UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
David KRISPER
ZAMENJAVA POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV Z UPORABO TEHNOLOGIJE CRISPR/CAS
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
David KRISPER
ZAMENJAVA POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV Z UPORABO TEHNOLOGIJE CRISPR/CAS
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
REPLACEMENT OF INDIVIDUAL NUCLEOTIDES USING THE CRISPR/CAS TECHNOLOGY
B. SC. THESIS
Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala doc. dr. Jerneja Ogorevca.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: doc. dr. Jernej OGOREVC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: prof. dr. Katarina VOGEL MIKUŠ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum predstavitve: 6. 9.2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 602.6:602.8:575.111(043.2)
KG CRISPR/Cas, SNP, urejanje genoma, urejevalec posameznih nukleotidov AV KRISPER, David
SA OGOREVC, Jernej (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN ZAMENJAVA POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV Z UPORABO TEHNOLOGIJE CRISPR/CAS
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 20 str., 10 sl., 45 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Tehnologija CRISPR/Cas se uporablja za preurejanje genoma. Gre za sistem, ki izhaja iz pridobljenega imunskega sistema prokariontov. V biotehnologiji se uporablja modificirana metoda, ki temelji na spojitvi sgRNA molekule in Cas endonukleaze.
Točkovne mutacije so posledica tranzicij in transverzij. Take spremembe nukleotidov v genomu lahko vodijo do razvoja bolezenskih stanj. Na podlagi sistema CRISPR/Cas se razvijajo urejevalci posameznih nukleotidov, ki omogočajo spreminjanje posameznih nukleotidov. Ti temeljijo na pripojitvi deaminaz ali reverznih transkriptaz na endonukleazno neaktivne mutante Cas9 proteina (npr. Cas9 nikaza, katalitično neaktivni Cas9 – dCas9). Urejevalci posameznih nukleotidnih baz omogočajo zamenjavo posameznega nukleotida za drug nukleotid. Z razvojem urejevalcev posameznih nukleotidov se odpira možnost zdravljenja predvsem monogenskih bolezni, kot so npr. anemija srpastih celic, β-talasemija in amiotrofična lateralna skleroza, kjer so vzrok bolezni točkovne mutacije.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 602.6:602.8:575.111(043.2)
CX CRISPR/Cas, SNP, nucleotide, genome editing, base editor AU KRISPER, David
AA OGOREVC, Jernej (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI REPLACEMENT OF INDIVIDUAL NUCLEOTIDES USING THE CRISPR/CAS TECHNOLOGY
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 20 p., 10 fig., 45 ref.
LA sl AL sl/en
AB The CRISPR/Cas technology is used to edit genomes. It is a system, derived from the acquired immunity of prokaryotes. A modified method based on the fusion of the sgRNA molecule and a Cas endonuclease is used in biotechnology. Point mutations are the result of transitions and transversions. Such changes of nucleotides in the genome can lead to development of diseases. CRISPR/Cas-base editors of single nucleotide bases are being developed to modify individual nucleotides. The base editors are a fusion of deaminase enyzmes or reverse transcriptases to Cas9 proteins (e.g., Cas9 nicase or catalytically inactive Cas9 - dCas9). Base editors enable replacement of individual nucleotides in deamination reactions. Development of base editors will be useful to treat monogenic diseases such as sickle cell anemia, β-thalassemia and amytrophic lateral sclerosis, where single nucleotide mutations are the cause of diseases.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO SLIK VI
1 UVOD... 1
1.1 NAMEN DELA ... 2
2 SISTEM CRISPR/CAS ... 2
2.1 LOKUS CRISPR IN PROTEINI CAS ... 2
2.2 MEHANIZMI DELOVANJA SISTEMA CRISPR/CAS9 ... 3
2.3 DELITEV CRISPR/CAS SISTEMOV ... 6
3 TOČKOVNE MUTACIJE ... 7
4 ZAMENJAVA POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV S TEHNOLOGIJO CRISPR/CAS ... 8
4.1 CITOZINSKI UREJEVALCI POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV ... 8
4.2 ADENINSKI UREJEVALCI POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV ... 10
4.3 TEHNOLOGIJA PREUREJANJA »PRIME« ... 11
5 PRIMERI APLIKATIVNE RABE UREJEVALCEV POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV ... 13
5.1 AMIOTROFIČNA LATERALNA SKLEROZA ... 13
5.2 TIROZINEMIJA... 14
5.3 β-TALASEMIJA ... 14
5.4 ANEMIJA SRPASTIH CELIC... 15
6 ZAKLJUČEK ... 15
7 VIRI ... 15
ZAHVALA
VI KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Zgradba CRISPR/Cas lokusa 3
Slika 2: Struktura RNP kompleksa 4
Slika 3: Mehanizem delovanja CRISPR/Cas9 5
Slika 4: Modifikacija RNP kompleksa za uporabo v biotehnologiji 6
Slika 5: Delitev CRISPR/Cas sistemov po razredih 7
Slika 6: Prikaz citidin deaminaze pripojene na katalitično neaktivni Cas9 9 Slika 7: Postopek spreminjanja C v T z uporabo urejevalca nukleotidov 10
Slika 8: Shema tranzicij in transverzij 11
Slika 9: Struktura Prime urejevalca nukleotidov 12
Slika 10: Mehanizem delovanja Prime urejevalca 13
1 1 UVOD
Leta 2012 je skupina znanstvenikov, pod vodstvom Jennifer A. Doudna in Emmanuelle Charpentier, objavila članek o modifikaciji sistema CRISPR/Cas, ki bi ga lahko uporabljali za tarčno spreminjanje genoma (Jinek in sod., 2012). Tehnologija izhaja iz arhej in bakterij, ki izrabljajo CRISPR in pripadajoče Cas proteine za obrambo pred vdorom virusov in plazmidov.
Ishino in sod. so leta 1987 v bakteriji Escherichia coli prvič odkrili palindromna zaporedja z vmesniki, ki jih danes poznamo kot CRISPR. Kasneje, leta 1989, so na univerzi Alicante, Mojica in sod. odkrili ista palindromna zaporedja v arheji Haloferax mediterranei (Mojica in Rodriguez-Valera, 2016; Mojica in sod., 2002). Jansen in sod. (2002) so odkrili, da so v prokariontih s CRISPR lokusom v neposredni bližini prisotni tudi Cas geni, ki so odsotni pri prokariontih brez CRISPR. To odkritje je nakazovalo, da so Cas geni povezani s CRISPR lokusom in funkcionalno sodelujejo.
Odkritje tehnologije CRISPR/Cas je povzročilo znanstveno revolucijo na področju, ki ga imenujemo preurejanje genoma. Prej poznani metodi, kot sta nukleaza s cinkovimi prsti (angl.
Zinc finger nuclease – ZFN) in efektorska nukleaza, podobna transkripcijskemu aktivatorju (angl. Transcription activator-like efector nuclease – TALEN), temeljita na fuziji proteinov in nukleaz. Novo odkrita metoda CRISPR/Cas ima pred ZFN in TALEN številne prednosti.
