KARAKTERIZACIJA TVORBE GVANOZINSKIH NANOŽIC Z METODAMI SIPANJA SVETLOBE

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO ODDELEK ZA FIZIKO

FIZIKA KONDENZIRANE SNOVI

Tomaž Pšeničnik

KARAKTERIZACIJA TVORBE GVANOZINSKIH NANOŽIC Z METODAMI SIPANJA SVETLOBE

Magistrsko delo

MENTORICA: prof. dr. Irena Drevenšek Olenik SOMENTORICA: doc. dr. Lea Spindler

Ljubljana, 2022

Karakterizacija tvorbe gvanozinskih nanožic z metodami sipanja svetlobe

Izvleček

Optični metodi dinamično sipanje svetlobe (DLS) in diferenčna dinamična mikro- skopija (DDM) sta primerni eksperimentalni tehniki za zaznavanje submikronskih delcev v različnih suspenzijah. V našem primeru so to vodne suspenzije z gvaninom bogatih oligonukleotidov DNK, ki ob prisotnosti primerne koncentracije kationov, kot sta recimo Na⁺ ali K⁺, tvorijo daljše strukture imenovane G-žičke. Metodi sta osnovani na sipanju svetlobe in izračunu avtokorelacijske funkcije intenzitete svetlobe zaznane na fotopomnoževalki ali zelo hitri kameri. Kljub temu, da je prin- cip merjenja pri omenjenih metodah različen, se rezultati - na podlagi primernega matematičnega modela - med seboj dopolnjujejo in so primerljivi. Z navedenima metodama smo določili difuzijske koeficiente sipalcev suspenzij, iz katerih smo ugo- tovili, katere mutacije začetnega oligonukleotida d(G2AG4AG2) tvorijo G-žičke ter kolikšna je dolžina teh žičk. Zaznali smo G-žičke različnih velikosti, katerih efektivne dolžine so v razponu od L_min ∼20nm do L_max ∼140 nm.

Ključne besede:

oligonukleotidi DNK, G-kvarteti, G-kvadrupleksi, G-žičke, Brownovo gibanje, dina- mično sipanje svetlobe, diferenčna dinamična mikroskopija.

Characterization of formation of guanosine nanowires by light scattering methods

Abstract

Optical methods, such as dynamic light scattering (DLS) and differential dynamic microscopy (DDM) are suitable experimental techniques for detecting submicron particles in different suspensions. In our case, these are aqueous suspensions of guanine-rich oligonucleotides that in the presence of a suitable concentration of cations, such as Na⁺ or K⁺, form longer structures called G-wires. The methods are based on light scattering and the calculation of the autocorrelation function of the perceived light intensity on a photomultiplier or a high-speed camera. Despite the fact, that the principle of measurement in the two mentioned methods is differ- ent, the results - based on a suitable mathematical model - complement each other and are comparable. With both methods, we determined the diffusion coefficients of the suspension, from which we deduced, which mutation of the initial oligonu- cleotide d(G2AG4AG2) form G-wires and what is the length of these wires. We detected G-wires of different sizes, whose effective lengths range fromL_min ∼20nm toL_max ∼140 nm.

Keywords:

DNA oligonucleotides, G-quartets, G-quadruplexes, G-wires, Brownian motion, dyna- mic light scattering, differential dynamic microscopy.

Kazalo

Seznam slik . . . 9

Seznam tabel . . . 11

1 Uvod . . . 13

1.1 Formiranje gvanozinskih kvadrupleksov . . . 14

1.2 Uporabljeni vzorci . . . 15

1.3 Cilj raziskave . . . 16

2 Brownovo gibanje . . . 17

2.1 Brownovo gibanje sferičnih delcev . . . 18

2.2 Model togih paličastih delcev . . . 18

2.2.1 Translacijsko Brownovo gibanje . . . 19

2.2.2 Rotacijsko Brownovo gibanje . . . 20

2.2.3 Skupno gibanje . . . 22

3 Eksperimentalne metode za karakterizacijo sipanja svetlobe . . . . 23

3.1 Dinamično sipanje svetlope - DLS . . . 23

3.1.1 Teorija sipanja svetlobe . . . 24

3.1.2 Model diskretnih sipalcev . . . 25

3.1.3 Detekcija . . . 26

3.1.3.1 Avtokorelacijska funkcija . . . 26

3.1.3.2 Homodinska in heterodinska detekcija . . . 28

3.1.3.3 Modelska funkcija . . . 30

3.1.4 Model poljske avtokorelacijske funkcije . . . 31

3.1.4.1 Prispevek translacije . . . 32

3.1.4.2 Prispevek anizotropnosti in rotacije . . . 32

3.1.4.3 Polarizirano in depolarizirano sipanje . . . 34

3.2 Diferenčna dinamična mikroskopija - DDM . . . 34

4 Eksperimenti in meritve . . . 37

4.1 Dinamično sipanje svetlobe - DLS . . . 37

4.1.1 Eksperiment . . . 37

4.1.2 Meritve . . . 38

4.1.3 Analiza in rezultati . . . 42

4.1.3.1 Analiza prvega sklopa vzorcev . . . 45

4.1.3.2 Analiza drugega sklopa vzorcev . . . 53

4.1.3.3 Analiza tretjega sklopa vzorcev . . . 57

4.2 Diferenčna dinamična mikroskopija - DDM . . . 62

4.2.1 Eksperiment . . . 62

4.2.2 Meritve in analiza . . . 62

4.2.2.1 Analiza DDM meritev vzorcev z oznako S1 različnih “mutacij” . . . 64

4.2.2.2 Analiza DDM meritev vzorcev S3 in S4 . . . 69

5 Analiza rezultatov in razprava . . . 75

6 Zaključek . . . 79

7 Dodatki . . . 81

7.1 Dodatek I . . . 81

7.2 Dodatek II . . . 82

7.3 Dodatek III . . . 83

Literatura . . . 85

Seznam slik

1.1 Gvanozin 5’-monofosfat . . . 13

1.2 G-kvartet in enostaven kvadrupleks . . . 14

1.3 Model nalaganja posameznih kvadrupleksov in formiranja G-žičk . . . 15

2.1 Brownovo gibanje . . . 17

2.2 Anizotropija v hidrodinamskem uporu na cilindričnih delcih . . . 19

2.3 Rotacijska difuzija na enotski sferi . . . 21

3.1 Shema sipanja v napravi DLS . . . 23

3.2 Diskretni sipalci . . . 26

3.3 Cilindrični delec v laboratorijskih sistemih . . . 33

3.4 Shema naprave diferenčne dinamične mikroskopije . . . 35

4.1 Shema eksperimentalne naprave DLS . . . 37

4.2 Izbrane meritve vzorca S1 1 mM oligo 100 mM KCl - d(G2AG4AG2) iz drugega sklopa . . . 39

4.3 Izbrane meritve vzorcev prvega sklopa . . . 40

4.4 Izbrane meritve vzorcev S3 in S4 . . . 41

4.5 Izbrane meritve vzorcev tretjega sklopa . . . 42

4.6 Izbrani primeri prileganja teoretične krivulje g⁽²⁾−1 k meritvam. . . 43

4.7 Analiza meritev vzorca S1_264 . . . 45

4.8 Meritve in analiza frekvencef_{V H} vzorca S1_264 prenosne DLS naprave 45 4.9 Počasni relaksacijski način vzorca S1_264 . . . 46

4.10 Vse meritve vzorca S1_264 v VV načinu . . . 47

4.11 Analiza meritev vzorca S1_363 . . . 48

4.12 Vse meritve vzorca S1_363 v VV in VH načinu . . . 48

4.13 Poseben primer analize vzorca S1_363 . . . 49

4.14 Analiza hitrega relaksacijskega načina meritev vzorca S1_t363 . . . . 50

4.15 Meritve in analiza meritev vzorca S1_t363 . . . 50

4.16 Analiza počasnega relaksacijskega načina VV meritev vzorca S1_t363 51 4.17 Analiza počasnega relaksacijskega načina VH meritev na stacionarni napravi vzorca S1_t363 . . . 52

