UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
DIPLOMSKO DELO
Adela Avdičević
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE
KEMIJA
Vloga elektrostatskih interakcij v proteinskih sistemih
DIPLOMSKO DELO
Adela Avdičević
MENTOR: izr. prof. dr. Miha Lukšič
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
diplomskega dela
Spodaj podpisana Adela Avdičević sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Vloga elektrostatskih interakcij v proteinskih sistemih.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom izr.
prof dr. Mihe Lukšiča;
sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in
sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št.
16/2007);
sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;
je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.
V Ljubljani, 31. 8. 2021 Podpis avtorice:
ZAHVALA
Rada bi se zahvalila svojemu mentorju izr. prof. dr. Mihi Lukšiču, ker me je sprejel pod svoje mentorstvo, pomagal pri izbiri teme, mi vedno strokovno svetoval in me usmerjal pri pisanju diplomske naloge.
Iskrena hvala tudi mojima staršema, da sta mi finančno omogočila študij ter da sta me vedno podpirala, spodbujala in mi z vso ljubeznijo in potrpljenjem stala ob strani tako v lepih kot tudi v težkih trenutkih.
Prav tako se zahvaljujem svoji sestri dvojčici Ameli, da je bila ob meni na vsakem koraku te poti. Hvala ti za vso razumevanje, podporo ter da si v vseh mojih vzponih in padcih vedno verjela vame.
Rada bi se zahvalila tudi svojemu fantu Leonu, da je bil vedno ob meni ter njegovi družini za vso moralno podporo in ostalo pomoč.
Hvala tudi vsem ostalim, ki ste mi vsa ta leta stali ob strani.
Vloga elektrostatskih interakcij v proteinskih sistemih.
Povzetek: V svoji diplomski nalogi sem se osredotočila na vlogo elektrostatskih interakcij v proteinskih sistemih. Orisala sem dva implicitna teoretična modela za obravnavo elektrostatike pri proteinih: Bornov in Poisson-Boltzmannov model.
Elektrostatske interakcije so pri proteinih močno odvisne od njihove zgradbe, pa tudi od pH raztopine, temperature, prisotnosti soli in kofaktorjev. Igrajo zelo pomembno vlogo (zlasti vodikova vez in solni mostički) na zvijanje in s tem na strukturo proteinov.
Pomembne so tudi za topnost proteinov, interakcije proteinov z drugimi biološkimi molekulami ter interakcije protein-protein, zaradi katerih pride do samozdruževanja le- teh.
Proteini se lahko tudi napačno zvijejo, kar vodi do agregacije. Ti agregati se začnejo kopičiti v tkivu, zaradi česa celica ne more več opravljati svoje funkcije, kar vodi do nastanka nevrodegenerativnih bolezni. Te bolezni so danes zelo razširjene, na žalost pa so še vedno neozdravljive.
Ključne besede: proteini, aminokisline, elektrostatske interakcije, vodikova vez, solni mostički, protein-protein interakcije, Hofmeistrova vrsta, agregacija proteinov
The role of electrostatic interactions in protein systems.
Abstract: In my diploma, I focused on the role of electrostatic interactions in protein systems. Outline of two implicit theoretical models used for treating electrostatics in systems containing proteins will be given: the Born and the Poisson-Boltzmann model.
Electrostatic interactions are strongly dependent on the protein composition, as well as on pH, temperature, presence of salts, and cofactors. They play a very important role (especially hydrogen bonding and salt bridges) in folding and thus in protein structure.
They are also important for protein solubility, protein interactions with other biological molecules, and protein-protein interactions that lead to protein self-aggregation, as proteins in the vast majority of cases do not act on their own.
Proteins can also be misfolded, which leads to protein aggregation. These aggregates begin to accumulate in the tissue, causing the cell to no longer be able to perform its function, leading to the development of neurodegenerative diseases. These diseases are very common today, but unfortunately they are still not curable.
Keywords: proteins, amino acids, electrostatic interactions, hydrogen bonding, salt bridges, protein-protein interactions, Hofmeister series, protein aggregation
Kazalo vsebine
1. Uvod ... 1
1.1. Proteini ... 2
1.1.1. Aminokisline ... 4
1.2. Elektrostatske interakcije ... 9
1.2.1. Ionske interakcije ... 9
1.2.2. Solni mostički... 10
1.2.3. Vodikova vez... 11
1.2.4. Halogenska vez ... 11
2. Namen dela ... 12
3. Teoretično ozadje ... 13
3.1. Modeli ... 13
3.1.1. Bornov model ... 13
3.1.2. Poisson–Boltzmannov model ... 14
3.2. Zvijanje proteinov in stabilnost nativne strukture ... 15
3.2.1. Vpliv pH ... 17
3.2.2. Vpliv mutacij ... 17
3.3. Vezava in samozdruževanje proteinov ... 18
3.3.1. Interakcije protein-protein ... 18
3.3.2. Interakcije proteinov z DNK/RNK ... 19
3.3.3. Interakcije proteinov s plazemsko membrano in organeli ... 20
3.4. Topnost proteinov ... 21
3.5. Napačno zvijanje proteinov ... 25
3.5.1. Vloga napačno zvitih proteinov pri razvoju nevrodegerativnih bolezni ... 26
3.4.2. Proteinski agregati... 27
3.4.3. Amiloidni agregati ... 28
4. Zaključek ... 30
5. Literatura ... 31
Seznam uporabljenih kratic in simbolov:
Å - angstrom (10−10 m)
AD – Alzheimerjeva bolezen (angl. Alzheimer's disease)
AK – aminokislina
ALS – amiotrofična lateralna skleroza (angl. amyotrophic lateral sclerosis)
DH - Debye–Hückel
DNK – deoksiribonukleinska kislina
GB – posplošeni Bornov model (angl. generalized Born) HD - Huntingtonova bolezen (angl. Huntington's disease) M – molarna koncentracija (mol/L)
mRNA - informacijska ribonukleinska kislina (angl. messenger ribonucleic acid) PB - Poisson–Boltzmann
PD- Parkinsonova bolezen (angl. Parkinson's disease)
pH – negativni desetiški logaritem aktivnosti oksonijevih ionov pI – izoelektrična točka (angl. isoelectric point)
pKa – negativni desetiški logaritem ionizacijske konstante
PPI – protein-protein interakcija (angl. protein–protein interactions) PrP – prionski protein
RNK – ribonukleinska kislina
TSE – prenosljiva spongiformna encefalopatija (angl. transmissible spongiform encephalopathies)
εr – relativna dielektrična konstanta
1
1. Uvod
Proteini (beljakovine) so biološke makromolekule. Tako kot maščobe in ogljikovi hidrati spadajo med makrohranila, saj jih je s hrano treba zaužiti v večjih količinah. Za organizem predstavljajo vir energije, dušika in aminokislin, iz katerih lahko celice nato sintetizirajo lastne proteine. Proteini so pomemben sestavni del vseh živalskih in rastlinskih celic. Opravljajo mnoge za življenje pomembne funkcije: so ključni gradniki celičnih struktur, so nujno potrebni za rast in razvoj, delujejo kot encimi, sodelujejo pri imunskem odzivu, izgradnji in delovanju mišičevja, vključeni so v popravljalne mehanizme in v prenos številnih snovi po organizmu itd. [1].
Proteine najdemo v velikem številu živil živalskega in rastlinskega izvora. Bogati viri živalskih beljakovin so jajca, mleko in mlečni izdelki, ribe in morski sadeži ter seveda meso. Slednje je za večino prebivalstva najpomembnejši vir beljakovin. Med s proteini bogate rastlinske vire uvrščamo stročnice, žita in oreščke. Toplotna obdelava na splošno izboljša biorazpoložljivost beljakovin in tudi njihov okus [1].
Beljakovinska živila se med seboj razlikujejo tako po količini kot po vrsti proteinov.
Različni viri vsebujejo zelo različne količine esencialnih aminokislin. Živila živalskega izvora v splošnem vsebujejo več proteinov kot rastlinska živila, hkrati pa tudi večje deleže za človeka esencialnih aminokislin. S tega vidika velja večina beljakovin živalskega izvora za visokokakovostne, medtem ko rastlinskih praviloma ne moremo uvrstiti med visokokakovostne. Če v prehrani določene aminokisline primanjkuje, to hkrati omejuje sposobnost telesa za uporabo preostalih aminokislin, ki jih je v prehrani sicer lahko dovolj [1].
Priporočljiv dnevni vnos beljakovin znaša 59 g/dan za odrasle moške in 47 g/dan za odrasle ženske. S starostjo se ta potreba nekoliko zniža, vendar ne bistveno: od 50. leta dalje približno 1 g na vsakih 10 let. Nekoliko več beljakovin potrebujejo otroci in nosečnice od 4. meseca nosečnosti dalje [2].
