BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE
Anja CEROVŠEK
VPLIV ELEKTROKEMOTERAPIJE S CISPLATINOM ALI BLEOMICINOM IN
SUNITINIBOM NA CELICE HUMANEGA RAKA TREBUŠNE SLINAVKE
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2022
ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE
Anja CEROVŠEK
VPLIV ELEKTROKEMOTERAPIJE S CISPLATINOM ALI BLEOMICINOM IN SUNITINIBOM NA CELICE HUMANEGA
RAKA TREBUŠNE SLINAVKE
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
EFFECT OF ELECTROCHEMOTHERAPY WITH CISPLATIN OR BLEOMYCIN AND SUNITINIB ON HUMAN PANCREATIC
CANCER CELLS
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2022
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Molekulska in funkcionalna biologija. Delo sem opravljala na Oddelku za eksperimentalno onkologijo na Onkološkem inštitutu Ljubljana.
Študijska komisija je za mentorja magistrskegadela imenovala prof. dr. Majo Čemažar, univ. dipl. biol., za somentorico znan. sod. dr. Mašo Bošnjak, mag. far. in za recenzenta prof. dr. Gregorja Seršo, univ. dipl. biol.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: doc. dr. Nada ŽNIDARŠIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Gregor SERŠA
Onkološki inštitut Ljubljana, Oddelek za eksperimentalno onkologijo
Članica: prof. dr. Maja ČEMAŽAR
Onkološki inštitut Ljubljana, Oddelek za eksperimentalno onkologijo Članica: znan.sod. dr. Maša BOŠNJAK
Onkološki inštitut Ljubljana, Oddelek za eksperimentalno onkologijo
Datum zagovora:
Anja Cerovšek
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 616(043.2)
KG elektrokemoterapija, citostatiki, sunitinib, citotoksičnost AV CEROVŠEK, Anja
SA ČEMAŽAR, Maja (mentor), BOŠNJAK, Maša (somentorica), SERŠA, Gregor (recenzent)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Magistrski študijski program druge stopnje Molekulska in funkcionalna biologija
LI 2022
IN VPLIV ELEKTROKEMOTERAPIJE S CISPLATINOM ALI BLEOMICINOM IN SUNITINIBOM NA CELICE HUMANEGA RAKA TREBUŠNE SLINAVKE TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja)
OP IV, 62 str., 3 pregl.,14 sl.,1 pril., 64 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Elektrokemoterapija je način zdravljenja, ki uporablja elektroporacijo v kombinaciji s citostatikom, bodisi bleomicinom ali cisplatinom, za dosego lokalne kontrole tumorja.
Bleomicin v celico vstopa s prenašalnimi proteini po endocitotski poti, cisplatin pa s pomočjo bakrovih kanalčkov in pasivno difuzijo. Ker je nabor prenašalnih proteinov precej majhen, je posledično tudi privzem citostatika v celico omejen. Elektrokemoterapija temelji na električnih pulzih, ki destabilizirajo celično membrano v tumorjih in tako se bistveno poveča vnos hidrofilnih citostatikov, ki imajo oviran transport skozi celično membrano. Bleomicin je protitumorsko zdravilo, ki prek tvorbe dvojnih prelomov ustavi celično delitev in povzroča smrt celic. Cisplatin pa uničujejo rakave celice tako, da poškodujejo DNA tako da z DNA tvori adukte, zavira sintezo in podvojevanje DNA in povzroči apoptotično smrt celic. Glavni cilj magistrske naloge je bil določiti občutljivost celic raka trebušne slinavke na elektrokemoterapijo s cisplatinom ali bleomicinom. Zanimalo nas je tudi, ali se citotoksični učinek poveča, če tretiramo celice raka trebušne slinavke s kombinacijo elektrokemoterapije s citostatikom in sunitinibom, saj tega do sedaj še nismo zasledili v literaturi. Sunitinib malat je molekula oksindola, zasnovana za selektivno interakcijo z znotrajceličnimi mesti ATP receptorjev kinaz kot so VEGFR1–3, PDGFR, KIT, FLT3 in CSF1R. Citotoksično delovanje kombinirane terapije smo preverili na humani celični liniji BxPC-3 raka trebušne slinavke. S testom PrestoBlueTM smo določili podvojitveni čas celične linije BxPC-3, ki je 48 ur (2 dni). Najbolj optimalno so rastle celice, ko smo jih nasadili 2000 / vdolbinico. Dokazali smo, da so celice BxPC-3 bolj občutljive na elektrokemoterapijo z bleomicinom kot na elektrokemoterapijo s cisplatinom.
Kombinacija elektrokemoterapije z inhibitorjem tirozin kinaz sunitinibom na rakavih celicah trebušne slinavke, je imela večji citotoksični učinek le v primeru uporabe bleomicna.
Kombinirana terapija elektrokemoterapije z 0,14 µM bleomicinom in sunitinibom v treh različnih koncentracijah (2,5, 5 in 7,5 µM) je imela sinergistični učinek. Glede na pozitivne in vitro rezultete, bi bilo smiselno tovrstno zdravljenje testirati tudi na tumorskem modelu trebušne slinavke in vivo.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 616(043.2)
CX electrochemotherapy, cytostatics, sunitinib, cytotoxicity AU CEROVŠEK, Anja
AA ČEMAŽAR, Maja (supervisor), BOŠNJAK, Maša (co-supervisor), SERŠA, Gregor reviewer)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Molecular and Functional Biology
PY 2022
TI EFFECT OF ELECTROCHEMOTHERAPY WITH CISPLATIN OR BLEOMYCIN AND SUNITINIB ON HUMAN PANCREATIC CANCER CELLS
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes – Molecular and Functional Biology) NO XII, 62 p.,3 tab., 14 fig., 1 ann., 64 ref.
LA sl AL sl/en
AB Electrochemotherapy is a treatment option, using electroporation in combination with cytotoxic drugs, either bleomycin or cisplatin, to achieve local tumor control. Bleomycin enters the cell through endocytic transfer proteins and cisplatin through copper channels and passive diffusion. Because the set of transport proteins is quite small, consequently the uptake of the cytostatic into the cell is also limited.The set of transporter proteins is quite small, therefore the uptake of cytostatics into the cell is limited. Electrochemotherapy is based on electrical pulses that destabilize the cell membrane in tumors and thus significantly increase the cellular uptake of hydrophilic cytostatics that have obstructed transport across the cell membrane. Bleomycin is an antitumor drug that stops cell division through the formation of DNA double strand breaks leading to cell death. Cisplatin, on the other hand, destroy cancer cells by damaging DNA with formation of DNA adducts, consequently inhibiting DNA synthesis and replication, and causing apoptotic cell death. The aim of the master's thesis was to determine the sensitivity of pancreatic cancer cells to electrochemotherapy with cisplatin or bleomycin. We also investigated whether the cytotoxic effect is enhanced when pancreatic cancer cells are treated with combined electrochemotherapy and sunitinib, as this has not been described in the literature to date.
