 9: Analiza pomnožitve kanamicinske kasete iz genomov mutant P. aeruginosa PA01.

L+1 - velikostna lestvica v baznih parih in linija 1, linije 1-4 so pomnožki, pridobljeni s paroma začetnih oligonukleotidov p11 + p8 na mutantah 1-4, linije 4-8 pa pomnožki iz

mutant 1-4, pridobljeni z začetnimi oligonukleotidi p11 + p50.

Odseke DNA štirih sevov smo pomnožili s setom začetnih oligonukleotidov p11 + p8 ali s p11 + p50. Uspešno je bil pomnožen odsek DNA pri četrtem klonu (slika 9 - označeno v črnem okvirju). Kot je bilo pričakovano, smo dobili pomnožka velikosti 450 baznih parov ali 700 baznih parov. Ta specifična pomnožka sta dokaz oziroma indikacija, da ima mutacijo na pravem mestu v genomu.

Pri drugih vzorcih smo za rezultat dobili nekaj velikih nespecifičnih lis, kar nakazuje na neustrezno mutagenezo. Reakcijo bi lahko izboljšali z dvigom temperature naleganja začetnih oligonukleotidov (npr. s 55 °C na 57 °C), s čimer bi izboljšali naleganje na specifična mesta.

Uspešno mutirani sev (sev številka 4), ki ima na pravilnem mestu v genomu vstavljeno kaseto, smo shranili. Za ohranitev delecijske mutante smo celicam dodali 15% glicerol za krioprotekcijo ter LB-gojišče ter jih shranili pri -80 °C. Nadaljnje analize bodo potrdile, ali smo res izdelali mutirani bakterijski sev P. aeruginosa, ki ni več sposoben produkcije proteina egerolizina. Tak sev lahko služi nadaljnjim analizam in testom, namenjenim boljšemu poznavanju vloge egerolizina v bakteriji. Uporabljalo se ga bo lahko na primer pri proučevanju njegove vloge pri protiinsektnemu delovanju, saj protein izkazuje interakcijo s specifičnimi insektnimi molekulami.

5. ZAKLJUČEK IN SKLEPI

V diplomskem delu sem predstavila protein RahU, ter nakazala na pomen bakterije P.

aeruginosa za zdravje ljudi. Ta bakterija je povzročitelj številnih bolnišničnih okužb in vnetij, zato je pomembno čim širše poznavanje bakterije. Ob tem je pomembno, da proučimo biologijo proteina RahU, ki je potencialni virulenčni dejavnik. Opisala sem postopke priprave delecijske mutante rahU in prikazala rezultate praktičnega dela priprave mutante.

Ob uporabi ustreznih metod mi je uspelo izdelati delecijsko mutanto bakterijskega seva ter z molekularnim orodjem preveriti uspešnost vstavitve kanamicinske kasete na mesto izbrisanega gena rahU v genomu, in tako doseči zastavljene cilje. Delecija je potekala v več fazah. Najprej sem s transformacijo v bakterijo P. aeruginosa PA01 vnesla plazmid pUCP18- RedS, ki nosi zapis za protein RedS, rekombinazo, ključno za homologno rekombinacijo.

Sintezo rekombinaze smo sprožili z L-arabinozo. Nato pa je sledila elektroporacija kanamicinske kasete (PCR-produkta, ki sem ga za delo dobila že prej pripravljenega) v transformanto. S pomočjo rekombinaze je prišlo do homologne rekombinacije med genom rahU na genomu in vstavljeno kanamicinsko kaseto zaradi homologije na njunih koncih. Če se je kaseta vstavila pravilno in na pravo mesto, pa sem preverila s polimerazno verižno reakcijo, z ustreznima začetnima oligonukleotidoma in pomnožke DNA analizirala z gelsko elektroforezo.

Ker mi je uspelo narediti delecijske mutante, sem jih shranila na način, da se bodo lahko ohranile in uporabile za nadaljnje analize, ter tako dosegla še zadnji zastavljeni cilj. Z zgoraj opisanim delom sem prav tako potrdila zastavljeno hipotezo.

Homologna rekombinacije je potekla z rekombinaznim sistemom Lambda Red, ki je hitra in zelo učinkovita tehnika. Spoznala sem, kako pomembna je povezava tehnike s hitrostjo in pridobivanjem mutant.

Namen uporabe delecijske tehnike je spoznavanje funkcije in vloge novega še ne popolnoma raziskanega proteina.

6. VIRI IN LITERATURA

Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., … Mori, H. (2006).

Construction of Escherichia coli K‐12 in‐frame, single‐gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular System Biology, 2. doi: 10.1038/msb4100050

Beamish, L., Greenwood, R., Petty, K. in Preston, E. (2004.). Successful Application of the λ- Red Recombinase System to Inactivate lacI in Escherichia coli C29, BW25993 and MG1655.

