• Rezultati Niso Bili Najdeni

DIPLOMSKO DELO

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "DIPLOMSKO DELO"

Copied!
89
0
0

Celotno besedilo

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Valeriya Musina

Ljubljana, 2021

(2)
(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA

Vloga NONO in PCBP2 v izražanju izbranih circRNA

DIPLOMSKO DELO

Valeriya Musina

MENTORICA: doc. dr. Tadeja Režen

Ljubljana, 2021

(4)
(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Valeriya Musina sem avtorica diplomskega dela z naslovom:

Vloga NONO in PCBP2 v izražanju izbranih circRNA.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr. Tadeje Režen;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, Podpis avtorice:

(6)
(7)

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem mentorici doc. dr. Tadeji Režen za strokovno pomoč in koristne nasvete pri izdelavi diplomske naloge.

Zahvaljujem se tudi delovnemu mentorju mag. biokem. Roku Razpotniku za vse napotke in dobro družbo v laboratoriju.

Rada bi se zahvalila tudi kolegom in prijateljem za vzpodbudo in pomoč v času študija.

Posebna zahvala gre vsem bližnjim, še posebej družini, ki mi je omogočila študij.

(8)
(9)

Vloga NONO in PCBP2 v izražanju izbranih circRNA Povzetek

Krožne RNA so nov razred RNA, ki imajo kovalentno povezano verigo. Krožne RNA imajo številne funkcije, lahko delujejo kot onkogeni ali tumor supresorji in imajo spremenjeno izražanje v številnih rakih, tudi v hepatocelularnem karcinomu. Krožne RNA se sintetizirajo v procesu povratnega spajanja, ki je odvisen od kanoničnih izrezovalno-povezovalnih kompleksov in cis in trans- delujočih elementov, kot so RNA-vezavni proteini. Povišano izražanje RNA- vezavnih proteinov NONO in PCBP2 statistično značilno negativno korelira s slabšim preživetjem bolnikov z rakom jeter. Namen diplomske naloge je bil preučevanje vloge NONO in PCBP2 v uravnavanju izražanja izbranih krožnih RNA, ki imajo spremenjeno izražanje v tumorjih raka jeter. In vitro analizo smo izvedli v humani hepatocelularni celični liniji Huh-7. V okviru diplomske naloge smo uspešno prekomerno izrazili oba RNA-vezavna proteina, NONO in PCBP2, s pomočjo qPCR izmerili izražanje krožnih RNA v celicah s prekomerno izraženima proteinoma in v kontrolnih celicah ter določili relativno spremembo v izražanju izbranih krožnih RNA. Potrdili smo, da lahko RNA-vezavni proteini vplivajo na izražanje izbranih krožnih RNA.

Ključne besede: krožne RNA, NONO, PCBP2, hepatocelularni karcinom.

The role of NONO and PCBP2 in the expression of selected circRNAs Abstract

Circular RNAs are a new class of RNA which have a covalently closed structure.

Circular RNAs have many functions, they can act as oncogenes or tumor suppressors, and are often dysregulated in various cancers, including hepatocellular carcinoma. Circular RNAs are synthesized during the process called backsplicing that depends on canonical spliceosomal machinery and both cis-acting and trans-acting factors such as RNA-binding proteins. Upregulated expression of RNA-binding proteins NONO and PCBP2 is statistically significantly negatively correlated with poorer survival of liver cancer patients.

The aim of the thesis was to examine the role of NONO and PCBP2 in the regulation of the expression of selected circular RNAs that are dysregulated in liver cancer tumors. In vitro analysis was performed in the human hepatocellular cell line Huh-7. In this thesis we successfully overexpressed both RNA-binding proteins, NONO and PCBP2, measured the expression of circular RNAs in cells with overexpressed proteins and control cells using qPCR, and determined the relative change in the expression of selected circular RNAs. We confirmed that RNA-binding proteins can affect the expression of selected circular RNAs.

Keywords: circular RNA, NONO, PCBP2, hepatocellular carcinoma.