Sunitinib malate is an oxindole molecule known to selectively interact with intracellular sites of ATP receptor kinases such as VEGFR1–3, PDGFR, KIT, FLT3, and CSF1R. The cytotoxic effect of combined therapy was examined on the human BxPC-3 pancreatic cancer cell line. The PrestoBlueTM assay was used to determine the doubling time of the BxPC-3 cell line, which was equal to 48 hours (2 days). Most optimal cell growth was observed when we plated 2000 cells per well. We demonstrated that BxPC-3 cells were more sensitive to electrochemotherapy with bleomycin than with cisplatin. Combination of electrochemotherapy with the tyrosine kinase inhibitor sunitinib on pancreatic cancer cells had more pronounced cytotoxic effect than electrochemotherapy alone, only when bleomycin was used. Combination therapy of electrochemotherapy with 0.14 µM bleomycin and sunitinib in three different concentrations (2.5, 5 in 7.5 µM) had a synergistic effect. Given the positive in vitro results, it would make sense to test this type of treatment on a tumor model of the pancreas in vivo.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ...III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV
KAZALO VSEBINE ... 20
KAZALO PREGLEDNIC ... VII KAZALO SLIK ... VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ...X 1 UVOD... 1
1. 1 OPREDELITEV PROBLEMA... 2
1. 2 NAMEN MAGISTRSKEGA DELA ... 3
1. 3 DELOVNE HIPOTEZE ... 3
2 PREGLED OBJAV ... 5
2.1 RAK TREBUŠNE SLINAVKE ... 5
2.1.1 Epidemiologija in dejavniki tveganja ... 6
2.1.2 Histopatologija in molekularna patologija ... 8
2.1.3 Diagnostika in stadij ... 9
2.1.4 Osnove zdravljenja ... 10
2.2 ELEKTROPORACIJA V MEDICINI ... 14
2.2.1 Elektrokemoterapija ... 15
3 MATERIAL IN METODE... 20
3.1 MATERIAL ... 20
3.1.1 Laboratorijski material in oprema ... 20
3.1.2 Kemikalije ... 21
3.1.3 Gojišča in dodatki... 21
3.1.4 Citostatiki ... 22
3.1.5 Tirozin kinazni inhibitor ... 22
3.1.6 Celična linija... 23
3.2 METODE... 24
3.2.1 Gojenje celičnih kultur ... 24
3.2.2 Menjava gojišč ... 24
3.2.3 Presajanje (pasaže) celic ... 24
3.2.4 Štetje celic v CytoSmart komori... 25
3.2.5 Rast celic, rastne krivulje in določanje sposobnosti tvorjenja kolonij celične linije BxPC-3 ... 25
3.2.6 Elektrokemoterapija z bleomicinom in cisplatinom... 27
3.2.7 Tretiranje celic s sunitinibom... 28
3.2.8 Test citotoksičnosti po elektrokemoterapiji, tretiranju s sunitinibom ali kombinaciji elektrokemoterapije in sunitiniba ... 29
3.2.9 Kombinacija elektrokemoterapije s cisplatinom in zaviralcem tirozin kinaz sunitinibom ... 29
3.2.10 Kombinacija elektrokemoterapije z bleomicinom in inhibitorjem tirozin kinaz sunitinibom ... 30
3.2.11 Statistična obdelava podatkov... 32
4 REZULTATI ... 33
4.1KARAKTERISTIKE CELIC: RAST IN SPOSOBNOST TVORJENJA KOLONIJ. 33 4.1.1 Rast celic in rastne krivulje ... 33
4.1.2 Klonogenost... 34
4.2 CITOTOKSIČNOST SUNITINIBA PO 3 IN 7 DNEVNI INKUBACIJI ... 36
4.3 CITOTOKSIČNOST ELEKTROKEMOTERAPIJE 3 IN 7 DNI PO ECT ... 37
4.3.1 Elektrokemoterapija s cisplatinom ... 37
4.3.2 Elektrokemoterapija z bleomicinom ... 38
4.4 KOMBINACIJA ELEKTROKEMOTERAPIJE Z INHIBITORJEM TIROZIN KINAZ, SUNITINIBOM ... 41
4.4.1 Kombinacija elektrokemoterapije s cisplatinom in inhibitorjem tirozin kinaz, sunitinibom po 7 dneh ... 41
4.4.2 Kombinacija elektrokemoterapije z bleomicinom in inhibitorjem tirozin kinaz, sunitinibom po 3 dneh ... 42
5 RAZPRAVA ... 45
5.1 ELEKTROKEMOTERAPIJA Z BLEOMICINOM /CISPLATINOM ... 46
5.2 CITOTOKSIČNOST SUNITINIBA... 49
5.3 KOMBINIRANA ELEKTROKEMOTERAPIJA S SUNITINIBOM ... 50
5.4 MORFOLOGIJA CELIC, TRETIRANIH S KOMBINIRANO ELEKTROKEMOTERAPIJO Z BLEOMICINOM IN SUNITINIBOM... 53
5.5 APLIKATIVNOST ŠTUDIJE ... 53
6 SKLEPI... 55
7 VIRI... 56
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Seznam uporabljenega laboratorijskega materiala in opreme ... 20 Preglednica 2: Seznam uporabljenih kemikalij in njihovih proizvajalcev. ... 21 Preglednica 3: Število preštetih kolonij 7-10 dni po nasaditvi celic ... 35
KAZALO SLIK
Slika 1: Prikazni model napredovanja PanIN. ... 9
Slika 2: Prikaz delovanja sunitiniba na tarčne receptorje ... 13
Slika 3: Morfologija komercialne celične linije raka trebušne slinavke BxPC-3 ... 23
Slika 4: Rastna krivulja celične linije BxPC-3... 33
Slika 5: Fotografija kolonij celic celične linije BxPC-3. ... 35
Slika 6: Citotoksičnost različnih koncentracij sunitiniba. ... 36
Slika 7: Citotoksičnost štirih različnih koncentracij cisplatina ... 37
Slika 8: Primerjava citotoksičnosti sedmih različnih koncentracij bleomicina na celice BxPC-3 brez in z elektroporacijo glede na kontrolno skupino in kontrolno skupino elektroporacije po 3 dneh inkubacije (8A) in 7 dneh inkubacije (8B) ... 38
Slika 9: BxPC-3 celice tretirane z bleomicinom (Bleomicin) in celice tretirane z elektrokemoterapijo (ECT Bleomicin), inkubirane 3 dni. ... 39
Slika 10: BxPC-3 celice tretirane z bleomicinom (Bleomicin) in celice tretirane z elektrokemoterapijo (ECT Bleomicin), inkubirane 7 dni. ... 40
Slika 11: Citotoksičnost štirih različnih koncentracij cisplatina na celice ... 41
Slika 12: Citotoksičnost sedmih različnih koncentracij bleomicina na celice ... 42
Slika 13: Prikaz izračuna kombinacijskega indeksa (CI)... 44
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
Okrajšava ATM
Pomen
gen, ki kodira ataxia-telangiectasia-mutant (ATM) protein.
BLM bleomicin
CA 19-9 karbohidratni antigen
CEA karcinoembrionalni antigen
CDK od ciklina odvisna kinaza
CDKN2A tumorsupresorski gen, ki kodira inhibitor od
ciklina odvisne kinaze 4
CDDP cisplatin
CT računališka tomografija
dH2O destilirana voda
DMSO dimetilsulfoksid
DNA deoksiribonukleinska kislina
ECT elektrokemoterapija
EDTA etilendiaminotetraetanojska kislina
EGFR receptor za epidermalni rastni faktor
EP elektroporacija
ESOPE Evropski standardni opeartivni postopki za
elektrokemoterapijo FBS
GIST KRAS2
PDGFR MR
serum govejega zarodka
gastrointestinalni stromalni tumor Kirstenov homolog virusnega onkogena podganjega-sarkoma
receptorji rastnega faktorja pridobljenega iz trombocitov
magnetna resonanca
PBS fiziološka raztopina v fosfatnem pufru
PE uspešnost nasaditve
PRSS1 receptorska tirozinska kinaza
RTK peptidaza, ki je vrsta encima, ki druge proteine razreže (razcepi) na manjše koščke.
SF SPINK1 STK11
faktor preživetja
gen, ki kodira protein zaviralec serinske proteaze
gen STK11 spada v skupino tumorskih
supresorskih (zaviralnih) genov. Produkt gena je serin treonin proteinska kinaza 11
(STK11), ki ima ključno vlogo pri zaviranju signalne poti mTOR.
TP53
UV
tumorsupresorski gen, ki kodira protein tp53, ki nadzoruje celične procese, vključno z zaustavitvijo celične rasti, pri apoptozi, diferenciaciji in popravljanju DNA.
ultravijolična svetloba
VEGF vaskularni endotelijski rastni faktor
SLOVARČEK
Alopecija- je izguba las, ki je najpogostejši neželeni učinek, ki nastane zaradi delovanja zdravil za zdravljenje raka na hitro deleče se celice lasnega folikla.
Displastični epitelij- epitelij, ki kaže moteno, spremenjeno celično razporeditev, motnje in nepravilnosti dozorevanja celic, različno velikost in obliko posameznih celic in jeder ter povečano število mitoz.
Hamartom- prirojena tumorju podobna malformacija, ki nastane zaradi čezmernega razvoja ortotopnega tkiva.
Hematemeza- bruhanje krvi iz želodca ali požiralnika.
Jedrski pleomorfizem- spremenjena velikost in oblika jedra.
Karcinogeneza- kancerogeneza, nastanek raka.
Karcinom- epitelijska maligna novotvorba.
Maligna hipertermija- smrtno nevarno zvišanje telesne temperature, ki jo povzročijo sproščanje ionov Ca2+iz sarkoplazemskega retikuluma, kar sproži termogenezo v mišicah.
Mucin- sluzast izloček žlez.
Onkogen- geni, ki lahko spodbudijo nastanek rakave celice in so pogosto mutirani protoonkogeni.
Tumor supresorski gen- antionkogen, gen, ki s svojim beljakovinskim produktom zavira razmnoževanje celic in zavira spremembo normalne celice v rakavo.
Kaheksija- je sindrom, pri katerem presnovne spremembe, po vsej verjetnosti povzročene zaradi kroničnega delovanja vnetnih dejavnikov, vodijo do shiranosti oz. izgube telesne mase, ki se je ne more nadomestiti samo s prehrano.
1 UVOD
Rak je splošno ime za obsežno skupino različnih bolezni, katerih glavna značilnost je nenadzorovana rast spremenjenih rakavih celic. Rak trebušne slinavke je eden izmed rakov z najslabšo prognozo, saj je petletno preživetje zgolj okoli 5%. Natančni vzroki za nastanek raka trebušne slinavke ostajajo nepojasnjeni, znani pa so nekateri dejavniki tveganja, kot so starost, kajenje, pozitivna družinska anamneza in genetika, sladkorna bolezen, debelost, prehrana bogata z mesom in živalskimi maščobami, uživanje alkohola in telesna neaktivnost.
Trebušna slinavka je organ z dvojno funkcijo, endokrino in eksokrino. Dve glavni vrsti raka trebušne slinavke sta adenokarcinomi in endokrini tumorji trebušne slinavke.
Adenokarcinomi so najpogostejši (95%) in vzniknejo iz celic eksokrinega dela trebušne slinavke, ki pokrivajo pankreatične duktuse. V 5% pa rak trebušne slinavke vznikne iz celic endokrinega dela, ki izločajo različne hormone (insulinom, glukagonom in drugi) (Arko in Strojan, 2018).
V zadnjih letih je prišlo do pomembnega napredka pri poznavanju molekularne biologije raka trebušne slinavke, pa tudi pri diagnostiki in zdravljenju bolnikov s tumorji v zgodnji fazi. Še vedno pa ostaja minimalen napredek pri preprečevanju razvoja raka in zdravljenju bolnikov z napredovalo boleznijo. Raziskave so pokazale, da je rak trebušne slinavke posledica zaporednega kopičenja genskih mutacij. Rak sprva vznikne iz duktalnega epitelija in se razvija od predmalignih lezij do invazivne oblike. Sam potek karcinogeneze poteka od minimalno displastičnega epitelija, do hujše displazije in nazadnje do invazivnega karcinoma. Ta potek je vzporeden s kopičenjem mutacij, ki vključujejo aktivacijo onkogena KRAS2, inaktivacija tumor supresorskega gena CDKN2A (ki kodira inhibitor od ciklina odvisne kinaze 4 [INK4A]) in nenazadnje inaktivacija tumor supresorskega gena TP53.