Tarčna zaporedja sistema CRISPR/Cas je enostavno spreminjati s programiranjem sgRNA molekul (Gaj in sod., 2013), tehnologija je prenosljiva v evkariontske celice (Jinek in sod., 2013), omogoča tarčno spreminjanje večih genov hkrati – genomsko multipleksiranje (Wang in sod., 2013) in je fleksibilna - Cas protein lahko npr. spojimo tudi z nikazo, ki cepi le eno verigo DNA ter omogoča večjo natančnost (Gaj in sod., 2013).
Točkovne mutacije (angl. Single nucleotide polymorphism – SNP) so najbolj pogoste genetske variacije v genomu. Poznamo štiri tipe DNA nukleotidov: adenin (A), timin (T), gvanin (G) in citozin (C). Pri točkovnih mutacijah gre za zamenjavo določenega nukleotida v DNA zaporedju z drugim. Obstajajo nekateri SNP-ji, ki zmanjšajo oz. povečajo tveganje za razvoj bolezni ali direktno povzročajo bolezensko stanje (Komar, 2009). V zadnjih letih so se pojavile nove tehnologije, ki temeljijo na CRISPR/Cas sistemu in omogočajo tarčno spreminjanje posameznih nukleotidov. Primer je spojitev Cas nikaze z urejevalci nukleotidnih baz (angl. base editors), kjer lahko z reakcijo deaminacije povzročimo konverzijo nukleotidov (Komor in sod., 2016). S pogostostjo točkovnih mutacij in z njimi povezanih genetskih bolezni, nam tehnologija CRISPR/Cas omogoča pripravo različnih živalskih modelov za preučevanje bolezni. Uporaba sistema CRISPR/Cas za spreminjanje posameznih nukleotidov se zdi obetavna tudi za zdravljenje bolezni, predvsem monogenskih, kot sta npr. anemija srpastih krvničk in β- talasemija (Liang in sod., 2017; Pickar-Oliver in Gersbach, 2019).
2 1.1 NAMEN DELA
V diplomski nalogi bom povzel osnovne značilnosti in mehanizme delovanja CRISPR/Cas sistema za zamenjavo posameznih nukleotidov, pri čemer bom predstavil tudi primere aplikativne uporabe.
2 SISTEM CRISPR/CAS
Skozi evolucijo so arheje in bakterije razvile obrambni mehanizem, ki temelji na pridobljeni imunosti, imenovan CRISPR/Cas. Ta sistem omogoča zaščito tem organizmom pred virusi in plazmidi. Ishino in sod. (1987) so odkrili ponavljajoča se zaporedja v prokariontskih genomih.
V zaporedjih, kasneje imenovanih CRISPR, so opazili homologije z genomskimi zaporedji bakteriofagov, virusov in plazmidov (Mojica in sod., 2005). To je kazalo na povezavo lokusa CRISPR z možnimi funkcijami pridobljenega imunskega sistema pri prokariontih. Poleg zaporedij CRISPR so odkrili tudi gene imenovane Cas, ki kodirajo encime nukleaze in helikaze.
Z analizami primerjalne genomike so potrdili, da lokus CRISPR in proteini Cas sodelujejo ter omogočajo prokariontskim celicam obrambo pred invazivnimi virusi in plazmidi, podobno kot proces RNA interference pri evkariontskih organizmih (Ishino in sod., 2018).
CRISPR/Cas temelji na majhnih RNA molekulah, ki imajo specifična zaporedja za zaznavo in utišanje invazivnih nukleinskih kislin. Ob vdoru tujih viralnih ali plazmidnih nukleinskih kislin bakterije in arheje le-te razrežejo ter integrirajo kratke fragmente tuje DNA v lasten genom. V fazi interference se fragmenti prepišejo v kratke molekule CRISPR RNA (crRNA), ki so komplementarne zaporedju invazivnih virusov ali plazmidov. Istočasno pride še do prepisovanja trans-aktivacijskih RNA molekul (tracrRNA). Ti dve RNA molekuli se spojita in nastane crRNA-tracrRNA struktura. Temu sledi procesiranje nastalega dimera in utišanje tarčnih zaporedij s pomočjo Cas proteinov, ki tvorijo kompleks s crRNA-tracrRNA molekulami. Proces utišanja poteče, ko ribonukleoproteinski (RNP) kompleks prepozna komplementarno zaporedje in motiv PAM, kar aktivira endonukleazno aktivnost Cas9 in povzroči dvojni prelom DNA ob mestu vezave. S to tehnologijo je možno tarčno posegati na specifična DNA mesta z uporabo edinstvenih RNA molekul (Jinek in sod., 2012).
2.1 LOKUS CRISPR IN PROTEINI CAS
Gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromih ponovitev oz. CRISPR (angl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) so prisotni v večini filogenetskih skupin prokariontov, kot so arheje, Gram-pozitivne in Gram-negativne bakterije. CRISPR so prisotni v 202 (87 %) od 232 vrstah arhej in 3059 (45 %) od 6782 vrstah bakterij (CRISPR database, 2021). Predstavljajo najbolj razširjeno vrsto ponovitev v genomih prokariontov. Posledično, tako pogosta prisotnost CRISPR zaporedij nakazuje na njihovo pomembno vlogo v pridobljenem imunskem sistemu prokariontov (Ishino in sod., 2018). CRISPR lokus vsebuje
3
kratke izmenične palindrome ponovitve, med njimi pa so zaporedja vmesnikov (angl. spacer).
Ob okužbi, arheje in bakterije, ki vsebujejo CRISPR lokus, razrežejo del tuje DNA v kratke fragmente, imenovane protovmesniki (angl. protospacer). Te vmesnike integrirajo v lasten genom na začetek CRISPR lokusa med izmenične palindromske ponovitve. Na ta način imajo prokariontske celice zaščito ob ponovni okužbi z istim virusom (Jinek in sod., 2012). Poleg zaporedja CRISPR so Jansen in sod. (2002) odkrili tudi štiri gene, imenovane Cas (angl.
CRISPR-associated). Prisotnost CRISPR zaporedij in Cas genov nakazuje na njihovo tesno povezanost in skupno funkcijo pri obrambi celice. Ob okužbi z že poznanim virusom pride do prepisovanja lokusa CRISPR - crRNA in tracrRNA molekuli se spojita in vežeta s Cas endonukleazo, kar povzroči razrez invazivne DNA. Gen Cas1 je bil najden pri vseh vrstah, ki imajo CRISPR lokus, ostali trije Cas geni pa so bili prisotni pri večini vrst, a ne pri vseh. Z analizo aminokislinskega zaporedja proteina Cas3 so odkrili, da vsebuje motive značilne za superdružino helikaz, proteinov, ki sodelujejo v odvijanju DNA molekule. Cas4 protein pa je imel značilnosti povezane z RecB eksonukleazo, ta je del RecBCD kompleksa v bakteriji E.
coli, ki je namenjen popravljanju dvojnih prelomov DNA. Poleg tega, so v analizah odkrili, da ima gen Cas1 visoko izoelektrično točko. Ta lastnost je značilna za proteine, ki sodelujejo pri vezavi nukleinskih kislin (Jansen in sod., 2002).