4.18 Vse analize meritev vzorca S1_t363 v VV načinu . . . 52

4.19 Analiza meritev vzorca S1 1mM oligo 100 mM KCl . . . 53

4.20 Analiza počasnega relaksacijskega načina za vzorec S1 1 mM oligo 100 mM KCl . . . 55

4.21 Analiza meritev vzorca S3 na prenosni DLS napravi . . . 55

4.22 Analiza vseh meritev vzorca S3 . . . 56

4.23 Analiza meritev vzorca S4 na prenosni DLS napravi . . . 56

4.24 Analiza vseh meritev vzorca S4 . . . 57

4.25 Analiza meritev vzorca S1 1mM oligo 300 mM KCl . . . 58

4.26 Analiza vseh meritev vzorca S1 1 mM oligo 300 mM KCl v VV načinu 58 4.27 Analiza izbranih meritev vzorca S1 3 mM oligo 100 mM KCl . . . 59 4.28 Analiza vseh meritev vzorca S1 3 mM oligo 100 mM KCl v VV načinu 60 4.29 Analiza meritev vzorca S1 3mM oligo 300 mM KCl . . . 61 4.30 Primerjava počasnega relaksacijskega načina vzorca S1 3mM oligo

300 mM KCl . . . 61 4.31 Analiza VH meritev vzorca S1 3mM oligo 300 mM KCl . . . 62 4.32 Zajem slik začetka DDM meritev vzorcev S3 in S4. . . 63 4.33 DDM meritve vzorca S1_264 - d(G2AG6AG4) pri izbranih sipalnih

valovnih vektorjih q s prilegajočimi teoretičnimi krivuljami g⁽¹⁾(q, τ) . 64 4.34 Analiza DDM meritev vzorca S1_264 - d(G2AG6AG4) . . . 65 4.35 DDM meritve vzorca S1_t363 - d(G3AG6TG3) pri izbranih sipalnih

valovnih vektorjih q s prilegajočimi teoretičnimi krivuljami g⁽¹⁾(q, τ) . 66 4.36 Analiza DDM meritev vzorca S1_t363 - d(G3AG6TG3) . . . 66 4.37 DDM meritve vzorca S1_363 - d(G3AG6AG3) pri izbranih sipalnih

valovnih vektorjih q s prilegajočimi teoretičnimi krivuljami g⁽¹⁾(q, τ) . 67 4.38 Analiza DDM meritev vzorca S1_363 - d(G3AG6AG3) . . . 67 4.39 DDM meritve vzorca S1 - d(G2AG4AG2) pri izbranih sipalnih valov-

nih vektorjih q s prilegajočimi teoretičnimi krivuljami g⁽¹⁾(q, τ) . . . . 68 4.40 Analiza DDM meritev vzorca S1_363 - d(G3AG6AG3) . . . 68 4.41 Prileganje dvorelaksacijske funkcije g⁽¹⁾ za vzorec S3 . . . 69 4.42 Frekvenca hitrega relaksacijskega načina za vzorec S3 - d(GCG2AG4AG2)

v odvisnosti od q² . . . 70 4.43 Dobljeni rezultati frekvence počasnega relaksacijskega načina za vzo-

rec S3 - d(GCG2AG4AG2) v odvisnosti od q² . . . 70 4.44 Primerjava počasne relaksacijske frekvence na DDM in DLS napravi

za vzorec S3 - d(GCG2AG4AG2) . . . 71

4.45 Prileganje dvorelaksacijske funkcijeg⁽¹⁾(q, τ)za vzorec S4 - d(GCG2AG4AG2CG) 72 4.46 Frekvenčna odvisnost od q² hitrega in počasnega relaksacijskega na-

čina za vzorec S4 - d(GCG2AG4AG2CG) . . . 72 4.47 Primerjava počasne relaksacijske frekvence na DDM in DLS napravi . 73 5.1 Vzorci z oborino v steklenih cevkah za NMR spektroskopijo . . . 76

Seznam tabel

1.1 Sklop prvih vzorcev . . . 16 1.2 Sklop drugih vzorcev . . . 16 1.3 Sklop tretjih vzorcev . . . 16 4.1 Primerjava med rezultati stacionarne in prenosne DLS naprave za

vzorec S1_264 . . . 46 4.2 Kvantitativni rezultati za vzorec S1_264 . . . 47 4.3 Rezultati hitrega relaksacijskega načina za vzorec S1_363 . . . 49 4.4 Primerjava rezultatov vzorca S1_t363 med podatki, pridobljeni s sta-

cionarno in prenosno DLS napravo . . . 51 4.5 Kvantitativni rezultati za vzorec S1_t363 . . . 53 4.6 Primerjava rezultatov vzorca S1 1mM oligo 100 mM KCl med po-

datki, pridobljeni s stacionarno in prenosno DLS napravo . . . 54 4.7 Tabela rezultatov vseh meritev vzorca S3 . . . 56 4.8 Tabela rezultatov vseh meritev vzorca S4 . . . 57 4.9 Rezultati vzorca S1 1 mM oligo 300 mM KCl za izbrane meritve . . . 58 4.10 Tabela rezultatov vseh meritev vzorca S1 1 mM oligo 300 mM KCl v

VV načinu . . . 59 4.11 Rezultati vzorca S1 3 mM oligo 300 mM KCl za izbrane meritve . . . 59 4.12 Tabela rezultatov vseh meritev vzorca S1 3 mM oligo 100 mM KCl v

VV načinu . . . 60

Poglavje 1 Uvod

Oligonukleotid je kratek polimer, ponavadi sestavljen iz treh do dvajset nukleotidov.

Vsako monomersko komponento sestavljajo nukleobaza, molekula sladkorja s petimi ogljiki in fosfatna skupina [1]. Oligonukleotidi so torej kratke molekule DNK ali RNK. Na sliki 1.1 je prikazan nukleotid z nukleobazo gvaninom.

Slika 1.1: Kemijska struktura nukleotida gvanozin 5’-monofosfata. Sestavlja ga nukleobaza gvanin, sladkor - pentoza in fosfatna skupina. Če se na ogljiku slad- korja nahaja R=OH, strukturo krajše imenujemo gvanozin. V primeru R=H imamo opravka z deoksigvanozinom. Slika je povzeta po [2].

Gvanozin se v vodnih suspenzijah spontano ureja v organizirane strukture. Štirje gvanozini tvorijo simetrično ravninsko strukturo, ki jo imenujemo G-tetrada ali G- kvartet (slika 1.2a). Vsak gvanin je hkrati donor in akceptor dveh vodikovih vezi.

Celotno strukturo tako skupaj drži osem Hoogsteenovih vodikovih vezi [3]. Dodatno stabilnost G-kvartetom omogoča kation, ki zasede prazen prostor v sredini in senči naboj rahlo negativno nabitih kisikov. G-kvarteti se dalje, z ustreznim zasukom, vertikalno nalagajo v paličaste skupke imenovane kvadrupleksi (slika 1.2b). Kationi se pomaknejo med dva G-kvarteta in s tem pripomorejo k stabilizaciji strukture.

Daljše kvadrupleksne strukture oz. njihove agregate imenujemo tudi G-žičke. Kako dolge žičke dobimo, zavisi od koncentracije kationov, koncentracije molekul gvano- zina, temperature in pH vrednosti suspenzije [4].

G-kvartete najdemo v naravi, v delih DNK, ki so bogati z gvaninom. Takšen je recimo del na kromosomu 9p21 z oznakoC9ORF72, kjer so opazili daljše ponovitve

Poglavje 1. Uvod

heksanukleotida G4C2. Teh ponovitev je pri pacientih z amiotrofično lateralno skle- rozo (ALS) in frontotemporalno degeneracijo - demenco (FTD) veliko več, kot pri zdravih osebah [5]. Obstaja sum, da so za nastanek omenjenih bolezni razlog ravno daljše ponovitve z gvaninom bogatih oligonukleotidov. Razlogi in pogoji za nastanek G-žičk na kromosomih še niso povsem znani. Del znanja o njihovem nastanku lahko pridobimo s temeljitim razumevanjem njihove termodinamike in kinetike v želenem sistemu. Za proučevanje njihovih lastnosti so tako primerne vodne suspenzije z gva- ninom bogatih oligonukleotidov, katerih vzorci so primerni za merjenje na napravah DLS ali DDM.

+

(a)

Zanka 1 Zanka 3

Zanka 2 G

G G G G

G

G

G

G

G G

G

5’

3’

(b)

Slika 1.2: (a) G-kvartet, kjer dR predstavlja sladkor in fosfatno skupino in (b) skica preprostega kvadrupleksa, katerega osnovni gradniki so med seboj povezani G-kvarteti. Na skici sta označena tudi odprta konca 3’ in 5’, ki imata pomembno vlogo pri modelu nalaganja kvadrupleksov. Premer G-kvarteta je ocenjen nad∼2,6 nm [6]. Sliki sta povzeti po [7].