(10)
(11)

Kazalo

1 UVOD ... 1

HEPATOCELULARNI KARCINOM ... 1

KROŽNE RNA ... 2

1.2.1 Tipi krožnih RNA ... 2

1.2.2 Sinteza ecircRNA in EIciRNA ... 3

1.2.3 Funkcije krožnih RNA ... 6

1.2.4 CircRNA in HCC ... 7

RNA-VEZAVNI PROTEINI ... 8

1.3.1 NONO ... 9

1.3.2 PCBP2 ... 10

2 NAMEN DELA IN HIPOTEZE ... 11

3 MATERIALI IN METODE ... 13

KEMIKALIJE ... 13

PUFRI ... 14

ENCIMI ... 15

PROTITELESA ... 15

LABORATORIJSKA OPREMA ... 15

SESALSKE CELIČNE LINIJE ... 17

VEKTORJI ... 18

ZAČETNI OLIGONUKLEOTIDI ... 24

DELO S SESALSKIMI CELICAMI ... 24

3.9.1 Gojenje celic ... 24

3.9.2 Odmrzovanje celic ... 25

3.9.3 Subkultivacija celic ... 25

3.9.4 Zamrzovanje celic ... 25

3.9.5 Štetje celic ... 26

TRANSFEKCIJA CELIC ... 26

OCENA UČINKOVITOSTI TRANSFEKCIJE ... 28

DELO S PROTEINI ... 28

3.12.1 Izolacija proteinov ... 28

3.12.2 Določanje koncentracije proteinov ... 29

3.12.3 NaDS-PAGE ... 30

3.12.4 Prenos western in imunodetekcija ... 31

3.12.5 Odstranjevanje protiteles iz membran ... 32

DELO Z RNA IN CDNA ... 33

3.13.1 Izlolacija RNA ... 33

3.13.2 Merjenje koncentracije in čistosti RNA ... 34

3.13.3 Merjenje celovitosti RNA ... 34

3.13.4 Reverzna transkripcija ... 35

(12)

3.13.5 Načrtovanje začetnih oligonukleotidov za qPCR ... 37

3.13.6 Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo ... 37

3.13.7 Analiza rezultatov qPCR ... 39

3.13.8 Studentov t-test ... 39

3.13.9 Agarozna gelska elektroforeza ... 40

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 41

UČINKOVITOST TRANSFEKCIJE ... 41

IZRAŽANJE REKOMBINANTNIH PROTEINOV NONO IN PCBP2 ... 43

4.2.1 Potrditev prekomernega izražanja s prenosom western in imunodetekcijo 43 4.2.2 Potrditev prekomernega izražanja s qPCR ... 47

CELOVITOST IZOLIRANE RNA ... 49

VPLIV PREKOMERNEGA IZRAŽANJA PROTEINOV NA IZRAŽANJE CIRCRNA ... 51

SPECIFIČNOST PRODUKTOV QPCR ... 64

5 ZAKLJUČEK ... 65

6 LITERATURA ... 67

(13)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

ACTB aktin beta

AGE agarozna gelska elektroforeza APS amonijev persulfat

Axyz absorbanca pri valovni dolžini xyz nm BCA bikinkonska kislina (angl. bicinchonic acid)

BSA goveji serumski albumin (angl. bovine serum albumin) CDK2 od ciklina odvisna kinaza 2

cDNA komplementarna DNA circRNA krožna RNA

ciRNA intronska krožna RNA Cp pražni cikel

DMEM Eaglovo minimalno gojišče, modificirano po Dulbeccu (angl.

Dulbecco's modified Eagle medium) DMSO dimetilsulfoksid

DNA deoksiribonukleinska kislina dNTP deoksinukleozid trifosfat DTT ditiotreitol

ecircRNA eksonska krožna RNA

eGFP izboljšani zeleni fluorescenčni protein (angl. enhanced green fluorescent protein)

EDTA etilendiaminotetraetanojska kislina EIciRNA eksonsko-intronska krožna RNA

FBS fetusni serum goveda (angl. fetal bovine serum)

GAPDH gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (angl. glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase)

HBV virus hepatitisa B

HCC hepatocelularni karcinom

HEPES 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kislina

HIF hipoksija inducibilni faktorj (angl. hypoxia-inducible factor)

(14)
(15)

HRP hrenova peroksidaza

Ig imunoglobulin

IRES notranje mesto za vezavo ribosoma (angl. internal ribosome entry site)

m6A N6-metiladenozin miRNA mikro RNA

mRNA informacijska RNA NaDS natrijev dodecilsulfat

NaDS-PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata

NONO vezavni protein za oktamero, ki ne vsebuje POU-domene (angl.

non-POU domain-containing octamer-binding protein)

nt nukleotid

PBS fosfatni pufer z NaCl

PCBP2 poli(rC)-vezavni protein 2 (angl. poly(rC)-binding protein 2) PCR verižna reakcija s polimerazo