2
1.1. Proteini
Proteini so osnovne makromolekule vseh živih celic. Zgrajeni so iz aminokislin.
Molekule proteinov se razlikujejo po svoji strukturi; poznamo, denimo, globularne, fibrilarne in membranske proteine. Le-te je mogoče razdeliti tudi glede na funkcijo, ki jo v telesu opravljajo [3].
Fibrilarni proteini so v vodi netopni. Imajo veliko natezno čvrstost ter togo strukturo (konformacijo). Najbolj znani predstavniki fibrilarnih proteinov so: kolagen, elastin, miozin in keratin. Globularni proteini so v vodi topni. Imajo izredno dinamičen nabor vlog, ki jih opravljajo. Po strukturi so urejeni in relativno fleksibilni. V to skupino spadajo: albumin, hemoglobin, mioglobin, ribonukleaza, lizocim, citokrom C, imunoglobulin idr. Membranske proteine najdemo v membranah celic. Pomagajo pri številnih celičnih funkcijah, vključno s transportom snovi skozi membrane in pripajanjem celic na druge strukture. Najbolj znana membranska proteina sta transporter glukoze in histon [3].
Proteini so sestavljeni iz več različnih aminokislin (AK), ki so med seboj povezane s kovalentno peptidno vezjo v polimerno strukturo. Prikaz nastanka te vezi je prikazan na sliki 1. Čeprav v naravi najdemo na stotine AK, so proteini zgrajeni iz skromnega nabora 20 AK, kljub temu pa izkazujejo osupljivo sposobnost tvorbe različnih struktur z visoko specifičnimi katalitičnimi mesti na površini. Posledično proteini na različnih fizioloških nivojih izvajajo v živih bitjih številne kompleksne biokemijske procese. Strukturo proteina lahko tvori ena ali več verig AK, protein pa je zgrajen iz vsaj ene polipeptidne verige. Krajše verige z manj kot 30 AK praviloma imenujemo peptidi ali oligopeptidi [4, 5].
3 Slika 1: Prikaz nastanka peptidne vezi iz dveh aminokisllin (dipeptid). Povzeto po [6].
Primarna struktura proteinov je točno določeno zaporedje aminokislin, ki tvorijo polipeptidno verigo. Le-to določa sekundarno, terciarno in kvartarno strukturo proteina [7]. Sekundarno strukturo proteinov opazimo kot ponavljajoče se vzorce zvijanja polipeptidne verige. Dva najpogostejša vzorca sta α-vijačnica in β-ploskev. Terciarna struktura proteinov se nanaša na splošno zlaganje celotne polipeptidne verige v določeno 3D-strukturo. Terciarna struktura proteinov je pogosto kompaktne oblike (bolj ali manj kroglaste). Številni proteini so zgrajeni iz več kot ene polipeptidne verige.
Kvartarna struktura opisuje način pakiranja teh različnih podenot. Na sliki 2 so shematsko prikazane ravni proteinske strukture [8].
4 Slika 2: Ravni proteinske strukture: primarna, sekundarna, tericarna in kvartarna
struktura. Povzeto po [9].
1.1.1. Aminokisline
Aminokisline so nizkomolekularne organske molekule, ki v povezavi z drugimi aminokislinami tvorijo proteine. AK so bistvene za življenje, ker proteini, ki jih tvorijo, sodelujejo v skoraj vseh celičnih funkcijah. Nekateri proteini delujejo kot encimi, nekateri kot protitelesa, spet tretji zagotavljajo strukturno podporo itd. Zaporedje aminokislin proteinov je določeno z informacijami v celični genetski kodi. Genetska koda je zaporedje nukleotidnih baz v nukleinskih kislinah (DNK in RNK), ki kodirajo aminokisline. Te kode ne določajo le vrstnega reda aminokislin v proteinih, temveč posredno tudi njihovo fukcijo in strukturo [10].
5 Aminokisline so sicer nujne za življenje, vendar jih človeško telo ni zmožno vseh proizvesti. Od 20 aminokislin jih lahko telo sintetizira 11 (za razliko od rastlin, ki so sposobne sintetizirati vseh 20 AK). Te neesencialne aminokisline so alanin, arginin, asparagin, aspartat, cistein, glutamat, glutamin, glicin, prolin, serin in tirozin. Z izjemo tirozina se sintetizirajo iz produktov ali intermediatov ključnih presnovnih poti. Na primer: alanin in aspartat se sintetizirata iz snovi, ki nastanejo med celičnim dihanjem.
Alanin se sintetizira iz piruvata, produkta glikolize. Aspartat se sintetizira iz oksaloacetata, intermediata cikla citronske kisline. Arginin, cistein, glutamin, glicin, prolin in tirozin so pogojno neesencialne AK, saj jih normalno telo samo proizvede v dovoljšnih količinah, v določenih okoliščinah pa je potreben vnos s hrano.
Aminokisline, ki jih ni mogoče naravno proizvesti, se imenujejo esencialne AK. To so histidin, izolevcin, levcin, lizin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan in valin. Te AK je treba pridobiti s prehrano. Cistein, tirozin, histidin in arginin pa so pri otrocih celo esencialne, saj jih ne morejo sintetizirati v dovoljšnjih količinah [10].
Struktura aminokislin je medseboj podobna: vse aminokisline imajo alfa ogljik, na katerega so vezani atom vodika, karboksilna skupina (-COOH), aminska skupina (-NH2) ter stranska skupina "R" (aminokislinski ostanek). AK se razlikujejo ravno v stranski skupini [10]. Za človeka relevantne aminoksiline so navedene v tabeli 1 in prikazane na sliki 3. Glede na stransko verigo ločimo nepolarne in polarne AK. Polarne AK so lahko nenabite ali nabite, v kolikor lahko stranska skupina odda ali sprejme proton. Delimo jih na hidrofobne in hidrofilne, na alifatske in aromatske. Pri tovrstni razdelitvi lahko izpostavimo dve izjemi:
1. Tirozin ima aromatsko in -OH skupino in velja za polarno nenabito aminokislino.
2. Metionin vsebuje žveplo, vendar kot del ogljikove verige. Žveplo ima podobno elektronegativnost kot ogljik, zato velja za nepolarno aminokislino [11] . Aminokisline krajše zapisemo z eno ali tričrkovno kodo (tabela 1). V tabeli 1 so podane tudi vrednosti ionizacijskih konstant skupin 𝛼-COOH (pKa1) in 𝛼-NH2 (pKa2), izoelektrične točke (pI) ter molska masa posamezne aminokisline.
6 LASTNOSTI STRANSKE
VERIGE IME AK OKRAJŠAVA pKa1 pKa2 pI
MOLSKA MASA (g/mol)
nepolarne
hidrofobne:
alifatske
alanin A ala 2,34 9,69 6,01 89,1
glicin G gly 2,34 9,60 5,97 75,1 izolevcin I ile 2,36 9,68 6,02 131,2
levcin L leu 2,36 9,60 5,98 131,2 metionin M met 2,28 9,21 5,74 149,2 prolin P pro 1,99 10,96 6,48 115,1
valin V val 2,32 9,62 5,97 117,2
hidrofobne:
aromatske
fenilanilin F phe 2,83 9,13 5,48 165,2 triptofan W trp 2,38 9,39 5,89 204,2
polarne,
nenabite hidrofilne
cistein C cys 1,96 10,28 5,07 121,2 asparagin N asn 2,02 8,80 5,41 132,1 glutamin Q gln 2,17 9,13 5,65 146,2
serin S ser 2,21 9,15 5,68 105,1
treonin T thr 2,20 9,11 5,66 119,1 tirozin Y tyr 2,11 9,62 5,87 181,2
polarne, nabite
hidrofilne:
kisle (negativno
nabite)
asparaginska
kislina D asp 1,88 9,60 2,77 133,1 glutaminska
kislina E glu 2,19 9,67 3,22 147,1 hidrofilne:
bazične (pozitivno
nabite)
histidin H his 1,82 9,17 7,59 155,2
lizin K lys 2,18 8,95 9,74 146,2 arginin R arg 2,17 9,04 10,76 174,2
Tabela 1: Razvrstitetev 20 aminokislin po lastnostih aminokislinskega ostanka.
Povzeto po [12,13].
7 Slika 3: Strukturne formule 20 osnovnih aminokislin pri pH vrednosti 7,0. Vijolično
obarvani deli so stranske (R) skupine. Povzeto po [14].
