UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Tinkara MORETTI
ELEKTROPORACIJA KOT SODOBNI PRISTOP DOSTAVE GENSKIH KONSTRUKTOV PRI GENSKI
TERAPIJI RAKA
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Tinkara MORETTI
ELEKTROPORACIJA KOT SODOBNI PRISTOP DOSTAVE GENSKIH KONSTRUKTOV PRI GENSKI TERAPIJI RAKA
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
ELECTROPORATION AS A MODERN APPROACH TO THE DELIVERY OF GENETIC CONSTRUCTS IN CANCER GENE
THERAPY
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Majo Čemažar.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Maja ČEMAŽAR
Onkološki inštitut Ljubljana, Oddelek za eksperimentalno onkologijo Član: prof. dr. Katarina VOGEL MIKUŠ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum predstavitve: 6. september 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 606:616-006.6:602.621(043.2)
KG rak, genska terapija, elektroporacija, plazmidna DNA, interlevkin-12, IL-12 AV MORETTI, Tinkara
SA ČEMAŽAR, Maja (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN ELEKTROPORACIJA KOT SODOBNI PRISTOP DOSTAVE GENSKIH
IIIIIIIIIKONSTRUKTOV PRI GENSKI TERAPIJI RAKA TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VIII, 22 str., 5 sl., 90 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Vodilni vzrok smrti v razvitem svetu je poleg krvožilnih bolezni rak. Po podatkih IARC je leta 2020 na svetu za rakom zbolelo 19,3 milijonov ljudi, 10 milijonov jih je raku podleglo. Rak ali malignom ali maligni tumor je poligenska bolezen, ki nastane kot posledica mutacije ali epigenetske spremembe v dednem zapisu ene same celice in je trenutno še ne znamo pozdraviti. Nov obetajoč pristop zdravljenja raka je genska terapija, pri kateri v tumorske celice administriramo gene, njihove dele, oligonukleotide, miRNA in siRNA z namenom utišanja, znižanja regulacije, modifikacije ali popravljanja tarčnih celic. Terapijo vnašamo in vivo ali ex vivo s pomočjo dostavnih sistemov oz. vektorjev, ki jih grobo delimo na virusne in nevirusne. Velik potencial za transfekcijo celic ima elektroporacija gole plazmidne DNA zaradi varnosti in največje učinkovitosti med nevirusnimi vektorji.
Elektroporacija je pojav tvorbe por na celični membrani, kar je posledica izpostavitve celic kratkim visokonapetostnim impulzom. Permeabilizirana membrana omogoča transport molekul različnih velikost v jedro. Po prenehanju delovanja električnega polja se membrana pri reverzibilni elektroporaciji povrne v prvotno stanje v določenem času (od nekaj milisekund do nekaj minut). Elektroporacijo uporabljamo pri imunski elektrogenski terapiji, kjer v tumorske celice vnašamo IL-12 plazmidno DNA. Gre za citokin, ki je zelo močan induktor protitumorske imunosti. Raziskovanje njegovega terapevtskega potenciala že poteka na predklinični in tudi na klinični ravni.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 606:616-006.6:602.621(043.2)
CX cancer, gene therapy, electroporation, plasmid DNA, interleukin-12, IL-12 AU MORETTI, Tinkara
AA ČEMAŽAR, Maja (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI ELECTROPORATION AS A MODERN APPROACH TO THE DELIVERY OF IIIIIIIIIGENETIC CONSTRUCTS IN CANCER GENE THERAPY
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VIII, 22 p., 5 fig., 90 ref.
LA sl AL sl/en
AB Cancer is the leading cause of death in the developed world, alongside circulatory diseases. According to the IARC, 19.3 million people worldwide were diagnosed with cancer in 2020, and 10 million succumbed to cancer. Cancer, or malignancy or malignant tumour, is a polygenic disease that arises as a result of a mutation or epigenetic change in the genome of a single cell, and which currently has no cure. A promising new approach to cancer treatment is gene therapy, in which genes, gene parts, oligonucleotides, miRNAs and siRNAs are administered into tumour cells to silence, down-regulate, modify, or repair target cells. Therapy is administered in vivo or ex vivo using delivery systems or vectors, which are roughly divided into viral and non-viral. The electroporation of naked plasmid DNA has great potential for cell transfection due to its safety and the highest efficiency among non-viral vectors.
Electroporation is the phenomenon of pore formation on the cell membrane resulting from the exposure of cells to short high-voltage pulses. The permeabilised membrane allows the transport of molecules of different sizes into the nucleus. After the electric field has ceased, the membrane returns to its original state within a certain time (from a few milliseconds to a few minutes) in reversible electroporation. Electroporation is used in immune electrogene therapy, where IL-12 plasmid DNA is injected into tumour cells. This is a cytokine that is a very potent inducer of antitumour immunity.
Its therapeutic potential is already being tested at both pre-clinical and clinical levels.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO SLIK ... VI OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... VII
1 UVOD ... 1
2 KANCEROGENEZA ... 1
3 EPIDEMIOLOGIJA IN INCIDENCA RAKA ... 2
4 NAJPOGOSTEJŠI TIPI RAKA ... 2
5 KLASIČNI NAČINI ZDRAVLJENJA RAKA ... 3
5.1 ONKOLOŠKA KIRURGIJA ... 3
5.2 RADIOTERAPIJA ... 3
5.3 SISTEMSKO ZDRAVLJENJE ... 3
6 NOVI PRISTOPI ZDRAVLJENJA RAKA – GENSKA TERAPIJA ... 4
6.1 ZAČETKI IN VPRAŠANJE VARNOSTI ... 4
6.2 IN VIVO IN EX VIVO VNOS GENSKE TERAPIJE ... 5
6.3 GENSKI DOSTAVLJALNI SISTEMI ... 6
6.4 VIRUSNI VEKTORJI ... 7
6.4.1 Virusno posredovan genski prenos ... 7
6.4.2 Bakterijsko posredovan genski prenos ... 7
6.5 NEVIRUSNI VEKTORJI ... 7
6.5.1 Kemijsko posredovan genski prenos ... 8
6.5.2 Fizikalno posredovan genski prenos ... 8
6.5.2.1 Elektroporacija ... 8
6.5.2.2 Tipi elektroporacij ... 11
6.6 VRSTE GENSKIH TERAPIJ IN NJIHOVE TARČE ... 13
6.6.1 Imunska genska terapija ... 13
6.6.1.1 Interlevkin-12 ... 13
6.6.1.2 Predklinične študije ... 15
6.6.1.3 Kombinirano zdravljenje ... 15
6.6.1.4 Klinične študije ... 15
7 ZAKLJUČEK ... 16
8 VIRI ... 16 ZAHVALA ... Napaka! Zaznamek ni definiran.
VI KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Prikaz pristopov uporabe genske terapije ... 5
Slika 2: Prikaz pogostosti uporabe posameznih vektorjev za prenos genskega materiala ... 6
Slika 3: Shema poenostavljene celične membrane in por v njej ... 10
Slika 4: Prikaz genske elektrotransfekcije (GET) ... 12
Slika 5: Prikaz mehanizma delovanja interlevkina-12 ... 14
VII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI AAV adeno-asociacijski virusi
ang. angleško
APC antigen predstavitvene celice BEP »bulk« elektroporacija CAR himerni antigen receptor
CD epitop površinskih molekul navadno belih krvničk, ang. cluster of differentiation (z določeno zaporedno številko)
cDNA komplementarna deoksiribonukleinska kislina
CPI zaviralci kontrolnih točk imunskega odziva, ang. Immune Checkpoint Inhibitors
DC dendritične celice
DNA deoksiribonukleinska kislina ECT elektrokemoterapija
EMA Evropska agencija za zdravila, ang. European Medicines Agency FDA Uprava za hrano in zdravila, ang. Food and Drug Administration GET genska elektrotransfekcija
GM-CSF granulocitno-makrofagne kolonije stimulirajoči faktor HPV humani (človeški) papilomavirus
IARC Mednarodna agencija za raziskovanja raka, ang. International Agency for Research on Cancer
IFN-α interferon-alfa IFN-β interferon-beta IFN-γ interferon-gama IL-1 interlevkin-1 IL-2 interlevkin-2 IL-4 interlevkin-4 IL-6 interlevkin-6
IL-12Rβ2 beta-2 podenota receptorja za interlevkin-12 IL-12Rβ1 beta 1 podenota receptorja za interlevkin-12 IL-12 interlevkin-12
IL-12R receptor za interlevkin-12 IL-23 interlevkin-23
VIII IL-18 interlevkin-18
IL-24 interlevkin-24 IL-27 interlevkin-27 IL-35 interlevkin-35
IRE ireverzibilna elektroporacija itd. in tako dalje
JAK Janusova kinaza MEP mikroelektroporacija
miRNA mikro ribonukleinska kislina
mRNA informacijska ribonukleinska kislina NEP nanoelektroporacija
NK naravne ubijalke npr. na primer oz. oziroma PEI polietilenimin
RAC Svetovalni odbor za rekombinatno DNA, ang. Recombinant DNA Advisory Committee
RNA ribonukleinska kislina
RNAi interferenčna ribonukleinska kislina
SFDA Kitajska državna uprava za hrano in zdravila, ang. The State Food and Drug Administration
siRNA mala interferenčna ribonukleinska kislina STAT pretvornik signala in aktivator transkripcije Th T celice pomagalke
TIL tumor infiltrirajoči limfociti TLR tolični receptor
TME tumorsko mikrookolje
TNA terapevtska nukleinska kislina TNF- α dejavnik tumorske nekroze alfa TNF-β dejavnik tumorske nekroze beta UV ultravijoličen
1
1 UVOD
Eden glavnih vzrokov za smrt ljudi na svetu je rak (Kovač, 2018). Ta bolezen je danes najbolj preučevano področje zdravljenja z gensko terapijo (Wirth in sod., 2013). Genska terapija je nov, preprost pristop zdravljenja rakave bolezni z dodajanjem, popravljanjem ali zamenjavo okvarjenih genov (Cha in Daud, 2012). Glavna ovira, s katero se raziskovalci srečujejo, je razvoj učinkovitih, netoksičnih genskih nosilcev za vnos tujih nukleinskih kislin v tarčne celice.