Slika 1: Zgradba CRISPR/Cas lokusa (prirejeno po Seahyoung in sod., 2015)
2.2 MEHANIZMI DELOVANJA SISTEMA CRISPR/CAS9
Najbolj pogost in poznan sistem za uporabo v biotehnologiji je CRISPR/Cas9, ki izhaja iz bakterije Streptococcus pyogenes, kjer nudi bakteriji zaščito pred invazivnimi nukleinskimi kislinami. Spada v tip II pri delitvi CRISPR/Cas sistemov in kot efektrosko nukleazo uporablja Cas9 (Mali in sod., 2013). Za delovanje je ključna spojitev dveh RNA molekul, zrele crRNA in tracrRNA. CrRNA molekula se sintetizira ob prepisu CRISPR lokusa, tracrRNA pa iz svojega lokusa. TracrRNA je kratka ne-kodirajoča RNA molekula, ki ima 2 funkciji: aktivira RNAzo III za procesiranje pre-crRNA in se veže na Cas9 proteinom.(Jinek in sod., 2012).
4
Slika 2: Struktura RNP kompleksa (prirejeno po Jinek in sod., 2012)
Prvi korak v obrambi bakterij s CRISPR/Cas9 je adaptacija. Ob infekciji celice z virusom ali plazmidom, proteina Cas1 in Cas2 tvorita kompleks, ki omogoča izrez DNA zaporedja iz invazivnega genoma imenovan protovmesnik (Nuñez in sod., 2014). Zaporedje protovmesnika potem celica integrira na začetek CRISPR lokusa med ponovitve (vmesnik). Tako je celica zaščitena pred ponovno invazijo tega virusa ali plazmida. Če pride do infekcije celice z že poznanim virusom sledi korak interference. CRISPR lokus, ki vsebuje zaporedja vmesnikov in ponovitev, se prepiše v prekurzorsko CRISPR RNA molekulo (pre-crRNA). Hkrati pride tudi do prepisovanja trans-aktivacijske RNA (tracrRNA). Sledi hibridizacija tracrRNA na zaporedja ponovitev pre-crRNA ob prisotnosti Cas9 proteina. Proces hibridizacije tracrRNA in crRNA aktivira ribonukleazo RNAzo III, ki producira zrele crRNA. Pride do tvorbe RNP (crRNA- tracrRNA-Cas9) kompleksa (Deltcheva in sod., 2011). Takšen zrel kompleks ima zmožnost vezave na tarčna zaporedja (protovmesniki) v invazivnem genomu), ki so komplementarna zaporedju vmesnika oz. crRNA. Če imajo komplementarna zaporedja na invazivni DNA polegkratko zaporedje imenovano PAM (angl. Protospacer adjacent motif) na 3` koncu, Se aktivira endonukleazna aktivnost Cas9 in sledi rezanje tuje DNA. Zaporedje PAM omogoča kompleksu Cas9 vezavo na tujo DNA, ki jo, ob komplementarnosti 5' konca crRNA (vmesnik), Cas9 reže. Zaporedje PAM preprečuje rezanje lastne DNA. Sistem CRISPR/Cas9 pri bakteriji Streptococcus pyogenes, prepoznava PAM zaporedje NGG (Mali in sod., 2013; Jinek in sod., 2012).
5
Slika 3: Mehanizem delovanja CRISPR/Cas9 (prirejeno po Mali in sod., 2013)
Osnovni princip sistema za uporabo v biotehnologiji temelji na uporabi himerne RNA molekule (sgRNA) za usmeritev Cas9 endonukleaze na specifično komplementarno mesto zaporedja, kjer pride do dvojnega preloma DNA. Jinek in sod. (2012) so na podlagi interakcij med crRNA in tracrRNA izdelali himerno RNA molekulo, imenovano sgRNA (angl. single guide RNA). To so naredili tako, da so spojili 3` konec crRNA in 5` konec tracrRNA s povezovalnikom (angl.
linker). Ta himerna RNA molekula omogoča razrez dsDNA na tarčnih mestih, ki so
6
komplementarna zaporedju sgRNA. Ta izboljšava olajša tarčno poseganje v genom, saj lahko le z oblikovanjem 5' konca sgRNA tarčno spreminjamo DNA zaporedje (Jinek in sod., 2012).
Slika 4: Modifikacija RNP kompleksa za uporabo v biotehnologiji (prirejeno po Jinek in sod., 2012)
Mutacije enega oz. več nukleotidov v zaporedju PAM ali v zaporedju protovmesnika lahko zaščitijo invazivne viruse pred delovanjem CRISPR/Cas sistema. Posledično je za delovanje CRISPR/Cas potrebno ujemanje med vmesnikom in protovmesnikom ter zaporedju PAM.
Semenova in sod. (2011) so dokazali, da mutacije izven tarčnega zaporedja (angl. seed sequence) ali PAM ne vplivajo na delovanje sistema CRISPR/Cas. Kakršnekoli mutacije znotraj tarčnega ali PAM zaporedja pa virusu omogočajo preživetje. To bakteriji s CRISPR/Cas sistemom omogoča, da eliminira tudi sorodne viruse, ki se ujemajo v delih zaporedja, ki se je integriral (seed regija), z enim samim vmesnikom in ji ni potrebno podaljševati lokusa CRISPR.
2.3 DELITEV CRISPR/CAS SISTEMOV
Sistem CRISPR/Cas se deli v dva glavna razreda. Delitev sistemov CRISPR/Cas temelji na zgradbi efektorskih modulov oz. proteinov. Znotraj teh dveh razredov trenutno poznamo 6 tipov, ki so razdeljeni še na 19 podtipov (Shmakov in sod., 2017).
Kljub diverziteti sistemov CRISPR/Cas, si ti delijo dva osnovna funkcijska modula.
Adaptacijski modul je zaslužen za izrez in vključevanje protovmesnikov v CRISPR lokus. Ta modul je enoten pri večini CRISPR/Cas sistemov in vsebuje dva značilna proteina, Cas1 ter Cas2. Nasprotno pa so efektorski moduli izjemno variabilni. Prvi razred sistemov CRISPR/Cas obsega tipe I, III in IV. Njihovi efektorski moduli, so sestavljeni iz različnih Cas proteinov, ki tvorijo skupni multi-proteinski kompleks. Razred 1 je prisoten pri bakterijah in arhejah (vključno pri vseh hipertermofilih). Približno 90 % vseh odkritih CRISPR/Cas lokusov spada v razred 1 in temelji na multi-proteinskem efektorskem kompleksu za obrambo. Ostalih 10 % lokusov pripada razredu 2 CRISPR/Cas sistemov. Ta razred obsega tipe II, V in VI ter je prisoten skoraj izključno samo v bakterijah (Shmakov in sod., 2017). Osnovna značilnost razreda 2 je, da efektorski modul sestavlja en sam Cas protein, sem spada tudi najbolj znan
7
sistem CRISPR/Cas9. Tehnologije za spreminjanje genoma se razvijajo primarno na razredu 2 CRISPR/Cas sistemov, ravno zaradi enostavnejše strukture efektorskih modulov, ki omogočajo lažje razumevanje mehanizmov delovanja sistema CRISPR/Cas (Makarova in sod., 2015;
Shmakov in sod., 2015).