8 Nepolarne aminokisline.
Stranske skupine teh aminokislin so enostavni, ne preveč reaktivni ogljikovodiki. Te aminokisline se zaradi hidrofobnega značaja alifatskih oziroma aromatskih stranskih skupin nahajajo predvsem v notranjosti proteinov. V vodnih raztopinah se globularni proteini zvijejo v tridimenzionalno obliko tako, da se hidrofobne AK skrijejo bolj v notranjost proteinov (niso izpostavljene na površini) [15].
Polarne, nenabite aminokisline.
Te hidrofilne aminokisline imajo širok spekter funkcionalnih skupin, za katere je značilno, da vsebujejo heteroatome (dušik, kisik, žveplo), ki s prostim elektronskim parom omogočajo nastanek vodikovih vezi. Posebno zanimiv in biokemijsko pomemben je cistein, ki s tiolno (-SH) skupino v oksidativnih razmerah omogoča nastanek kovalentne disulfidne vezi (S-S) med dvema cisteinoma. Disulfidni mostički so izrednega pomena za mnoge proteine [15].
Polarne, nabite aminokisline.
Stranske skupine teh aminokislin kažejo dodatne bazične in kisle lastnosti. Kisle aminokisline imajo pri nevtralnem pH negativen naboj. Ta negativni naboj se pojavi kot posledica deprotonacije karboksilne funkcionalne skupine na stranski verigi.
Karboksilna skupina je šibka kislina in v vodni raztopini odda proton, ko je pH-vrednost večja od negativnega desetiškega logaritma njene ionizacijske konstante (pKa) ter tako postane negativno nabita. (pKa je merilo jakosti kisline: manjša ko je vrednost pKa, večja je kislost). Sem spadata: asparaginska in glutaminska kislina (v ionski obliki ju imenujemo aspartat in glutamat). Ti dve AK sta hidrofilni in se praviloma nahajata na površini proteinov [5,16].
Bazične aminokisline so tiste, ki imajo pri nevtralnem pH pozitiven naboj. Ta pozitivni naboj se pojavi kot posledica protonacije aminske funkcionalne skupine na stranski verigi. Aminska skupina je šibka baza, ki lahko pri pH-vrednostih nižjih od negativnega desetiškega logaritma svoje disociacijske konstante sprejme proton in tako postane pozitivno nabita [5].
Titracijska krivulja aminokislin, ki lahko oddajo/sprejmejo proton na stranski skupini, se nekoliko razlikuje od ostalih aminokislin; ima tri prevojne točke, od katerih ena ustreza -COOH oz. -NH2 skupini na stranski verigi [16]. Vsak protein je unikaten v svojem AK zaporedju (primarna struktura). Ravno zaradi tega ima vsak protein svojo izoelektrično točko, pI [5]. Naboji na stranskih skupinah (kot tudi na terminalnih AK) so pri danem pH odgovorni za daljnosežne elektrostatske interakcije [5,16].
9
1.2. Elektrostatske interakcije
Elektrostatske interakcije so vrsta privlačnih oziroma odbojnih sil, ki delujejo med električno nabitimi delci. Gre za nekovalentne interakcije, saj ne pride do delitve elektronov med dvema atomoma. Med nekovalentne interakcije štejemo tudi van der Waalsove interakcije, -interakcije ter hidrofobni efekt. Elektrostatske interakcije so pomembne pri ionski vezi (interakcija med ioni), vodikovi vezi ter halogenski vezi [17].
Sila med dvema stacionarnima točkastima nabitima delcema z nabojema q1 in q2, ki sta oddaljena za razdaljo r12, je podana s Coulombovim zakonom:
𝐹 (𝑟12) = 1 4𝜋𝜀0𝜀𝑟
|𝑞1| ∙ |𝑞2|
𝑟122 (1)
pri čemer je 𝜀0 permitivnost vakuuma, 𝜀𝑟 pa dielektična konstanta medija.
Elektrostatska energija interakcije med dvema nabojema (Coulombov potencial) je definirana kot integral sile po razdalji (od neskončnosti do razdalje r12):
𝐸 (𝑟12) = 1
4𝜋𝜀0𝜀 𝑞1 ∙ 𝑞2
𝑟12 (2)
Celotno elektrostatsko energijo sistema nabojev dobimo s (v približku) seštevanjem posameznih parov. S poznavanjem dipolnih momentov vezi lahko določimo skupni naboj posameznih atomov. Izraz za E velja le za točkaste ali sferično simetrične naboje, zato tega pristopa ni mogoče z veliko natančnostjo uporabiti za verigo polipeptida.
Monopolne naboje lahko aproksimiramo z efektivnim dipolnim momentom na sredini vezi med atomoma. Na ta način dobimo dokaj zanesljive rezultate za oceno interakcije med bolj oddaljenimi atomi [18].
1.2.1. Ionske interakcije
Privlačne elektrostatske interakcije med dvema nasprotno nabitima ionoma ali molekulama s permanentnim nabojem imenujemo ionske interakcije. So zelo močne interakcijske sile, zato obstajajo ionske spojine tudi v trdnem stanju. V primeru proteinov predstavljajo kisli oziroma bazični aminokislinski ostanki potencialna mesta na proteinu, ki se lahko deprotonirajo oziroma protonirajo. Te nabite skupine lahko interagirajo z nabitimi skupinami, ki so dovolj blizu skupaj (na primer ioni v raztopini proteina interagirajo z nabitimi AK ostanki) [17].
10 1.2.2. Solni mostički
Elektrostatska »povezava« dveh ionskih skupin z nasprotnima nabojema, ki sta del proteina, se imenuje ionski par ali solni most. Zavedati se moramo, da so ioni v vodni raztopini hidratirani. Tvorba solnega mostička je ugodna z energijskega vidika, neugodna pa z entropijskega vidika (pride do lokalizacije dveh skupin, ki tvorita solni most). Prosta energija raztapljanja dveh ločenih ionov je približno enaka prosti energiji tvorbe njunega nesolvatiranega ionskega para (brez upoštevanja entropijske »kazni«).
Zaradi tega solni mostički navadno malo prispevajo k stabilnosti nativne strukture [18].
Solni mostički v proteinih so vezi med nasprotno nabitimi ostanki, ki so med seboj dovolj blizu, da pride do elektrostatskega privlaka. So posledica ionske interakcije, kakor tudi vodikove vez. Primer solnega mostička je prikazan na sliki 4. Prispevajo k specifičnosti interakcij proteinov z drugimi biomolekulami [19].
Slika 4: Primer solnega mostička med asparaginsko kislino (negativno nabita) in argininom (pozitivno nabit). Povzeto po [20].
Nastanek solnega mostička je odvisen od protonacijskega stanja kislih/bazičnih AK in s tem vrednosti pH raztopine. Treba je opozoriti, da igra privlak/odboj pomembno vlogo tudi, če sta geometrijski središči funkcionalnih skupin ločeni za več kot 4 Å (razdalja, ki se običajno uporablja za identifikacijo solnega mostu). Daljnosežne elektrostatske interakcije niso pomembne samo za stabilnost proteinov (struktura), temveč tudi za njihovo funkcionalnost (vezava liganda, kataliza itd.) [21].
11 1.2.3. Vodikova vez
Vodikova vez je privlačna elektrostatska interakcija med vodikovim atomom molekule ali molekulskega fragmenta X-H, kjer je X bolj elektronegativen element od vodika (kisik, dušik), in elektronegativnim atomom Y (kisik, dušik) iste ali različne molekule.
Vodikovo vez ponazorimo kot X-H···Y, kjer tri pikice predstavljajo vodikovo vez. X- H predstavlja donor vodikove vezi, atoma sta med seboj povezana s kovalentno vezjo.
Y predstavlja akceptor vodikove vezi. Jakost vodikovih vezi je odvisna od lokalnega okolja [22].
1.2.4. Halogenska vez
Halogenska vez je privlačna, nekovalentna interakcija, ki ne vključuje tvorbe niti prekinitve dejanskih vezi, temveč je podobna vodikovi vezi. Pri halogenski vezi atom halogena deluje kot elektrofil in tvori šibko elektrostatsko interakcijo z nukleofilnimi oziroma z elektroni bogatimi zvrstmi. Nukleofil je v teh interakcijah ponavadi močno elektronegativen atom (na primer kisik, dušik ali žveplo) ali pa je anion (negativni naboj). Halogenska vez igra pomembno vlogo na področju supramolekularne kemije, kristalnem inženirstvu in proizvodnji tekočih kristalov [23].
12
2. Namen dela
Nekovalentne interakcije (elektrostatske, Van der Waalsove, hidrofobne interakcije) igrajo pomembno vlogo v kemiji in fiziki. Zlasti relevantne so pri interakcijah bioloških makromolekul, kamor sodijo tudi proteini.