Ena najbolj perspektivnih in konkurenčnih nevirusnih tehnologij za transfekcijo celic je elektroporacija plazmidne DNA, ki je v zadnjih letih doživela velik razvoj zaradi prednosti v fizikalnem načinu delovanja, natančno določenem odmerku, visoki učinkovitosti transfekcije v primerjavi z ostalimi nevirusnimi vektorji, minimalni poškodbi celic in varnosti (nasprotno od virusnih vektorjev) (Shi in sod., 2018; Shirley in sod., 2014).
Eden izmed učinkov, ki jih lahko povzroči prepis transgena na plazmidni DNA, je okrepitev imunskega sistema proti tumorskim celicam. V tem primeru lahko plazmidna DNA vsebuje zapis za interlevkin-12, enega izmed citokinov, ki povzroči imunski protitumorski odziv brez sistemske toksičnosti in potencialno dolgotrajno tumorsko regresijo na mestu zdravljenja in na oddaljenih nezdravljenih mestih (Cha in Daud, 2012). Testiranje te imunske genske terapije že poteka na predklinični in klinični ravni, kjer so zaznali nekaj pomanjkljivosti terapije, kar pa ne posega v njen potencial in možnost za nadaljnji razvoj (Čemažar in sod., 2010).
2 KANCEROGENEZA
Prevladujoča teorija o nastanku raka, tudi malignoma oz. malignega tumorja (Zadnik in Žagar, 2021) (klonalna teorija nastanka), pravi, da je rak poligenska bolezen, ki je posledica mutacije ali epigenetske spremembe v dednem zapisu ene same celice (telesne ali spolne) v organizmu (Novaković, 2018). Mutacije se dogodijo tekom našega življenja ali pa jih podedujemo (Zadnik in Žagar, 2021). Okvara, ki se prenese s staršev, potomcem predstavlja večjo nevarnost za razvoj raka, saj je proces spremembe v rakavo celico pospešen. Največkrat do genetskih okvar pride zaradi neposrednega delovanja nevarnostnih dejavnikov in/ali zaradi nepravilnosti pri celičnih delitvah, ki so rezultat zmanjšane sposobnosti (posledica genske nagnjenost) za popravljanje napak (Blatnik in sod., 2020). Škodljive dejavnike delimo na fizikalne (npr.: UV sevanje), kemične (npr.: izvirajo iz cigaretnega dima ali hrane) ali biološke (npr.: virus HPV) (Zadnik in Žagar, 2021).
Celice so v našem telesu pod vplivom različnih vrst regulatornih mehanizmov, ki urejajo njihovo delitev, diferenciacijo in umiranje na podlagi potreb organizma. Normalne celice se na te mehanizme ustrezno odzivajo, se npr.: pred iztekom življenjske dobe delijo, tako da nastanejo nove, ki obnavljajo in ohranjajo organizem zdrav (Serša in Novaković, 2000). Ko so ti mehanizmi zaradi prej omenjenih razlogov moteni, pride do razvoja rakave celice, čemur pravimo kancerogeneza (Novaković, 2018). Za te celice je značilno, da rastejo nekontrolirano, se močno množijo, se upirajo celični smrti, izogibajo delovanju imunskega sistema ter inducirajo angiogenezo in tvorijo metastaze.
Ključni faktor tumorske rasti je genomska nestabilnost tumorskih celic in pro-vnetno okolje.
Kompleksnost in variabilnost tumorjev je glavni izziv preventive, zgodnje diagnostike, presajanja in zdravljenja raka po celem svetu. Tumorsko mikrookolje ali krajše TME, ki nastane ob interakciji tumorskih celic z njihovim okoljem, omogoča veliko heterogenost med celicami znotraj tumorja. Pride do nastanka prostorsko in fenotipsko ločenih podklonov (Hanahan in
2
Weinberg, 2000). Tumorje, ki so rezultat kompleksnega, večstopenjskega procesa, delimo na benigne (so podobni normalnemu tkivu, le da imajo visoko stopnjo celične delitve) in maligne (rastejo hitro, zanje je značilna poliploidija, tvorijo metastaze, vraščajo se v zdrava tkiva) (Serša in Novaković, 2000). Vrst raka je ogromno, saj izvirajo iz najrazličnejših celic. Glede na videz tumorja rake pri mikroskopskem pregledu rakastega tkiva razdelimo v štiri širše kategorije.
Karcinomi so epitelni tumorji iz celic povrhnjice, te predstavljajo gradnike večine telesnih organov. Tumorji vezivnega, maščobnega, kostnega in hrustančnega tkiva so sarkomi (Serša in Novaković, 2000). Levkemije so raki krvi in krvotvornih organov. Zanje je značilno, da se za razliko od drugih rakavih bolezni običajno ne pojavljajo v obliki bul ali zatrdlin. Zadnjo kategorijo predstavljajo limfomi, raki limfatičnega sistema (sistem mezgovnic in bezgavk) (Zadnik in Žagar, 2021).
3 EPIDEMIOLOGIJA IN INCIDENCA RAKA
Rak je poleg krvožilnih bolezni poglavitni vzrok smrti v razvitem svetu (Kovač, 2018). Za uspešno preprečevanje te bolezni je pomembno prepoznavanje dejavnikov, ki predstavljajo večje ali manjše tveganje za razvoj obolenja, kar je tudi cilj onkološke epidemiologije. Ta na podlagi razširjenosti raka med prebivalci na določenem kraju in času preučuje značilnosti in razlike med zdravimi in obolelimi ter poskuša poiskati povezave med izpostavljenostjo in boleznijo (Zadnik in Primic-Žakelj, 2018).
Letno za rakom zboli približno 15 000 Slovencev, od tega malo manj kot 8000 moških in več kot 7000 žensk. Boj z rakom vsako leto izgubi več kot 6000 ljudi (Zadnik in sod., 2020). Pri nas beležimo približno šestkratno zvišanje incidence od leta 1950, v zadnjih desetih letih pa je narastla za 28 % pri moških in za 16 % pri ženskah. Umrljivost prav tako raste, pri moških se je povečala za 15 %, pri ženskah za 17 % v zadnjem desetletju (Zadnik in Primic-Žakelj, 2018).
Med 27 evropskimi državami imajo več rakavih bolnikov kot Slovenija Danska, Nizozemska, Belgija, Ciper, Madžarska in Francija. Pred nami so po umrljivostni stopnji Slovaška, Poljska, Ciper, Madžarska, Hrvaška in Danska, kar pomeni, da zasedamo sedmo mesto v Evropi (Zadnik in sod., 2020).
Po podatkih Mednarodne agencije za raziskovanje raka (IARC) je leta 2020 na svetu za rakom zbolelo 19,3 milijonov ljudi, od tega približno 10 milijonov moških in 9,2 milijonov žensk.
Zaradi raka je lani umrlo približno 10 milijonov ljudi (IARC, 2021).
4 NAJPOGOSTEJŠI TIPI RAKA
Dvesto različnih vrst raka priča o tem, da je v principu lahko večina celic v organizmu rakotvornih (Kovač, 2018). Med seboj vrste raka razlikujemo po pogostosti, načinu zdravljenja in njegovem izidu ter po bolj ali manj znanih nevarnostnih dejavnikih.
V Sloveniji so najpogostejši kožni raki (brez melanoma), sledijo rak prostate, raki debelega črevesja in danke, rak dojke in pljuč. V različnih življenjskih obdobjih prevladujejo različni raki, pri otrocih in mladostnikih do 20. leta so to levkemije ter tumorji centralnega in avtonomnega živčnega sistema. Mlajše odrasle največkrat prizadene rak mod pri moških in rak dojke pri ženskah (Zadnik in sod., 2020).
3
Po podatkih IARC je bilo leta 2020 na svetu najpogostejše rakavo obolenje rak dojk, sledil je rak pljuč, kolorektalni rak, rak prostate in želodca. Moške najpogosteje doleti rak pljuč, prostate in kolorektalni rak. Pri ženskah pa prevladuje rak dojk, rak debelega črevesja in danke ter rak pljuč (IARC, 2021). Prevladujoča vrsta raka na nekem območju sveta je odvisna od dejavnikov, ki povzročajo njen nastanek (Zadnik in Primic-Žakelj, 2018).
5 KLASIČNI NAČINI ZDRAVLJENJA RAKA
Trenutno raka še ne znamo preprečiti, saj delovanja rakastih celic še ne poznamo v celoti, lahko pa ga poskušamo čim prej odkriti in primerno zdraviti. Raka zdravimo kirurško, z obsevanjem in z zdravili, kar imenujemo tudi sistemsko zdravljenje. Najboljši načini zdravljenja so tisti, ki odstranijo največ tumorja in imajo minimalen vpliv na zdrave, normalne celice. Večino vrst rakov se obravnava interdisciplinarno, kar pomeni, da zdravljenje združuje kirurgijo, obsevanje in sistemsko zdravljenje (npr.: kirurško se odstrani »izvorni« tumor ter področne bezgavke, obseva se ležišče tumorja ali zasevkov, ki so področja v drugih organih, kamor se je razširil rak, in se hkrati izvaja še sistemsko zdravljenje s citostatiki, hormonskimi zdravili …) (Borštnar in sod., 2019).