PI propidijev jodid pre-mRNA prekurzorska mRNA PVDF polivinil difluorid

qPCR kvantitativna verižna reakcija s polimerazo RBP RNA-vezavni proteini

RIN številka celovitosti RNA RNA ribonukleinska kislina RNaza ribonukleaza

RNP ribonukleoprotein

RRM RNA-prepoznavni motiv (angl. RNA recognition motif) RT reverzna transkriptaza

TBE tris-borat-EDTA

TBS puferska raztopina Tris in NaCl

TBST puferska raztopina Tris in NaCl z dodatkom Tween 20 TEMED N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin

(16)
(17)

Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol UV ultravijolična svetloba

v/v volumski delež vrt/min vrtljaji na minuto w/v masni delež

(18)
(19)

1 Uvod

Hepatocelularni karcinom

Rak jeter je šesti najpogostejši rak na svetu in četrti najpogostejši vzrok smrti zaradi raka [1]. Njegova najpogostejša oblika je hepatocelularni karcinom (HCC), ki nastane v hepatocitih in predstavlja približno 90 % primerov primarnega raka na jetrih [2–4]. Večina HCC se pojavi pri bolnikih s kronično boleznijo jeter, kot posledica okužbe z virusom hepatitisa B ali C (HBV ali HCV) ali prekomernega uživanja alkohola. Vedno pogostejši vzrok postaja tudi nealkoholna zamaščenost jeter, ki skupaj s presnovnim sindromom in debelostjo povečuje tveganje za nastanek raka na jetrih [1]. Z velikim tveganjem za HCC so povezane tudi redke monogenske bolezni, kot so pomanjkanje alfa1-antitripsina, bolezen skladiščenja glikogena tipa I, hemokromatoza, akutna intermitentna in pozna kožna porfirija ter dedna tirozinemija tipa I [3].

Pri bolnikih s kronično boleznijo jeter pogosto pride do vnetja jeter, fibroze in atipične regeneracije hepatocitov. Te nepravilnosti lahko povzročijo cirozo in spodbudijo vrsto genetskih in epigenetskih sprememb, kar vodi do nastanka displastičnih vozličkov. Dodatne molekularne spremembe dajejo displastičnim celicam prednost pri proliferaciji, invaziji in preživetju ter zaključijo prehod v HCC.

HCC se lahko pojavi tudi pri bolnikih s kronično boleznijo jeter, ki nimajo ciroze ali izrazitega vnetja, na primer pri bolnikih z okužbo s HBV. Tveganje za razvoj HCC se razlikuje glede na vzrok, geografsko območje, spol, starost in stopnjo okvare jeter [1].

HCC ima slabo prognozo, visoko stopnjo malignosti, visoko verjetnost ponovitve in je odporen na številna kemoterapevtska sredstva. HCC običajno metastazira preko krvi ali limfe, maligne metastaze pa je težko nadzorovati. Poleg tega ni učinkovitih metod klinične napovedi, diagnoze in zdravljenja HCC [4]. Pogosto HCC diagnosticirajo šele v pozni fazi, ko je prepozno za uporabo kurativne terapije. Tudi če so bolniki primerni za resekcijo, presaditev jeter ali lokalno ablacijo, ki izboljšajo njihovo stanje, stopnja preživetja še vedno ostaja nizka.

Zato so nujno potrebni novi biološki označevalci in terapevtski pristopi za izboljšanje preživetja bolnikov s HCC [5].

Ugotovili so, da je izražanje nekodirajočih RNA (ncRNA) in tudi krožnih RNA (circRNA) pri HCC pogosto spremenjeno in je povezano z razvojem bolezni. To nakazuje, da bi morda lahko s pomočjo circRNA napovedali razvoj in določili terapevtske tarče pri HCC. Vendar zaradi zapletenega molekularnega mehanizma še ni dokazano, na kakšen način circRNA sodelujejo pri razvoju HCC [4].