1.1 Formiranje gvanozinskih kvadrupleksov

S problematiko formiranja kvadrupleksov iz izbranega zaporedja nukleotidov, ki ka- sneje pod določenimi pogoji tvorijo G-žičke, se ukvarjajo na Kemijskem inštitutu v Ljubljani, od koder smo dobili že pripravljene vzorce za uporabo na napravi DLS.

V teoriji je model nalaganja nukleotidov v kvadruplekse in nato zlaganje kvadruple- ksov v G-žičke zelo zapleten. Ker cilj raziskovalne naloge leži drugje, v podrobnosti modela ne bomo zahajali. Vseeno pa si poglejmo osnovno idejo formiranja G-žičk, saj je le ta bistvena za razumevanje kasnejših predpostavk in modelov.

Eden izmed modelov formiranja G-žičk predpostavlja dva različna mehanizma.

Prvi temelji na ustreznem prileganju GC-koncev posameznega enostavnega kva- drupleksa. Pri tem se posamezen GC-konec nahaja na izbranem mestu 3’ ali 5’.

1.2. Uporabljeni vzorci

Pri drugem mehanizmu poteka zlaganje prek “čelnega” (π − π) nalaganja konč- nih GG kvartetov [8]. Shematično je prikazano nalaganje kvadrupleksov na sliki 1.3 za primer treh različnih sekvenc: d(GGTG4TGG), d(GGTG4TGGCG)−3^′ in 5^′−d(GCGGTG4TGGCG)−3^′. S črko d označujemo, da gre v resnici za deoksinu- kleotide. Model predpostavlja, da oligonukleotidi s koncema 3’-GC in 5’-GC tvorijo krajše ali enojne kvadruplekse, ostali z odprtim koncem pa daljše agregate (G-žičke).

Daljše strukture oz. G-žičke bomo obravnavali kot cilindrične paličice.

3’GC konec

5’GC konec

(a)

d(GGTG₄TGGCG)

d(GGTG4TGG)

d(GCGGTG₄TGGCG)

(b)

Slika 1.3: Shematični prikaz modela nalaganja posameznih kvadrupleksov in for- miranja G-žičk. (a) Enostavni kvadrupleksi, ki se (b) ustrezno nalagajo v daljše strukture oz. G-žičke. Poleg naloženih struktur je zapisana njihova sekvenca. Pov- zeto po [8].

1.2 Uporabljeni vzorci

Pri raziskovalni nalogi smo uporabili 9 vzorcev, z oznakami in sekvencami: S1 - d(G2AG4AG2), S1_264 - d(G2AG6AG4), S1_363 - d(G3AG6AG3), S1_t363 - d(G3AG6TG3), S3 - d(GCG2AG4AG2) in S4 - d(GCG2AG4AG2CG). Vzorci so bili pripravljeni na Kemijskem inštitutu v Ljubljani. Označeni vzorci in njihove lastnosti so razvidne iz tabel 1.1, 1.2 in 1.3.

Podoben model nalaganja kvadrupleksov, kot je bil predstavljen v prejšnjem razdelku, lahko predpostavimo tudi za naše merjene vzorce. Kot lahko opazimo iz podanih sekvenc, se vzorca S3 in S4 razlikujeta po GC-koncih od ostalih vzorcev z oznako S1. Vzorca z oznako S3 in S4 služita neke vrste kontroli modela agregacije posameznih kvadrupleksov, saj zaradi GC-koncev ne pričakujemo, da se nalagata v daljše strukture [9] od vzorcev z vsebovano oznako S1. V vzorcih S3 in S4 posledično pričakujemo hitrejšo dinamiko sipalcev.

Vzorci z vsebovano oznako S1 se med seboj razlikujejo po “mutacijah”. Z mutacijo mislimo na prisotnost in položaj kakšnega drugega nukleotida kot gvanozina, na

Poglavje 1. Uvod

primer adenozina, ki pa je lahko zamenjan z drugim nukleotidom, kot je v našem primeru to timidin v vzorcu S1_t363.

Tabela 1.1: Oznake prvega sklopa vzorcev. Spremenjeno je število nukleotidov z gvaninsko bazo ali zamenjan adenozin s timidinom.

oznaka S1_264 S1_363 S1_t363

koncentracija oligonukleotida 1 mM 1 mM 1 mM koncentracija soli 100 mM KCl 100 mM KCl 100 mM KCl

datum priprave 10. 6. 2020 10. 6. 2020 10. 6. 2020

Tabela 1.2: Oznake drugega sklopa vzorcev. Vzorca S3 in S4 imata različno število GC-koncev.

oznaka S1 S3 S4

koncentracija oligonukleotida 1 mM 1 mM 1 mM koncentracija soli 100 mM KCl 15 mM KCl 15 mM KCl

opomba / 20% D2O 10% D2O

datum priprave 31. 8. 2020 20. 8. 2020 20. 8. 2020

Tabela 1.3: Oznake tretjega sklopa vzorcev. Vsebujejo različne koncentracije oligo- nukleotidov in soli.

oznaka S1 S1 S1

koncentracija oligonukleotida 1 mM 3 mM 3 mM koncentracija soli 300 mM KCl 100 mM KCl 300 mM KCl

datum priprave 6. 11. 2020 24. 11. 2020 24. 11. 2020

1.3 Cilj raziskave

Cilji magistrske naloge so bili naslednji. Spoznati in razumeti delovanje eksperi- mentalne naprave DLS. Na njej pomeriti pripravljene vzorce in predstaviti njihove bistvene lastnosti v okviru modela gibanja cilindričnih paličic, ki sta ga razvila Maria M. Tirado in José Garcia de la Torre [10] ter določiti dolžino L in premer dpaličic.

Na ta način smo želeli najti zvezo med spremembami v zaporedju nukleotidov in sposobnostjo tvorbe žičk. Iste vzorce smo pripravili za merjenje tudi na napravi DDM. Cilj je bil preveriti ustreznost tehnike DDM za analizo tovrstnih vzorcev ter primerjava dobljenih rezultatov z rezultati na napravi DLS.

Poglavje 2

Brownovo gibanje

Delci v suspenziji konstantno spreminjajo svoj položaj zaradi difuzije. Kadar so delci v suspenziji mnogo večji od delcev topila, lahko privzamemo, da se delci nahajajo v kontinuiranem mediju ali topilu. Molekule topila se nenehno zaletavajo v delce in jim tako naključno spreminjajo hitrost in položaj. Omenjeno naključno gibanje delcev v raztopini imenujemo Brownovo gibanje po Škotskem botaniku Robertu Brownu.

Povezano je s termično energijo k_bT [11], kjer sta k_b Boltzmannova konstanta in T temperatura.

Brownovo gibanje je stohastičen proces in spada med procese Markova. Delcu v suspenziji vnaprej ni mogoče določiti, kje se bo nahajal ob kasnejšem časut, če smo njegov položaj težišča poznali na začetku ob času t^′. Položaj lahko le napovemo z verjetnostjo porazdelitvijoP(R,R^′;t, t^′), da se bo delec v topilu nahajal na položaju R ob času t, če se je ob času t^′ nahajal na položaju R^′ [11]. Primer Brownovega gibanja delca v raztopini prikazuje slike 2.1.

Slika 2.1: Primer Brownovega gibanja. Delec se ob času t^′ nahaja na lokaciji R^′, ob kasnejšem času t ga najdemo na lokaciji R. Med tem velikokrat spremeni svojo lokacijo.