Skoraj vsi bolniki s popolno diagnostiko raka trebušne slinavke imajo eno ali več od štirih genetskih napak (Hidalgo, 2010). Sunitinib ali sunitinib malat je peroralni inhibitor tirozin kinaze s protitumorskim in antiangiogenim delovanjem. Registriran je za uporabo pri metastatskih tumorjih in tumorjih pankreasa, ki se jih ne da kirurško odstraniti. Dokazano je, da imajo receptorji tirozin kinaze, vključno z receptorji rastnega faktorja pridobljenega iz trombocitov (PDGFR), receptorji rastnega faktorja fibroblastov in vaskularnimi endotelijskimi rastnimi faktorji (VEGFR) in njihovimi ligandi pomembno vlogo pri rasti
tumorjev in angiogenezi (Kerbel in Folkman, 2002). Dokazano je bilo, da je sunitinib močan zaviralec VEGFR-1, VEGFR-2, fetalnega jetrnega tirozin kinaznega receptorja 3 (FLT3), receptorja faktorja izvornih celic (KIT), PDGFRα in PDGFRβ v biokemijskih in celičnih testih (Abrams in sod., 2003; Mendel in sod., 2003).
Za učinkovito zdravljenja čvrstih tumorjev in boljše citotoksično delovanja protitumorskih učinkovin je potrebno, da ti vstopajo v tumorske celice in dosežejo svoje znotrajcelične tarče.
Pri potovanju po krvi morajo naprej prečkati celične bariere in priti na mesto tarčnih tumorskih celic. Znano je, da se določeni citostatiki, kot sta cisplatin in bleomicin, težje transportirata preko celične membrane, zato je njihovo delovanje s samo kemoterapijo omejeno. Z namenom, da preidemo omejitve prepustnosti celičnih membran in povečamo vnos citostatikov lahko uporabimo različne kemične in fizikalne načine vnosa. Eden izmed fizikalnih načinov vnosa molekul v celice in tkiva je elektroporacija. Elektroporacija je metoda, pri kateri celice izpostavimo zunanjemu električnemu polju, posledica tega je nastanek por v celični membrani, ki omogočijo vnos želenih molekul v celice. Po končanemu dovajanju električnih pulzov pa se pore zaprejo in celična membrana preide nazaj v normalno fiziološko stanje. V primeru, ko z elektroporacijo v celice ali tkivo vnašamo citostatike, govorimo o elektrokemoterapiji. Z elektroporacijo lahko povečamo citotoksičnost cisplatina za 80-krat in bleomicina za 800-krat (Serša in sod., 2007).
1. 1 OPREDELITEV PROBLEMA
Elektrokemoterapija deluje tarčno, saj pride do povečanega vnosa citostatikov le na območju tumorja. Z lokalno dovedenimi električnimi pulzi prav tako podaljšamo čas zadrževaje in delovanja citostatikov, saj v tumorskem žilju začasno ustavimo pretok krvi bolj, kot v normalnih tkivih. Na tumor elektrokemoterapija deluje žilnorazdiralno, saj z električnimi pulzi elektroporiramo vse celice v tumorju in z vnesenim citostatikom poškodujemo endotelij žil v tumorju. S sproščanjem antigenov iz tumorskih celic pa se sproži še imunski odgovor, ki dodatno prispeva k protitumorski učinkovitosti elektrokemoterapije. Ena izmed prednosti elektrokemoterapije je tudi uporaba nizkih odmerkov citostatikov, ki imajo le malo neželenih učinkov (Serša in sod., 2007). Po številnih predkliničnih raziskavah je bila elektrokemoterapija preizkušena tudi v mnogih kliničnih raziskavah in se izkazala kot učinkovita metoda zdravljenja tudi za globoko ležeče tumorje, zlasti za zdravljenje jetrnih
tumorjev. To si želimo uresničiti tudi pri zdravljenju raka trebušne slinavke, pri katerem se bolniki pogosto zdravlijo s sunitinibom. Po mednarodnih smernicah zdravljenja pa sicer še vedno ostaja standardno zdravljenje napredovalega raka trebušne slinavke zdravljenje z gemcitabinom v monoterapiji ali kombinacija gemcitabina z erlotinibom ali kapecitabinom ali oksaliplatinom (Ocvirk in Reberšek, 2006). Ker v literaturi do sedaj še nismo zasledili medsebojne učinke delovanj kombiniranih terapij sunitiniba in elektrokemoterapije s cisplatinom ali bleomicinom, smo si zadali, da to preskusimo v magistrski nalogi. Zanimalo nas je kakšen je medsebojni učinek kombinacije elektorkemoterapije in sunitiniba. S tem bi lahko bolnikom z rakom pankreasa, ki ga ni mogoče odstraniti s kirurgijo, nudili nove možnosti zdravljenja.
1. 2 NAMEN MAGISTRSKEGA DELA
V magistrski nalogi smo želeli preveriti učinkovitost elektrokemoterapije na humanih celicah raka trebušne slinavke BxPC-3. Omenjene celice smo tretirali z dvema citostatikoma, bleomicinom in cisplatinom, ki smo ju vnesli z elektroporacijo. Poleg tega pa smo celice tretirali tudi z različnimi koncentracijami sunitiniba.
V nalogi smo želeli preveriti, kakšna je občutljivost celic raka trebušne slinavke na elektrokemoterapijo s cisplatinom ali bleomicinom na celični liniji Bx-PC3. Preverili smo, ali ima kombinacija elektrokemoterapije in sunitiniba večji citotoksični učinek na celice raka trebušne slinavke, kot monoterapija. S testom citotoksičnosti smo določili delež preživelih celic po elektrokemoterapiji, oziroma po elektrokemoterapiji v kombinaciji s sunitinibom.
Prav tako smo poskusili določiti interakcijo med terapijama in ugotoviti ali gre za aditivni ali sinergistični učinek dveh terapij.
1. 3 DELOVNE HIPOTEZE
Glede na zastavljene cilje smo postavili in preverjali naslednje hipoteze:
- Kombinacija elektrokemoterapije z inhibitorjem tirozin kinaz sunitinibom na rakavih celicah trebušne slinavke ima večji citotoksični učinek kot samo elektrokemoterapija z bleomicinom.
- Kombinacija elektrokemoterapije z inhibitorjem tirozin kinaz sunitinibom na rakavih celicah trebušne slinavke ima večji citotoksični učinek kot samo elektrokemoterapija s cisplatinom.
2 PREGLED OBJAV
2.1 RAK TREBUŠNE SLINAVKE
Rak trebušne slinavke spada med tumorje zgornjih prebavil, ki sestavljajo najbolj obsežno skupino malignih bolezni in hkrati tudi najpogostejšo obliko raka pri obeh spolih. V to skupino spadajo maligni tumorji požiralnika, želodca, trebušne slinavke, jeter, žolčnika in žolčnih izvodil. Načeloma so tumorji prebavil, ki so odkriti v začetnem stadiju bolezni, povsem ozdravljivi. Zdravijo se s kirurgijo, izjema pa so limfomi prebavil, ki jih praviloma zdravimo s kemoterapijo. Bolniki pri katerih je bolezen že napredovala potrebujejo kombinirano zdravljenje s kirurgijo, radioterapijo in kemoterapijo (Novaković in sod., 2009).
Trebušna slinavka je organ z dvojno funkcijo, endokrino in eksokrino (Novaković in sod., 2009). V njej lahko vznikne več vrst neoplazem. Dve glavni vrsti raka trebušne slinavke sta adenokarcinomi in endokrini tumorji trebušne slinavke. Adenokarcinomi se pojavljajo v 95% in vzniknejo iz celic eksokrinega dela trebušne slinavke, ki pokrivajo pankreatične duktuse (karcinomi). V 5% pa rak trebušne slinavke vznikne iz celic endokrinega dela, ki izločajo različne hormone (insulinom, glukagonom in drugi) (Arko in Strojan., 2018).
Ker adenokarcinom predstavlja najpogostejšo obliko raka, razumemo pod pojmom rak trebušne slinavke prav to obliko. Adenokarcinom trebušne slinavke spada med enega od rakov z najslabšo prognozo. Samo petina bolnikov je ob postavitvi diagnoze primerna za kirurško zdravljenje, pri tretjini je bolezen področno napredovala, pri polovic i pa že razširjena (Raki prebavil, 2020). Nizko stopnja preživetja prepisujemo več dejavnikom, od teh je morda najpomembnejša stopnja v kateri je večina bolnikov diagnosticirana. Večina bolnikov je namreč do razvoja v napredovalo fazo asimptomatskih (Terumi in sod., 2016).
Običajno se sprva pojavijo neznačilni, tihi simptomi. Pogosto so to zlatenica, ki se pojavi zaradi vraščanja raka glave trebušne slinavke v skupni pankreatični vod. Pri raku trupa trebušne slinavke se pogosto kot prvi simptom pojavijo hude bolečine v hrbtu. Ob razraščanju tumorja v okolico se lahko pojavijo izguba apetita s hujšanjem in slabostjo (Raki prebavil, 2020). Lahko se pojavi hripavost, kašelj ter povečane vratne in subklavikularne bezgavke. Pri napredovali bolezni se pojavijo hematemeza, kaheksija in kroničen kašelj
(Novaković in sod., 2009). Ozdravitev je možna le v primeru kirurške resekcije, ki pa je zaradi pozne postavitve diagnoze možna le pri 15–20 % bolnikov (Finderle, 2017).
Pojavnost raka trebušne slinavke ni zelo visoka, predstavlja približno 2 % vseh rakov.
Značilno je, da se pojavi po 65. letu starosti z enako pogostostjo pojavljanja pri obeh spolih.