Slika 5: Delitev CRISPR/Cas sistemov po razredih (prirejeno po Makarova in sod., 2019)
3 TOČKOVNE MUTACIJE
Točkovne mutacije spadajo med najbolj enostavne variacije DNA. Gre za zamenjave med štirimi osnovnimi nukleotidnimi bazami . Te variacije se imenujejo polimorfizmi posameznih nukleotidiov (angl. single nucleotide polymorphism - SNP) in so posledica mutacij. SNP-ji predstavljajo več kot 80 % vseh poznanih polimorfizmov ter so odgovorni za številne fenotipske razlike znotraj osebkov iste vrste. Točkovni polimorfizmi so lahko tranzicije (zamenjava dveh purinskih baz oz. dveh pirimidinskih baz), transverzije (zamenjava purinske s pirimidinsko bazo in obratno) ali insercije/delecije (indels) in se pojavljajo približno na vsakih 1000 baznih parov v genomu (Brookes, 1999). SNP-ji so lahko prisotni v kodirajočih ali nekodirajočih regijah genoma. Točkovne mutacije v nekodirajočih regijah genoma so prisotne v intronskih, promotorskih ali vezavnih mestih zaporedij različnih transkripcijskih faktorjev.
Mutacije v kodirajočih regijah delimo na sinonimne in nesinonimne. Sinonimne ali tihe (angl.
silent) mutacije so spremembe nukleotidov, ki ne povzročijo zamenjav aminokisline zaradi degeneriranosti genetskega koda. Nesinonimne mutacije pa zaradi zamenjav nukleotidov povzročijo spremembo v aminokislinskem zaporedju in lahko vodijo do napak v delovanju proteinov in razvoju bolezni. Čeprav sinonimne mutacije načeloma ne povzročijo sprememb v zgradbi proteinov, so odkrili, da so lahko vpletene v stabilnost mRNA molekul in izrezovanje intronov (angl. splicing). Vse te spremembe lahko vplivajo tudi na zvijanje proteinov, njihovo strukturo in delovanje znotraj celice. Prisotnost nukleotidnih variacij v genomu je uporabna tudi za identifikacijo SNP markerjev. Uporaba le-teh v medicini nam omogoča identifikacijo kandidatnih genov, ki so povezani z določenimi bolezenskimi stanji (Komar, 2009).
8
4 ZAMENJAVA POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV S TEHNOLOGIJO CRISPR/CAS
Tehnologije, ki temeljijo na sistemu CRISPR/Cas povzročijo dvojne prelome v tarčni DNA verigi. Obstajata dve poti za popravljanje dvojnih prelomov, in sicer nehomologno spajanje koncev (angl. nonhomologous end joining – NHEJ) in homologna rekombinacija (angl.
homology directed repair – HDR). Pri evkariontih se za popravljanje dvojnih prelomov pretežno aktivira pot NHEJ, ki povzroči nastanek manjših insercij in delecij na tarčnem mestu popravljanja. Pot HDR pa temelji na popravljanju dvojnih prelomov z uporabo donorske matrice DNA. V človeških proliferajočih celicah, se ob poškodbah DNA z NHEJ mehanizmom popravi približno 75 % dvojnih prelomov, medtem ko se s HDR ostalih 25 % (Mao in sod., 2008).
Razmerje med NHEJ in HDR niha med filogenetskimi skupinami. Sesalci in rastline za popravilo prelomov DNA primarno uporabljajo pot NHEJ, kvasovke pa v večini HDR. Pri filogenetskih skupinah z večjimi genomi, kot so sesalci in rastline, lahko pot HDR povzroči škodljive prerazporeditve v genomu, ki so lahko za organizem usodne. Zato se te skupine poslužujejo poti NHEJ, ki je bolj varna in povzroča akumulacijo manjših insercij in delecij (indel). Pri tehnologijah preurejanja genoma se mehanizem NHEJ uporablja za povzročitev mutacij - delecij in insercij. HDR pa se uporablja pri vstavljanju posameznih nukleotidov ali daljših odsekov DNA. Glavna težava pri spreminjanju genoma je prisotnost izven-tarčnih učinkov (angl. off-target effects), ki lahko povzročijo naključne in nezaželene mutacije (Pickar- Oliver in Gersbach, 2019; Gaj in sod., 2013).
4.1 CITOZINSKI UREJEVALCI POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV
Komor in sod. (2016) so ustvarili citozinski urejevalec nukleotidnih baz (angl. Base editor) prve generacije (BE1) s citidin deaminazo, pripojeno na katalitično neaktivni Cas9 (angl. dead Cas9 - dCas9). Citidin deaminaza je encim, ki katalizira reakcijo deaminacije citozina v uracil. Ti encimi primarno delujejo na RNA molekulah, a poznamo primere, ki delujejo na enojnih verigah DNA (ssDNA) (Harris in sod., 2002). Katalitično pomanjkljiv Cas9 (dCas9) vsebuje Asp10Ala in His840Ala mutaciji, ki inaktivirata nukleazno aktivnost encima Cas9. DCas9 ohranja zmožnost vezave na DNA ob ustrezni homologiji sgRNA molekule, ampak ob vezavi ne cepi DNA verige. Fuzija citidin deaminaze in dCas9 omogoča spreminjanje posameznih nukleotidov iz C v T, brez uvajanja dvojnih prelomov v tarčne verige DNA.