Poglavje 2. Brownovo gibanje

2.1 Brownovo gibanje sferičnih delcev

V opisu Brownovega gibanja smo uporabili položaj težišča delca R(t), saj delci v raztopini nemalokrat nastopajo v različnih “pravilnih” in nepravilnih oz. poljubnih oblikah. Kljub temu, lahko vse delce v topilu obravnavamo kot sferične s pripadajo- čim hidrodinamskim radijemR_h. Fenomenološko opišemo proces gibanja z difuzijsko enačbo

∂P(R,R^′;t, t^′)

∂t =D∇²P(R,R^′;t, t^′), (2.1) kjer je D difuzijska konstanta in ∇² = _∂X^∂22 + _∂Y^∂22 + _∂Z^∂22, ki deluje na koordinate težišča R. Rešitev enačbe (2.1) je Gaussova verjetnostna porazdelitev

P(R,R^′;t, t^′) = (4πD(t−t^′))^−3/2exp (︃

−(R−R^′)² 4D(t−t^′)

)︃

. (2.2)

Brez težav lahko postavimo t^′ = 0 in R^′ = 0. Uporabimo splošno Gaussovo trodi- menzialno porazdelitev [12]

G(X, Y, Z) =(︁

2πσ²)︁−3/2

exp (︃

−X² +Y²+Z² 2σ²

)︃

, (2.3)

pri čemer smo upoštevali ⟨X⟩=⟨Y⟩=⟨Z⟩= 0. upoštevamo še X²+Y²+Z² =R² in σ=σ_X =σ_Y =σ_Z →σ_R =σ/√

3ter primerjamo enačbo (2.3) z enačbo (2.2) in dobimo prenovljeno enačbo k enačbi (2.2)

P(R, t) = (︃2π

3 σ_R² )︃−3/2

exp (︃

−3R² 2σ_R²

)︃

. (2.4)

Za Gausssovo porazdelitev poznamo povprečen kvadrat odmika, ki je σ_R² =⟨︁

(R(t)−R(0))²⟩︁

=⟨︁

∆R²(t)⟩︁

= 6Dt, (2.5)

pri tem vsaka prostorska stopnja doprinese enak delež

⟨︁∆X²(t)⟩︁

=⟨︁

∆Y²(t)⟩︁

=⟨︁

∆Z²(t)⟩︁

= 2Dt. (2.6)

Kot vidimo, se povprečen kvadrat odmika veča linearno s časom t. Einsteinova relacija [13]

D=k_bT /ζ, ζ = 6πηR_h, (2.7)

povezuje difuzijsko konstanto D s sferičnimi delci z radijem R_h. Parameterζ pred- stavlja upor na gibajoč delec. V našem primeru je to Stokesov hidrodinamski upor, pri čemer je η viskoznost topila.

2.2 Model togih paličastih delcev

Nesferični delci imajo poleg translacijskega Brownovega gibanja, prikazanega na sliki 2.1, še rotacijsko Brownovo gibanje. Rotacijsko gibanje je še posebej zaznavno pri paličastih delcih. Kot smo že omenili, kvadruplekse iz oligonukleotidov, ki se pove- zujejo v G-žičke, v približku obravnavamo kot gibanje togih paličastih delcev. Za

2.2. Model togih paličastih delcev

opis potrebujemo več parametrov kot pri sferičnih delcih. Paličasti delci se Bro- wnovo gibljejo na dva načina: s translacijskim Brownovim gibanjem, ki je naključno gibanje težišča in rotacijskim Brownovim gibanjem, ki je naključno spreminjanje orientacije. Gibanji lahko ločimo ob predpostavki, da imamo opravka z redkimi raztopinami. Takrat translacija in rotacija nista sklopljeni in ju lahko obravnavamo ločeno [14].

2.2.1 Translacijsko Brownovo gibanje

Najprej se lotimo opisa translacijskega Brownovega gibanja palic, ki jih obravnavamo kot cilindre. Pri tem se bomo uprli na izpeljavo v literaturi [15].

Palici določimo usmerjenost z enotskim vektorjem uˆ, ki kaže v smeri dolge osi.

Glede na smer gibanja palice nanjo deluje različna sila upora. Če se palica giblje vzdolž uˆ oz. vzdolž svoje dolge osi, nanjo deluje upor ζ∥. Če se giblje v smeri svoje kratke osi oz. pravokotno na uˆ, deluje nanjo upor ζ_⊥. Pri splošnem gibanju deluje na palico kombinacija obeh uporov ζ∥ in ζ⊥. Opravka imamo z anizotropijo hidrodinamskega upora. Opisano gibanje je prikazano na sliki 2.2.

(a) F=−ζ_kv (b)F=−ζ⊥ v (c)F=−ζ_k v_k−ζ⊥v⊥

v

F F

v

F v

Slika 2.2: Anizotropija v hidrodinamskem uporu. F je sila upora, ki se pojavi zaradi premikanja paličastega delca s hitrostjo v in orientacijou. (a) v ∥uˆ, (b) v⊥uˆ, (c) splošna smerv =v∥+v⊥.

Postavimo se v lasten koordinatni sistem palice in naj bo dolga os palice v smeri xin s temuˆ =eˆ_x. V lastnem sistemu palice potem zapišemo tenzor upora in tenzor translacijske difuzijske konstane

ζ =

⎡

⎢

⎢

⎢

⎣ ζ∥

ζ_⊥ ζ⊥

⎤

⎥

⎥

⎥

⎦

→ D^t =k_bT ζ⁻¹ =

⎡

⎢

⎢

⎢

⎣ D^t_∥

D_⊥^t D_⊥^t

⎤

⎥

⎥

⎥

⎦

. (2.8)

Iz enačbe Smoluchowskega [15], kjer upoštevamo anizotropijo 2.8, dobimo difuzijsko enačbo

∂P(R, t)

∂t = ∂

∂R

[︁D∥u⊗u+D⊥(I−u⊗u)]︁∂P(R, t)

∂R , (2.9)

pri čemer je

∂

∂R =eˆ_x ∂

∂X +eˆ_y ∂

∂Y +eˆ_z ∂

∂Z. (2.10)

Poglavje 2. Brownovo gibanje

Rezultat je Gaussova verjetnostna porazdelitev

P(R, t) = (2π)^−3/2(σ∥σ²_⊥)⁻¹exp (︄

−X²

2σ²_∥ − Y²+Z² 2σ²_⊥

)︄

, (2.11)

ki je zelo podobna porazdelitvi (2.4). Za razliko od povprečnega kvadrata odmika v (2.6), so tokrat prispevki prostorskih stopenj različni

⟨︁∆X²(t)⟩︁

= 2D_∥^tt, ⟨︁

∆Y²(t)⟩︁

=⟨︁

∆Z²(t)⟩︁

= 2D_⊥^tt. (2.12) S primerjavo povprečnega kvadrata odmika v (2.5), izračunamo povprečno transla- cijsko difuzijsko konstanto

6D^t = 2D^t_∥+ 4D^t_⊥ → D^t = D^t_∥+ 2D^t_⊥

3 =tr(D)/3 (2.13)

Vrednosti difuzijskih konstant D_∥^t, D^t_⊥, D^t so povezane z dolžino palice L in njenim presekom d oz. natančneje z razmerjem p = L/d. Povezave in izračune za simetrične cilindrične delce, kjer velja 2 ≤ p ≤ 30, sta podala Maria M. Tirado in José Garcia de la Torre [10]

4πηLD^t_⊥/k_bT = lnp+γ_⊥, (2.14) 2πηLD^t_∥/kbT = lnp+γ∥, (2.15) 3πηLD^t/k_bT = lnp+γ, (2.16) kjer so γ⊥,γ∥ in γ popravki zaradi končnih palic z vrednostmi

γ⊥ = 0.839 + 0.185/p+ 0.233/p², (2.17) γ∥ =−0.207 + 0.980p−0.133/p², (2.18) γ = 0.312 + 0.565/p+ 0.100/p². (2.19)

2.2.2 Rotacijsko Brownovo gibanje

Da si rotacijsko difuzijo lažje predstavljamo, si zamislimo gibanje enotskega vektorja u(θ, ϕ), usmerjenega v smeri vzdolž dolge osi palice, ki se giblje po enotski sferi.

Gibanje je prikazano na sliki 2.3.

2.2. Model togih paličastih delcev

y z

x

u(0) u(t)

Slika 2.3: Rotacijska difuzija na enotski sferi.

Podobno kot pri translacijski difuziji, tudi tokrat dobimo iz enačbe Smolu- chowskega [15] rotacijsko difuzijsko enačbo

∂P(u,u₀;t)

∂t =D^r (︃

u× ∂

∂u )︃2

P(u,u₀;t). (2.20) V enačbi 2.20 predstavlja P(u,u0;t) verjetnostno porazdelitev, da ima palica ori- entacijo u ob času t, če je bila njena orientacija u₀ ob času t = 0. Nastopa tudi rotacijska difuzijska konstanta D^r, katera je povezana z dolžino palice L in z raz- merjem med dolžino in presekom p=L/d kot [10]

πηL³D^r/3kbT = lnp+δ, (2.21) kjer je [10]

δ =−0.662 + 0.917/p−0.050/p². (2.22) Upoštevali smo le rotacijo palice okoli krajše osi, rotacijo okoli daljše osi smo zane- marili.