Ugotovljenih je bilo več dejavnikov tveganja za razvoj raka trebušne slinavke, kot so pozitivna družinska anamneza raka trebušne slinavke. Ostali dejavniki tveganja so še kajenje, debelost, kronični pankreatitis, prehrana, uživanje alkohola, okužba z Helicobacter pylori, sladkorna bolezen, mucinozne pankreatične ciste ter nekatere kemične substance (Finderle, 2017). Rak trebušne slinavke najpogosteje zaseva v jetra, trebušno mreno (peritonej) in trebušne bezgavke (Raki prebavil, 2020).
2.1.1 Epidemiologija in dejavniki tveganja
Čeprav rak trebušne slinavke predstavlja le 2% vseh rakavih bolezni, je četrti najpogostejši vzrok smrti med raki. Po vsem svetu rak trebušne slinavke vsako leto povzroči več kot 200 000 smrtnih primerov. Skupna smrtnost zaradi raka trebušne slinavke trenutno narašča in naj bi bila do leta 2030 v ZDA drugi največji vzrok smrti zaradi raka. Tudi v evropskih populacijah so poročali o povečanju umrljivosti zaradi raka trebušne slinavke, kar poudarja naravo bolezni po vsem svetu. Tako pri moških kot pri ženskah zaseda četrto mesto po umrljivosti med vsemi raki v Evropi (Finderle, 2017). Incidenca je najnižja med populacijami v Indiji, Afriki in jugovzhodni Aziji, vendar lahko slabši dostop do podatkov vpliva na realno oceno (Kamisawa in sod., 2016).
Po podatkih Registra raka za Slovenijo, je v zadnjem petletnem obdobju (2012‒2016) v Sloveniji za rakom trebušne slinavke zbolelo povprečno 379 ljudi na leto, 195 moških in 184 žensk, umrlo pa je 368 ljudi, 187 moških in 181 žensk (Zadnik in sod., 2020).
Rak trebušne slinavke se najpogosteje pojavi pri starejših bolnikih, pri čemer se večina primerov pojavi med 60. in 80. letom starosti. Srednja starost pri moških je 71 let in pri ženskah 75 let. Pri večini bolnikov gre za lokalno napredovalo oz. metastatsko obliko, kjer resekcija ni mogoča (Finderle, 2017).
Rak trebušne slinavke je tudi genetska bolezen, kar podpirajo ponovljivi vzorci genetskih mutacij, ki se kopičijo med karcinogenezo trebušne slinavke. Te skupne nepravilnosti so odgovorne za procese rasti, invazije in metastaz pri posameznih bolnikih. Znane so štiri glavne skupine mutiranih genov pri karcinogenezi trebušne slinavke, to so onkogeni, tumorski supresorki geni, geni za vzdrževanje genoma in geni za vzdrževanje tkiva.
Približno 10 % primerov vzroka raka trebušne slinavke je družinska osnovna anamneza (Kamisawa in sod., 2016). Te mutacije so zarodne in se prenašajo znotraj družine, ostale pa so somatske mutacije, pridobljene tekom življenja, ki se ne prenašajo na potomce (Devita in sod., 2015).
Večina rakov trebušne slinavke je posledica sporadičnih mutacij. Te se pojavljajo v več kot 80 % primerov. Pri približno 10% bolnikov pa gre za mutacije v genih zarodnih celic (Finderle, 2017). Finderle (2017) navaja veliko povezanost med tveganjem za razvoj raka trebušne slinavke in geni BRCA2, p16, ATM, STK11, PRSS1/PRSS2, SPINK1, PALB2.
BRCA2 je najpogosteje mutiran pri dednih družinskih rakih trebušne slinavke. Mutacija se pojavi pri vsaj dveh sorodnikih prvega kolena (Finderle, 2017), medtem pa vloga BRCA1 mutacij pri družinskem raku trebušne slinavke ostaja nepojasnjena (Kamisawa, 2016).
Kamisawa s sodelavci (2016) navaja tudi mutacijo KRAS, ki je skupaj s spremembami CDKN2A (znan tudi kot p16) pomemben za zgodnje dejavnike v karcingenezi celic trebušne slinavke. Mutacije zarodnih linij v CDKN2A povzročajo še družinski sindrom atipičnih nevusov melanoma, pri katerem imajo bolniki večje tveganje za nastanek melanoma in raka trebušne slinavke.
Bolniki s Peutz-Jeghersevim sindromom (PJS), ki imajo spremembe zarodnih linij v genu serin treonin proteinska kinaza 11 (STK11, znanem tudi kot LKB1), imajo poleg hamartomov prebavil tudi znatno večje tveganje za raka trebušne slinavke. Zaradi ponavljajočih se vnetij in popravil v trebušni slinavki, imajo veliko tveganje za razvoj raka tudi bolniki z dednim pankreatitisom, kateri je posledica mutacij zarodnih linij PRSS1 in SPINK1. Prav tako povezujejo povečano tveganje za razvoj pankreatitisa in posledično razvoj raka trebušne slinavke bolnike, ki imajo mutacije zarodnih linij v genu CFTR (Kamisawa in sod., 2016).
Obstaja tudi povezava med povečanim tveganjem nastanka raka trebušne slinavke in bolniki z Lynchovim sindorom, čigar nastanek je posledica mutacij zarodnih linij genov, ki kodirajo proteine za popravljanje neujemanj DNA molekul (Kamisawa in sod., 2016).
Poleg teh dobro opisanih genetskih sindromov so nedavne študije opredelile tudi genetske spremembe, na katerih temeljijo majhne podskupine družinskega raka trebušne slinavke, brez predhodno opisanih genetskih sindromov. Mutacije zarodnih linij PALB2, katerih proteinski produkt sodeluje z BRCA2, predstavljajo majhno podskupino bolnikov z družinskim rakom trebušne slinavke. Poleg tega obstaja ločena podskupina družinskega raka trebušne slinavke, ki jo povzročajo heterozigotne mutacije zarodnih linij genov ATM, ki kodirajo kinazo, ki sodeluje pri popravilu DNA, in povzroča ataksijo telangiektazijo (A-T) oziroma Louis-Bar sindrom, kadar je bilelno inaktivirana v zarodni liniji (Kamisawa in sod., 2016). A–T je posledica okvare gena ATM, ki sodeluje pri prepoznavanju in popravilu poškodovane DNA. Za sindrom je značilno, da imajo bolniki zmanjšan imunski sistem, kar poveča nagnjenost k okužbam. Hkrati mutacija preprečuje popravilo DNA in s tem povečuje tveganje za nastanek raka (Savitsky K, 1995; Shiloh Y, 2001).
Drugi dejavniki tveganja za nastanek raka trebušne slinavke so kajenje cigaret, ki poveča tveganje za 75 %. K ostalim dejavnikom tveganja prištevamo kronični pankreatitis in sladkorno bolezen. Pri sladkorni bolezni obstaja 30-odstotno večje tveganje za nastanek raka trebušne slinavke, ki traja več kot 20 let po začetni diagnozi diabetesa, kar kaže na to, da diabetes ni le oznaka disfunkcije trebušne slinavke kot posledice neoplazije. Obstaja tudi pozitivna povezava med rakom trebušne slinavke in debelostjo, posebej med visokem indeksu telesne mase (ITM) in centralizirano porazdelitev maščob (Kamisawa in sod., 2016).
2.1.2 Histopatologija in molekularna patologija
Najpogostejša oblika raka je pankreatični duktalni adenokarcinom. Je invazivni tumor, ki proizvaja mucin in tvori intenzivno stromalno desmoplastično reakcijo. Poznamo nekaj ključnih histoloških značilnosti, ki nam pomagajo diagnosticirati pankreatični duktalni adenokarcinom. To so naključna razporeditev žlez, jedrski pleomorfizem, nepopolna lumina žleze, žlezna nekroza, neoplastična žleza pritrjena tik ob žilah mišic, perinevralna invazija in limfovaskularna invazija (Kamisawa in sod., 2016).
Glede na stopnjo diferenciacije so adenokarcinomi trebušne slinavke razdeljeni na tri stopnje: dobro, zmerno in slabo diferencirani. Večina karcinomov nastane zaradi mikroskopske neinvazivne epitelne proliferacije znotraj pankreatičnih duktusov, imenovane
intraepitelialne neoplazije trebušne slinavke. Te lezije razvrščamo na osnovno arhitekturo in citološke atipije. Nekateri duktalni adenokarcinomi trebušne slinavke izvirajo iz makroskopski cističnih predhodnikov- in sicer intraduktalne papilarne mucinozne neoplazme in mucinozne cistične neoplazme. Poleg morfologije duktalnega adenokarcinoma trebušne slinavke ima več morfoloških različic edinstvene značilnosti (Kamisawa in sod., 2016).
Slika 1: Prikazni model napredovanja PanIN, ki nakazuje na kopičenje genetskih in epigenetskih sprememb ter razvoja neoplazem od predhodnih lezij nizke stopnje (PanIN 1 in PanIN 2) do displazije visoke stopnje (PanIN 3) do sčasoma invazivnega adenokarcinoma trebušne slinavke (Hackeng in sod., 2016).
2.1.3 Diagnostika in stadij
Pri diagnozi raka trebušne slinavke se poleg laboratorijskih preiskav poslužujemo predvsem računalniške tomografije (CT) trebuha in endoskopskega ultrazvoka, ki nam omogoča tudi pridobitev tkiva za patološko preiskavo. Ostale slikovne preiskave uporabljamo redkeje.
Magnetno resnonanco (MR) včasih uporabimo za oceno zajetosti žilja in natančnejšo oceno jeternih metastaz raka trebušne slinavke, ki je s CT ne moremo opredeliti (Finderle, 2017).