9
Slika 6: Prikaz citidin deaminaze pripojene na katalitično neaktivni Cas9 (prirejeno po Komor in sod., 2016)
Komor in sod. (2016) so ugotovili, da je v celicah prisoten encim uracil DNA glikozilaza (UDG), ki lahko zamenja U:G par nazaj v C:G. Posledično, so razvili urejevalce nukleotidov druge generacije (BE2). BE2 so na C-terminalni konec dodali inhibitor uracil DNA glikozilaze (UGI). Ta korak je povečal učinkovitost BE2 za trikrat v primerjavi z BE1. Da bi še dodatno povečali učinkovitost, so razvili urejevalce nukleotidov tretje generacije (BE3), ki uporabljajo encim Cas9 nikazo. V dCas9 so odstranili mutacijo His840Ala in obnovili histidinski ostanek na 840 mestu. Ugotovili so, da v celicah obstaja popravljalni mehanizem, ki glede na rez v DNA odstrani bazo in sintetizira novo. Ta mehanizem povzroči, da se uracil spremeni nazaj v citozin, glede na komplementaren gvanin na nespremenjeni verigi. BE3, ki vsebuje Cas9 nikazo, naredi zarezo v nespremenjeno verigo z gvaninom in celica zazna to kot napako. Glede na vstavljen uracil, zamenja gvanin z adeninom in pride do pravilne spremembe v U:A oz. T:A. BE2 imajo manjšo učinkovitost (20 %) spreminjanja nukleotidov, ampak pride do tvorbe manj indel mutacij (< 0,1 %). BE3 pa omogočajo višjo učinkovitost (37 %), pri čemer je stopnja indel mutacij okoli 1 %. Kim in sod. (2017) so spojili citidin deaminazo še z ostalimi homologi Cas9, ki prepoznavajo druga PAM zaporedja. To omogoča prepoznavanje več tarčnih mest v genomu in še dodatno poveča učinkovitost urejevalcev nukleotidov. Testirali so tudi različne mutante citidin deaminaz, z namenom, da bi zmanjšali širino okna za urejanje (angl. editing window) nukleotidov. Okno za urejanje se nanaša na regijo nukleotidov, na katero ob vezavi na PAM deluje encim. Širino okna za urejanje lahko manjšamo ali večamo z npr. mutacijami encimov.
Kim in sod. (2017) je uspelo priti do širine 1-2 nukleotida.
Kleinstiver in sod. (2016) so razvili Cas9 s povečano natančnostjo delovanja (ang. High-fidelity Cas9 - HF-Cas9), kar so dosegli z vnosom štirih točkovnih mutacij, ki vplivajo na interakcije med Cas9 in fosfatom v DNA. Leto kasneje, so Rees in sod. (2017) uporabili HF-Cas9 v urejevalcu nukleotidov in zmanjšali izven-tarčne učinke pri spreminjanju nukleotidov.
10
Razvijajo se tudi urejevalci četrte generacije, ki stremijo h izboljšanju učinkovitosti in zmanjšanju tvorbe indel mutacij (Komor in sod., 2017).
Slika 7: Postopek spreminjanja C v T z uporabo urejevalca nukleotidov (prirejeno po Komor in sod., 2016)
4.2 ADENINSKI UREJEVALCI POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV
Gaudelli in sod. (2017) so prvi razvili adeninski urejevalec, ki spreminja A:T v G:C brez dvojnih prelomov DNA verige. Deaminacija adenina povzroči nastanek inozina, ki ga polimeraze berejo kot gvanin in se pari s citozinom. Trenutno sicer ni znanih encimov, ki bi katalizirali reakcijo deaminacije adenina v DNA, zato so ga razvili z usmerjeno evolucijo in proteinskim inženiringom. Uporabili so TadA tRNA adenozin deaminazo iz bakterije E. coli, ki pretvarja adenin v inozin. Ustvarili so knjižnico TadA mutantov spojenih z dCas9 v E. coli. Bakterije so vsebovale še selekcijski plazmid s kloramfenikolno rezistenco in mutacijo A:T v genu kloramfenikol acetil transferaza. Z uvedbo C:G v T:A mutacijo so inaktivirali gen kloramfenikol acetil transferaza. Preživele E. coli so vsebovale TadA mutante, ki so bili sposobni pretvoriti A:T v G:C in obnoviti gen za rezistenco na kloramfenikol. Nastali adeninski urejevalec so lahko vnesli v sesalske celice z zamenjavo dCas9 s Cas9 nikazo. Z usmerjeno evolucijo so pridobili sedem generacij adeninskih urejevalcev. Z uporabo citozinskih in adeninskih urejevalcev posameznih nukleotidov lahko zajamemo glavne štiri tranzicijske mutacije (ki so C→T, G→A, A→G, T→C).
Richter in sod. (2020) so nadgradili adeninske urejevalce sedme generacije z uporabo metod evolucije s pomočjo fagov (angl. phage-assisted evolution). Adeninski urejevalci nukleotidnih baz osme generacije (ABE8) vsebujejo osem dodatnih mutacij, ki pospešijo hitrost preurejanja za 590-krat v primerjavi z ABE7. Prejšnji ABE so imeli počasno delovanje, zaradi česar se je Cas9 domena pogosto odcepila od DNA preden je prišlo do tranzicije nukleotidov. Zhang in sod. (2020) so spojili citozinska in adeninska urejevalca skupaj s Cas9 nikazo v dvojni
11
urejevalec nukleotidnih baz. Z A&C-BEmax dvojnim urejevalcem lahko spreminjamo C → T in A → G nukleotide na istem alelu. Učinkovitost pri pretvorbi adeninov je pri A&C-BEmax urejevalcu nižja kot pri navadnih ABE, učinkovitost pri spreminjanju citozinov pa je višja, ob zmanjšanih izven-tarčnih učinkih.
4.3 TEHNOLOGIJA PREUREJANJA »PRIME«
Z uporabo citozinskih in adeninskih urejevalcev nukleotidnih baz lahko tarčno posegamo v genom in spreminjamo nukleotide na podlagi štirih tranzicij. Glavna ovira trenutnih urejevalcev je, da so zamenjave nukleotidov zmožne le znotraj štirih tranzicijskih mutacij (C→T, G→A, A→G, T→C) in ne zajemajo še ostalih osem transverzijskih mutacij (C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G). Anzalone in sod. (2019) so razvili tehnologijo preurejanja imenovano »Prime«. Tehnologija omogoča tarčne insercije, delecije in vseh 12 točkovnih mutacij brez dvojnih prelomov verig in potrebe po donorski DNA. S preurejanjem s »Prime«
lahko potencialno popravimo 90% indel in SNP mutacij, ki povzročajo bolezni. Podobno kot bazni urejevalci nukleotidov, tudi tehnologija »Prime« temelji na CRISPR/Cas sistemu (Scholefield in Harrison, 2021).
Slika 8: Shema tranzicij in transverzij (prirejeno po Wondji in sod., 2007)
Prime urejevalci so nastali s spojitvijo reverzne transkriptaze na C-terminalni konec Cas9 nikaze ter za delovanje potrebujejo »prime-editing« vodilno RNA (pegRNA). Molekula pegRNA se bistveno razlikuje od navadnih sgRNA pri CRISPR/Cas9. PegRNA vsebuje informacijo za tarčno zaporedje, ki usmerja Cas9 nikazo in nosi zaporedje, ki narekuje zaželene spremembe v DNA (Anzalone in sod., 2019).
12
Slika 9: Struktura Prime urejevalca nukleotidov (prirejeno po Anzalone in sod., 2019)
Cas9n-RT-pegRNA (Cas9 nikaza-reverzna transkriptaza-»prime-editing« vodilna RNA) kompleks se veže na tarčno DNA zaporedje in zareže v verigo 3 bp navzgor od motiva PAM.