Rotacijske difuzijske enačbe (2.20) ne najdemo pogosto v literaturi. Bolj pogosto se srečamo z obliko [16]

∂P(u−u₀)

∂t =D^r 1 sin²θ

[︃

sinθ ∂

∂θ (︃

sinθ ∂

∂θP(u−u0) )︃

+ ∂²

∂ϕ²P(u−u0) ]︃

, (2.23) katere rešitev je [16]

P(u−u₀, t) =

∞

∑︂

l=0 l

∑︂

m=−l

Y_lm(u)Y_lm^⋆ (u₀) exp [−D^rl(l+ 1)t]. (2.24) V rešitvi nastopajo sferični harmoniki Y_lm(θ, ϕ). Vpeljava le teh bo jasna v nasle- dnjem poglavju. Da sta si enačbi (2.20) in (2.23) zares enakovredni, je pokazano v dodatku 7.1.

Poglavje 2. Brownovo gibanje

2.2.3 Skupno gibanje

Translacijsko in rotacijsko gibanje smo obravnavali ločeno in zapisali difuzijsko enačbo za vsako gibanje posebej. Vendar pa lahko difuzijski enačbi združimo v skupno difuzijsko enačbo [15]

∂P

∂t = ∂

∂R

[︁D_∥^tu⊗u+D^t_⊥(I−u⊗u)]︁ ∂P

∂R+D^r (︃

u× ∂

∂u )︃2

P, (2.25) kjer je P zmnožek verjetnostnih porazdelitev za rotacijo in translacijo P =PrPt.

Poglavje 3

Eksperimentalne metode za

karakterizacijo sipanja svetlobe

V prejšnjem poglavju smo opisali Brownovo gibanje za sferične delce in za izbrani model togih cilindričnih palic. Parameter, ki ga iščemo, je difuzijska konstanta za izbrani model, iz katere lahko ocenimo velikost delcev. V vzorcih pričakujemo manjšo velikost delcev, kot je valovna dolžina vidne svetlobe. Primerni tehniki za opazovanje opisanih delcev in določitev njihove difuzijske konstante sta dinamično sipanje svetlobe (angl. Dynamic Light Scattering - DLS) in diferenčna dinamična mikroskopija (angl. Differential Dynamic Microscopy - DDM)

3.1 Dinamično sipanje svetlope - DLS

Na sliki 3.1 je prikazana shema sipanja svetlobe v tipičnem sipalnem eksperimentu.

Svetloba vpada na vzorec, ki je v našem primeru razredčena raztopina oligonu- kleotidnih kvadrupleksov. Velik del vpadne svetlobe vzorec prepusti, nekaj vpadne svetlobe pa se na njem siplje. Z detektorjem, postavljenem pri kotuΘ, zaznavamo fo- tone sipane svetlobe. Z detektorjem tako merimo intenziteto sipane svetlobeI(Θ, t), ki skozi meritev fluktuira. Območje, iz katerega prihaja sipana svetloba in jo zazna detektor, imenujemo sipalni volumen V.

Slika 3.1: Shema sipanja v napravi DLS. Pogled od zgoraj na tipični sipalni ekspe- riment. Svetloba, ki jo zazna detektor, se siplje v sipalnem volumnuV.

Poglavje 3. Eksperimentalne metode za karakterizacijo sipanja svetlobe

Popolnoma homogen medij ne siplje svetlobe oz. sipanje opazimo le v smeri vpadne svetlobe. Da opazimo sipanje v vse smeri prostora, so potrebne fluktuacije v mediju. Običajno povezujemo te fluktuacije s krajevno - r in časovno -t odvisno koncentracijo c(r, t)delcev v raztopini. Koncentracijo delcev lahko zapišemo kot [2]

c(r, t) = ⟨c⟩+δc(r, t), (3.1)

kjer ⟨c⟩ predstavlja povprečno koncentracijo delcev, δc(r, t) pa fluktuacije. Sipa- joči delci imajo drugačen lomni količnik od medija, zato lahko koncentracijo delcev c(r, t) povežemo z dielektričnostjo snovi. Za sferične, homogene in izotropne delce je dielektričnost ε skalarna količina in velja

c(r, t)∝ε(r, t) =⟨ε⟩+δε(r, t), (3.2) kjer ⟨ε⟩ predstavlja povprečno dielektričnost vzorca in δε(r, t) fluktuacije. Zveza (3.2) ne velja za anizotropne, nehomogene in nesferične rotirajoče delce. Dieleke- tričnost vzorca zato zapišemo s tenzorji drugega reda [2]

ε(r, t) =⟨ε⟩I+δε(r, t), (3.3)

kjer je I enotski tenzor.

3.1.1 Teorija sipanja svetlobe

Naj na vzorec vpada ravno valovanje z električnim poljem oblike

E_i(r, t) = iE₀exp(ik_i·r−iω_it). (3.4) Valovanje se širi v smeri valovenga vektorjak_i s kotno frekvencoω_i in amplitudoE₀. Vpadno polarizacijo predstavlja enotski vektor i. Pozicija detektorja določa kot Θ med vpadno in sipano svetlobo, kot prikazuje slika 3.1. Polarizacijof sipane svetlobe izberemo z analizatorjem. Sipana svetloba se širi v smeri valovnega vektorja k_f s kotno frekvenco ωf. Spremenljivke označene zi predstavljajo (angl. initial) vpadne količine, spremenljivke označene z f pa sipane količine (angl. final). Pomembno je, da ločimo med oznako spremenljivke iin imaginarnim številom i=√

−1.

Na detektorju, oddaljenem R od središča sipalnega volumna V, zaznavamo si- pano svetlobo posameznih delcev. Predpostavimo, da je raztopina redka in da se svetloba na sipalcih siplje le enkrat - imamo enojno sipanje. Če velja R ≫ λ, pri čemer je λvalovna dolžina sipane svetlobe pri kotuΘ, je celotno zaznano električno polje seštevek vseh prispevkov sevanja delcev v sipalnem volumnu V [14]

E_s(R, t) = E0e^(ikfR) 4πR

∫︂

V

eⁱ⁽q·r−ωit)

[f ·[k_f ×(k_f ×(δε(r, t))·i)]]d³r. (3.5) Na novo smo vpeljali sipalni vektor

q=k_f −k_i. (3.6)

Kadar je dinamika delcev v raztopini počasna in je Dopplerjev premik [14]

∆ω =±q·v, (3.7)

3.1. Dinamično sipanje svetlope - DLS

zanemarljiv v primerjavi s kotno frekvenco vpadne in sipane svetlobe, privzamemo ω_f ≈ω_i in|k_f| ≈ |k_i|. S tem je velikost sipalnega vektorja q odvisna le od kota Θ

q = 4πn λ sinΘ

2, (3.8)

pri čemer je n=√︁

⟨ε⟩ lomni količnik raztopine.

V naslednjem koraku se v enačbi (3.5) znebimo vektorskega produkta¹ in upo- rabimo zvezo

δε_if(r, t) = f ·δε(r, t)·i, (3.9) kjer smo upoštevali simetričnost dielektričnega tenzorja δε_if(r, t) = δε_{f i}(r, t). Do- bimo poenostavljeno enačbo (3.5)

E_s(R, t) = −k_f²E₀ 4π

exp [i(k_fR−ω_it)]

R

∫︂

V

δε_if(r, t) exp(iq·r)dr³. (3.10) V prvem faktorju prepoznamo sevanje nihajočega dipola [17]. V drugem faktorju prepoznamo krožno valovanje. Integral po sipalnem volumnuV je Fourierova trans- formacija

δε_if(q, t) =

∫︂

V

exp(iq·r)δε_if(r, t)d³r, (3.11) ki je posledica faznih zamikov q·r svetlobe na sipalcih. Z združitvijo enačb (3.10) in (3.11) dobimo zvezo v recipročnem prostoru

E_s(R, t) = −k_f²E₀ 4π

exp [i(k_fR−ω_it)]

R δε_if(q, t). (3.12)

3.1.2 Model diskretnih sipalcev

Enačba (3.10) je sicer pravilna, vendar pa ne vsebuje informacije o posameznih si- palcih. Kot bomo spoznali, je ta informacija pomembna pri obravnavi detekcije in je ključna pri prileganju pričakovane avtokorelacijske funkcije k meritvam. Zami- slimo si N sipalcev v sipalnem volumnu, katerih težišče se nahaja pri R_j(t), kot je razvidno iz slike 3.2. Z upoštevanjem j-tega delca v enačbi (3.10)

r =R_j(t) +r_j, (3.13)

kjer je r_j koordinata delčka volumna dV_j, dobimo [18]

E_s(R, t) =− k²_fE₀ 4π

exp [i(k_fR−ω_it)]

R

·∑︂

j

(︄∫︂

Vj

δε_if(r, t) exp(iq·r_j)d³r_j )︄

exp(iq·R_j(t)), (3.14) pri tem seštevamo po vseh delcih v sipalnem volumnu. Vpeljemo novo količino, ki jo imenujemo “sipalna dolžina”

b_j(q, t) =k_f²

∫︂

Vj

ε_if(r, t) exp(iq·r_j)d³r_j, (3.15)

1Uporabimo identitetoA×(B×C) =B(A·C)−C(A·B)in dejstvo, da je polarizacija pravokotna na smer širjenja valovanjaf ·kf = 0.