5.1 ONKOLOŠKA KIRURGIJA
Onkološka kirurgija je najstarejša in najuspešnejša posamezna metoda zdravljenja solidnih rakov. V samo kirurško zdravljenje raka poleg odstranitve tumorja spadajo tudi rekonstruktivni posegi po odstranitvi velikih tumorjev za izboljšanje funkcionalnosti in kvalitete življenja ter zagotavljanje tkiv za morfološko diagnostiko. Cilj kirurgije je fizično odstraniti vse tumorske celice, v primerjavi z radiacijo in sistemskim zdravljenjem, ki poskušata ustaviti njihovo proliferacijo, jih ubiti (Perhavec in Žgajnar, 2018).
5.2 RADIOTERAPIJA
Radioterapija ali zdravljenje z obsevanjem je vrsta zdravljenja raka, pri katerem z uporabo ionizirajočega sevanja dosegamo terapevtski učinek. Večina bolnikov prejme teleradioterapijo (vir sevanja je zunaj bolnikovega telesa), preostali pa brahiradioterapijo (vir sevanja je vstavljen v bolnikovo telo ali se nahaja na njem). Cilj je dostaviti zadostno dozo sevanja v prej določeno tarčo oz. tumor in pri tem čim manj obsevati okoliška zdrava tkiva in organe (Strojan in sod., 2018).
5.3 SISTEMSKO ZDRAVLJENJE
Sistemsko zdravljenje je vrsta zdravljenja raka, pri katerem uporabljamo zdravila. To so citostatiki (kemoterapija), hormonska (hormonsko zdravljenje) in biološka zdravila (tarčno zdravljenje in imunoterapija). Zdravljenje s kemoterapijo je najstarejši način boja proti raku z zdravili, ki deluje na vse (rakave in normalne) hitro deleče celice. Pri hormonskem zdravljenju želimo znižati ravni ženskih in moških spolnih hormonov oz. zasesti hormonske receptorje, na katere se ti vežejo ter tako zaustaviti rast in širjenje raka. Biološka zdravila omogočajo tarčno zdravljenje (predstavlja največji napredek zadnjih dveh desetletij v sklopu sistemskega zdravljenja) in imunoterapijo. Kot že samo ime pove, tarčna zdravila učinkujejo na specifične tarče v rakavi celici, največkrat na rastne dejavnike (na membrani teh celic ali v žilju tumorja) in
4
na celične signalne poti. Glede na strukturo ločimo dve vrsti tarčnih zdravil, to so monoklonska protitelesa (-mabi) in male molekule (-nibi). Pomemben napredek pri zdravljenju raka predstavljajo tudi nova zdravila z zaviralci imunskih kontrolnih točk (CPI) za imunoterapijo (Čufer in sod., 2018).
6 NOVI PRISTOPI ZDRAVLJENJA RAKA – GENSKA TERAPIJA
Raziskovanje bolezni in dopolnjevanje, odkrivanje novih možnosti zdravljenja raka poteka ves čas, z namenom zmanjšanja stranskih učinkov in povečanja učinkovitosti zdravljenja. Med povsem nove pristope zdravljenja prištevamo tudi gensko terapijo. V primerjavi z ostalimi terapijami je genska v prednosti, ker se lahko pacientom nudi lokalno, kar tudi omogoča odmerjanje višjih količin zdravila brez tveganja za sistemske neželene učinke. Enkratni odmerki pri večini genskih terapij jih delajo tudi dolgoročno stroškovno učinkovite (Wirth in Ylä- Herttuala, 2014).
Evropska agencija za zdravila (EMA) gensko terapijo definira kot biološko zdravilo z dvema značilnostma – vsebuje aktivno učinkovino, ki sestoji iz ali vsebuje rekombinantno nukleinsko kislino, ki se uporablja oz. odmerja ljudem z namenom regulacije, popravljanja, nadomeščanja, dodajanja ali izbrisa genetske sekvence. Terapevtski, profilaktičen ali diagnostičen učinek biološkega zdravila je neposredno odvisen od rekombinantne sekvence nukleinske kisline, ki jo vsebuje, ali pa se nanaša na produkt genskega izražanja. Cepiva proti nalezljivim boleznim ne spadajo med zdravila za gensko terapijo. Gensko terapijo pa ameriška Uprava za hrano in zdravila (FDA) opredeljuje kot produkte, ki učinkujejo preko s transkripcijo in/ali translacijo prenesenega genetskega materiala in/ali z vključevanjem v genom gostitelja v obliki nukleinske kisline, virusa ali genetsko spremenjenega mikroorganizma. Modifikacije, ki jih ti produkti omogočajo, lahko nastanejo in vivo ali pa so prenesene v celice ex vivo, preden jih odmerimo prejemniku (Wirth in sod., 2013).
6.1 ZAČETKI IN VPRAŠANJE VARNOSTI
Konec leta 1988 je Svetovalni odbor ameriškega Nacionalnega inštituta za zdravje za rekombinatno DNA (RAC) prvič odobril klinični protokol za vnos tujih genov v človeka. Dve leti kasneje je FDA prvič odobrila preizkušanje genske terapije na ljudeh, nekoliko kasneje je temu sledila še Evropa (Wirth in sod., 2013). Genska terapija je tako cvetela do leta 1999, kljub temu da prve študije niso kazale željenih rezultatov, potem pa je med kliničnim testiranje genskega zdravila umrl Jesse Gelsinger. Takoj po vnosu terapije se je Gelsingerjev imunski sistem odzval na visoke količine adenovirusa, kar je pripeljalo do odpovedi več organov in smrti po štirih dnevih. Gre za prvi primer, kjer je bilo možno vzrok smrti direktno povezati z virusnim vektorjem (Stolberg, 1999). Dodatno skrb pri uporabi (retro)virusnih vektorjev je povzročal tudi fenomen insercijske mutageneze oz. ektopična kromosomska integracija virusne DNA, ki vodi v maligno transformacijo celic. Tako je zaradi vprašanja o varnosti razvoj genske terapije nekoliko obstal v začetku 21. stoletja, posebno v Evropi in ZDA (Shalala, 2000), saj je strah pred stranskimi učinki in genskim inženiringom samim vplival na ljudi, ki se zato na primer niso želeli udeleževati kliničnih testiranj genskih terapij (Cavazzana-Calvo in sod., 2000).
Gensko terapijo delimo na somatsko, kjer se genetski material vnese v neko tarčno celico, ne bo pa prišlo do prenosa spremembe na potomce, in germinalno gensko terapijo, ki deluje ravno nasprotno, terapija oz. modificiran gen bo prisoten v naslednji generaciji. Trenutna zakonodaja
5
dovoli gensko terapijo le na somatskih celicah, kar je tudi etično bolj sprejet način zdravljenja.
Najbolj pogosta bolezen, ki jo zdravimo z gensko terapijo, je prav rak. Predstavlja kar 60 % vseh kliničnih testiranj, ki trenutno potekajo po svetu. Več kot 1800 odobrenih genskih terapij vstopa v klinična preizkušanja oz. ta že potekajo (Wirth in sod., 2013). Kitajska je leta 2003 postala prva država, ki je za klinično uporabo odobrila zdravilo (Gendicin) na osnovi genske terapije. Gre za rekombinantni adenovirusni vektor, ki se uporablja za zdravljenje ploščato celičnega karcinoma glave in vratu (Peng, 2005). Gendicin je bil odobren brez podatkov o poteku III. faze kliničnega preizkušanja, kar je kasneje vodilo v razprave o učinkovitosti zdravila (Xin, 2006). Kljub tem očitkom je leta 2005 kitajska Državna uprava za hrano in zdravila (SFDA) dovoljenje za promet izdala Oncorinu, rekombinantnemu humanemu adenovirusu z onkolitičnimi lastnostmi, za zdravljenje orofaringealnega raka v poznem stadiju v kombinaciji s kemoterapijo (Wirth in sod., 2013). Do leta 2019 so bila za zdravljenje raka odobrena (tudi v Evropi in ZDA) še genska zdravila Imlygic, Kymriah in Yescarta (Ma in sod., 2020).
6.2 IN VIVO IN EX VIVO VNOS GENSKE TERAPIJE
Aplikacija genske terapije v tumorske celice se izvaja in vivo ali ex vivo (Slika 1). Pri ex vivo metodi se pacientu odvzame tumorske celice in se jih nato goji v gojišču z nadzorovanim mikrookoljem. S celicami, (po navadi) gojenimi kot 2D enosloj, se gensko manipulira (dodaja se jim nove gene ali proteine – transgene) in se jih nato vrne nazaj v gostitelja. Pri in vivo pristopu se lahko tumorskim celicam neposredno približamo, terapija se izvede in loco kot npr.: pri intradermalnem injiciranju metastaze ali pri intravezikalni terapiji površinskega raka sečnega mehurja. Genski material se v tumorske celice gostitelja vnaša tudi intravenozno ali predsistemsko po oralni, očesni, transdermalni ali nosni dostavni poti. Vse pogojuje lokacija tumorja in stopnja, do katere je bolezen napredovala.
Slika 1: Prikaz pristopov uporabe genske terapije in vivo, kjer terapevtske gene vnesemo direktno v telo pacienta, in ex vivo, kjer se pacientove celice najprej izolira iz telesa, se jih zunaj genetsko modificira in se jih potem vrne v pacientovo telo (Roma-Rodrigues in sod., 2020).