Odpre se veriga z visečim 3` koncem, ki se specifično veže z zaporedjem na pegRNK imenovanim začetno vezavno mesto (angl. primer binding site – PBS), ki je dolgo 14-16 nukleotidov. Reverzna transkriptaza uporabi zaporedje pegRNA kot matrico za sintezo DNA verige. Posledično imamo 3` preurejen viseči konec in 5` nespremenjen konec. Celična nukleaza odstrani nespremenjen 5` konec in dobimo spremenjeno zaporedje. Zaradi neujemanja baz med novo nastalo preurejeno verigo in staro nespremenjeno verigo se aktivirajo popravljalni mehanizmi. V tem koraku je pomembno, da Cas9 nikaza zareže v nespremenjeno verigo. To povzroči, da popravljalni mehanizem DNA preurejeno verigo uporabi kot komplementarno matrico. Baza v nespremenjeni verigi se spremeni, da ustreza novo sintetizirani bazi. V pegRNA molekuli se lahko doda tudi ne ujemajoč nukleotid za PAM zaporedje. To pomeni, da se po reverzni transkripciji, spremeni tudi nukleotid znotraj PAM zaporedja in tako izgine mesto PAM. To se uporablja za preprečitev nadaljnjega delovanja.
Tudi pri urejevalcih Prime poznamo več generacij. Prime urejevalci druge generacije (PE2) vsebujejo pentamutant reverzne transkriptaze in imajo višjo učinkovitost ter lahko funkcionirajo s krajšimi PBS zaporedji. Urejevalci PE3 pa so spremenjeni tako, da pride do zareza v nespremenjeno verigo s Cas9 nikazo šele po reverzni transkripciji preurejene verige.
Tudi ta pristop je dodatno povečal učinkovitost in zmanjšal izven-tarčne učinke (Kantor in sod., 2020; Anzalone in sod., 2019).
13
Slika 10: Mehanizem delovanja urejevalca Prime (prirejeno po Anzalone in sod., 2019)
5 PRIMERI APLIKATIVNE RABE UREJEVALCEV POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV
5.1 AMIOTROFIČNA LATERALNA SKLEROZA
Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, ki poškoduje motorične nevrone hrbtenjače in možganov. Bolezen se največkrat pojavi pri starejših ljudeh in simptomi vključujejo progresivno mišično atrofijo, paralizo in naposled smrt. Trenutno ni zdravila za zdravljenje ALS. Približno 10 % primerov ALS predstavlja dedna avtosomalna dominantna bolezen. Rosen in sod. (1993) so odkrili gen superoksid dismutaza 1 (SOD1), ki je povezan z napredovanjem ALS. Od vseh primerov dedne amiotrofične lateralne skleroze, jih je 20 % povezanih z mutacijami v genu SOD1 (Iannitti in sod., 2018). Obstaja več kot 100 mutacij v SOD1 genu (Lim in sod., 2020). Superoksid dismutaza je encim, ki katalizira razpad toksičnega superoksidnega aniona na kisik in vodikov peroksid ter nudi celici zaščito pred prostimi radikali.
Lim in sod. (2020) so z uporabo citozinskega urejevalca nukleotidov in Cas9 na mišjem modelu G93A-SOD1 upočasnili napredek ALS. Tarča je bil citozin v kodonu CAG, ki so ga z uporabo CBE hoteli spremeniti v timin. Vnos CBE-ja v celico je temeljil na z inteinom posredovanim sistemom za spajanje. Citozinski urejevalec je prevelik, da bi ga lahko celotnega vnesli v celico z uporabo adeno povezanih virusnih vektorjev (AAV). Zato so uporabili dva adenovirusna vektorja in ločili CBE na dva dela pri Val 957. Na tem mestu so spojili N in C fragmente inteina iz Rhodothermus marinus z REC in NUC domeno proteina Cas9. Ob vnosu teh dveh adenovirusov v celico pride do združenja obeh polovic, v delujoč citozinski urejevalec.
Učinkovitost združitve je bila ⁓30 %. Lim in sodelavcem (2020) je uspelo z uporabo CBE spremeniti C → T, podaljšati preživetje mišim za ⁓11 % in upočasniti razvoj bolezni v poznem stadiju za ⁓85 % (Lim in sod., 2020).
14 5.2 TIROZINEMIJA
Tirozinemija tipa 1 je dedna avtosomno recesivna bolezen, ki povzroča napake v razgradnji aminokisline tirozin, zaradi pomanjkanja ali odsotnosti encima fumarilacetoacetat hidrolaze (FAH). Pomanjkanje FAH encima vodi do akumulacije škodljivih intermediatov, kot so fumarilacetoacetat, maleilacetoacetat in sukcinilaceton, ki povzročajo poškodbe jeter in ledvic (Aponte in sod., 2001).
Song in sod. (2019) so uporabili adeninski urejevalec nukleotidov za zamenjavo A:T v G:C. Ta točkovna mutacija, na nukleotidu 9, povzroči preskakovanje eksona in vodi v izgubo funkcionalnega FAH proteina. ABE in ustrezne sgRNA so v celice vnesli z injiciranjem. Na nukleotidu 9 je prišlo do zaželene spremembe A → G z dokaj nizko učinkovitostjo (~10 %).
Odkrili so, da v ABE oknu za urejanje na mestu 6 obstaja še en adenin, kar pomeni, da obstaja verjetnost, da bo tudi na tem mestu prišlo do zamenjave. Prisotnost dodatnega adenina znotraj okna za urejanje lahko negativno vpliva na aktivnost FAH. Sprememba adenina v gvanin na šestem mestu namreč spremeni aminokislino serin v alanin (S235A). Ta točkovna mutacija lahko zmanjša encimsko aktivnost fumarilacetoacetat hidrolaze. V nekaterih primerih je prišlo je tudi do zamenjave A6G, ampak z nižjo učinkovitostjo, okoli 2 %. Kljub temu, so Song in sod. (2019) uspešno popravili točkovno mutacijo na nukleotidu 9 in inducirali nastanek FAH pozitivnih hepatocitov in vivo.
5.3 β-TALASEMIJA
β-talasemija je dedna bolezen, ki je posledica mutacije v genu za hemoglobin β (HBB). Obstaja več različnih točkovnih mutacij HBB gena. Mutacije v HBB genu povzročijo zmanjšanje sinteze hemoglobin β verig in posledično, napake v zgradbi hemoglobina. Simptomi β- talasemije so anemija, težave z dihanjem in poškodbe organov. Zdravljenje bolezni temelji na transfuziji krvi in uporabi kelatorjev za vezavo železa (Li in sod., 2020).
Liang in sod. (2017) so uporabili citozinski urejevalec tretje generacije (BE3) za zamenjavo G
→ A na mestu 28 HBB gena, ki je najbolj razširjena patogena različica na Kitajskem. Uporabili so tri različne sgRNA za spremembo citozina na komplementarni verigi v timin. Sprva so delovanje BE3 testirali na celični liniji HEK 293T. Potem so odvzeli še celice fibroblastov pacienta z β-talasemijo in preizkusili učinkovitost delovanja BE3. Učinkovitost popravljene točkovne mutacije je bila v celični liniji HEK 293T in fibroblastih približno 20 %. Sledilo je še testiranje na kloniranih človeških zarodkih. Od 22 analiziranih zarodkov, jih je 9 (40,9 %) vsebovalo zaželeno spremembo gvanina v adenin (Liang in sod., 2017).