Stadij bolezni dokončno doložimo z rentgenom ali CT prsnih organov. Opravimo tudi preiskave krvne slike, biokemične preiskave in določimo tumorske označevalce karbohidratni antigen 19-9 (CA 19-9) in karcinoembrionalni antigen CEA (Raki prebavil, 2020). Tumorski marker CA 19-9 velja za najpomembnejšega tumorskega markerja pri raku trebušne slinavke. Zvišane vrednosti opazimo pri skoraj 80 % bolnikov z napredovalo boleznijo. Kljub temu pa saj so lahko povišane tudi pri drugih malignih in benignih boleznih, zato pri tem potrebujemo še ostale preiskave (Finderle, 2017).
Tudi lokacija tumorja je pomembna pri začetni diagnostiki. V bolj napredovalih stadijih običajno diagnosticiramo tumorje telesa in repa trebušne slinavke, kjer zaradi pritiska tumorske mase pride do obstrukcije skupnega žolčnega voda in/ali pankreatičnega voda.
Posledično takšni pacienti hitreje izgubljajo telesno maso. Tumorji lahko vraščajo v steno dvanajstnika in povzročijo obstrukcijski ileus (Finderle, 2017).
Tako kot mnoge druge vrste tumorjev tudi duktalni adenokarcinom trebušne slinavke razvščamo po velikosti z uporabo enovite in mednarodno sprejete klasifikacije TNM. Pri vsakem bolniku lahko ocenimo tako imenovani stadij bolezni na podlagi ocene velikosti tumorja v centimetrih (T), zasevkih v regionalnih bezgavkah (N) in zasevkih v oddaljenih organih (M). Za natančno določitev stopnje T je treba oceniti velikost tumorja in invazijo v okoliška tkiva (kot sta dvanajstnik in žolčni kanal). Čeprav si strokovnjaki še vedno niso enotni, se predlaga, da je za natančno določanje stopnje N potrebnih vsaj 15 pregledanih bezgavk. Prisotnost invazivnega karcinoma in visokokakovostne displazije ali karcinoma in situ je potrebno dokumentirati na vseh robovih (Kamisawa in sod., 2016).
2.1.4 Osnove zdravljenja 2.1.4.1 Kirurško zdravljenje
Lokalni način zdravljenja predstavlja operacija, pri kateri zdravniki odstranijo tumor v trebušni slinavki. Včasih je potrebno odstraniti tudi del želodca, žolčnika in okolna tkiva ter področne bezgavke. Za operacijo se odločijo takrat, kadar izključijo prisotnost oddaljenih zasevkov in ugotovijo, da tumor ne vrašča v pomembne žilne strukture. Pomemben je predvsem klinični stadij bolezni, lega, velikost tumorja in histološki izvid (Ocvirk in sod., 2008). Po končanem radikalnem zdravljenju bolnike sledimo na 3 mesece, po pretečenih dveh letih pa na 6 mesecev. Ob kontrolah se naredi klinični pregled, osnovne krvne in biokemične preiskave, pregledajo se tumorski markerji in ultrazvok trebuha (Novaković in sod., 2009).
2.1.4.2 Obsevanje/radioterapija
Radioterapijo uvrščamo med lokalne načine zdravljenja, saj je njen učinek omejen na mesto absorpcije visokoenergetskih ionizirajočih žarkov. Ker je v obsevalno polje delno zajeto tudi okolno zdravo tkivo, se pojavijo nezaželeni učinki zdravljenja kot so vnetje kože, utrujenost,
izguba teka, težje požiranje, slabost in bruhanje. Po navadi bolniki dobivajo ob obsevanju tudi kemoterapijo, saj ta stopnjuje njegov učinek, obenem pa se z zdravili uničuje mikrozasevke. Namen obsevanja in kemoterapije je preprečiti lokalno in področno ponovitev obolenj in uničiti morebitne mikrozasavke v telesu (Ocvirk in sod., 2008).
Obsevanje v kombinaciji s 5-fluorouracilom ali gemcitabinom značilno podaljša bolnikovo 5-letno preživetje, v primerjavi z bolnikom, ki je bil samo operiran. Poleg kemoterapije s citostatikom gemcitabinaom se uporabljajo še ostali - kapecitabin, oxaliplatin in erlotinib, vendar imajo v primerjavi s prvim, več nezaželenih učinkov (Novaković in sod., 2009).
2.1.4.3 Sistemsko zdravljenje
Sistemsko zdravljenje je uničevanje rakavih celic s citostatiki in/ali tarčnimi zdravili, ki zavirajo delitev rakavih celic. Citostatiki in tarčna zdravila potujejo po krvi in dosežejo tudi oddaljene organe, kjer se lahko nahajajo zasevki (Ocvirk in sod., 2008). Večina klasičnih citostatikov deluje po istem mehanizmu preprečevanja delitev hitro delečih se celic, posledično pa so prizadete tudi normalne hitro se deleče celice kostnega mozga in sluznice (Novaković in sod., 2009).
Osnovno zdravljenje raka trebušne slinavke predstavlja citostatik, ki se daje intravensko.
Učinkovitost lahko povečamo z dodatkom drugih citostatikov ali tarčnih zdravil (Ocvirk, 2008). Pri iskanju pravega citostatika moramo biti pozorni na to, da minimalno vpliva na zdrave celice. Napredek v poznavanju molekularnih dogodkov, ki urejajo karcinogenezo, je privedel do odkritja številnih novih citostatikov, ki so usmerjeni na specifične poti, ki so ključne za rast in razvoj tumorjev, te pa so različne od poti normalnih celic. Idealen citostatik mora vplivati na vse rakaste celice enako, občutljivost celic na citostatik se ne sme spreminjati. Pri tem koncentracija citostatika v rakastih celicah in občutljivost celice na citostatike ne smeta biti odvisni od mesta, na katerem se nahaja tumorska celica v gostitelju (Novaković in sod., 2009).
Tarčna zdravila v primerjavi s citostatiki delujejo na tumor bolj ciljano in s tem povzročijo manj nezaželenih učinkov (Ocvirk, 2008). Blokirajo lahko receptorje za rastne dejavnike, inhibirajo celični cikel, preprečijo delovanje onkogenov, povrnejo apoptozo, zavirajo
angiogenezo ter povrnejo delovanje tumorskih supresorskih genov (Novaković in sod., 2009).
Sistemsko zdravljenje se lahko uporablja pred operacijo pri mejno resektabilnih tumorjih, po operaciji in pri zdravljenju lokalno napredovale ali metastatske bolezni. Za predoperativno sistemsko zdravljenje se najpogosteje uporablja shema FOLFIRINOX (5- fluoracil, folna kislina, irinotekan, oxaliplatin) ali shema gem-paklitaksel (gemcitabin, nab- paklitaksel), ki predstavljajo najbolj učinkovito zdravljenje, če želimo tumor stabilizirati ali zmanjšati. Po operaciji se navadno uporablja šestmesečno zdravljenje z gemcitabinom ali gemcitabin v kombinaciji s kapecitabinom, ki pomembno izboljša preživetje bolnikov po radikalni operaciji. Pri pacientih z napredovalo boleznijo in zasevki v oddaljenih organih, je za zdravljenje prvi izbor kempoterapija po shemi FOLFIRINOX ali kombinacija gemcitabina in nab-paklitaksela. Tovrstno zdravljenje je mogoče le pri bolnikih, ki so v dobrem splošnem stanju telesne zmogljivosti, brez pridruženih bolezni. Kemoterapija drugega izbora pa je ponavadi kombinirano zdravljenje z gemcitabinom, fluropirmidini in/ali z oxaliplatinom ali pa glede na izsledke zadnjih raziskav kombinirano zdravljenje s fluoropirimidini in nal-irinotekanom. Kombinirano zdravljenje z gemcitabinom in biološkimi učinkovinami (erlotinibom) se zaradi zelo kratkega izboljšanja preživetja in neželenih učinkov le redko uporablja.Eden izmed tarčnih zdravil, ki se uporablja tudi za zdravljenje nevroendokrinih tumorjev trebušne slinavke (pNET) je sunitinib. Sunitinib pod imenom zdravila Sutent, je indicirano za zdravljenje tumorjev, ki jih ni mogoče izrezati ali metastatskih tumorjev, ki so dobro diferencirani (Glavne začilnosti sunitiniba, 2020).
2.1.4.3.1 Sunitinib
Sunitinib malat je molekula oksindola, zasnovana za selektivno interakcijo z znotrajceličnimi mesti ATP receptorjev kinaz kot so VEGFR1–3, PDGFR, KIT, FLT3 in CSF1R. Zaviranje receptorjev ima številne učinke na celične procese vključno s preživetjem tumorskih celic, rastjo in migracijo endotelijskih celic in vaskularno prepustnostjo tumorjev (Faivre in sod., 2007). Sunitinib bistveno zmanjša vaskularno prepustnost, zavira nastanek novih krvnih žil in spodbuja regresijo obstoječe tumorske vaskulature (Papaetis in Syrigos, 2009).
Slika 2: Prikaz delovanja sunitiniba na tarčne receptorje (povzeto po Faivre in sod., 2007).