Za doseganje končnega cilja je ex vivo pristop enostavnejši, saj je s celicami lažje manipulirati od zunaj, prav tako je zelo pomemben pri indirektni imunski terapiji (krvne celice pacientov se
6
modificira tako, da napadejo tumorsko tkivo). Pri ex vivo pristopu celice za manipulacijo izberemo sami, spremenjene, ki jih vrnemo v pacientovo telo, so tako imunokompatibilne (avtologne celice). Modificirane celice morajo imeti za uspešno zdravljenje boljše proliferacijske lastnosti kot tumorske (prerasti jih morajo), kar je ravno nasprotno s ciljnim delovanjem ostalih genskih terapevtikov, ki napredovanje tumorja zavirajo prav z napadom na sposobnost hitrega deljenja. In vivo pristop je manj invaziven kot ex vivo in na ta način lahko terapija direktno napade deleče-se tumorske celice ter jim prepreči nadaljnjo delitev. Slabost in vivo pristopa je, da je odvisen od vektorjev, ki so lahko imunogeni (Miller, 1992; Roma- Rodrigues in sod., 2020).
6.3 GENSKI DOSTAVLJALNI SISTEMI
Transfekcijo definiramo kot prenos genetskega materiala neposredno v celice (po navadi ob pomoči nevirusnih vektorjev), medtem ko transdukcija pomeni, da prenos nekega genskega materiala v celico poteka z virusnim ali bakterijskim vektorjem (Shirley in sod., 2014). Če bi golo terapevtsko nukleinsko kislino (TNA) vstavili v npr.: sistemski krvni obtok, bi ji pot do cilja oteževale oz. onemogočile biološke bariere, dovzetnost za nukleaze, fagociti, stimulirala bi lahko tudi odziv imunskega sistema in hiter ledvični očistek. Zato se za usmerjanje TNA v tumorske celice uporablja stabilne genske prenašalce, dostavne sisteme oz. vektorje. Dober vektor mora TNA varovati, jo po telesu voditi brez razprševanja preko limfatičnega ter krvnega obtoka (interakcije s krvnimi celicami, fagociti, proteini in lipidi ne smejo motiti delovanja terapije), se izogibati netarčnim celicam, imeti zmožnost kopičiti se v tumorju in izstopati iz tarčne celice z endocitozo preko kompleksnega hidrofobnega sloja plazmaleme (Haasteren in sod., 2018; Sun in sod., 2019, Yin in sod., 2014; Yue in Wu, 2012). Varnost, učinkovitost in možnost kontrole izbranega vektorja so ključni za uspešno zdravljenje raka z gensko terapijo.
Obstaja več načinov, kako delimo vektorje, najbolj široka je delitev na virusne (oz. bakterijske) in nevirusne vektorje (Sun in sod., 2019). Fizikalno, kemijsko ali na drug način posredovan prenos genov prištevamo k nevirusnim vektorjem (Shirley in sod., 2014). Najpogosteje uporabljeni vektorji za prenos genov (Slika 2) so adeno- in retrovirusni vektorji ter goli plazmidi (Wirth in sod., 2013).
Slika 2: Prikaz pogostosti uporabe posameznih vektorjev za prenos genskega materiala pri genski terapiji pri kliničnih testiranjih. Najpogosteje uporabljeni vektorji so adenovirusi, retrovirusi in goli plazmidi (Vectors …, 2021).
7 6.4 VIRUSNI VEKTORJI
6.4.1 Virusno posredovan genski prenos
Prvi predlagani vektorji za gensko terapijo so bili virusi zaradi svoje strukture in enostavnega načina prenosa RNA in DNA (enoverižne ali dvoverižne) v človeške celice po vezavi nanje (Lundstrom, 2018), kar je del njihovega replikacijskega procesa. S seboj lahko ob vstopu v celico prinesejo tudi dodaten tovor oz. drug genetski material (transgene) (Shirley in sod., 2014).
Njihova prednost je, da se jih enostavno očisti v velikih titrih in da imajo dolgotrajno ekspresijo genov (Yuan in sod., 2014). Kljub možni imunogenosti, omejeni količini gensko-terapevtska tovora, tveganju za nastanek raka zaradi bližine terapevtskih genov in genov, ki kontrolirajo celično rast in omejeni množični proizvodni virusnih vektorjev, je po številnih kliničnih preskušanjih prišlo do odobritve nekaterih genskih terapij z virusnimi vektorji. Vse naštete pomanjkljivosti virusnih vektorjev so spodbudile razvoj nevirusnih (Roma-Rodrigues in sod., 2020).
V kliničnih testiranjih se za dostavo genskih zdravil največ uporabljajo retrovirusi, lentivirusi, adenovirusi, adeno-asociacijski virusi (AAV), virus herpesa simpleksa, poksivirus itd. Vsak ima svoje prednosti in omejitve, zato zahtevajo modifikacije pred uporabo v terapevtske namene.
Retrovirus je bil prvi, ki so ga uporabili kot vektor za gensko terapijo, lahko se integrira v genom gostiteljske celice (ekspresija traja mesece, leta) ter zahteva celično delitev za transdukcijo. Lentivirusi se tudi integrirajo v genom v proliferirajoče celice kot tudi v neproliferirajoče. Adenovirusni vektorji imajo visoko transdukcijsko učinkovitost v delečih in ne delečih se celicah, vendar pogosto povzročijo imunski odziv, kar vodi v izgubo terapevtskih genov (Ratko in sod., 2003). Testira se tudi različne genetsko modificirane ali nemodificirane onkolitične viruse, ki se lahko replicirajo ali pa so atenuirani, npr.: adenovirusi, virus vakcinije in ošpic, reovirus, virus vezikularnega stomatitisa, virus atipične kokošje kuge itd. (Gill in sod., 1997).
6.4.2 Bakterijsko posredovan genski prenos
Bakterijski vektorji so atenuirani in pridobljeni iz vrst Listeria in Salmonella. Imajo naravno sposobnost napada antigen predstavitvenih celic, njihova mikrobna narava deluje kot močan adjuvans. Uporabljajo se kot cepiva proti raku z eksogeni, ki pri gostitelju povzročijo trajen in terapevtski imunski odziv (Toussaint in sod., 2013).
6.5 NEVIRUSNI VEKTORJI
Nevirusni vektorji lahko prenašajo večjo količino genetskega tovora, so bolj varni in povzročijo manjši imunski odgovor. Zaradi slabe sposobnosti ciljanja celic in nizke stopnje transfekcije in vivo, se jih večinoma uporablja in vitro (Sun in sod., 2019). Od leta 2004 do 2013 je uporaba nevirusnih vektorjev v kliničnih raziskavah narasla, uporaba virusnih pa močno padla. Kljub temu noben trenutno razpoložljivi nevirusni vektor še ne izpolnjuje idealnih vektorskih zahtev (Ramamoorth in Narvekar, 2015).
Osnovna komponenta nevirusnega vektorja je po navadi gola plazmidna DNA, ki vsebuje željeni gen za ekspresijo in ustrezen promotor pred njim. Čeprav je lahko gola DNA sama (po) sebi vektor, ji njena negativno nabita narava onemogoča pasivni vstop v celico (Heinzerling in sod., 2001). Plazmidni vektorji so episomalni, posledično se med celično delitvijo izgubijo.
8
Vnašamo jih sistemsko ali v tumorska oz. ne tumorska tkiva (Gill in sod., 1997). Prednost gole DNA je ta, da je minimalno toksična, prav tako nima drugih neželenih učinkov (manjša verjetnost za odziv imunskega sistema v primerjavi z virusnimi vektorji), enostavno se jo formulira z rekombinantnimi tehnikami, producira v velikih količinah in je cenovno ugodna.
Problematična je njena nizka učinkovitost pri prenosu genov v primerjavi z virusi (Wirth in Ylä- Herttuala, 2014). Razvijajo se številne metode za vnos gole DNA, pri katerih bodo odpravljene težave z varnostjo, učinkovitostjo in ekspresijo genov in vivo (Gill in sod., 1997).
6.5.1 Kemijsko posredovan genski prenos
Kemijske prenašalce lahko široko razdelimo na anorganske delce, kationske lipide, peptide in polimere. Anorganski delci so običajno nanodelci različnih velikosti, oblik in poroznosti, ki DNA ali RNA objamejo ali adsorbirajo na svojo površino in imajo možnost pobega endotelijskemu retikulumu (Ramamoorth in Narvekar, 2015). Mednje spadajo kalcijev sulfat, silicijev oksid, zlato, magnetne spojine … (Al-Dosari in Gao, 2009). Nekateri nevirusni prenašalni sistemi imajo kationsko naravo (lahko vzpostavijo elektrostatsko povezavo z negativno nabito DNA). Skupni naboj je pozitiven, kar omogoča prenašalcu učinkovito interakcijo z negativno nabito celično membrano in vstop v celico (Behr, 1994). Kationski lipidi ali liposomi skupaj z DNA tvorijo lipoplekse. Pogosto se uporablja kvarterne amonijeve detergente in kationski holesterol. Polipleksi so nanomerni kompleksi DNA in kationskih polimerov ter so bolj stabilni od lipopleksov. Polimere delimo na naravne (proteini, peptidi, polisaharidi - hitozan) in sintetične (polietilenimin (PEI), dendrimeri, polifosfoestri).
Lipopolipleks sestavljajo DNA, kationski polimer in kationski lipid (Ramamoorth in Narvekar, 2015). Plazmidni vektorji so pogosto inkorporirani v liposome (Gill in sod., 1997) ali nanodelce za in vivo dostavo (Konstan in sod., 2004).