15 5.4 ANEMIJA SRPASTIH CELIC
Anemija srpastih celic je avtosomalna recesivna bolezen, ki je podobno kot β-talasemija, povezana z mutacijo v HBB genu. Gre za zamenjavo timina v adenin, kar vodi do spremembe hidrofilnega glutamina v hidrofobni valin. Ta mutacija povzroča sprijemanje krvničk v podolgovate celice srpaste oblike. Simptomi so pomanjkanje rdečih krvnih celic (anemija), kar lahko vodi tudi do poškodb organov (Sundd in sod., 2018).
Anemija srpastih celic je posledica transverzijske mutacije, ki spremeni T → A. Anzalone in sod. (2019) so z uporabo Prime urejanja zamenjali A → T v celični liniji HEK 293T. Uporabili so 14 različnih pegRNA molekul in opazovali rezultate. Učinkovitost spremembe mutacije HBB E6V v divji tip HBB je bila 26-52 %, s prisotnostjo indel mutacij ⁓3 %.
6 ZAKLJUČEK
Odkritje CRISPR/Cas tehnologije in uporaba le te kot orodje za spreminjanje genoma je revolucionarno. Ob pojavu tehnologije se je hitro razširila želja po aplikativni rabi. Trenutno se uporablja v kmetijstvu, medicini, farmaciji, biotehnologiji, molekularni biologiji, mikrobiologiji itd. V okviru medicine se lahko uporablja za zdravljenje prej neozdravljivih genetskih bolezni, razvoj transgenih živalskih modelov in gensko terapijo. Razvoj novih tehnologij, ki omogočajo spreminjanje posameznih nukleotidov pa obljublja še bolj natančno poseganje v genom. Prav raznolikost in enostavnost uporabe je naredila CRISPR/Cas tehnologijo tako zanimivo. Hiter in stalen razvoj na področju CRISPR/Cas sistemov omogoča raznovrstno aplikativno rabo, ki temelji na tem sistemu. Z rastjo popularnosti in relativne enostavnosti in ekonomičnosti tehnologije se odpirajo številna vprašanja o bioetiki. Glavna bioetična vprašanja se nanašajo na varnost in poseganje v genom. Čeprav po vsej verjetnosti še nismo blizu posegov v človeški genom so se ob iznajdbi tehnologije CRISPR/Cas že pojavila številna etična vprašanja. Glavne skrbi so tudi glede varnosti. Naše znanje o tehnologiji CRISPR/Cas in o genomu je še vedno omejeno. Uvajanje raznih sprememb ima lahko usodne trajne posledice, ki so lahko posledica izven-tarčnih učinkov ali preurejanja večjih delov genoma. Kljub trenutnim pomislekom in omejitvam, menim da bo tehnologija CRISPR/Cas igrala pomembno vlogo v razvoju znanosti, saj omogoča preurejanje genomov po lastnih željah.
7 VIRI
Anzalone A. V., Randolph P. B., Davis J. R., Sousa A. A., Koblan L. W., Levy J. M., Chen P.
J., Wilson C., Newby G. A., Raguram A., Liu D. R. 2019. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 576, 7785: 149-157
Aponte J. L., Sega G. A., Hauser L. J., Dhar M. S., Withrow C. M., Carpenter D. A., Rinchik E. M., Culiat C. T., Johnson D. K. 2001. Point mutations in the murine fumarylacetoacetate
16
hydrolase gene: Animal models for the human genetic disorder hereditary tyrosinemia type 1. Procedings of the National Academy of Sciences USA, 98, 2: 641-645
Brookes A. J. 1999. The essence of SNPs. Gene, 234, 2: 177-186 CRISPRs web server. 2021. CRISPR database.
https://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/ (5. avg. 2021)
Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C. M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A., Eckert M. R., Vogel J., Charpentier E. 2011. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature, 471, 7340: 602-607
Gaj T., Gersbach C. A., Barbas C. F. 3rd. 2013. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnology, 7: 397-405
Gaudelli N. M., Komor A. C., Rees H. A., Packer M. S., Badran A. H., Bryson D. I., Liu D. R.
2017. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage.
Nature, 551, 7681: 464-471
Harris R. S., Petersen-Mahrt S. K., Neuberger M. S. 2002. RNA editing enzyme APOBEC1 and some of its homologs can act as DNA mutators. Molecular Cell, 10, 5: 1247-1253 Iannitti T., Scarrott J. M., Likhite S., Coldicott I. R. P., Lewis K. E., Heath P. R., Higginbottom
A., Myszczynska M. A., Milo M., Hautbergue G. M., Meyer K., Kaspar B. K., Ferraiuolo L., Shaw P. J., Azzouz M. 2018. Translating SOD1 gene silencing toward the clinic: A highly efficacious, off-target-free, and biomarker-supported strategy for fALS. Molecular Therapy - Nucleic Acids, 12: 75-88
Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., Amemura M., Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology, 169, 12: 5429-5433
Ishino Y. Krupovic M., Forterre P. 2018. History of CRISPR-Cas from encounter with a mysterious repeated sequence to genome editing technology. Journal of Biotechnology, 200, 7, e00580-17, doi: 10.1128/JB.00580-17: 17 str.
Jansen R., van Embden J. D. A., Gaastra W., Schouls L. M. 2002. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology, 43, 6: 1565-1575 Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. 2012. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.
Science, 337, 6096: 816-821
Jinek M., East A., Cheng A., Lin S., Ma E., Doudna J. 2013. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife, 2, e00471. doi: 10.7554/eLife.00471: 9 str.
17
Komar A. A. 2009. Single nucleotide polymorphisms – methods and protocols. Second Edition.
Humana Press: 464 str.
Kantor A., McClements M. E., MacLaren R. E. 2020. CRISPR-Cas9 DNA base-editing and Prime-editing. International Journal of Molecular Science, 21, 17: 6240, doi:
10.3390/ijms21176240: 21 str.
Kim Y. B., Komor A. C., Levy J. M., Packer M. S., Zhao K. T., Liu D. R. 2017. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions. Nature Biotechnology, 35, 4: 371-376
Kleinstiver B. P., Pattanayak V., Prew M. S., Tsai S. Q., Nguyen N. T., Zheng Z., Joung J. K.
2016. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature, 529: 490-495
Komor A. C., Kim Y. B., Packer M. S., Zuris J. A., Liu D. R. 2016. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533, 7603:
420-424
Komor A. C., Zhao K. T., Packer M. S., Gaudelli N. M., Waterbury A. L., Koblan L. W., Kim Y. B., Badran A. H., Liu D. R. 2017. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Science Advances, 3, 8, eaao4774. doi: 10.1126/sciadv.aao4774: 9 str.