Poglavje 3. Eksperimentalne metode za karakterizacijo sipanja svetlobe

v kateri je zapakirana anizotropnost in nehomogenost delcev ter ob predpostavki, da rotacija in translacija delcev nista sklopljeni, zapakirana tudi rotacija. Da lahko ločimo rotacijsko in translacijsko gibanje, smo privzeli že pri teoriji Brownovega gibanja v Poglavju 2. Zapišemo lahko končno sipano električno polje

E_s(R, t) =−E₀ 4π

exp [i(k_fR−ω_it)]

R

∑︂

j

b_j(q, t) exp(iq·R_j(t)). (3.16)

0 R_j(t)

R_j+1(t) r_j(t)

r_j+1(t) dV_j

dVj+1

Slika 3.2: Prikazani so diskretni sipalci. R_j(t)predstavlja koordinato težišča sipalca, r_j(t) pa je koordinata majhnega volumskega elementadV_j. Slika je povzeta iz [18].

3.1.3 Detekcija

Sipana svetloba z vzorca pada na majhno vhodno odprtino optičnega vlakna. Sipano svetlobo z optičnim vlaknom vodimo do fotopomnoževalke, s katero detektiramo si- pane fotone. Število detektiranih fotonov v časovnem oknu je povezano z intenziteto sipane svetlobe

Is(t) =Es(R, t)E_s^∗(R, t) =|Es(R, t)|². (3.17) Signal iz fotopomnoževalke obdela digitalni korelator, ki je povezan na računalnik, preko katerega spremljamo meritev.

Za obdelavo meritev imamo tako le vhodni podatek število sipanih fotonov ozi- roma intenziteto sipane svetlobe. Za dobro detekcijo je potrebno imeti kakovostno fotopomnoževalko in še pomembneje, zmogljiv digitalni korelator, kateri nam v re- alnem času računa intenzitetno časovno avtokorelacijsko funkcijo, s katero merimo časovno povezanost fluktuacij v intenziteti sipane svetlobe.

3.1.3.1 Avtokorelacijska funkcija

Časovne korelacijske funkcije so primerne pri obravnavi stohastičnih procesov in fluktuirajočih signalih. Časovna avtokorelacijska funkcija - korelacija stohastičnega

3.1. Dinamično sipanje svetlope - DLS

procesa s samim seboj - razkriva značilen relaksacijski čas, s katerim pridobimo in- formacijo o načinu gibanja delcev. Časovna avtokorelacijska funkcija spremenljivke A(q, t) je definirana kot [19]

⟨A(q,0)A(q, τ)⟩= lim

T→∞

1 T

∫︂ T 0

A(q, t)A(q, t+τ)dt. (3.18) Iz definicije razberemo, da z oznako ⟨⟩ zapišemo časovno povprečje. Ko je čas zakasnitve τ = 0, je funkcija (3.18) popolnoma korelirana in doseže maksimum.

Kadar pošljemo čas zakasnitve τ → ∞, je funkcija (3.18) popolnoma nekorelirana.

V našem primeru nastopa v časovni avtokorelacijski funkciji (3.18) intenziteta sipane svetlobe Is(q, t) namesto funkcije A(q, t). Časovna avtokorelacijska funkcija intenzitete sipane svetlobe se glasi

G⁽²⁾(q, τ) = ⟨I_s(q,0)I_s(q, τ)⟩= lim

T→∞

1 T

∫︂ T 0

I_s(q, t)I_s(q, t+τ)dt. (3.19) Dana zveza velja za zvezne funkcije. Pri meritvah digitalni korelator zajema podatke v časovnem oknu ∆t in je zato potrebno zvezo (3.19) diskretizirati

⟨I_s(q,0)I_s(q, τ)⟩= 1 N∆t

N

∑︂

i=0

I_s(q, t_i)I_s(q, t_i+τ)∆t. (3.20) Običajno v eksperimentu merimo normalizirano količino (3.19), ki jo zapišemo kot

g⁽²⁾(q, τ) = ⟨Is(q,0)Is(q, τ)⟩/⟨︁

I_s²(q,0)⟩︁

. (3.21)

Poznamo tudi poljsko avtokorelacijsko funkcijo sipanega polja G⁽¹⁾(q, τ) :=⟨E_s^∗(q,0)E_s(q, τ)⟩= lim

T→∞

1 T

∫︂ T 0

E_s^∗(q, t)E_s(q, t+τ)dt, (3.22) normalizirana oblika pa je

g⁽¹⁾(q, τ) =⟨E_s^∗(q,0)E_s(q, τ)⟩/⟨I_s(q,0)⟩. (3.23) Poljsko avtokorelacijsko funkcijo posredno določimo iz intenzitetne avtokorelacijske funkcije, saj sta povezani preko Siegertove relacije [20]

g⁽²⁾(q, τ) = 1 +|g⁽¹⁾(q, τ)|², (3.24) ki pa sloni na predpostavki, da je sipano polje E_s Gaussovsko porazdeljena spre- menljivka.

Če je celotno območje, skozi katerega gre laserski snop, tako veliko, da ga je mogoče razdeliti na mnogo manjših območij, lahko celotno sipano polje zapišemo kot vsoto med seboj neodvisnih sipanih polj

E_s =∑︂

n

E_s⁽ⁿ⁾, (3.25)

kjer je Es⁽ⁿ⁾ sipano polje izn-tega manjšega območja. Po centralnem limitnem teo- remu je zato sipano poljeEs porazdeljeno po Gaussovi porazdelitvi [14]. Siegertova

Poglavje 3. Eksperimentalne metode za karakterizacijo sipanja svetlobe

relacija odpove v sistemih, kjer so fluktuacije korelirane na velikih razdaljah, na pri- mer v bližini faznega prehoda ali pa pri izjemno redkih raztopinah, kjer je sipalcev zelo malo.

Pri eksperimentih namesto Siegertove relacije (3.24) pogosto nastopa relacija g⁽²⁾(q, τ) = 1 +β²|g⁽¹⁾(q, τ)|², (3.26) pri čemer je faktor 0 < β ≤ 1 in predstavlja razmerje med površino detektorja in površino interferenčnih lis, ki jih detektor lahko zazna [21]. K zmanjšanju faktorja β vplivajo tudi zaznani višji interferenčni načini oz. nekorelirane interferenčne lise [22].

3.1.3.2 Homodinska in heterodinska detekcija

V homodinskem režimu, kjer na detektor vpada le sipana svetloba, velja popravljena Siegertova relacija (3.26). Kadar k sipani svetlobi primešamo del svetlobe z laserja ali drugega svetlobnega vira, govorimo o heterodinskem režimu. Ob naši predpostavki, da je sipano polje E_s porazdeljeno po Gaussovi porazdelitvi, sta si heterodinska in homodinska metoda enakovredni in je iz obeh rezultatov mogoče pridobiti iste informacije.

V našem primeru na DLS napravi merimo v heterodinskem režimu, saj se na detektorju ni moč izogniti prisotnosti statične komponente svetlobe, ki je posledica sipanja laserske svetlobe na sestavnih delih eksperimenta, kot je na primer ste- klena cevka, v kateri se nahaja raztopina. Zato si je potrebno podrobneje pogledati prestrukturiranje poljske (3.23) in intenzitetne (3.21) avtokorelacijske funkcije ob prisotnosti statične komponente.