6.5.2 Fizikalno posredovan genski prenos
Fizikalni način vnosa genskega materiala v celico je najbolj primeren za gensko terapijo. Je enostaven način uporabe fizične sile (mehanske, električne, toplotne …) za prodor preko membranske celične pregrade v primerjavi s prej naštetimi dostavnimi sistemi, kjer je prenos posredovan s prenašalci. Najenostavnejši način administracije genskega materiala je z iglo in brizgo (mikro- in nanoinjiciranje) (Ramamoorth in Narvekar, 2015; Shi in sod., 2018), ki je skupaj z gensko pištolo z balističnimi delci, na katerih je DNA, prevladujoč način vnašanja genskega materiala v celice (Klein in sod., 1987). Celica mora biti sposobna nastale poškodbe v membrani ali drugih organelih po penetraciji z omenjenimi metodami sama popraviti.
Permeabilizacijske metode, kot so laser, elektroporacija, ultrazvok, hidroporacija (Niidome in Huang, 2002), naredijo celico prepustnejšo za genski material, tako da povzročijo dovolj velike motnje v membrani s spremembo temperature, električnega polja, pufrske sestave itd. S permeabilizacijskimi strategijami lahko lažje nadzorujemo spremembe na membrani kot s penetracijskimi (Neumann in sod., 1982).
6.5.2.1 Elektroporacija
Elektroporacija je primeren način za vnos genske terapije na osnovi plazmidne DNA. Pred ostalimi je v prednosti, saj učinkuje na najrazličnejših tipih celic (Shirley in sod., 2014), administracija in njena kontrola sta enostavni, omogoča prenos malih molekul in velikih
9
proteinov oz. protiteles (Shi in sod., 2018), tveganje za integracijo genskega materiala v genom in posledično možna malignost je majhno, ima majhen potencial za imunogenost (Shirley in sod., 2014), povzroči minimalne funkcionalne motnje le na plazmalemi, ostali membranski organeli pa so nepoškodovani (Maček Lebar in sod., 1998). Težave, s katerimi se še vedno srečuje elektroporacija, so natančna kontrola odmerka zdravila, viabilnost celic po aplikaciji (Shi in sod., 2018), otežen dostop do tumorskega tkiva, učinkovit transport genov čez membrano in doseganje dosledne ekspresije (Cha in Daud, 2012). Trenutno poteka veliko kliničnih testiranj tega dostavljenega sistema, posebno na pacientih z malignim melanomom, rakom prostate, kolorektalnim rakom in levkemijo (Shirley in sod., 2014).
Raziskovanje vplivov električnega polja na celice in njihov transmembranski potencial se je začelo v petdesetih letih prejšnjega stoletja (Hamilton in Sale, 1967). Do spoznanja, da lahko ob spremembi prepustnosti celične membrane vanjo vstopijo različne majhne (ioni, barvila, sladkorji) in velike molekule (DNA, zdravila) pa so prišli v osemdesetih letih (Zimmermann in sod., 1980). Neumann in njegovi kolegi so leta 1982 ugotovili, da lahko elektroporacija poveča učinkovitost transfekcije plazmidne DNA v mišjih celicah lioma (Neumann in sod, 1982). Prva elektroporacija v onkologiji je bila izvedena leta 1987, ko so v maligne celice z reverzibilno elektroporacijo vnesli citotoksična sredstva, kar danes imenujemo elektrokemoterapija (Okino in Mohri, 1987). V začetku devetdesetih so Titomirov in sod. (1991) uspešno izvedli prvi genski elektrotransfer v tkivo oz. kožo novorojene miške, ki so jo transfecirali s plazmidno DNA. Prva genska terapija, pri kateri so tumor podkožnega melanoma pri miškah transfecirali s pomočjo elektroporacije, je bila objavljena leta 1999 (vneseni gen Stat3 je povzročil apoptozo tumorskih celic) (Niu in sod., 1999). Zanimanje za to metodo je zaradi vseh prednostnih lastnosti v devetdesetih naraščalo, tako da je v 21. stoletju to najbolj priljubljena nevirusna metoda za transfekcijo celic tako in vivo kot tudi in vitro. Razvili so se tudi komercialni elektroporacijski sistemi (Shi in sod., 2018). Vsako celico ščiti plazemska membrana, zgrajena iz dielektričnega lipidnega dvosloja (debeline 5 nm) (Tsong, 1991), v katerem so proteini za transport molekul in ionov. Mirovni membranski potencial celic pri normalnih pogojih je negativen, v velikosti nekaj deset mV (Laboratorij za kibernetiko, 2017), kar je posledica razlik v koncentraciji ionov zunaj in znotraj celice (Tsong, 1991). Absolutna vrednost tega potenciala se ob primeru izpostavitve kratkim visokonapetostnim impulzom poveča, v membrani nastane električno polje, pri kritični vrednostih membranskega potenciala celice membrana postane nestabilna in pojavi se elektroporacija (Laboratorij za kibernetiko, 2017) ali elektropermeabilizacija. To je pojav, ki povzroči strukturne spremembe na celični membrani, imenovane pore, ki nastanejo zaradi kratkotrajnega visokonapetostnega električnega pulza (Weaver in Chizmadzhev, 1996). Kljub vsem eksperimentalnim podatkom in teoretičnim analizam še vedno ne vemo, kako elektroporacija deluje (Cha in Daud, 2012).
Oblikovanje por se začne s prodiranjem vodnih molekul v lipidni dvosloj, kar povzroči spreminjanje položaja lipidov v neposredni bližini – polarne glave lipidov se obrnejo proti vodi.
Takšne pore lahko sicer nastanejo tudi brez prisotnosti električnega polja, vendar je njihova življenjska doba nanosekundna in zato potrebujejo veliko energije. To energijo pri elektroporaciji dobimo iz električnega polja, kar verjetnost za nastanek por poveča (Yarmush in sod., 2014). Nova odkritja kažejo tudi na to, da naj bi visoka napetost permeabilizacijo membrane povzročala tudi s kemijskimi spremembami lipidov in s spreminjanjem funkcije membranskih proteinov, ki so del ion transportnih napetostno omejenih kanalčkov (Kotnik in sod., 2019).
10
Slika 3: Shema poenostavljene celične membrane in por v njej. Zunanje električno polje povzroči večanje števila por, čemur pravimo kratkotrajne spremembe v membranski strukturi celice. Te se po prenehanju delovanja električnega polja vrnejo v osnovno stanje. Če pa v nekaj milisekundah vzpostavijo stabilno konfiguracijo, tem pravimo dolgotrajne spremembe, saj traja približno 10 minut, da se povrnejo v prvotno stanje (Maček Lebar in sod., 1998).
Sprememba membranskega potenciala se dogodi zelo hitro, v nekaj milisekundah pod vplivom zunanjega električnega polja (Weaver in Chizmadzhev, 1996). Če je ta dovolj velika, bo prišlo do spremembe membranske strukture. Velikost celice in jakost električnega polja je premosorazmerna s spremembo membranskega potenciala. Ta pa je odvisen od lokacije na membrani. Vrednostni prag membranskega potenciala, pri katerem pride do povečane prepustnosti plazmaleme, je okoli 1 V (Orlowski in Mir, 1993) ali po nekaterih podatkih še nižji, okoli 200 mV (Teissie in Rols, 1993). Ko se pojavi električno polje, se začnejo kratkotrajne spremembe v strukturi množiti oz. povečevati. Ker so kratkotrajne, se po prenehanju delovanja električnega polja vrnejo v prvotno stanje (Slika 3). Lahko pa v nekaj milisekundah vzpostavijo stabilno konfiguracijo, čemur pravimo dolgotrajne spremembe, saj se izhodiščno stanje vzpostavi počasi (tudi po več kot 10 min) (Maček Lebar in sod., 1998).
Moč električnega polja, trajanje pulziranja in tip celice določa, kakšne posledice bo na celici pustila elektroporacija. Elektroporacija deluje na vseh vrstah celic – bakterijskih, rastlinskih in živalskih (Weaver in Chizmadzhev, 1996); in vivo v tkivih, ex vivo v tkivih in celicah. Če je jakost električnega polja prevelika, celice ne bodo preživele (Maček Lebar in sod., 1998).
Poznamo reverzibilno elektroporacijo, kjer se celica po pulziranju (8 pulzov z amplitudo 100- 1000 V) vrne v prvotno stanje. Gre za tip elektroporacije, ki je osnova za elektrokemoterapijo (ECT), genska elektrotransfekcijo (GET) in elektrofuzijo. Ireverzibilna elektroporacija (IRE) (z amplitudo do 3000 V in z vsaj 80-100 pulzi) pa celico preveč poškoduje, da bi lahko ponovno vzpostavila homeostazo (Yarmush in sod., 2014).
Celična smrt tumorskih celic je posledica apoptoze ali nekroze, ki nastopita ob trajni prekinitvi membrane ali ob sekundarni razgradnji membrane zaradi obilnega transmembranskega prenosa elektrolitov in adenozin trifosfata (Gissel in sod., 2011). Čeprav so tarčne celice pri tej terapiji uničene, okoliško tkivo ohrani svojo strukturo, kar izkoriščamo za zdravljenje tumorjev v bližini velikih žil, črevesja ter žolčnega in sečnega trakta (Geboers in sod., 2020). Pri tumorskem tkivu elektroporacija povzroči takojšno, a kratkotrajno, skoraj popolno zaustavitev pretoka krvi (Jarm in sod., 2010). Prekinjeni medcelični stiki prepuščajo proteine, kar povzroči povečanje
11
intersticijskega tlaka in znižanje intravaskularnega pritiska (Markelc in sod., 2013). Prednost tega efekta je, da zmanjša izhajanje plazmidne DNA med GET in zmanjša krvavitev pri uporabi invazivnih elektrod (Jarm in sod., 2010).