Sunitinib se uporablja kot samostojno zdravilo in v kombinaciji z drugimi zdravili. Pri različnih bolnikih je pokazal časovno odvisne in od odmerka odvisne antiproliferativne učinke rakavih celičnih linij vključno z rakom ledvic, dojk, pljuč in melanomom. Poleg tega je bila protitumorska aktivnost učinkovita pri številnih vrstah tumorjev, vključno z rakom ledvičnih celic (RCC), gastrointestinalnim stromalnim tumorjem (GIST), nevroendokrinim tumorjem (NET), nedrobnoceličnim pljučnim rakom (NSCLC), rakom ščitnice in melanomom faze I in zgodnje faze II (Faivre in sod., 2007). Kadar gre za napredovanje bolezni pri odraslih, je sunitinib pod imenom zdravila Sutent, indicirano za zdravljenje tumorjev, ki jih ni mogoče izrezati ali metastatskih tumorjev, ki so dobro diferencirani nevroendokrini tumorji trebušne slinavke (pNET). Če pride do odpornosti alineprenašanja na imatinib, se sunitinib uporablja za zdravljenje neizrezljivega in/ali metastatskega malignega GISTa pri odraslih. Uporablja se tudi kot prva linija zdravljenje napredovalega ali metastatskega karcinoma ledvičnih celic (MRCC) pri odraslih. Njegova uporaba za prvo linijo zdravljenje pri napredovalem karcinomu ledvičnih celic v primerjavi z zdravljenjem s
citokini, je izboljšala splošno preživetje. Pri bolnikih z GIST, ki so intolerantni na imatinib, je uporaba sunitiniba dosegla objektivni odziv z 7 % (Glavne značilnosti zdravila Sutent, 2020).
Dejstvo, da sunitinib cilja številne različne receptorje, vodi do številnih njegovih stranskih učinkov. Najpogostejši nezaželeni učinki sunitiniba so utrujenost, katero je poročalo 50–70
% bolnikov z napredovalim RCC in GIST. Drugi neželeni učinki so driska, anoreksija, slabost in bruhanje, peroralne spremembe in krvavitve (Papaetis in Syrigos, 2009).
2.2 ELEKTROPORACIJA V MEDICINI
Elektroporacija je pojav, kjer celice ali tkiva izpostavimo visokonapetostnim, kratkotrajnim električnim pulzom, ki povzročijo prehodno povečanje prepustnosti njihove plazemske membrane, kar omogoča transmembranski transport sicer neprehodnih molekul (Kotnik in sod., 2019). Obseg permeabilizacije celične membrane je odvisen od parametrov električnih pulzov, značilnosti medijev za elektropermeabilizacijo in lastnosti celic, ki jih izpostavimo električnim pulzom. Postopek elektropermeabilizacije je sestavljen iz najmanj treh ločenih faz. Prva faza je nastajanje hidrofilnih por, kar je odziv celične membrane na inducirani prag membranskega potenciala. Drugo fazo zajema časovno odvisno širitev velikosti por. Zadnjo fazo pa sestavlja regeneracija membrane, ki poteka po končanem tretiranju z električnimi pulzi (Kandušer in sod., 2008).
Elektroporacija se je uveljavila na različnih področjih medicine in biotehnologije. Danes je reverzibilna elektroporacija uveljavljena metoda za vnos citostatikov v tumorske celice, znana pod imenom elektrokemoterapija. Elektroporacija se uporablja tudi kot metoda vnosa za gensko terapijo, pri čemer v celice vnašamo RNA ali DNA. Pomembna je za vnašanja genskih konstruktov v mikroorganizme in elektrotransfekcijo arhej, mikroalg in kvasovk. V biotehnologiji je uporabna za ekstrakcijo biomolekul in inaktiviacijo mikrobov, v klinični medicini pa se ireverzibilna elektroporacija uporablja kot metoda za ablacijo tkiv (Kotnik in sod., 2019). Elektroporacija se uporablja za elektrofuzijo, kjer s pomočjo elektroporacije dosežemo zlitje dveh membran. Ob nastanku por v membrani ta postane fuzogena in je sposobna zlivanja z drugo celično membrano. Ta metoda se uporablja za pridobivanje hibridnih celic in tudi pripravo celičnih cepiv za stimulacijo imunskega odziva pri zdravljenju raka (Rems in Miklavčič, 2014).
2.2.1 Elektrokemoterapija
Elektrokemoterapija (ECT) je ciljno lokalizirana oblika kemoterapije, ki je v rutinski klinični uporabi za zdravljenje kožnih metastaz različnih histologij (Serša in sod., 2013). Zapisana je v nacionalnih in medarodnih smernicah za zdravljenje kožnih metastaz in primarnega kožnega raka (Gehl in sod., 2018). Posebno je primerna za zdravljenje kožnih zasevkov, ki niso primerni za kirurško zdravljenje ali obsevanje. Poleg tega je primerna in učinkovita za zdravljenje zasevkov, ki so bili predhodno zdravljeni s kirurgijo ali radioterapijo. Zaradi dobre proitumorske učinkovitosti, ki zaustavi krvavitev, predstavlja dober pristop tudi za zdravljenje krvavečih nodulov (Serša in sod., 2016). Zaradi močno povečanega citotoksičnega učinka se uporablja za zdravljenje melanoma, adenoracinoma (dojke ali drugega), bazalnoceličnega karcinoma, ploščatoceličnega karcinoma, sarkomov in drugih malignih tumorjev. Elektrokemoterapija za druge globoko ležeče tumorje, kot je trebušne slinavka in pljuča so še v kličninih preskušanjih (Gehl in sod., 2018).
Osnova za delovanje elektrokemoterapije je elektroporacija, ki temelji na električnih pulzih, ki destabilizira celično membrano v tumorjih in tako se v celice bistveno poveča vnos hidrofilnih citostatikov, ki imajo oviran transport skozi celično membrano (Gehl in sod., 2018). Za dosego lokalne kontrole tumorja se uporabljata citostatika bodisi bleomicin ali redkeje cisplatin. Raziskave potrjujejo, da ima bleomicin daleč najmočnejši citotoksični učinek, zato je potrebna samo enkratna terapija (Clover in sod., 2020). Je daleč najbolj uporabljeno zdravilo za elektrokemoterapijo, najpogostejša pa je intravenska infuzija dajanje zdravila (Gehl in sod., 2018).
Stepišnik (2016) navaja, da je v predkliničnih raziskavah dokazano, da se z izpostavitvijo tkiva električnemu polju močno poveča tudi učinkovitost delovanja bleomicina in cisplatina, medtem ko se pri drugih citostatikih njihova učinkovitost kljub izpostaviti tkiva električnem polju, učinkovitost ne poveča. Prednosti elektrokemoterapije so v tem, da zaradi povečanja učinkovitosti citostatika uporabimo nižjo koncentracijo, ki ne povzroča sistemskih stranskih učinkov. Poleg tega pa ima tudi žilnorazdiralni učinek, ki je dobrodošel pri zdravljenju krvavečih tumorjev (Serša in sod., 2013), hkrati pa povzroča vazokonstrikcijo. Z izpostavitvijo tumorja električnemu polju postanejo tudi endotelijske celice v tumorskem
žilju bolj dovzetne za privzem citosatika. Na tak način pride do apoptoze endoteljnih celic in prekinitve pretoka krvi v tumorju (Stepišnik in sod., 2016).
Pri biomedicinski uporabi, uporabljamo kratke enosmerne visokonapetostne električne pulze. Gre za reverzibilno elektroporacijo, saj amplituda in trajanje električnih pulzov nista previsoka, in tako čez čas celica vzpostavi selektivno prepustnost in preživi. Amplituda pulzov, ki je bila preizkušena na in vivo raziskavah, mora biti takšna, da na celotnem področju tumorja doseže električno polje velikosti vsaj 400 V/ cm pri zaporedju 8 pulzov s trajanjem 100 mikrosekund (Stepišnik in sod., 2016).
Elektrokemoterapija se izvaja v lokalni ali splošni anastaziji, saj aplikacija električnih pulzov povzroči kontrakcijo mišic. Postopek običajno traja 8-28 minut po i.v. aplikaciji bleomicina, pri starejših pacientih pa tudi do 40 minut (Grošelj, 2016) pri tem je potrebna največ enodnevna hospitalizacija (Stepišnik in sod., 2016).
Elektrokemoterapija je varna, saj do sedaj še ni bilo zabeleženih resnih zapletov. Sam potek elektrokemoterapije zajema uporabo generatorja, ki generira električne pulze, ki so različnih amplitud glede na vrsto elektrod, ki jo uporabimo (Serša in sod, 2013). Pri zdravljenju tumorjev na koži ali neposredno pod njeno površino uporabimo ploščate elektrode, ki jih neinvazivno pritisnemo ob kožo. Za globje ležeče tumorje uporabimo elektrode v obliki igel, ki jih vbodemo skozi kožo (Stepišnik in sod., 2016).
Citostatik vbrizgamo v veno ali v sam tumor. Cisplatin se injicira intratumorsko, bleomicin pa intramuskularno ali intravensko, saj se uporablja pri zdravljenju večjih ali multiplih nodulov. Moč citostatika se meri v protimikrobnih enotah dejavnost (Gehl in sod., 2018). Po aplikaciji citostatika s pomočjo elektrod do tumorjev dovajamo kratke visokonapetostne električne pulze, ki zagotavljajo reverzibilno elektroporacijo celic v tumorju. Za dobro učinkovitost terapije je potrebno izbrati ustrezno elektrodo in zaobjeti celotno geometrijo tumorja. Različna tkiva imajo različno električno prevodnost, zato moramo v primeru globoko ležečih, večjih tumorjev ali tumorjev nepravilnih oblik, pred zdravljenjem opraviti izračune, s katerimi pred samim posegom določimo razporeditev in mesto vstavljanja elektrod ter ustrezno napetost. Na tak način celoten tumor izpostavimo določeni jakosti električnega polja (Stepišnik in sod., 2016).
2.2.1.1 Bleomicin
Bleomicin molekularno spada v skupino glikopeptidov, ki so jih leta 1966 prvič izolirali Umezawa in sodelavci iz bakterije Streptomyces verticillus (Gour in sod., 2021, Umezawa in sod., 1968). Bleomicin je bil prvič odobren za uporabo leta 1973 v Združenih državah Amerike, trenutno pa se uporablja za zdravljenje tumorjev testisov, zarodnih celic jajčnikov, raka glave in vratu, Hodgkinovega in ne-Hodgkinovega limfoma ter malignega plevralnega izliva (LiverTox, 2012, Glavne značilnosti zdravila Bleomicin medac, 2020).