Na detektorju v heterodinskem režimu zaznavamo električno polje

E(t) =E_c(t) +E_s(t), (3.27)

kjer je E_c(t) statična komponenta in E_s(t) sipana svetloba iz vzorca. Komponenti sta med seboj neodvisni, zato zanju velja

⟨E_c(t)E_s^∗(t)⟩=⟨E_c(t)⟩ ⟨E_s^∗(t)⟩. (3.28) Z definicijo avtokorelacijske funkcije (3.18) zapišimo heterodinsko poljsko avtokore- lacijsko funkcijo

g_het⁽¹⁾(q, τ) = ⟨(E_c(0) +E_s(q,0)) (E_c(τ) +E_s(q, τ))^∗⟩

⟨|E_c(0) +E_s(q, τ)|²⟩ . (3.29) To še ni končen rezultat, saj lahko števec in imenovalec razpišemo. Pri tem najprej upoštevamo neodvisnost komponentE_c(t)inE_s(t). Upoštevamo tudi, da je statična komponenta Ec(t) konstanta in komponentaEs fluktuirajoče polje. Zanju velja

⟨E_cE_c^∗⟩=I_c ter ⟨E_s(0)E_s^∗(0)⟩=⟨I_s⟩. (3.30) Mešani členi tipa (3.28) so enaki nič. Vemo, da ⟨E_c⟩ ̸= 0. Edina preostala možnost je ⟨Es(t)⟩ = 0. Vrnimo se k modelu diskretnih sipalcev k sipanemu električnemu polju (3.16) in se osredotočimo le na sumacijski del. Povprečen prispevek enega sipalca zapišemo

⟨︁E_s^(j)⟩︁

∝ ⟨bj(q, t) exp(iq·Rj(t))⟩=⟨bj(q, t)⟩ ⟨exp(iq·Rj(t))⟩. (3.31)

3.1. Dinamično sipanje svetlope - DLS

Translacija delca je neodvisna od “sipalne dolžine” b_j(q, t), saj smo predpostavili ločeno obravno rotacije in translacije. Verjamemo, da je sistem oz. vzorec homogen in so v njem delci naključno razporejeni. Verjetnost, da najdemo delec v sipalnem volumnu V je tako

dP/dV =⟨δ(r−R_j(t))⟩=V⁻¹. (3.32) Kako pridemo do tega rezultata je razloženo v razdelku Dodatek II. Povprečje tran- slacijskega člena v enačbi (3.31) izračunamo s pomočjo verjetnosti (3.32)

⟨exp(iq·R_j(t))⟩=V⁻¹

∫︂

V

exp(iq·r(t))d³r =δ(q), (3.33) kjer smo integrirali po celotnem sipalnem volumnuV. V našem eksperimentu vedno merimo pri q ̸= 0, zato so mešani členi tipa (3.28) enaki nič. Še več, ker so delci v redki raztopini med seboj neodvisni, so tudi mešani členi različnih delcev j ̸= k enaki nič

⟨︁E_s^(j)E_s^(k)∗⟩︁

=⟨︁

E_s^(j)⟩︁ ⟨︁

E_s^(k)∗⟩︁

= 0. (3.34)

Z nekaj truda dobimo končno heterodinsko poljsko avtokorelacijsko funkcijo [23]

g⁽¹⁾_het(q, τ) = I_c+⟨I_s⟩g⁽¹⁾_hom(q, τ)

I_c+⟨I_s⟩ , (3.35)

kjer smo upoštevali g⁽¹⁾_hom=g⁽¹⁾ iz enačbe (3.23).

S koherenčnim faktorjem β, ki smo ga uvedli pri popravljeni Siegertovi relaciji (3.26), tudi tukaj zapišemo popravljeno heterodinsko poljsko avtokorelacijsko funk- cijo [23]

g_het⁽¹⁾(q, τ) = I_c+⟨I_s⟩βg_hom⁽¹⁾ (q, τ)

I_c+⟨I_s⟩ . (3.36)

Enako se lotimo tudi z izračunom heterodinske intenzitetne avtokorelacijske funkcije s pomočjo definicije avtokorelacijske funkcije (3.18), ki jo hkrati norma- liziramo

g_het⁽²⁾(q, τ) = ⟨E(0)E^∗(0)E(τ)E^∗(τ)⟩

⟨|E(0)E^∗(0)E(0)E^∗(0)|²⟩. (3.37) V števcu dobimo 16 členov vendar je 10 členov enakih nič. Poleg že obravnavanih členov pri poljski heterodinski avtokorelacijski funkciji g_het⁽¹⁾, dobimo še člene tipa

⟨EcE_s^∗(0)Es(τ)E_s^∗(τ)⟩=⟨Ec⟩ ⟨E_s^∗(0)Es(τ)E_s^∗(τ)⟩. (3.38) in

⟨E_cE_s^∗(0)E_cE_s^∗(τ)⟩=⟨︁

E_c²⟩︁

⟨E_s^∗(0)E_s^∗(τ)⟩. (3.39) Da so členi tipa (3.38) in (3.39) zares nič, pokažemo podobno kot prej. Za člene tipa (3.38) in iste delce dobimo že znan rezultat

⟨︁E_s^(j)∗(0)E_s^(j)(τ)E_s^(j)∗(τ)⟩︁

∝ ⟨exp(−iq·R_j(t) +iq·R_j(t+τ)−iq·R_j(t+τ))⟩

=⟨exp(−iq·Rj(t))⟩ ∝δ(q). (3.40) Drugače je za člene tipa (3.39), za katere velja

⟨︁E_s^(j)∗(0)E_s^(j)∗(τ)⟩︁

∝ ⟨exp(−iq·R_j(t)−iq·R_j(t+τ))⟩. (3.41)

Poglavje 3. Eksperimentalne metode za karakterizacijo sipanja svetlobe

Podobno kot prej poiščemo verjetnostno porazdelitev

dP/dV =⟨δ(r−R_j(t)−R_j(t+τ))⟩= (8V)⁻¹ =V˜⁻¹, (3.42) kjer je V sipalni volumen in izračunamo povprečje

⟨exp(iq·R_j(t) +iq·R_j(t+τ))⟩=V˜⁻¹∫︂

V˜

exp(iq·r)d³r =δ(q), (3.43) kjer smo integrirali po volumnu V˜. Kako pridemo do tega rezultata je razloženo v razdelku Dodatek II. Izračun ostalih petih neničelnih členov je dokaj trivialen.

Zaplete se le pri šestem členu, ki se glasi [23]

⟨E_s(0)E_s^∗(0)E_s(τ)E_s^∗(τ)⟩=⟨I_s⟩²+⟨I_s⟩²|g_hom⁽¹⁾ (q, τ)|². (3.44) Ko seštejemo vse neničelne člene, za rezultat dobimo

g_het⁽²⁾(q, τ) = 1 + 2I_c⟨I_s⟩ |g_hom⁽¹⁾ (q, τ)|+⟨I_s⟩²|g⁽¹⁾_hom(q, τ)|²

(I_c+⟨I_s⟩)² (3.45)

in z upoštevanjem faktorja β [23]

g_het⁽²⁾(q, τ) = 1 + 2I_c⟨I_s⟩β|g_hom⁽¹⁾ (q, τ)|+⟨I_s⟩²β²|g_hom⁽¹⁾ (q, τ)|²

(I_c+⟨I_s⟩)² . (3.46) V avtokorelacijski funkciji (3.46) prepoznamo dva člena:

• heterodinski člen - 2I_c⟨I_s⟩β|g_hom⁽¹⁾ (q, τ)| in

• homodinski člen - ⟨I_s⟩²β²|g⁽¹⁾_hom(q, τ)|². 3.1.3.3 Modelska funkcija

Funkcija (3.46) ni primerna za eksperimentalno rabo, saj vsebuje preveč parametrov za prileganje k meritvam. Potrebno je najti bolj robustno funkcijo, v kateri bodo parametri ustrezno zapakirani. Poleg tega nismo povedali še nič o obnašanju funkcije g⁽¹⁾_hom(q, τ), za katero zaenkrat pričakujemo

g_hom⁽¹⁾ (q, τ = 0) = 1 in g_hom⁽¹⁾ (q, τ → ∞) = 0.