Na prehod molekule skozi membrano vpliva njena velikost in velikost pore, molekulska teža (težje so, težje vstopajo v celico) in naboj (Venslauskas in Šatkauskas, 2015). Pri dolgotrajnih spremembah v strukturi membrane se tvorijo nekakšne vodne poti (Gift in Weaver, 1995) za vstop ionov in majhnih molekul v celico. Večja bo jakost električnega polja, več molekul bo vstopilo v celice. Ob najvišji jakosti (platoju), ki jo celica še prenese, transport ni več odvisen od nje, ampak od nekega procesa, podobnega difuziji. Da se prepustnost celične membrane poveča, mora nastati določeno število por ustreznih velikosti, kar omogoči ionom, majhnim molekulam, makromolekulam (protitelesom, encimom, nukleinskim kislinam), zdravilom, materialom (barvilom) vstop v celično notranjost, česar sicer ne morejo (Prausnitz in sod., 1993;
Venslauskas in Šatkauskas, 2015; Weaver in Chizmadzhev, 1996). Zaradi njihove majhnosti (nekaj nm) jih ne moremo opazovati z optičnimi metodami, ampak jih napovedujejo s simulacijami molekularne dinamike. S pomočjo električnih meritev in flourescenčnih barvil jih lahko opazujemo posredno (Laboratorij za kibernetiko, 2017).
Prehod majhnih molekul čez pore je mogoč z difuzijo (Venslauskas in Šatkauskas, 2015) (na to kaže enaka koncentracija majhnih molekul zunaj in znotraj celice) (Maček Lebar in sod., 1998).
Če so molekule nabite (npr.: nukleinske kisline), se jim doda elektroforetična komponenta, ki poveča dostavo v celice med pulzom (Gabriel in Teissie, 1997). Velike molekule so skoraj popolnoma odvisne od pulziranja, sploh če so nabite (Gehl, 2003; Venslauskas in Šatkauskas, 2015). Splošno imajo za vstop v celico krajše priložnostno okno kot majhne (Gehl., 2003), zato je za večje molekule bolje, da pulz traja dalj časa ali pa si sledi večje število krajših (Maček Lebar in sod., 1998), da se uspešno prenesejo v celico (Gehl, 2003; Venslauskas in Šatkauskas, 2015). Predvidevajo, da nekaterim prehod čez membrano omogoča elektroporacija, drugim, npr.: DNA, pa elektroforeza, čemur tudi prilagodijo pulziranje (krajši in bolj intenzivni za elektroporacijo, daljši in manj intenzivni za elektroforezo) (Satkauskas in sod., 2002). Velike pore se po prenehanju delovanja električnega polja takoj pomanjšajo, medtem ko manjše vztrajajo še nekaj minut (Gabriel in Teissie, 1997).
6.5.2.2 Tipi elektroporacij
Konvencionalna elektroporacija poteka v paralelnih ploščah v stilu kivete, kjer se celična suspenzija in molekule (pripravljene za vstop vanje) mešajo v prevodni pufrski raztopini med dvema elektrodama, priključenima na generator z visoko električno napetostjo. Ker je omogočena elektroporacija veliki količini celic, jo imenujemo tudi »bulk« elektroporacija (BEP). Zaradi svoje tehnične preprostosti, hitre intracelularne dostave in skorajšnje neomejenosti pri izbiri tarčnega celičnega tipa in velikosti celice je BEP široko uporabljen elektroporacijski sistem. Kljub temu ima ta sistem nekaj pomanjkljivosti, ena izmed njih je težaven nadzor natančnega odmerjanja tovora za dostavo v tarčne celice, kar vpliva na prihodnost možnih kliničnih aplikacij intercelularnega prenosa.
Z razvojem nanotehnologije in mikrofluidne fabrikacije se je tudi elektroporacija začela pomikati v smeri miniaturizacije, kar je dobra strategija za odpravljanje prej omenjene pomanjkljivosti. Poznamo mikroelektroporacijo (MEP) in nanoelektroporacijo (NEP) (Shi in sod., 2018), ki omogočata prenos genskega materiala na nivoju posamezne celice (Kurosawa in sod., 2006) oz. prekinitev zelo majhnega dela površine celične membrane (NEP) (Xie in sod.,
12
2012). Obstaja več sistemov MEP, vsem pa je skupno, da so celice ujete v mikroaparaturo ali pa potujejo skozi mikrokanal (Fei in sod., 2010). Pri NEP je velikost aparature zmanjšana na 90 nm, kar omogoča še večjo celično viabilnost in natančen nadzor nad doziranjem, kar ne uspeva nobeni drugi metodi. Problem te metode je le to, da ima majhno prepustnost, saj mora biti celica za transfekcijo postavljena v en mikrokanal z uporabo optične pincete. NEP ima potencial za uporabo v biomedicini, kar so v praksi že preizkusili pri intracelularnemu biomarkerskemu merjenju rakavih celic, celičnem reprogramiranju in pri presejanju antitumorskih zdravil (Xie in sod., 2012).
In vivo elektroporacija je tehnika, ki se uporablja za dostavljanje DNA v tumorje, jetra, kožo, srčno mišico, skeletne mišice in možgansko tkivo (Cha in Daud, 2012). Glede na tarčo zdravljenja moramo za uspešno gensko ekspresijo optimizirati številne parametre, npr.:
največkrat se visoka moč električnega polja kombinira s kratkimi impulzi in obratno; pomemben je tudi dizajn elektrode, ali ta vstopi v tkivo ali ne (npr.: pri mišicah se pri elektrodi, ki jo prebode, uporabi večja napetost na centimeter, kot če mišice ne bi prebodli) (Heller in sod., 2002). Ena izmed tehnik, ki v onkologiji izkorišča in vivo elektroporacijo za dostavo genov v tumorske celice ali zdrave celice v njihovi okolici z namenom imunske stimulacije in stimulacije protirakavih lastnosti, je GET (Slika 4). V tarčno tkivo injicira plazmidno DNA (optimalna doza še ni določena, pogojuje jo velikost tumorja) pod visokim pritiskom (omogoča povečanje učinkovitosti tudi do 500-krat). Kratki in intenzivni impulzi, ki trajajo nekaj mikrosekund, permeabilizirajo membrano, sledijo jim dolgi in manj intenzivni impulzi, ki po nekaj milisekundah omogočijo elektroforezni transport DNA v celice, kjer pride do modifikacije (Rosazza in sod., 2016). Problem te tehnike je prehod na testiranje iz živalskih modelov na ljudi in nizka učinkovitost, zato tudi še ni široko sprejeta za uporabo pri ljudeh (Suschak in sod., 2017). Dve najbolj razviti aplikaciji GET v onkologiji sta terapija s citokini in DNA cepljenje.
Obe združujeta elektroporacijo in imunologijo. Citokinska terapija, osnovana na elektroporaciji, uporablja visoko napetostne impulze za transport plazmidov, ki kodirajo citokine v tumorske celice (Čemažar in sod., 2010).
Slika 4: Prikaz genske elektrotransfekcije (GET). A: Pred GET se okoli tumorja (rdeče) v zdravo tkivo ustavi elektrode (rjavo). Povečava kaže tumorsko celico z intaktno membrano, obdano z injicirano DNA (rumeno). B:
Med GET kratki in intenzivni impulzi permeabilizirajo membrano celic znotraj cone ablacije (modro), sledijo jim dolgi in manj intenzivni impulzi, ki omogočijo elektroforezni transport DNA v celice. C: Po GET sta celična viabilnost in struktura tkiva ohranjeni (sivo). Celica obnovi integirteto membrane in v jedro transportirana plazmidna DNA spremeni celične lastnosti (zeleni receptorji) (Geboers in sod., 2020).
13
6.6 VRSTE GENSKIH TERAPIJ IN NJIHOVE TARČE
Na začetku so z gensko terapijo želeli deaktivirati onkogene in nadomestiti nedelujoče gene za zaviranje tumorjev, pri čemer niso bili preveč uspešni. Novi pristopi pa omogočajo prenos genskega materiala (transgenov) neposredno v ciljne celice z namenom trajne ali prehodne spremembe fenotipa (Miller, 1992). Eksogene nukleinske kisline, ki jih v tarčne celice vnašamo pri genski terapiji, so geni, njihovi segmenti, oligonukleotidi, miRNA in siRNA. Tumorske celice naj bi potem izražale vnesene, spremenjene tarčne gene, mRNA ali sintetizirale eksogene proteine (Roma-Rodrigues in sod., 2020). Tarče genske terapije so maligne ali metastaze, krožeče tumorske celice, dormantne matične celice ali specifične celice, kot so limfociti T in dendritične celice (Husain in sod., 2015). V tarčni celici lahko pod vplivom na novo vnesenega genskega materiala, ki se vključi v jedrno DNA, pride do utišanja, znižanja regulacije, modifikacije ali do popravljanja tarčnih celic (Amer, 2014).
Uspešnost genske terapije pogojuje genomika raka, ki se spreminja s fazami bolezni. Trenutno se razvija terapije, ki se lotevajo ene ali več kritičnih genskih napak, čemur pravimo monogena genska terapija (Husain in sod., 2015). Lahko jo kombiniramo tudi z drugimi zdravljenji oz.
lahko genske modifikacije pomagajo izboljšati rezultat pri nadaljnjem zdravljenju s kemoterapijo, imunoterapijo ali sevanjem (Amer, 2014). Med strategije genske terapije za zdravljenje raka prištevamo nadomestitev tumor supresorskih genov, utišanje onkogenov z RNAi, terapijo s samomorilnimi geni, antitumorsko antiangiogenezo, imunsko gensko terapijo, onkolitično terapijo, tehnike genskega urejanja itd. (Roma-Rodrigues in sod., 2020).