Moj namen je bil v diplomski nalogi predstaviti vpliv elektrostatskih interakcij na zvijanje in s tem posledično strukturo proteinov, na njihovo topnost, na vezavo proteinov z drugimi biološkimi molekulami ter na interakcije protein-protein, ki vodijo do samozdruževanja molekul proteinov. Na koncu sem še na kratko opisala meni osebno zelo zanimivo temo: nastanek bolezni, do katerih pride zaradi napačnega zvijanja proteinov.
13
3. Teoretično ozadje 3.1. Modeli
Pri implicitni obravnavi hidratacije topljencev, ki imajo elektrostatski karakter, je relevantna količina dielektrična konstanta vode. Elektrostatska interakcija med dvema nabojema v polarizabilnem mediju (kot je voda) je zaradi efekta senčenja naboja manjša kot v vakuumu (enačba 2). Senčenje je posledica dejstva, da ioni polarizirajo medij, v katerem se nahajajo. Implicitni modeli vode obravnavajo vodo kot dielektrični kontinuum. Vloga vode na interakcije med ioni je obravnavana zgolj preko relativne dielektrične konstante, 𝜀𝑟. Prednost implicitnih modelov v primeru obravnave kompleksnih molekul, kot so proteini, je v hitrosti računanja, slabost pa v tem, da ne moremo obravnavati določenih detajlov, kot so npr. vodikova vez ter posledično korelacije voda-voda, voda-protein, protein-protein.
3.1.1. Bornov model
Prosto entalpijo solvatacije (ΔsolvG) posameznih ionov je mogoče oceniti iz enačbe, ki jo je izpeljal Max Born. ΔsolvG je identificiral z električnim delom, ki je potrebno za prenos iona iz vakuuma v topilo z relativno dielektrično konstanto 𝜀𝑟. Bornova enačba se glasi [24]:
𝑠𝑜𝑙𝑣𝐺 = − 𝑞2𝑁𝐴
8𝜋𝜀0𝑎 (1 − 1
𝜀𝑟) (3)
kjer je q naboj iona in a njegov polmer, NA pa je Avogadrovo število. Upoštevati moramo, da je ΔsolvG močno negativna za majhne ione z velikim nabojem, ki se nahajajo v mediju z nizko dielektrično konstanto [25]. V primeru, ko lahko molekulo topljenca modeliramo kot skupek nabitih kroglic, razdalja med naboji pa je dosti večja od radijev kroglic, lahko prosto entalpijo solvatacije molekule izrazimo kot vsoto Bornovih členov (enačba 3) ter parskih Coulombovih energij (enačba 2). V posplošenem Bornovem modelu ta dva člena zamenjamo z enim samim členom, pri čemer radij sfere ter razdaljo med nabojema nadomestimo s funkcijo fGB [24]:
𝑠𝑜𝑙𝑣𝐺GB= − 𝑁𝐴
8𝜋𝜀0 (1 − 1
𝜀𝑟) ∑𝑞𝑖𝑞𝑗 𝑓GB
𝑖,𝑗
(4)
14 Model je potrebno parametrizirati z izbiro ustreznih efektivnih radijev atomov. Običajno je posplošeni Bornov model parametriziran na podlagi Poisson-Boltzmannovega modela.
3.1.2. Poisson–Boltzmannov model
Poisson-Boltznamov model prav tako obravnava topilo implicitno. Vse interakcije med naboji so upoštevane preko Coulombovega zakona, seštete skupaj s pomočjo reševanja Poissonove enačbe za dano porazdelitev fiksnih (ali mobilnih) nabojev (Boltzmannova distribucija). Pri reševanju enačb moramo definirati dielektrično mejo ter izbrati vrednosti dielektričnih konstant, ki pripadajo posamezni regiji. Numerično reševanje je bolj zahtevno od Bornovega modela.
Poisson-Boltzmannova enačba je odigrala pomembno vlogo pri razvoju Debye- Hücklove teorije razredčenih raztopin elektrolitov. Kot pove že ime, temelji na dveh komponentah: Poissonovi enačbi, ki povezuje lokalno gostoto naboja ρe ter lokalni elektrostatski potencial φ, in Boltzmannove porazdelitve, ki podaja porazdelitve naboja okoli izbranega centralnega iona. Če enačbi povežemo, dobimo Poisson- Boltzmannovo enačbo. Če bi bili položaji ionov v raztopini elektrolita popolnoma naključni, bi bil skupni učinek elektrostatskih interakcij v povprečju enak nič. Vsak odboj kation-kation ali anion-anion bi bil kompenziran s privlakom kation-anion. V dejanski raztopini položaji ionov niso naključni: vsak kation ima v neposrednem okolju presežek anionov (ionska atmosfera ali oblak), vsak anion pa ima okoli sebe presežek kationov [26,27].
Centralni (pozitivni ali negativni) ion je obdan z (negativno ali pozitivno) ionsko atmosfero [26]. Za raztopino elektrolita s koncentracijo nemotene raztopine 𝑐0 se Poisson-Boltznannova enačba glasi [28]:
∇2𝜑 = 𝑐0𝑒 𝜀0𝜀𝑟[𝑒
𝑒𝜑 𝑘𝐵𝑇− 𝑒−
𝑒𝜑
𝑘𝐵𝑇] (5)
pri čemer ∇2 označuje Laplaceov operator, e je elementarni naboj, kB je Boltzmannova konstanta, T pa absolutna temperatura [28]. Rešitev enačbe (5) je elektrostatski potencial.
Izračuni, ki temeljijo na Poisson-Boltzmannovi enačbi, so se izkazali za še posebej koristne pri razumevanju elektrostatskih lastnosti bioloških makromolekul. Metoda je bila uporabljena tudi za preučevanje vezave liganda na proteine. Pri uporabi metode so še vedno nekateri praktični izzivi, od katerih mnogi izhajajo iz uporabljenih numeričnih približkov [29].
15
3.2. Zvijanje proteinov in stabilnost nativne strukture
Zvijanje proteinov (angl. protein folding) je kompleksen fizikalen proces, kjer se polipeptid zvije v svojo karakteristično in funkcionalno 3D-strukturo, t.i. nativno obliko.
Obraten proces od zvijanja imenujemo denaturacija proteina. To je prehod proteina iz zvitega v nezvito stanje, torej porušenje njegove 3D-strukture. Razviti proteini dolgoročno niso stabilni in so biološko neaktivni. Zvitje je odvisno od številnih dejavnikov, kot so na primer topilo, vrednosti pH, temperature, prisotnosti kofaktorjev, naboja, prisotnost soli (elektrolita) itd. Do denaturacije lahko pride zaradi povišanja temperature (porušijo se H-vezi), spremembe vrednosti pH (spremenijo se elektrostatske interakcije) ali zaradi prisotnosti majhnih molekul (gvanidinijev hidroklorid, urea) in organskih topil, kot je etanol (povzroči porušenje hidrofobnih interakcij) [30].
Zvijanje proteina ne poteka naključno, temveč po v naprej določenih poteh konformacijskega faznega prostora, ki so se razvile tekom evolucije. Na takšni potencialni ploskvi, lahko nezvita polipeptidna veriga v procesu proteinskega zvijanja zaide na različne poti, ki vodijo do končne, nativne proteinske strukture [30].
Do danes so predlagali že več modelov zvijanja proteinov. En model predlaga, da je proces zvijanja postopen, ker so nekatera stanja bolj termodinamsko stabilna kot druga.
Protein se najprej zvije lokalno, kasneje pa se začne zvijati zaradi daljnosežnih interakcij, dokler ne doseže nativne strukture [31]. Drugi model predlaga spontano zvitje polipeptida v kompaktno strukturo zaradi hidrofobnega efekta. Pri tem so pomembne interakcije med nepolarnimi aminokislinskimi ostanki. Podobno kot pri prvem modelu poteka postopek v korakih [32]. Zvijanje večine proteinov je verjetno kombinacija podmen obeh modelov [5]. Po zvitju proteina se tako razdalja med naboji kot tudi okolje, s katerim je protein v stiku s topilom, bistveno spremenita. Težko je izračunati ali izmeriti celotni elektrostatski prispevek k zvijanju proteinov [33].
Spodnja slika (slika 5) nam prikazuje nastanek nativne proteinske strukture, ki nastane kot posledica intramolekularnih interakcij hidrofobnih delov (črno obarvane) intermediatov. Hidrofobni deli se skrijejo v notranjosti proteina medtem ko se hidrofilni deli nahajajo na površini, saj raje stopijo v stik s polarno vodo. [5,32].
16 Slika 5: Postopek zvijanja proteina preko intermediatov do nativne strukture. Povzeto
po [32].