Za začetek uvedemo novi spremenljivki j_s= ⟨I_s⟩

⟨I_s⟩+I_c, j_c= I_c

⟨I_s⟩+I_c, → j_s+j_c = 1, (3.47) kjer sta j_s in j_c razmerji za sipano in statično svetlobo. Parameter β zapakiramo v funkcijo g⁽¹⁾_hom(q, τ). Z novima spremenljivkama, vpeljanima v (3.47), preuredimo funkcijo (3.46) v [24]

g_het⁽²⁾(q, τ) = 1 + 2(1−js)jsg_hom⁽¹⁾ (q, τ) +j_s²|g⁽¹⁾_hom(q, τ)|², (3.48)

3.1. Dinamično sipanje svetlope - DLS

ki zgleda že precej robustneje, vendar jo lahko še poenostavimo in za prileganje k meritvam uporabimo sledečo funkcijo

h(q, τ) = g_het⁽²⁾(q, τ)−1

= (1−js+js|g_hom⁽¹⁾ (q, τ)|)²−(1−js)²

=y₀+ (1 +j_s(|g_hom⁽¹⁾ (q, τ)| −1))². (3.49) Uvedli smo popravek bazne linijey₀ = (1−j_s)², ki pa ga ponavadi obravnavamo kot samostojen parameter, neodvisen od razmerja j_s.

V veliko sistemih opazimo en relaksacijski način intenzitetne avtokorelacijske funkcije (3.46) [14]. Opazni pa so tudi primeri z več relaksacijskimi načini. Relaksa- cijski načini so – v našem primeru – posledica eksponentnih relaksacijskih načinov poljske avtokorelacijske funkcijeg⁽¹⁾_hom(q, τ), katero izrazimo kot [2]

g_hom⁽¹⁾ (q, τ) = ∑︂

i

a_iexp(−f_iτ), (3.50) pri čemer sta a_i delež in f_i karakteristična relaksacijska frekvencai-tega relaksacij- skega načina. V parametru a_i je tudi vsebovan parameter β, ki smo ga prvič srečali pri Siegertovi relaciji (3.26).

V naravi le redko najdemo čisti eksponentni relaksacijski način z enim samim karakterističnim relaksacijskim časom 1/f_i. Pogosteje opazimo porazdelitev rela- ksacijskih časov z njihovo srednjo vrednostjo⟨1/f_i⟩, kar nakazujejo tudi mnogi eks- perimenti [25]. Z upoštevanjem porazdelitve relaksacijskih časov, poljsko avtokore- lacijsko funkcijo opišemo z “razširjeno” eksponentno funkcijo oziroma Kohlrausch–

Williams–Watts (KWW) funkcijo

g⁽¹⁾_hom(q, τ) =∑︂

i

aiexp [−(τ fi)^γi], (3.51) ki vsebuje empiričen parameter γ_i, ki ima vrednost 0< γ_i ≤1. Povprečen relaksa- cijski čas izračunamo iz [26]

⟨︃1 fi

⟩︃

=

∫︂ ∞ 0

exp [−(τ f_i)^γi]dτ = 1 fiγi

Γ(1/γ_i), (3.52) kjer je Γ(1/γi) gama funkcija.

3.1.4 Model poljske avtokorelacijske funkcije

V enačbi (3.50) smo prvič zapisali, da poljska avtokorelacijska funkcija relaksira eksponentno. Kot bomo pokazali, je razlog za eksponentno relaksacijo Brownovo gibanje. Podrobnejša razlaga se nahaja v literaturi [14]. Z uporabo enačbe sipa- nega električnega polja diskretnih sipalcev (3.16), zapišemo poljsko avtokorelacijsko funkcijo (3.23) kot

g_hom⁽¹⁾ (q, τ) =

∑︁

j

⟨︁b_j(q, τ)b^∗_j(q,0)⟩︁

⟨exp [iq·(R_j(τ)−R_j(0))]⟩

∑︁

j

⟨︁b_j(q,0)b^∗_j(q,0)⟩︁ , (3.53) pri čemer smo ločili rotacijo in anizotropnost od translacije.

Poglavje 3. Eksperimentalne metode za karakterizacijo sipanja svetlobe

3.1.4.1 Prispevek translacije

Najprej si poglejmo prispevek translacijskega člena

⟨exp [iq·(R_j(τ)−R_j(0))]⟩=⟨exp [iq·∆R_j(τ)]⟩. (3.54) Porazdelitev težišč delcev je Gaussova funkcija (2.4)

⟨δ(R−∆R_j(τ))⟩=P_t(R_j, τ) = (︃2π

3 σ_R² )︃−3/2

exp (︄

−3R²_j 2σ_R²

)︄

, (3.55)

ki smo jo spoznali v Poglavju 2. Izračun prispevka translacijskega gibanja (3.54) enostavno izračunamo

⟨exp [iq·∆Rj(τ)]⟩=

∫︂

Pt(Rj, τ) exp(iq·Rj)d³Rj = exp(−q²σ²_R/6). (3.56) S pomočjo enačbe (2.5) razberemo

exp(−q²σ_R²/6) = exp(−q²D^tτ) → f^t =q²D^t. (3.57) 3.1.4.2 Prispevek anizotropnosti in rotacije

Nekoliko več dela imamo z izračunom člena ⟨b(q, τ)b^∗(q,0)⟩. Opravka imamo s pali- cami v obliki cilindra, kot smo že prepodstavili pri rotacijskem Brownovem gibanju.

Postavimo se v lastni sistem palice, kot prikazuje slika 3.3 in predpostavimo, da zaradi cilindričnosti nastopa anizotropnost v dielektričnem tenzorju. Tenzor dielek- tričnosti v lastnem sistemu paličastega delca zapišemo

ε=

⎡

⎢

⎢

⎢

⎣ ε∥

ε_⊥ ε⊥

⎤

⎥

⎥

⎥

⎦

→ δε_ij =ε_ij −ε_m, (3.58)

kjer je ε_m dielektričnost topila oz. medija. Z enačbo za sipalno dolžino (3.15) v lastnem sistemu izračunamo tenzor b delca

b =

⎡

⎢

⎢

⎢

⎣ b_∥

b⊥

b_⊥

⎤

⎥

⎥

⎥

⎦

. (3.59)

Sipanje se dogaja v ravnini xy laboratorijskega sistema. Končni valovni vektor naj bo k_f = keˆ_x. Omejili se bomo na primer, kjer sta začetna polarizacija v z smeri in končna polarizacija v z ali y smeri. Izračunali bomo le za nas pomembna prispevka b_zy inb_zz. Enotska vektorja laboratorijskega sistemaeˆ_z ineˆ_y projiciramo na lasten sistem delca x^′, y^′, z^′. Projekciji sta

eˆ_z = (cosθ,sinθ,0), eˆ_y = (sinθsinϕ,−cosθsinϕ,−cosϕ). (3.60)

3.1. Dinamično sipanje svetlope - DLS

x⁰ y⁰ z⁰

y z

x

θ

φ

Slika 3.3: Cilindrični delec v laboratorijskem x, y, z in lastnem x^′, y^′, z^′ sistemu.

Slika je povzeta iz [14].

S projekcijama izračunamo

b_zz =eˆ_z·b·eˆ^T_z =b_∥cos²θ+b⊥sin²θ (3.61) b_zy =eˆ_z ·b·eˆ^T_y = (b∥−b⊥) sinθcosθsinϕ, (3.62) ki ju lahko izrazimo s sferičnimi harmoniki Y_2,m(θ(t), ϕ(t))

b_zz(t) =A+B (︃16π

45 )︃1/2

Y₂₀(θ(t), ϕ(t)), (3.63) bzy(t) = iB

(︃2π 15

)︃1/2

[Y21(θ(t), ϕ(t)) +Y2−1(θ(t), ϕ(t))]. (3.64) Upoštevali smo časovno odvisnost komponent in uvedli parametra A= ¹₃(b_∥+ 2b_⊥) inB =b∥−b⊥.

V izračunu ⟨b_zz(τ)b^∗_zz(0)⟩in ⟨︁

b_zy(τ)b^∗_zy(0)⟩︁

nastopajo členi

F_mm^l ′(τ) = ⟨Y_lm(τ)Y_lm^∗′(0)⟩, (3.65) katere izračunamo s pomočjo enačbe (2.24) za verjetnostno porazdelitevP^r(u−u0, t) Brownovega rotacijskega gibanja

⟨Y_lm(τ)Y_lm^∗′(0)⟩=

∫︂

d²u

∫︂

Y_lm(u)P^r(u−u₀, τ) 1

4πY_lm^∗′(0)d²u₀

= 1

4π exp(−l(l+ 1)D^rτ)δ_mm^′. (3.66) V ravnovesju pričakujemo, da so delci enakomerno porazdeljeni po smeri, kar pred- stavlja člen 1/4π.