6.6.1 Imunska genska terapija
Imunska genska terapija deluje tako, da okrepi imunski sistem proti celicam TME, še posebno proti celicam tumorja. Okrepitev se lahko izvaja na tri različne načine; s citokinsko gensko terapijo, cepivi proti tumorjem in terapijo s CAR-T (Roma-Rodrigues in sod., 2020). Osnova citokinske genske terapije je povečanje števila lokalnih citokinov s protitumorskimi lastnostmi.
To so interlevkin-2 (IL-2), IL-4, IL-6, IL-12, IL-27, IL-1, IL-24, interferon-alfa (IFN-α), IFN-β, IFN-γ, dejavniki tumorske nekroze (TNF) TNF-α in TNF-β, kolonijo stimulirajoči faktor (GM- CSF) itd. (Sun in sod., 2019). Ko citokine rakavim bolnikom administriramo sistematsko, so močno toksični, kar je peljalo v razvoj in vivo in ex vivo pristopov, pri katerih induktorje za izražanje citokinov v TME vnesemo z virusnimi in nevirusnimi vektorji (Hernandez-Alcoceba in sod., 2016). Veliko konstruktov genske terapije je sposobnih tumorske regresije, vendar dolgotrajna po elektroporaciji plazmida večinoma ni uspela. Z IL-12 plazmidno DNA je to mogoče v različnih tumorjih (Cha in Daud, 2012).
6.6.1.1 Interlevkin-12
Citokini so glavni akterji kontroliranega imunskega odziva. To spoznanje je vodilo v razvoj različnih terapij, ki citokine izkoriščajo za boj proti raku. Glavni predstavnik družine citokinov IL-12 je imunomodulacijski citokin IL-12, ki je močan induktor protitumorske imunosti. V to družino pa spadajo še IL-23, IL-27 in IL-35 (Vignali in Kuchroo, 2012). IL-12 je heterodimer, v katerem sta težka (p40) in lahka veriga (p35) med seboj kovalentno povezani z disulfidnimi vezmi. Njegova molekulska masa znaša 70 kDa (Kobayashi in sod., 1989). Za prepoznavanje citokinov morajo tarčne celice vsebovati receptor IL-12R, sestavljen iz dveh aminokislinskih podenot (IL-12Rβ1 in IL-12Rβ2). Ko se na ta kompleks, ki ga najdemo na NK celicah, aktivnih
14
T celicah, limfocitih B in nekaterih drugih (Pistoia in sod., 2009), uspešno veže IL-12, se aktivira JAK-STAT signalna pot, ki je ključna za aktivnost IL-12 (Bacon in sod., 1995).
Leta 1989 je bil IL-12 prepoznan kot stimulatorni faktor celic naravnih ubijalk (NK) z mnogimi biološki učinki na limfocite periferne krvi (Kobayashi in sod., 1989). Antigen predstavitvene celice (APC), kot so dendritične celice (DC), monociti, makrofagi in B celice, ob vključitvi toličnega receptorja (TLR) producirajo IL-12 (Trinchieri in sod., 1993). Izločati se začne ob okužbah kot zgodnji predvnetni citokin (Medzhitov, 2001).
IL-12 inducira produkcijo INF-γ, ki je glavni mediator njegovih aktivnosti (Slika 5). Pride do aktivacije tako prirojenega kot tudi pridobljenega imunskega sistema. Prirojeni imunski odziv v tem primeru pomeni povečano proliferacijo in aktivacijo celic naravnih ubijalk in indukcija proizvajanja kemokinov, ki privabljajo različne imunske celice. V pridobljenem imunskem sistemu IL-12 prispeva k aktivaciji in zorenju limfocitov T v celice pomagalke (Th) tipa 1, natančneje CD4+ in citotoksične limfocite T (CD8+). Th1 CD4+ celice producirajo INF-γ, IL-12 in TNF-β, kar vzbudi celično posredovano imunost in fagocitno vnetje. CD8+ T celice na koncu prepoznajo in uničijo tumorske celice. Funkciji IL-12, ki nista direktno povezani z imunskim sistemom, sta inhibicija angiogeneze v tumorju in pomoč pri protitumorski aktivnosti (Voest in sod., 1995).
Slika 5: Prikaz mehanizma delovanja interlevkina-12 (Čemažar in sod., 2010).
Terapevtski potencial IL-12 se široko raziskuje. Prva ocena kombinirane uporabe IL-12 in elektroporacije je pokazala, da gre za učinkovito dostavno metodo, ki povzroči povečano sistemsko koncentracijo IL-12 in njegove efektorske molekule INF-γ (Čemažar in sod., 2010).
15 6.6.1.2 Predklinične študije
Predklinične študije elektrogenske terapije z IL-12 so pokazale, da gre za učinkovit pristop k zdravljenju različnih tumorjev in metastaz različnih histologij. Poleg tega ponovljeni poskusi kažejo, da se je po tovrstni elektrogenski terapiji razvila protitumorska imunost. Razlike v odzivu tumorja se lahko pripiše različnim modelom, ki so bili uporabljeni v študijah, različnim načinom administracije plazmidne DNA (intratumorsko, peritumorsko, intramuskularno), različnim količinam plazmidne DNA in tudi različnim električnim parametrom ter obliki elektrod. Najboljši izid elektrogenske terapije z IL-12 je bil pri intratumorski administraciji terapije, ki je dala visoke koncentracije IL-12 in INF-γ v samih tumorjih in minimalno oz.
ničelno povečanje koncentracije omenjenih molekul v serumu. Sistemska toksičnost ni bila zaznana v nobeni od študij. Celovita ocena toksičnosti je bila izvedena po intratumoralni elektrogenski terapiji z IL-12 pri miših z induciranim melanomom B16. Edina abnormalnost, ki so jo zaznali (na histopatološkem nivoju), je bilo vnetje, povezano z ledvicami, pri miših 30 dni po zdravljenju. Zaradi zmanjšanega bremena tumorja so zdravljene miške pokazale manj nenormalnosti kot nezdravljene (Heller in sod., 2006).
V času predkliničnih študij so tudi preučevali mehanizem delovanja IL-12 in ugotovili, da je njegovo protitumorsko učinkovanje pleiotropično in vključuje različne elemente, infiltracijo efektorskih celic imunskega sistema in antiangiogeni učinek (Čemažar in sod. 2010).
6.6.1.3 Kombinirano zdravljenje
Ker ima elektrogenska terapija z IL-12 še vedno omejeno učinkovanje (ne deluje pri določenih tipih tumorjev), se jo lahko kombinira z drugimi načini zdravljenja raka (Kishida in sod., 2003).
Povečevanje ekspresije IL-12 preko povečevanja količine vektorja ni varno, saj je IL-12 lahko toksičen (Hernandez-Alcoceba in sod., 2016). Do učinka sinergije pride pri kombinaciji elektrogenske terapije z IL-12 z radioterapijo in elektrokemoterapijo (že v klinični uporabi) (Kishida in sod., 2003), ki združuje elektroporacijo in kemoterapijo. Visoko napetostni električni pulzi povečajo prepustnost membrane, kar omogoči boljše prehajanje citostatikov (npr.: cistoplatina in blomicina) v celico (Mir, 2006). Rezultati kažejo, da sta omenjeni standardni terapiji v kombinaciji z elektrogensko terapijo z IL-12 zelo učinkoviti, saj dajeta visok procent popolne odstranitve primarnih tumorjev in inducirata metastaze, kar vodi v razvoj protitumorske imunosti (Čemažar in sod., 2010). Povečevanje učinka zdravljenja z elektrogensko terapijo z IL-12 omogočajo tudi kombinacije z drugimi genskimi terapijami, ki vključujejo druge citokine in/ali sostimulacijske molekule, tudi imunomodulatorska protitelesa, antiangiogene faktorje, samomorilne gene (Hernandez-Alcoceba in sod., 2016) … Rezultati so bili v povprečju slabši kot pri kombinaciji s standardnimi metodami, npr.: IL-18 in IL-12 plazmidna DNA sta skupaj povzročili približno 70 % ozdravitev tumorja (Kishida in sod., 2001), medtem ko kombinirano zdravljenje z interferenčno RNA ni bilo uspešno (Li in sod., 2002).
6.6.1.4 Klinične študije
Dobra protitumorska učinkovitost genske terapije je vodila v raziskovanje na klinični ravni. V veterinarski onkologiji so z elektrogensko terapijo z IL-12 poskusili zdraviti mastocitome pri psih. Opazili so dobro lokalno protitumorsko učinkovanje, saj se je velikost zdravljenih tumorjev močno zmanjšala (za 15-83 %). Zmanjšalo se je tudi število malignih mast celic in
16
infiltracija vnetnih celic v zdravljenih tumorjih. Sistemskih stranskih učinkov niso zaznali, kljub sproščanju IL-12 in INF-γ. Podatki kažejo, da bi se lahko ta terapija uporabljala za lokalni in sistemski nadzor bolezni. Pri konjih je zdravljenje zahtevnih sarkoidov z elektrogeno terapijo z IL-12 v kombinaciji z elektrokemoterapijo prav tako pokazalo dobro protitumorsko učinkovitost tega pristopa (Čemažar in sod., 2010).