Stabilnost proteina definiramo kot težnjo po vzdrževanju tridimenzionalne nativne konformacije [5]. Pravilno zvijanje in stabilnost proteinov se ohranja s številnimi interakcijami med AK ostanki, ki so zakopani v notranjosti zvitega proteina, kakor tudi med ostanki, ki so na površini proteina in izpostavljeni topilu. Tradicionalno sta hidrofobni efekt, vodikova vez, Van der Wallsove interakcije ter solvatacija veljale za prevladujoče, medtem ko je bila vloga površinskih lastnosti - zlasti elektrostatskih interakcij - pogosto zanemarjena. Čeprav so elektrostatske interakcije daljnosežne in s tem šibko specifične, lahko prispevajo k pravilnemu zvijanju in stabilnosti (npr. s solnimi mostički) [34].
Vpliv elektrostatike na stabilnost proteinov je kompleksen, zlasti zaradi tekmovanja med več vplivi, vključno z lokalnimi dipolnimi interakcijami, privlakom in odbojem med nabitimi AK ostanki in energijskimi prispevki solvatacije ioniziranih skupin (ki so odvisne od dielektričnih lastnosti topila, na katere vpliva temperatura). Poleg tega je treba pri obravnavanju stabilnosti upoštevati ravnovesje med elektrostatskim in hidrofobnim prispevkom. Zaradi te zapletenosti se zdi, da številne študije opozarjajo na nasprotujoče si rezultate glede moči stabilizacije/destabilizacije elektrostatskih interakcij [34]. Na strukturno stabilnost proteinov vpliva več dejavnikov in med temi se največkrat navaja pH-vrednost in temperatura sistema [5].
Položaj in okolica aminokislin sta ključnega pomena: hidrofobni AK ostanki so običajno skriti v jedro proteinske strukture, medtem ko so polarne in nabite aminokisline pogosteje izpostavljene topilu, razen če se s skritjem naboja v proteinsko jedro vzpostavi ugodnejša interakcija [34].
17 3.2.1. Vpliv pH
Čeprav se na splošno predpostavlja, da ima voda in vodno okolje v celicah nevtralno vrednost pH (7), se veliko proteinov v živih organizmih dejansko nahaja v okolju z vrednostmi pH, ki so daleč stran od 7. Na primer: nekateri znotrajcelični organeli (npr.
endosomi in lizosomi) imajo kisel pH. Proteini so običajno denaturirajo pri ekstremnih vrednostih pH, ker protonacija ali deprotonizacija ionizirajočih skupin povzroči elektrostatski odboj med istoimenskimi naboji. Želodec sesalcev se pri prebavi proteinov zanaša na to kislo denaturacijo. Po drugi strani pa so se bakterije, ki živijo v želodcu ali preidejo skozi želodec, temu ustrezno prilagodile.
Eksperimentalno določanje pKa vrednosti za nezvit protein je manj zanimivo, saj se to stanje ne pojavlja pogosto v živih organizmih [33].
3.2.2. Vpliv mutacij
Na podlagi pregleda velikega števila eksperimentalnih podatkov o učinkih mutacij na stabilnost proteinov je C.N. Pace s sodelavci predstavil prepričljive argumente, da tako hidrofobne interakcije kot vodikova vez veliko prispevajo k stabilnosti proteinov.
Ocenil je, da vodikova vez v povprečju poveča stabilnost za približno 1 kcal /mol [35].
Gao pa je ugotovil, da lahko vodikove vezi zagotovijo do 1,2 kcal/mol večjo stabilizacijo, kadar se nahajajo v nepolarnih okoljih kot kadar so izpostavljene polarnemu topilu [36].
Številni laboratoriji poročajo o uspehih pri spreminjanju površinskega naboja proteina s pomočjo mutacij AK z namenom povečanja stabilnosti. Strategija je v tem, da se pri proteinih, ki imajo velik neto naboj pri nevtralnem pH, zmanjša odbojne elektrostatske interakcije. V primeru, ko so nabite AK odgovorne za funkcijo proteina, lahko s tem, da jih zamenjamo (in s tem sicer povečamo stabilnost proteina) izgubimo njegovo biološko funkcijo [33].
18
3.3. Vezava in samozdruževanje proteinov
3.3.1. Interakcije protein-protein
Običajno proteini med izvajanjem svojih funkcij v živem organizmu skorajda ne delujejo samostojno. Ugotovljeno je bilo, da je več kot 80 % proteinov vezanih v kompleksih [37]. Interakcije protein-protein (angl. protein-protein interactions; PPI) so tako ključni mehanizem za ohranjanje funkcije celice, saj obvladujejo širok spekter bioloških procesov, vključno z medsebojnimi interakcijami med celicami ter nadzor presnove in razvoja. Sprememba PPI lahko spremeni kinetične lastnosti encimov, spremeni vezno mesto za majhne efektorske molekule, inaktivira ali zavire proteine ter spremeni specifičnost proteina za substrat [34].
Pri PPI gre za nekovalentne interakcije med AK ostanki. Glede na njihove strukturne in funkcionalne značilnosti jih lahko razvrstimo na več načinov. Na podlagi njihove interakcijske površine so lahko agregati homooligomerni ali heterooligomerni, če pa so merjeni z njihovo obstojnostjo, jih delimo na prehodne ali trajne. Prehodne interakcije tvorijo signalne poti, medtem ko trajne interakcije tvorijo stabilen proteinski kompleks [37, 38].
Študije so pokazale, da lahko med proteine z večjim številom interakcij štejemo encime, transkripcijske faktorje in intrinzično neurejene proteine [37]. Vendar te interakcije vključujejo bolj raznolike procese zato je obseg njihove regulacije velik. Funkcionalnost neidentificiranih proteinov je mogoče napovedati na podlagi interakcij s proteinom, katerega funkcija je že poznana [37].
Daljnosežne elektrostatske interakcije so še posebej zanimive pri samozdruževanju proteinov. Energija elektrostatske interakcije med dvema nabitima deloma, ki nosita enotski naboj, in sta med seboj oddaljena za 10 Å, je veliko večja od katerekoli druge vrste interakcij pri takšni razdalji. Seveda poleg elektrostatskih sil, vplivajo na PPI tudi koncentracija soli, pH ter stopnja zvitja proteina, kjer je hidrofoben del lahko bolj ali manj izpostavljen zunanjosti [5,34].
Pomembni kazalniki PPI interakcij so vrednosti pKa ionizirajočih skupin. Tvorba kompleksa lahko spremeni vrednosti pKa AK ostankov glede na vrednosti pKa v neveznih proteinih, zlasti če ti ostanki sodelujejo pri PPI. Premike v pKa lahko uporabimo kot indikator prispevka elektrostatike k stabilnosti kompleksa [38].
19 V sistemih, ki vsebujejo visoko koncentracijo proteinov v vodni raztopini, lahko pride do tvorbe dveh tekočinskih faz, do t.i. faznega prehoda tekoče-tekoče (angl. liquid- liquid phase transition). Sistem z dvema fazama dobimo, če raztopino ohladimo na temperaturo, ki je nižja od temprerature točke zmotnitve (angl. cloud point temperature). Pojavijo se zelo majhne kapljice agregiranega proteina: ena faza vsebuje zelo veliko koncentracijo proteina, medtem ko druga vsebuje izredno nizko koncentracijo proteina. Študij fazne separacije nam nudi vpogled v naravo PPI ter vplive na PPI [5].
3.3.2. Interakcije proteinov z DNK/RNK
Na splošno je elektrostatika pomembna pri interakcijah proteinov z drugimi polipeptidi ali s proteinskimi molekulami. Vpliv elektrostatskih interakcij pri proteinih se pojavi že med translacijskimi dogodki. Izhodni ribosomski tunel je negativno nabit, zato lahko na njegov lokalni elektrostatski potencial vplivajo nabite aminokisline nastajajočih peptidov, ko se premikajo po tunelu [38].
Elektrostatika ima tudi osrednjo vlogo pri interakciji proteinov z visoko nabitimi biološkimi molekulami, kot so DNK, RNK in membranski fosfolipidi. Na primer:
večina proteinov, ki se vežejo z nukleinskimi kislinami, je bogatih s pozitivno nabitimi AK ostanki (zlasti v njihovih vezavnih regijah) in le-ti povzročijo elektrostatski privlak z negativno nabito hrbtenico DNK/RNK. Zanimivo je, da lahko več proteinov, ki vežejo nukleinske kisline, povzroči motnje v regiji, ki veže DNK, kar daje prednost njihovi vezavi na DNK, vendar ovira vezavo drugih proteinskih partnerjev. Te interakcije večinoma poganjajo elektrostatske sile, ki prispevajo k moduliranju dostopnosti nukleinske kisline [38].