Od njihovega odkritja je postal bleomicin pomembna sestavina v številnih protokolih kombinirane kemoterapije. Glikopeptidi bleomicina si delijo enako jedrno strukturo, vendar se razlikujejo po adiciji sladkorja in po pozitivno nabitih repih. Bleomicin je na voljo v obliki raztopine ali praška za injiciranje z različnimi koncentracijami (LiverTox, 2012). Sestavljen je iz dveh oblik bleomicina, ki se razlikujeta po pozitivno nabitih repih. Vsebuje približno 60 % bleomicina A2 in približno 30 % bleomicina B2 ter dodatne manjše komponente (Chen in sod., 2005). Bleomicin običajno dajemo v kombinaciji z drugimi zdravili proti raku, najpogosteje s cisplatinom, vinblastinom, etopozidom, adriamicinom ali dakarbazinom.
Tipični odmerek bleomicina se razlikuje glede na indikacijo in je prilagojen telesni teži in ledvični funkciji. Bleomicin lahko dajemo intravensko, intramuskularno ali subkutano.
Pogosti neželeni učinki bleomicina vključujejo slabost, drisko, glavobol, omotico, alopecijo, utrujenost in šibkost. Občasni, a resni toksični učinki bleomicina vključujejo intersticijski pnevmonitis, preobčutljivostne reakcije in maligno hipertermijo, ki je lahko usodna (LiverTox, 2012).
Bleomicin v celico vstopa s prenašalnimi proteini po endocitotskipoti. Nabor prenašalnih proteinov je precej majhen, zato je posledično tudi privzem bleomicina v celico omejena.
Njegovo dostopnost celicam povečamo z uporabo elektrokemoterapije, pri čemer z električnim pulzom membrana postane prepusta za bleomicin (Orlowski in sod., 1991; Serša in sod., 2008).
Primarni mehanizem delovanja bleomicina vključuje sposobnost vezave na kovinske ione, vključno z železom, in tvorbo metalobleomicinskih kompleksov. Reaktivne kisikove zvrsti, ki jih tvorijo ti kompleksi, povzročajo enoverižne in dvoverižne prekinitve DNA med 3' – 4'
vezmi v deoksiribozi. Ti prelomi verig proizvajajo proste bazične propenale, zlasti timina, kar povzroči zaustavitev celičnega cikla v fazi G2. Po izpostavljenosti celicam bleomicinu lahko citološko opazimo kromosomske aberacije, prelome kromatid in translokacije.
Predvidljivo so celice s pomanjkanjem popravljanja DNA bolj občutljive na toksične učinke bleomicina kot celice divjega tipa. Učinek bleomicina je odvisen tudi od celičnega cikla celice. Zdi se, da so gojene celice najbolj dovzetne za bleomicinin v G2 in M fazi celičnega cikla, kar lahko odraža boljšo dostopnost zdravila zaradi odprte strukture kromatina (Lazo in sod., 2002).
Odpornost na bleomicin v normalnih tkivih je povezana s prisotnostjo encima bleomicin hidrolaze, ki je član družine cistein proteinaz. Ta encim nadomešča terminalni amin s hidroksilno skupino in s tem zavira citotoksično aktivnost z zmanjšanjem vezave na železo.
Nizka koncentracija hidrolaz v koži in pljučnem tkivu je prispevala k hipotezi o občutljivosti na bleomicin, ki jo najdemo na teh mestih (Brandt in Gerriets, 2020). Drugi vpleteni mehanizmi citotoksičnost, ki jo povzroča bleomicin, so lipidna peroksidacija, zaviranje encimov topoizomeraze II in oksidativna RNA degradacija (Sprangers in sod., 2019).
2.2.1.2 Elektrokemoterapija s cisplatinom
Cisplatin je eno izmed najučinkovitejših zdravil proti raku. Leta 1844 ga je prvi sintetiziral M. Peyronie, njegovo kemijsko strukturo pa je leta 1893 določil Alfred Werner. V šestdesetih letih prejšnjega stoletja je bilo ugotovljeno, da ima citotoksične lastnosti, do konca sedemdesetih let pa je cisplatin postal ključna sestavina pri sistemskem zdravljenju raka zarodnih celic. Na splošno cisplatin in druge spojine na osnovi platine veljajo za citotoksična zdravila, ki uničujejo rakave celice tako, da poškodujejo DNA, zavirajo sintezo in mitozo DNA in povzročajo apoptotično smrt celic. Danes se cisplatin veliko uporablja za zdravljenje različnih vrst novotvorb, vključno z levkemijami in rakom glave in vratu, pljuč, jajčnikov, dojk, možganov, ledvic in mod (Dasari in Tchounwou, 2014; Glavne značilnosti zdravila Cisplatin Kabi, 2020).
Cisplatin uporabljamo v kombinaciji z elektrokemoterapijo, saj je tako kot pri bleomicinu njegov vstop v celico preko celične membrane oviran. S pasivno difuzijo se preko membrane prebije le polovica molekul cisplatina, ostale pa prehajajo preko transportnih molekul, ki jih je omejeno na razpolago (Serša in sod., 2008). Glavni mehanizem delovanja cisplatina je
njegova vezava na DNA in zaviranje replikacije DNA, kar prizadene predvsem hitro proliferirajoče se celice. Njegov način delovanja je povezan z zmožnostjo navzkrižne povezave s purinskimi bazami na DNA, poseganjem v popravljalne mehanizme DNA, povzročanjem poškodb na DNA in posledično induciranje apoptoze v rakavih celicah.
Cisplatin se aktivira, ko vstopi v celico. Sam potek delovanja je takšen, da se v citoplazmi eden od dveh kloridnih atomov na cisplatinu zamenjajo z molekulo vode. Ta hidroliziran produkt je močan elektrofil, ki lahko reagira s katerim koli nukleofilom, vključno z sulfhidridnimi skupinami na proteinih in donorskim atomom dušika na nukleinskih kislinah.
Cisplatin se veže na reaktivni center N7 na ostankih purina in kot tak lahko pov zroči poškodbe molekul DNA v rakavih celicah, blokira delitev celic in povzroči apoptozo celic.
Vključenih je več molekularnih mehanizmov delovanja, vključno z indukcijo oksidativnega stresa, za katero je značilna tvorba reaktivnih kisikovih vrst in peroksidacija lipidov, indukcija signalizacije p53 in zastoj celičnega cikla, regulacija protoonkogenov in antiapoptotičnih proteinov ter aktivacija notranjih in zunanjih poti apoptoze (Dasari in Tchounwou, 2014).
3 MATERIAL IN METODE
Eksperimentalni del magistrskega dela smo izvedli v laboratoriju Oddelka za eksperimentalno onkologijo Onkološkega inštituta Ljubljana.
3.1 MATERIAL
3.1.1 Laboratorijski material in oprema
Za izvedbo eksperimentov smo uporabili ustrezne pripomočke in laboratorijsko opremo, kar je predstavljeno v Preglednici 1.
Preglednica 1: Seznam uporabljenega laboratorijskega materiala in opreme ter njihovih proizvajalcev.
Laboratorijski material in oprema Proizvajalec
Mikrocentrifugirke -1,5 ml, 2 ml in 5 ml VWR, VWR International, LLC, Radnor, Pensilvanija, ZDA
Nastavki za pipete Rainin, Mettler-Toledo Rainin, LLC, Oakland, Kalifornija, ZDA
Posode za gojenje celic T25, T27 Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ZDA
Sterilne serološke pipete 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml
Corning Incorporated, New York, New York, ZDA
Pipete velikosti 10 – 1000 μl Rainin, Mettler-Toledo Rainin Sterilni nastavki za pipete Rainin, Mettler-Toledo Rainin Večkanalna avtomatska pipeta Rainin, Mettler-Toledo Rainin 50 ml sterilne plastične falkonke Falcon, Corning Science, Reynosa,
Tamaulipas, Mehika
Plastične banjice Corning Incorporated
Objektno steklo Thermo Fisher Scientific
Steklene kadičke za barvanjepreparatov VWR, VWR International Invertni fluorescentni mikroskop IX-70 Olympus, Hamburg, Nemčija Centrifuga, Heraeus Multifuge 1S-R
Centrifuge
Thermo Fisher Scientific Centrifuga Heraeus Megafuge 1.0 R Thermo Fisher Scientific Centrifuga Centrifuge 5430R Eppendorf, Hamburg, Nemčija
Plošče z zmanjšano možnostjo pritrjevanja celic in 24 vdolbinicami
Corning Incorporated
Plošče z 96 vdolbinicami z okroglim dnom Corning Incorporated Plošče s 6 vdolbinicami Corning Incorporated
Čitalec mikrotiterskih plošč Infinite 200, Tecan, Männendorf, Švica
3.1.2 Kemikalije
Skladno z navodili proizvajalcev smo reagente shranjevali pri sobni temperaturi (Tsob), v hladilniku pri 4 °C ali v zamrzovalniku pri -20 °C. Seznam vseh uporabljenih kemikalij je podan v Preglednici 2.
Preglednica 2: Seznam uporabljenih kemikalij in njihovih proizvajalcev.