Rezultati veterinarske onkologije podpirajo učinkovitost in varnost prvih kliničnih testiranj elektrogenske terapije z IL-12 na ljudeh. Leta 2008 je v prvi fazi kliničnega preizkušanja dozo IL-12 elektrogenske terapije dobilo 24 pacientov z metastatskim malignim melanomom v podkožju. Glavni negativen stranski učinek terapije je bila prehodna bolečina po aplikaciji električnih pulzov. Prišlo je do pomembne nekroze tumorjev in infiltracije celic T. Pri 10 % pacientov je prišlo do popolne regresije oddaljenih metastaz, ki niso bile zdravljene, 42 % pacientov pa je kazalo stabilno stanje ali delni odziv na terapijo, kar kaže na sistemski učinek (Daud in sod., 2008).
7 ZAKLJUČEK
Napovedi kažejo, da naj bi med rojenimi leta 2012 do 75. leta starosti najverjetneje za rakom zbolel eden od dveh moških in ena od treh žensk (Kovač, 2018). Genska terapija je zanimiv terapevtski način, ki bo slej ali prej postal del standardne zdravstvene oskrbe za zdravljenje različnih bolezni (Wirth, 2013), tudi raka. Poznamo že veliko genov, za katere je jasno, da so zelo učinkoviti za odstranjevanje rakavih celic, če so izraženi na pravem mestu in v pravih količinah. Neuspešno iskanje idealnega vektorja in s tem posledično vprašanje o učinkovitosti in varnosti ostajajo glavni problem zdravljenja bolezni z gensko terapijo. V zadnjih letih zanimanje za nevirusne vektorje raste (Ramamoorth in Narvekar, 2015). Podatki kliničnih in predkliničnih testiranj kažejo velik potencial terapij, osnovanih na elektroporaciji, za zdravljenje raka zaradi njihove varnosti in enostavne priprave plazmidne DNA. Čeprav klinična preizkušanja rekombinantnega IL-12 niso prinesla želenih rezultatov, je genska terapija pritegnila veliko pozornosti, ker ni toksična in ima kontroliran izpust, kar ji daje potencial za prenos v kliniko (Čemažar in sod., 2010).
8 VIRI
Al-Dosari M. S., Gao X. 2009. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal, 11, 4: 671-681
Amer M. H. 2014. Gene therapy for cancer: present status and future perspective. Molecular and Cellular Therapies, 2, 27, doi: 10.1186/2052-8426-2-27: 19 str.
Bacon C. M., McVicar D. W., Ortaldo J. R., Rees R. C., O’Shea J. J., Johnston J. A. 1995.
Interleukin 12 (IL-12) induces tyrosine phosphorylation of JAK2 and TYK2: differential use of Janus family tyrosine kinases by IL-2 and IL-12. Journal of Experimental Medicine, 181, 1: 399-404
Behr J. P. 1994. Gene transfer with synthetic cationic amphiphiles: prospects for gene therapy.
Bioconjugate Chemistry, 5, 5: 382-389
17
Blatnik A., Krajc M., Strojnik K., Novaković S., Perić B., Banjac M. 2020. Kaj je dedni rak?:
dedno pogojeni raki – genetsko svetovanje in testiranje. Ljubljana, Onkološki inštitut Ljubljana: 17 str.
Borštnar S., Bernot M., Horvat M., Jezeršek Novaković B., Mlakar Mastnak D., Ocvirk J., Rožman S., Sonc M., Šeruga B., Umičević S., Zajc M., Zakotnik B. 2019. Napotki za premagovanje neželenih učinkov sistemskega zdravljenja raka: kaj morate vedeti?. Ljubljana, Onkološki inštitut Ljubljana: 65 str.
Cavazzana-Calvo M., Hacein-Bey S., de Saint Basile G., Gross F., Yvon E., Nusbaum P., Selz F., Hue C., Certain S., Casanova J. L., Bousso P., Deist F. L., Fischer A. 2000. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science, 288: 669-672 Cha E., Daud A. 2012. Plasmid IL-12 electroporation in melanoma. Human Vaccines and
Immunotherapeutics, 8, 11: 1734-1738
Čemažar M., Jarm T., Serša G. 2010. Cancer electrogene therapy with interleukin-12. Current Gene Therapy, 10, 4: 300-311
Čufer T., Knez L., Mrhar A. 2018. Sistemsko zdravljenje: Osnovni principi. V: Onkologija:
učbenik za študente medicine. Strojan P., Hočevar M. (ur.). Ljubljana, Onkološki inštitut Ljubljana: 262-292
Daud A. I., DeConti R. C., Andrews S., Urbas P., Riker A. I., Sondak V. K., Munster P. N., Sullivan D. M., Ugen K. E., Messina J. L., Heller R. 2008. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. Journal of Clinical Oncology, 26, 36: 5896-5903
Fei Z., Hu X., Choi H. W., Wang S., Farson D., Lee L. J. 2010. Micronozzle array enhanced sandwich electroporation of embryonic stem cells. Analytical Chemistry, 82: 353-358
Gabriel B., Teissie J. 1997. Direct observation in the millisecond time range of fluorescent molecule asymmetrical interaction with the electropermeabilized cell membrane. Biophysical Journal, 73: 2630-2637
Geboers B., Scheffer H. J., Graybill P. M., Ruarus A. H., Nieuwenhuizen S., Puijk R. S., van den Tol P. M., Davalos R. V., Rubinsky B., de Gruijl T. D., Miklavčič D., Meijerink M. R.
2020. High-voltage electrical pulses in oncology: Irreversible electroporation, electrochemotherapy, gene electrotransfer, electrofusion, and electroimmunotherapy.
Radiology, 295, 2: 254-272
Gehl J. 2003. Electroporation: Theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica, 177: 437-447
Gift E. A., Weaver J. C. 1995. Observation of extremely heterogeneous electroporative molecular uptake by Saccharomyces cerevisiae which changes with electric field pulse amplitude. Biochimica et Biophysica Acta (BBA), 1234, 1: 52-62
Gill D. R., Southern K. W., Mofford K. A., Seddon T., Huang L., Sorgi F., Thomson A., MacVinish L. J., Ratcliff R., Bilton D., Lane D. J., Littlewood J. M., Webb A. K., Middleton P. G., Colledge W. H., Cuthbert A. W., Evans M. J., Higgins C. F., Hyde S. C. 1997. A placebo-controlled study of liposome-mediated gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. Gene Therapy, 4, 3: 199-209
18
Gissel H., Lee R. C., Gehl J. 2011. Electroporation and cellular physiology. V: Clinical aspects of electroporation. Kee S. T., Gehl J., Lee E. W. (ur.). New York, Springer: 9-17
Haasteren J., Hyde S. C., Gill D. R. 2018. Lessons learned from lung and liver in-vivo gene therapy: implications for the future. Expert Opinion on Biological Therapy, 18, 9: 959-972 Hamilton W. A., Sale A. J. H. 1967. Effects of high electric fields on microorganisms II.
Mechanism of action the lethal effect. Biochimica et Biophysica Acta (BBA), 148: 789-800 Hanahan D., Weinberg R. A. 2000. The hallmarks of cancer. Cell, 100: 57-70
Heinzerling L. M., Feige K., Rieder S., Akens M. K., Dummer R., Stranzinger G., Moelling K.
2001. Tumor regression induced by intratumoral injection of DNA coding for human interleukin 12 into melanoma metastases in gray horses. Journal of Molecular Medicine, 78, 12: 692-702
Heller L. C., Ingram S. F., Lucas M. L., Gilbert R. A., Heller R. 2002. Effect of electrically mediated intratumor and intramuscular delivery of a plasmid encoding IFN alpha on visible B16 mouse melanomas. Technology in Cancer Research and Treatment, 1: 205-209
Heller L., Merkler K., Westover J., Cruz Y., Coppola D., Benson K., Daud A., Heller R. 2006.
Evaluation of toxicity following electrically mediated interleukin-12 gene delivery in a B16 mouse melanoma model. Clinical Cancer Research, 12, 10: 3177-3183
Hernandez-Alcoceba R., Poutou J., Ballesteros-Briones M. C., Smerdou C. 2016. Gene therapy approaches against cancer using in vivo and ex vivo gene transfer of interleukin-12.
Immunotherapy, 8, 2: 179-198
Husain S. R., Han J., Au P., Shannon K., Puri R. K. 2015. Gene therapy for cancer: regulatory considerations for approval. Cancer Gene Therapy, 22, 12: 554-563
IARC. 2021. Globocan 2020: World.
https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/900-world-fact-sheets.pdf (15. avg. 2021) Jarm T., Čemažar M., Miklavčič D., Serša G. 2010. Antivascular effects of electrochemotherapy: implications in treatment of bleeding metastases. Expert Review of Anticancer Therapy, 10, 5: 729-746
Kishida T., Asada H., Itokawa Y., Yasutomi K., Shin-Ya M., Gojo S., Cui F. D., Ueda Y., Yamagishi H., Imanishi J., Mazda O. 2003. Electrochemo-gene therapy of cancer:
intratumoral delivery of interleukin-12 gene and bleomycin synergistically induced therapeutic immunity and suppressed subcutaneous and metastatic melanomas in mice.
Molecular Therapy, 5: 738-745
Kishida T., Asada H., Satoh E., Tanaka S., Shinya M., Hirai H., Iwai M., Tahara H., Imanishi J., Mazda O. 2001. In vivo electroporation-mediated transfer of interleukin-12 and interleukin- 18 genes induces significant antitumor effects against melanoma in mice. Gene Therapy, 16:
1234-1240
Klein T. M., Wolf E. D., Wu R., Sanford J. C. 1987. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature, 327: 70-73
Kobayashi M., Fitz L., Ryan M., Hewick R. M., Clark S. C., Chan S., Loudon R., Sherman F., Perussia B., Trinchieri G. 1989. Identification and purification of natural killer cell stimulatory factor (NKSF), a cytokine with multiple biologic effects on human lymphocytes.
Journal of Experimental Medicine, 170: 827-845