Nukleinske kisline, bodisi DNK ali RNK, so polimeri nukleotidov, od katerih vsak nosi negativno nabit fosfat. Dvoverižne molekule DNK imajo dobro znano strukturo (dvojna vijačnica), medtem ko enoverižne molekule RNK tvorijo terciarne strukture, ki nekoliko spominjajo na proteine. Interakcije DNK-protein so bistvenega pomena za razumevanje transkripcije, začetka bioloških procesov, vključno z normalno celično funkcijo, razvojem ter številnimi boleznimi. RNK igra glavno vlogo pri različnih funkcijah v celici [33,41].
20 Proteini, ki vežejo nukleinsko kislino, so vključeni v temeljne procese, kot so replikacija, popravilo DNK, transkripcija in celo virusna okužba. Čeprav fizikalna osnova za te postopke prepoznavanja ni popolnoma razumljena, nam rentgenska kristalografija, NMR spektroskopija in molekularno modeliranje nudijo veliko informacij o prepoznavanju DNK [39,40].
Čeprav je biološki pomen kompleksiranja proteinov z RNK dobro prepoznan, poseben mehanizem interakcije protein-RNK ni popolnoma razumljen. Merjenje interakcij DNK-protein in RNK-protein, specifičnih za zaporedje, je ključni eksperimentalni postopek v molekularni biologiji genske regulacije. Elektrostatske interakcije poganjajo nastanek nukleosoma, ki obsega približno 146 baznih parov genomske DNK, ovite okoli oktomera histona in je osnovna enota kromatina. Ni presenetljivo, da so vezavna mesta nukleinskih kislin na proteinih močno obogatena z bazičnimi ostanki [33,41].
Ionske interakcije med pozitivno naelektrenimi aminokislinami in fosfatnim kisikom so pomembne za stabilizacijo kompleksov in so lahko vključene v interakcije na dolge razdalje [40].
3.3.3. Interakcije proteinov s plazemsko membrano in organeli
Študije so pokazale, da se periferni proteini pritrdijo na biološke membrane bodisi zaradi njihove strukturne in geometrijske razporeditve, bodisi zaradi elektrostatskih interakcij z negativno nabiti lipidi [34]. Usklajevanje teh dveh »strategij adsorpcije proteinov«
bistveno vpliva na lokalizacijo proteinov na točno določenih mikro domenah in posledično na začetek procesov, ki vključujejo biološke membrane. [34].
Najpomembnejši lipid, ki sodeluje pri elektrostatskih interakcijah s proteini, je negativno nabit PtdSer. PtdSer se proizvaja z izmenjavo fosfolipidov med endoplazemskim retikulumom in mitohondriji na mestih, kjer sta organela v neposredni bližini. Negativni elektrostatski potencial površine privlači kationske sfingolipidne hidrolaze/transferaze in fosfolipaze, ki s svojo aktivnostjo povečajo številčnost svojih substratov in tako prispevajo k preoblikovanju membran. Izpostavljenost negativno nabitega dela PtdSer na zunanji strani plazemske membrane povzroči celične signalne kaskade tako znotrajcelično kot na zunajcelični ravni in celično smrt. Izčrpavanje PtdSer iz plazemsko membranskega citosola bi povzročilo sproščanje elektrostatsko vezanih proteinov v citosol, medtem ko bi njegova izpostavljenost okolici predstavljala možnost za rekrutiranje fagocitov in odstranjevanje mrtvih celic [34].
21 Elektrostatske lastnosti proteinov se nadalje modulirajo s post-translacijskimi modifikacijami, kot sta fosforilacija in lipidiranje (uvajanje negativnih nabojev), proteoliza pa odstranjuje nabita aminokislinska zaporedja [34].
3.4. Topnost proteinov
Med funkcionalnimi lastnostmi proteinov je njihova topnost primarnega pomena zaradi pomembnega vpliva na druge funkcionalne lastnosti. Z drugimi besedami: zmanjšanje topnosti proteinov neugodno vpliva na njegovo funkcionalnost. Topnost proteinov se nanaša na interakcije hidrofobnih površin proteinov in na hidrofilne interakcije proteinov s topilom. Gonilna sila topnosti proteinov so ugodne interakcije protein- topilo. Ko hidrofobni deli interagirajo med seboj, se prične tvorba agregatov, ki so v začetni stopnji dimerov in trimerov še topni v vodi, ko pa velikost gruč narašča, hitro prekoračimo mejo topnosti [5,42].
Topnost je odvisna od številnih dejavnikov, predvsem pa od pH in temperature. pH raztopine vpliva na naravo in porazdelitev neto naboja proteina. Na splošno so proteini bolj topni pri nizkih (kislih) pH ali visokih (bazičnih) vrednostih pH zaradi presežka nabojev istega predznaka. Le-ti povzročajo odboj med molekulami proteinov in posledično prispevajo k njegovi večji topnosti. Večji kot je neto naboj proteina, večja je njegova topnost [33,42].
Topnost lahko povečamo tudi tako, da izpostavljene nepolarne ostanke nadomestimo z nabitimi. Pomemben razlog za prisotnost nabitih AK ostankov v proteinih je zagotavljanje topnost in preprečevanje agregacije [33,42].
Drugi dejavnik, ki vpliva na topnost, je temperatura. Topnost proteinov se na splošno poveča s temperaturo med 40–50 °C. Če se temperatura raztopine za določen čas poviša na dovolj visoko, se proteini denaturirajo. Ta proces poteče zaradi vpliva temperature na nekovalentne vezi (vodikove, hidrofobne in elektrostatske interakcije), ki stabilizirajo sekundarno in terciarno strukturo proteina. Ko se sekundarne in terciarne strukture »razkrijejo« oz. porušijo, se hidrofobne skupine izpostavijo topilu (npr. -SH skupina, prvotno znotraj molekul proteinov. Kakršne koli hidrofobne interakcije vodijo do agregacije, čemur sledi koagulacija in obarjanje. Denaturacija zmanjša topnost v primerjavi z nativnimi proteini, in vodi do njihovega samozdruževanja [42].
22 Protein ima običajno najmanjšo topnost v izoelektrični točki (pI). Pri pH = pI je namreč neto naboj na proteinu enak nič. Molekule proteinov se bolj približajo in združijo, kar lahko vodi tudi do obarjanja. Pri vrednosti pH nad in pod pI ima protein neto negativni ali pozitivni naboj. Odbojne interakcije prispevajo k večji topnosti in proteini lahko ostanejo raztopljeni. Za veliko število proteinov je njihov pI v območju 3,5 in 6,5. Pri ekstremno kislih ali bazičnih vrednostih pH se lahko protein denaturira [42].
Organska topila, kot je recimo etanol, imajo veliko nižje dielektrične konstante kot voda, njihove mešanice z vodo pa imajo dielektrične konstante, ki so odvisne od razmerja organskega topila in vode v mešanici. Že dolgo je znano, da dodajanje organskih topil v vodo zmanjšuje topnost proteinov. Običajna razlaga je, da nižja dielektrična konstanta pomeni močnejšo elektrostatsko privlačno interakcijo (enačba 2). Molekule vode v proteinskih kristalih, ki nastanejo v vodnih mešanicah organskih topil, zavzemajo večino površine proteinov, organske molekule pa se vežejo zgolj na nekaj položajev.
Topnost se v glavnem zmanjša zaradi manj ugodnih interakcij proteinskih nabojev z manj polarno mešanico topil [18].
S prisotnostjo soli v raztopini lahko ioni nevtralizirajo naboje na površini proteina, kar prepreči njegovo agregacijo (slika 6). Topnost proteina se zviša, če je koncentracija soli dovolj nizka (< 0,5 M). S povečevanjem koncentracije soli se povečuje ionska moč raztopine [5]. Visoke koncentracije soli ponavadi vodijo do manjše topnosti oziroma oborijo protein. Efekt koncentracije soli na topnost proteina je prikazan na sliki 6. Ta pojav je leta 1888 dokumentiral Hofmeister in je poznan pod imenom Hofmeistrov efekt. Ioni dajejo prednost polarnemu okolju pred nepolarnim. Tako je za ione energijsko neugodno, da preidejo iz topila na površino proteina, čeprav taka prerazporeditev ionov zmanjša elektrostatsko energijo proteinskih nabojev. Soli imajo tako dva nasprotujoča si učinka: elektrostatska energija proteinskih nabojev daje prednost porazdelitvi protiionov po površini proteina, energija solviranja mobilnih ionov pa daje prednost hidraciji v topilu. Če lahko protein obstaja v dveh stanjih (na primer v zvitem in nezvitem) ali v dveh fazah (na primer raztopljen ali trden), ki se razlikujeta po površini in izpostavljenosti topilu, lahko soli, odvisno od njihove koncentracije, spremenijo ravnotežje v eno ali drugo stanje [33].