Journal of Experimental Microbiology and Immunology, 12, 94‒99.

Berg, J. M., Tymoczko, J. L. in Stryer, L. (2002). Biochemistry, Fifth edition. New York: W.

H. Freeman and Company.

Berne, S., Lah, L., in Sepčić, K. (2009). Aegerolysins: structure, function, and putative biological role. Protein science, 18, 694‒706.

Clancy, S., in Shaw, K. M. (2008). DNA Deletion and Duplication and the Associated Genetic Disorders. Nature Education, 1(1). Pridobljeno s http://www.nature.com/scitable/topicpage/dna-deletion-and-duplication-and-the-associated- 331

Cooper, G. M. (2000). The Cell: A Molecular Approach, Second Edition. Washington: ASM Press.

Čresnar, B., Dolžan, V., Hudler, P., Plemenitaš, A., in Žakelj-Mavrič, M. (2011). Navodila za vaje iz biokemije II. Ljubljana: Biografika BORI.

Datsenko, K. A., in Wanner, B. L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 97(12), 6640–6645.

de Bentzmann, S., in Plesiat, P. (2011). The Pseudomonas aeruginosa opportunistic pathogen and human infections. Environmental Microbiology, 13 (7), 1655–1665.

Erjavec, M. S. (2012). Genetika za študente univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Pedagoške fakultete. Navodila za vaje s teoretičnimi osnovami. Ljubljana.

Flemming, H. C., Wingender, J. (2010). The biofilm matix. Nature Reviews Microbiology, 8, 623‒633. doi: 10.1038/nrmicro2415

Fojkar, M. (2014). Odpornost bakterije Pseudomonas aeruginosa proti izbranim antibiotikom (Diplomsko delo). Biotehniška fakulteta, Ljubljana.

Gasparič, A., in Komel, R. (1996). Metode izboljšanja delovnih mikroorganizmov. V P.

Raspor (ur.), Biotehnologija. Osnovna znanja (str. 188‒196). Ljubljana, BIA.

Lebar, A. M., Serša, G., Čemažar, M., in Miklavčič, D. (1998). Elektroporacija. Med razgledom, 37, 339‒354. Pridobljeno s http://lbk.fe.uni-lj.si/pdfs/mr1998.pdf

Lesic, B., in Rahme, L. G. (2008). Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Molecular Biology, 9(20).

doi:10.1186/1471-2199-9-20

Micro-Environmental Imaging & Analysis Facility (MEIAF). University of California, Santa Barbara. Pridobljeno dne 30.5.2016, s

http://www.bren.ucsb.edu/facilities/MEIAF/portalimages/original/MEBAWD04.jpg

Miklavič, Š., Kogovšek, P., Hodnik, V., Korošec, J., Kladnik, A., Anderluh, G., ... Butala, M.

(2015). The Pseudomonas aeruginosa RhlR-controlled aegerolysin RahU is a low-affinity rhamnolipid-binding protein. Pridobljeno s

http://femsle.oxfordjournals.org/content/362/10/fnv069

Novak, M., Kraševec, N., Skočaj, M., Maček, P., Anderluh, G., in Sepčić, K. (2014). Fungal aegerolysin-like proteins: distribution, activities, and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. doi:10.1007/s00253-014-6239-9

Potera, C. (2012). Common Bacterium Induces Histamine Production in Neutrophils.

Environmental Health Perspectives,120. doi: 10.1289/ehp.120-a190. Pridobljeno s http://ehp.niehs.nih.gov/120-a190/

Rao, J., DiGiandomenico, A., Unger, J., Bao, Y., Polanowska-Grabowska, R. K., in Goldberg, J. B. (2008). A novel oxidized low-density lipoprotein-binding protein from Pseudomonas aeruginosa. Microbiology, 154, 654‒665.

Rao, J., DiGiandomenico, A., Artamonov, M., Leitinger, N., Amin, A. R., in Goldberg, J. B.

(2011). Host derived inflammatory phospholipids regulate rahU (PA0122) Gene, Protein and Biofilm Formation in Pseudomonas aeruginosa. Cellular Immunology, 270, 95‒102.

Rao, J., Elliot, M. R., Leitinger, N., Jensen, R. V., Goldeberg, J. B., in Amin, A. R. (2011).

Cellular Immunology, 270, 103‒113. doi:10.1016/j.cellimm.2011.05.012.

Schuster, M., in Greenberg, E. P. (2007). Early activation of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa reveals the architecture of a complex regulon, BMC Genomics, 8:287. doi:

10.1186/1471-2164-8-287

Todar, K. (2008‒2012). Todar’s online textbook of bacteriology. Pridobljeno s http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html