Liang P., Ding C., Sun H., Xie X., Xu Y., Zhang X., Sun Y., Xiong Y., Ma W., Liu Y., Wang Y., Fang J., Liu D., Songyang Z., Zhou C., Huang J. 2017. Correction of β-thalassemia mutant by base editor in human embryos. Protein Cell, 8, 11:811-822
Lim C. K. W., Gapinske M., Brooks A. K., Woods W. S., Powell J. E., Zeballos C. M. A., Winter J., Perez-Pinera P., Gaj T. 2020. Treatment of a mouse model of ALS by in vivo base editing. Molecular Therapy, 28, 4: 1177-1189
Li J., Zhou Z., Sun H. X., Ouyang W., Dong G., Liu T., Ge L., Zhang X., Liu C., Gu Y. 2020.
Transcriptome analyses of β-thalassemia -28(A>G) mutation using isogenic cell models generated by CRISPR/Cas9 and asymmetric single-stranded oligodeoxynucleotides (assODNs). Frontiers in Genetics, 11, doi: 10.3389/fgene.2020.577053: 12 str.
Makarova K. S., Wolf Y. I., Alkhnbashi O. S., Costa F., Shah S. A., Saunders S. J., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Haft D. H., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J., Terns R.
M., Terns M. P., White M. F., Yakunin A. F., Garrett R. A., van der Oost J., Backofen R., Koonin E. V. 2015. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 13, 11: 722-36
Makarova K. S., Wolf Y. I., Iranzo J., Shmakov S. A., Alkhnbashi O. S., Brouns S. J. J., Charpentier E., Cheng D., Haft D. H., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J. M., Scott D., Shah S. A., Siksnys V., Terns M. P., Venclovas Č., White M. F., Yakunin A. F., Yan W., Zhang F., Garrett R. A., Backofen R., van der Oost J., Barrangou R., Koonin E. V. 2019.
18
Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants.
Nature Reviews Microbiology, 18: 67-83
Mali P., Esvelt K. M., Church G. M. 2013. Cas9 as a versatile tool for engineering biology.
Nature Methods, 10, 10: 957-963
Mao Z., Bozzella M., Seluanov A., Gorbunova V. 2008. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair, 7, 10: 1765-1771 Mojica F. J. M., Díez-Villaseñor C., Soria E., Juez G. 2002. Biological significance of a family
of regularly spaced repeats in the genomes of Archea, Bacteria and mitochondria. Molecular Microbiology, 36, 1: 244-246
Mojica F. J. M., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Soria E. 2005. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of Molecular Evolution, 60: 174-182
Mojica F. J. M., Rodriguez-Valera F. 2016. The discovery of CRISPR in archea and bacteria.
The FEBS Journal, 283, 17: 3162-3169
Nuñez J. K., Kranzusch P. J., Noeske J., Wright A. V., Davies C. W., Doudna J. A. 2014. Cas1- Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity. Nature Structular and Molecular Biology, 21, 6: 528-534
Pickar-Oliver A., Gersbach C. A. 2019. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 20, 8: 490-507
Rees H. A., Komor A. C., Yeh W., Caetano-Lopes J., Warman M., Edge A. S. B., Liu D. R.
2017. Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery. Nature Communications, 8, 15790, doi:
10.1038/ncomms15790: 10 str.
Richter M. F., Zhao K. T., Eton E., Lapinaite A., Newby G. A., Thuronyi B. W., Wilson C., Koblan L. W., Zeng J., Bauer D. E., Doudna J. A., Liu D. R. 2020. Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity. Nature Biotechnology, 38: 883-891
Rosen D. R., Siddique T., Patterson D., Figlewicz D. A., Sapp P., Hentati A., Donaldson D., Goto J., O`Regan J. P., Deng H., Rahmani Z., Krizus A., McKenna-Yasek D., Cayabyab A., Gaston S. M., Berger R., Tanzi R. E., Halperin J. J., Herzfeldt B., Van den Bergh R., Hung W., Bird T., Deng G., Mulder D. W., Smyth C., Laing N. G., Soriano E., Pericak-Vance M.
A., Haines J., Rouleau G. A., Gusella J. S., Horvitz H. R., Brown Jr R. H. 1993. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature, 362: 59-62
Semenova E., Jore M. M., Datsenko K. A., Semenova A., Westra E. R., Wanner B., van der Oost J., Brouns S. J., Severinov K. 2011. Interference by clustered regularly interspaced
19
short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence. Procedings of the National Academy of Sciences USA, 108, 25: 10098-10103
Scholefield J., Harrison P. T. 2021. Prime editing – an update on the field. Gene Therapy, 28:
396-401
Seahyoung L., Chang Y. L., Jiyun L., Seo H. 2015. Cut and paste the genome: Genome editing for research and therapy. Journal of Cellular Biotechnology, 1, 1: 95-106
Shmakov S., Abudayyeh O. O., Makarova K. S., Wolf Y. I., Gootenberg J. S., Semenova E., Minakhin L., Joung J., Konermann S., Severinov K., Zhang F., Koonin E. V. 2015.
Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas Systems.
Molecular Cell, 60, 3: 385-397
Shmakov S., Smargon A., Scott D., Cox D., Pyzocha N., Yan W., Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Makarova K. S., Wolf Y. I., Severinov K., Zhang F., Koonin E. V. 2017.
Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 15, 3: 169-182
Song C. Q., Jiang T., Richter M., Rhym L. H., Koblan L. W., Zafra M. P., Schatoff E. M., Doman J. L., Cao Y., Dow L. E., Zhu L. J., Anderson D. G., Liu D. R., Yin H., Xue W.
2019. Adenine base editing in an adult mouse model of tyrosinaemia. Nature Biomedical Engineering, 4, 1: 125-130
Sundd P., Gladwin M. T., Novelli E. M. 2019. Pathophysiology of sickle cell disease. Annual Review of Pathology, 14: 263-292
Zhang X., Zhu B., Chen L., Xie L., Yu W., Wang Y., Li L., Yin S., Yang L., Hu H., Han H., Li Y., Wang L., Chen G., Ma X., Geng H., Huang W., Pang X., Yang Z., Wu Y., Siwko S., Kurita R., Nakamura Y., Yang L., Liu M., Li D. 2020. Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells. Nature Biotechnology, 38: 856-860 Wang H., Yang H., Shivalila C. S., Dawlaty M. M., Cheng A. W., Zhang F., Jaenisch R. 2013.
One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 153, 4: 910-918
Wondji C. S., Hemingway J., Ranson H. 2007. Identification and analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the mosquito Anopheles funestus, malaria vector. BMC Genomics, 8, 5, doi: 10.1186/1471-2164-8-5: 13 str.
20 ZAHVALA
Zahvaljujem se doc. dr. Jerneju Ogorevcu za pomoč, nasvete in potrpežljivost pri izdelavi diplomske naloge.
Zahvaljujem se tudi sestri Lani za pomoč, ter staršema za spodbudo.