23 Slika 6: Shematski prikaz odvisnosti topnosti proteina od koncentracije soli v raztopini. Pri nizkih koncentracijah soli povzroči dodatek soli povečanje topnosti
proteina, pri visokih konncentracijah pa je efekt ravno obraten. Povzeto po [43].
Kirkwood je izračunal oba nasprotna energijska prispevka, da bi razložil odvisnost topnosti proteinov od koncentracije soli. Pokazal je, da pri nizkih koncentracijah soli, le te premaknejo ravnotežje proti fazi raztopine, tj. povečanju topnosti ali vsoljevanju. Po drugi strani pa pri visokih koncentracijah soli prispevek hidracije ionov prevladuje in soli nato premaknejo ravnotežje proti trdni (bodisi amorfni, bodisi kristalni) fazi [33].
Na splošno velja, če je pH raztopine nad pI, opazimo izsoljevanje. Ena razlaga tega pojava je, da ioni soli zadržujejo molekule vode in jim preprečujejo, da bi tvorili ugodne vodikove vezi s površino proteina. Posledično le-ti raje tvorijo medmolekularne interakcije med seboj, namesto z vodo, kar povzroči privlačne PPI. Privlačnost protein- protein je največja za koncentracijo soli 0,15 M. Nad to vrednostjo PPI postanejo veliko bolj odbojne. Ti učinki so bili pripisani odbojnim hidratacijskim silam, ki se pojavijo, ko se močno hidratirani kationi vežejo na negativno nabite površine. Izvor teh sil še vedno ni jasen, čeprav se predpostavlja, da izvirajo iz energije, ki je potrebna za motenje vodikove vezi [44].
24 Ko se koncentracija soli v območju izsoljevanja poveča, se topnost proteinov zmanjša zaradi privlaka med molekulami proteina, ki jih povzroča sol. Topnost je odvisna tudi od vrste soli glede na njen položaj v Hofmeistrovi vrsti. Ta vrsta je bila prvotno postravljena za razvrstitev učinkovitosti izsoljevanja različnih ionov za globularne proteine (slika 7) [44].
Slika 7: Hofmeisterjeva vrsta za anione in katione. Povzeto po [41].
Hofmeistrova vrsta deli ione na kaotrope in kozmotrope. Anioni imajo ponavadi večji vpliv na kemijske in fizikalne lastnosti, zato so pogosteje v središču pozornosti.
Kozmotropi povečujejo površinsko napetost in zmanjšujejo denaturacijo proteinov ter povzročajo izsoljevanje (angl. salting-out), medtem ko kaotropi zmanjšujejo površinsko napetost in povečujejo denaturacijo proteinov. Slednji povzročajo vsoljevanje (angl.
salting-in) [5]. Zanimivo je omeniti, da vezava dobro hidriranih ionov na površino proteinov vodi v odbojne hidratacijske interakcije, vezava kaotropnih anionov pa vodi v privlačne interakcije [44].
Vsoljevanje torej deluje na principu lastnosti ionov, da ščitijo proteinske molekule pred nabojem drugih proteinskih molekul. Izsoljevanje pa je vpliv ionov na hidratacijski ovoj proteina. Ioni soli odzamejo molekule vode hidrofilni površini proteina, kar povzroči, da postanejo PPI močnejše kot so interakcije protein-voda [5].
Polivalentni kationi (npr. Y3+) se lahko tesno vežejo na kisle AK ostanke in celo vodijo do spremembe celokupnega naboja proteina. Poleg interakcije s proteini vplivajo soli posredno tudi na stabilnost in topnost proteinov s povečanjem medfazne napetosti med proteinom in vodo [33].
25
3.5. Napačno zvijanje proteinov
Napačno zvijanje proteinov in njegove patogene posledice so postale pomembno vprašanje v zadnjih dveh desetletjih, saj naj bi po mnenju raziskovalcev prionov napačno zvijanje proteinov lahko vplivalo na skoraj polovico vseh človeških bolezni [45].
Že manjša sprememba v okolju, v katerem se nahaja protein, lahko poruši stabilizacijske interakcije znotraj polipeptidne verige, kar lahko vodi do nepravilno zvitih proteinov.
Z napačnim zvijanjem lahko zavzamejo proteini stabilno, alternativno, ne-nativno konformacijsko obliko, ki v večini primerov povzroči agregacijo proteinov in kopičenje agregata v tkivu. Predpostavljajo, da so agregati strupeni za celico, ker vplivajo na njene funkcije. Torej, če proteini ne uspejo obdržati svoje nativne konformacije, ne morejo več opravljati svoje biološke funkcije. V primeru podedovanih mutacij v proteinu, ki povzročajo napačno zvijanje le-tega, v celici ni aktivne oblike proteina, zato ta ne opravlja več svoje funkcije, kar vodi do bolezni, ker celica ni sposobna izvesti določenega dejanja, če ta protein ne deluje [46,47].
Obstaja več dobro znanih bolezni, ki so posledica nepravilnega zvitja proteinov. Te vrste bolezni lahko razdelimo v tri glavne kategorije: bolezni zaradi izgube funkcije, bolezni zaradi toksične funkcije ter nalezljive bolezni zaradi napačnega zvijanja [46].
Bolezni, ki so posledica izgube funkcije proteina, nastanejo navadno zaradi mutacij proteina ali zaradi prezgodnje prekinitve transkripcije [46,47]. To vodi do napačnega zvijanja, napačno zvit protein pa deluje kot antagonist funkcije, ki jo opravlja pravilno zvit, nativni protein.
Pogosto je potreben transport proteinov od mesta, kjer se sintetizirajo, do mesta, kjer opravljajo svojo funkcijo. Da bi se pravilno transportirali, večina proteinov za to potrebuje ustrezno konformacijo, zato lahko njihova napačna struktura vodi do napačne lokacije proteina v celici. Na ta način lahko napačno zvitje proteina povzroča bolezen na dva načina: z izgubo funkcije proteinov na njegovi matični lokaciji znotraj celice ali pridobivanje nove funkcije, potencialno patogene, če se protein akumulira na ne-matični lokaciji v celici. Poleg napačne lokalizacije, je toksičnost napačno zvitih proteinov lahko posledica spremembe konformacije proteina, ki vodi do nastanka prevladujočega fenotipa, tako da ima nova proteinska konformacija za organizem neugodne lastnosti [46,47].
26 V primeru bolezni zaradi toksičnih funkcij je situacija nekoliko drugačna. Mehanizem še ni popolnoma razumljen, obstaja pa več predlaganih modelov, kot je tvorjenje por v celični membrani oziroma aktivacija površinskih receptorjev. V zadnjih modelih se domneva, da napačno zviti proteini tvorijo topne oligomerne komplekse, ki imajo toksične učinke na celico [46].
Nalezljive bolezni kot posledica napačnega zvijanja so najmanjša skupina bolezni. Edini danes poznan protein, ki ima sposobnost prenosa infektivnosti, je prionski protein (okrajšano PrP). Njegova posebnost je, da obstaja v dveh strukturnih oblikah. Prva je pogosta, neškodljiva različica, zgrajena iz treh α-vijačnic in dveh kratkih β-ploskev.
Druga pa je narobe zvita, škodljiva oblika, v kateri prevladujejo β-ploskve, kjer bi morale biti α-vijačnice [46,48].
3.5.1. Vloga napačno zvitih proteinov pri razvoju nevrodegerativnih bolezni Bolezni, povezane z napačnim zvijanjem proteinov (engl. protein conformational diseases), vključujejo skupino bolezni, pri katerih je ključni dogodek napačno zvijanje in akumulacija proteinov ter kopičenje agregatov v tkivu. V to skupino najpogosteje spadajo oblike nevrodegenerativnih bolezni, pa tudi nekatere redke dedne motnje [47].
Nevrodegenerativne bolezni so bolezni, ki prizadenejo predvsem živčne celice – nevrone v osrednjem živčnem sistemu. Do danes ni niti ena nevrodegenerativna bolezen ozdravljiva in ima za posledico postopno degeneracijo in/ali smrt nevronov. Vplivajo lahko tudi na razmišljanje, gibanje, čustva, spomin itd. Prvi znaki, da so napačno zviti proteini in njihova agregacija povezani z nevrodegenerativnimi boleznimi, izhajajo iz nevropatoloških raziskav mrtvih, ki so v življenju trpeli za nevrodegenerativno boleznijo [47].