Kemikalije Proizvajalec
Pufer PBS (ang. Phosphate Bufferd Saline) Merck Milipore, Darmstadt, Nemčija Elektroporacijski pufer: 250 mmol/L
saharoza, 10 nmol/L K2HPO4, 2,5 mmol/L KH2PO4, 2 mmol/L MgCl2 ∙ 6 H2O
Pripravljen na Onkološkem Inštitutu Ljubljana
Tripsin Thermo Fisher Scientific
Fiziološka raztopina (0,9 % NaCl) BRAUN, Melsungen, Nemčija EDTA (etilendiamin tetraacetat) Gibco, Thermo Fisher Scientific Kristal vijolično z metanolom Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ZDA
PrestoBlueTM Cell Viability Reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific
3.1.3 Gojišča in dodatki
Celice smo gojili v tekočih gojiščih, ki smo jih pripravili po priporočilu American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, ZDA) v A-RPMI (Advanced RPMI-1640, Gibco). Mediju smo dodali fetalni goveji serum (FBS, Gibco) v končni koncentraciji 5 % (vol/vol), L-glutamin (10 mM, GlutaMAX, Gibco) in Penicilin-Streptomycin v končni koncentraciji 1 % (vol/vol) (založna koncentracija 10,000 U/ml, Gibco). FBS zadostuje posebnim presnovnim zahtevam za rast celic. Dodatek GlutaMAX je alternativa L-
glutaminu z večjo stabilnostjo, ki izboljšuje rast celic. Dodatek antibiotika pa prepreči razrast bakterij.
3.1.4 Citostatiki
Različne koncentracije cisplatina (Kabi, Fresenius Kabi, Indija) smo pripravili iz založne koncentracije 1 mg/ml (3,33 μM) z zaporednimi redčitvami s fiziološko raztopino tako, da so bile končne koncentracije v celični suspenziji: 0,17 μM, 1,67 μM, 16,67 μM in 166,67 μM. Te smo pripravili iz delovnih koncentracij 2,5 × 10−4 mg/ml, 2,5 × 10−3 mg/ml, 2,5 × 10−2 mg/ml in 2,5 × 10−1 mg/ml.
Različne koncentracije bleomicina (Bleomicin medac, Medac, Wedel, Nemčija) smo pripravili iz založne raztopine s koncentracijo 3 mg/ml (2,12 μM) z zaporednimi redčitvami s fiziološko raztopino, tako, da so bile končne koncentracije v celični suspenziji 1,4 ×10-6 μM, 1,4 ×10-5 μM, 1,4 ×10-4 μM, 1,4 ×10-3 μM, 1,4 ×10-2 μM, 1,4 ×10-1 μM in 1,4 μM. Te smo pripravili iz delovnih koncentracij bleomicina 1,0 × 10−5μg/ml, 1,0 × 10−4 μg/ml, 1,0 × 10−3 μg/ml, 1,0 × 10−2 μg/ml, 1,0 × 10−1μg/ml, 1,0 μg/ml, 10 μg/ml in 100 μg/ml.
3.1.5 Tirozin kinazni inhibitor
Sunitinib (Sunitinib 50 mg, Selleckchem, Houston, TX, USA) smo si najprej pripravili tako, da smo 50 mg liofiliziranega praška raztopili v 2000 μl DMSO (Thermo Fisher Scientific), nato pa smo si pripravili alikvote in nadalje redčili 100 μl prej pripravljene mešanice v 527,4 μl DMSO, da smo dobili koncentracijo 10 mM. Tako pripravljen sunitinib smo razdelili v epice po 50 μl in jih do uporabe shranili na -80 °C.
Za vsak poskus smo si pripravili delovne koncentracije sunitiniba v fiziološki raztopini: 1 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM in 100 μM, tako, da so bile končne koncentracije v celični suspenziji 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2,5 μM, 5 μM, 7,5 in 10 μM.
Pri kombinirani terapiji smo uporabili delovne koncentracije 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM in dodali še 200 μM. Končne koncentracije pri celicah so bile 2,5 μM, 5 μM, 7,5 μM, 10 μM in 20 μM.
3.1.6 Celična linija
Celice humanega raka trebušne slinavke BxPC-3 (ATCC; ATCC® CRL-1687™) smo pridobili iz celične banke ATCC, v kateri je vodena pod imenom CRL-1687™. Po morfologiji je celična linija epitelna in raste pritrjena na podlago. Za celice je značilno, da proizvajajo mucin ter so tumorigene v miših. Tumor je zmerno dobro do slabo diferenciran, tako kot primarni adenokarcinom. Celice imajo izražen specifični antigen raka trebušne slinavke PCAA in karcinoembrionski antigen CEA (BxPC-3, American Type Culture Collection, 2020).
Slika 3:Morfologija komercialne celične linije raka trebušne slinavke BxPC-3 (povzeto iz ATCC).
3.2 METODE
Pred pričetkom in po koncu dela s celicami smo, skladno z načeli dobre laboratorijske prakse, komoro z laminarnim pretokom zraka skrbno očistili s čistilom in razkužilom.
3.2.1 Gojenje celičnih kultur
Eksperimentalno delo je potekalo na humani celični liniji raka trebušne slinavke BxPC-3.
Celično linijo smo gojili v mediju RPMI , ki smo mu dodali fetalni goveji serum (FBS, Gibco) v končni koncentraciji 5% (vol/vol), L-glutamin (10 Mm, Glutamax, Gibco) in Penicilin-Streptomycin v končni koncentraciji 1 % (vol/vol) (založna koncentracija 10,000 U/ml, Gibco). Celice smo gojili v sterilni posodi za gojenje celic v inkubatorju v vlažni atmosferi s 5 % CO2 ter pri temperaturi 37 °C.
3.2.2 Menjava gojišč
Gojišče, ki smo ga shranjevali v hladilniku pri 4 °C smo pred uporabo vedno segreli v vodni kopeli na 37 °C. Posode s celičnimi kulturami smo prenesli iz inkubatorja v aseptično delovno komoro, kjer smo staro gojišče aspirirali in ga nadomestili z enako količino svežega, predhodno ogretega gojišča. Dobro zaprte posode za gojenje celičnih kultur smo prenesli nazaj v inkubator. Gojišče smo menjali dvakrat tedensko.
3.2.3 Presajanje (pasaže) celic
Celice smo presajali 2-3 krat na teden oz. takrat, ko so dosegle 70-80 % konfluenco, ki smo jo vedno preverili pod svetlobnim mikroskopom. Samo presajanje je potekalo tako, da smo celicam odstranili gojišče. Nato smo jih sprali z 1x fosfatnim pufrom (PBS), da je bila pokrita celotna površina posode za gojenje celic. Celice smo ločili od podlage tako, da smo dodali 0,25 % prej ogrete raztopine tripsina in jih približno dve minuti inkubirali na 37 °C. Pod svetlobnim mikroskopom smo preverili, da so se celice ločile od podlage in jim nato dodali enak volumen prej ogretega svežega gojišča, kot smo ga na začetku odstranili. Pazili smo, da je bila količina gojišča vsaj enaka količini tripsina in s tem zagotovili inaktivacijo delovanja tripsina. Gojišče smo spirali po stenah posode in ga zbrali v svežo 50 ml centrifugirko. Posodo s celicami smo sprali še s PBS in celoten volumen dodali v centrifugirko. Celično suspenzijo smo centrifugirali pri sobni temperaturi, pet minut pri 1500
rpm. Po centrifugiranju smo supernatant, ki je predstavljal gojišče zavrgli, celicam, ki so se zbrale na dnu pa smo resuspendirali v ustreznem volumnu elektroporcijskega pufra, PBS oz.
medija (odvisno od nadaljnjih postopkov).
3.2.4 Štetje celic v CytoSmart komori
Za standardizirano izvedbo poskusov in analizo rezultatov smo morali določiti točno število celic pred poskusom. Načinov določanja števila celic v kulturi je več, mi pa smo se poslužili avtomatiziranega štetja celic CytoSmart. Koncentracijo celic v suspenziji določimo tako, da odpipetiramo celice v komoro CytoSmart, nato pa jih avtomatizirana metoda s pomočjo števca in pripadajoče programske opreme, prešteje. Ker števec ni specifičen, moramo ob vsakem štetju vizualno oceniti ali dobljeni rezultati zajemajo le celice ali pa so v seštevek zajeti še drugi artefakti.
Pripravi smo komoro CytoSmart in krovno stekelce, ki jo smo jo pred tem očistili z destilirano vodo in etanolom. Brušeni del komore smo rahlo navlažili in nanj položili krovno stekelce. Iz dobro premešane celične suspenzije smo odpipetirali 10 µl in jo previdno prenesli na rob števne komore, da se je komora napolnila. Če smo ocenili, da je celična suspenzija pregosta, smo jo pred štetjem redčili v mikrocentrifugirki. Celice na ekranu računalnika Cytosmart smo dobro izostrili v 3 vidnih poljih. Zapisali smo si povprečno število celic v 1 ml vzorca.
3.2.5 Rast celic, rastne krivulje in določanje sposobnosti tvorjenja kolonij celične linije BxPC-3
3.2.5.1 Rast celic in rastne krivulje
Za določanje rasti in rastnih krivulj smo si pripravili plošče s 96 vdolbinicami, na katere smo nasadili različno število celic (1000, 1500 in 2000 / vdolbinico). V zadnjo vrstico smo odpipetirali gojišče, kar nam je služilo kot slepi vzorec. Dve uri po nasajanju smo dodali 10 μl barvila PrestoBlueTM (Invitrogen) in inkubirali 1 uro na 37 °C in 5 % CO2. Barvilo smo uporabili za indikacijo viabilnih celic, saj so le te sposobne metabolizirati resazurin v resorufin, ki ga nato spektrofotometrično detektiramo. Barvilo PrestoBlueTM smo dodali še naslednje 4 dni in vsakič določili intenziteto fluorescence s čitalcem mikrotirerskih plošč pri valovnih dolžinah 535 nm (ekscitacija) in 595 nm (emisija). Od dobljenih vrednosti