Med nevrodegenerativne bolezni spadadajo Alzheimerjeva bolezen (AD), Parkinsonova bolezen (PD), Huntingtonova bolezen (HD), prenosljiva spongioformna encefalopatija (TSE), amiotrofična lateralna skleroza (ALS), cistična fibroza, Gaucherjeva bolezen, Creutzfeldt-Jakobova bolezen ter nekatere vrste raka. Vzroki za različne nevrodegenerativne bolezni so raznolike: nastanek AD je predvsem posledica nevrotoksičnih procesov, ki so prisotni pri vseh ljudeh ali so posledica podedovanih mutacij. PD se pojavlja občasno (vzrok ni znan), vendar kaže povezavo z nekaterimi dejavniki življenjskega tveganja, kot je izpostavljenost nekaterim toksinom. Pri ALS, pa tudi pri AD in PD, je približno 10 % primerov dednega značaja, medtem ko je ostalih 90 % primerov neznanega izvora. Vsi primeri HD imajo dedni značaj, TSE pa se lahko deduje ali pa se dobi z izpostavljenostjo prionskemu proteinu (PrP) [47].
27 Kljub različnim kliničnim nevrološkim simptomom in napredovanju vseh teh bolezni, imajo nekatere od njih skupne značilnosti: večina jih lahko ima dedni značaj, pojavijo se kasneje v življenju in njihovo patologijo karakterizira izguba nevronov in nepravilnosti delovanja sinapse. Ena nedavno opažena skupna značilnost vseh nevrodegenerativnih bolezni, za katero se domneva, da je skupni molekularni mehanizem patologije, je kopičenje napačno zvitih proteinov v agregatih znotraj ali zunaj nevronov ali glijskih celic, ki tvorijo centralni živčni sistem [49]. Zagotavlja tudi skupen molekularni mehanizem za različne bolezni, ki so lahko podedovane ali povzročene z okužbo. Stalno prisotno počasno odlaganje agregatov lahko povzroči, da se nakopiči dovolj materiala, da pride do nevrotoksičnosti (v daljšem časovnem obdobju). Po drugi strani pa nastale nevrodegenerativne bolezni, ki so rezultat dednosti, na splošno vključujejo genetske mutacije, ki spodbujajo agregacijo proteinskega mutiranega gena [47].
3.4.2. Proteinski agregati
Proteinski agregat nastane kot posledica destabilizacije α-vijačne strukture in sočasne tvorbe β-ploskev (slika 8). Agregacija proteinov je neizogibna posledica celičnega obstoja in ti agregati so oligomerni kompleksi tujerodnih konformerjev, ki nastanejo zaradi medmolekularnih interakcij med zvijanjem proteinov [45,47].
Slika 8: Shematski prikaz tvorbe agregata, kot posledica intermolekularnih povezav v proteinu. Povzeto po [32].
28 Zdi se, da napačno zvitje proteinov vodi do površinske izpostavljenosti hidrofobnih aminokislin, ki so v nativni strukturi skrite znotraj proteinov. Te aminokisline sodelujejo pri interakcijah med proteini, ki ne obstajajo, ko je protein pravilno zvit. Tako napačno zvit protein s hidrofobnimi deli, izpostavljenimi vodnemu okolju, tvori agregat z drugim napačno zvitim proteinom za stabilizacijo svoje konformacije. Ti agregati v nobenem primeru niso topni in presnovno stabilni v fiziološkem okolju [45,47].
Proteinska agregacija je pomemben dejavnik pri številnih procesih, vključno z boleznimi, ki nastanejo kot posledica pretvorbe nativne strukture enega ali več proteinov v amiloidni fibril, kot tudi pri študijah proteinskega zvitja, stabilnosti bioloških zdravil in industrijski pripravi proteinov. Danes pa se tudi preučuje in preiskuje možnost, da bi lahko vključitev neproteinogenih aminokislin v proteine povzročila nevrodegenerativne bolezni, saj lahko povzroči nastanek proteinskega agregata [47,50].
Neto kopičenje toksičnih proteinskih agregatov v celici je odvisno od stabilnosti, kompaktnosti in hidrofobne izpostavljenosti agregatov ter od hitrosti sinteze proteinov v celici [45].
3.4.3. Amiloidni agregati
S spektroskopskimi metodami je bilo ugotovljeno, da so napačno zviti proteini znotraj amiloidnih agregatov zelo bogati z β-ploskvami, kar je značilna sekundarna struktura, ki jo najdemo v nativnih konformacijah proteina. Amiloidni agregati nastanejo postopoma. Kadar pride do napačnega zvijanja proteina, je ta nestabilen v vodnem okolju, saj amiloidi niso topni v vodi; lahko pa se stabilizirajo z interakcijami z drugimi molekulami, pri čemer nastajajo oligomeri, bogati z β-ploskvasmi [47].
Agregacija proteinov je vzrok številnih patoloških stanj v človeškem telesu, kar vodi k različnim obolenjem, ki jih s skupnim imenom imenujemo amiloidoze. Fibrile so po navadi široke 6–12 nm in sestavljene iz 2–6 protofilamentov, razporejenih v vijačno strukturo. Tvorba amiloidnih fibril izzove strukturno prerazporeditev nativnega proteina v konformacijo z velikim deležem β-ploskev. Sama tvorba ne poteka neposredno iz nativne proteinske molekule, temveč preko delno zvitega intermediata (slika 9). Prvi korak so konformacijske spremembe v nativni strukturi, kar omogoči specifične intermolekularne interakcije, ki so potrebne za proces oligomerizacije in fibrilacije.
Številni proteini v raztopinah ne zavzemajo stabilne sekundarne in/ali terciarne strukture, temveč se izrazijo kot dinamični skupki notranjih spreminjajočih se struktur [50].
29 Zaenkrat še ni znano, ali napačno zvijanje proteinov vodi do agregacije ali oligomerizacija povzroči spremembo konformacije proteinov, ki nato povzročijo agregacijo. Strukturna sprememba naravne konformacije proteina vodi do delnega napačno zvitega proteina, medtem ko je popolnoma napačno zvitje odvisno od oligomerizacije 15 delno napačnih zvitih proteinov. Mehanizem in vzrok tvorbe amiloidnih agregatov še ni povsem znan. Napačno zvitje je lahko posledica mutacij, interakcij s kovinskimi ioni, sprememb pH in oksidacije ter protolize [47,50].
Razumevanje zgodnjih dogodkov v procesu amiloidne agregacije je izrednega pomena, če želimo bolje razumeti oz. spoznati mehanizme, ki vodijo do tovrstne agregacije.
Pomaga tudi pri načrtovanju strategij za preprečitev procesov, ki vodijo v različne amilodoze [50]. Amiloidom podobno zvitje imajo lahko tudi nepatološki proteini.
Slika 9: Shematski prikaz nastanka amiloidnih fibril. Povzeto po [51].
30
4. Zaključek
Proteini so makromolekule, zgrajene iz aminokislin. Določene aminokisline imajo na stranski verigi skupine, ki se lahko deprotonirajo ali protonirajo in pri določeni vrednosti pH raztopine nosijo pozitivni in negativni naboj. Aminokisline z ionizirajočimi stranskimi verigami, na primer Asp, Glu, His, Lys in Arg, dajejo proteinom pomembne lastnosti. Spreminjanje celokupnega naboja proteina, npr. s spreminjanjem pH, lahko povzroči spremembe v konformaciji proteina (pride do denaturacije). Naboji pomembno sodelujejo pri interakcijah, odgovornih za pravilno zvijanje proteina, kakor tudi za interakcije med površino proteina in njegovo okolico (topilo, prisotnost dodatkov).
Elektrostatske interakcije so daljnosežne (npr. 5–10 Å) in so lahko ključni dejavnik pri določanju konstant hitrosti vezave proteinov na druge makromolekule. Na splošno nabiti aminokislinski ostanki preprečujejo agregacijo proteinov in pomembno prispevajo k topnosti v vodi topnih proteinov. Ti ostanki se pogosto nahajajo na funkcionalnih mestih in neposredno sodelujejo pri biološki funkciji proteina.
Nukleinske kisline in celične membrane imajo površinske naboje, zato se pričakuje, da bodo elektrostatske interakcije močno vplivale na vezavo le-teh s proteini. Naboji imajo tudi pomembne naloge v procesih, kot je prenos ionov po transmembranskih kanalih in vezava ionov (npr. Ca2+) ali nabitih ligandov (npr. ATP) na določena mesta v proteinih.
Interakcije nabitih ostankov s polarnimi skupinami, zlasti v obliki vodikovih vezi, so specifične. Nabiti ostanki se bistveno razlikujejo od nepolarnih ostankov. Slednji so odgovorni za hidrofobne interakcije, ki so gonilna sila za zvijanje proteinov.
Vzroki, ki vodijo do napačnega zvijanja proteinov, zaradi katerih nastane veliko število bolezni, še niso povsem jasni. Gotovo imajo elektrostatske interakcije pri tem velik vpliv. Proučevanje vloge interakcij v teh kompleksnih sistemih predstavlja raziskovalne izzive tako na eksperimentalnem kot teoretičnem področju.