(20)

Krožne RNA

Krožne RNA predstavljajo nov razred RNA, so endogene, številne in stabilne v celicah [4, 6]. Za razliko od linearnih RNA so circRNA enoverižni kovalentno povezani krožni prepisi, ki ne vsebujejo kape na 5’-koncu in poliA repa na 3'- koncu [7]. Krožne RNA se običajno sintetizirajo iz prekurzorske mRNA (pre- mRNA) v procesu nekanoničnega spajanja, imenovanem povratno spajanje (angl. backsplicing) [6, 7]. Večina circRNA se izraža iz znanih protein kodirajočih genov in je sestavljena iz enega samega ali več eksonov [6]. Če circRNA vsebuje samo en ekson, je ta praviloma daljši kot eksoni v circRNA z več eksoni in v linearnih RNA. Prav tako so introni okoli eksonov, ki sestavljajo circRNA, ponavadi trikrat daljši od intronov v linearnih RNA [8]. Nekatere circRNA vsebujejo tudi eksone, ki niso vključeni v linearne transkripte [6].

Čeprav je povratno spajanje manj učinkovito od linearnega, se lahko circRNA kopičijo v določenih vrstah celic zaradi svoje visoke stabilnosti. Ta stabilnost je posledica njihove kovalentno povezane krožne strukture, ki molekule ščiti pred razgradnjo z eksonukleazami. Krožne RNA so na splošno manj izražene kot linearne RNA iz istega lokusa, a so za številne gene prevladujoči transkripti prav circRNA [6]. Poleg tega je izražanje circRNA odvisno od vrste celice in tkiva, kar kaže na to, da imajo circRNA tkivno specifične biološke funkcije [7].

Krožne RNA so prvič odkrili v RNA virusih leta 1976 [7, 9]. Kmalu za tem, leta 1979, so bile circRNA odkrite tudi v evkariontskih celicah [10]. Takšne molekule so zaradi nizke stopnje izražanja običajno veljale za produkte nepravilnega spajanja RNA [9]. Vendar je bilo z razvojem tehnologije globokega sekvenciranja RNA in bioinformatike odkritih na tisoče circRNA v vrstah od arhej do ljudi in dokazano, da je circRNA pomembna vrsta RNA, ki je povezana s človeškimi boleznimi [4, 9].

1.2.1 Tipi krožnih RNA

Glede na način biogeneze in dele genoma, iz katerih so sestavljene, lahko circRNA razdelimo na tri glavne skupine: eksonske circRNA (ecircRNA), intronske circRNA (ciRNA), eksonsko-intronske circRNA (EIciRNA) [11]. Poleg tega obstajajo še tri vrste circRNA:

• tRNA intronske krožne RNA (tricRNA), ki nastanejo iz intronov prenašalne RNA;

• fuzijske krožne RNA (f-circRNA), ki nastanejo s fuzijo genov [11];

• intergenske krožne RNA, ki nastanejo iz nekodirajočih regij med geni [12].

Vsaka kategorija ima različno strukturo, lokacijo v celici, regulatorno funkcijo in model sinteze [13].

Eksonske krožne RNA vsebujejo en ali več eksonov, nastanejo predvsem v procesu povratnega spajanja ali preskakovanja eksonov in se nahajajo pretežno

(21)

v citoplazmi. EcircRNA predstavljajo tudi večino identificiranih v človeških celicah circRNA [13].

Intronske krožne RNA se nahajajo pretežno v jedru celic in naj bi imele regulatorno vlogo pri izražanju starševskih genov [13, 14]. Za razliko od ecircRNA in EIciRNA, ki vsebujejo 3’-5' fosfodiestersko vez, imajo ciRNA 2’-5' fosfodiestersko vez [14]. Sestavljene so iz intronov, ki imajo skupna zaporedja:

motiv sedmih nukleotidov, bogatih z gvanini in uracili, blizu 5’-spojitvenega mesta in motiv enajstih nukleotidov, bogatih s citozini, blizu 3’-spojitvenega mesta [13].

Eksonsko intronske krožne RNA so sestavljene iz intronov in eksonov. Ta kategorija ima značilnosti in funkcije tako eksonskih kot intronskih circRNA.

Vsebujejo komplementarna zaporedja v intronih kot ecircRNA in se nahajajo pretežno v jedru kot ciRNA [14].

1.2.2 Sinteza ecircRNA in EIciRNA

Študije so pokazale, da je sinteza circRNA odvisna od kanoničnih izrezovalno- povezovalnih kompleksov, saj inhibicija spajalnega telesca zmanjša raven tako circRNA kot linearnih prepisov [6, 14]. Na proces spajanja vplivajo številni cis- in trans-delujoči elementi, kot so dolžina eksonov, robni introni s ponavljajočimi se elementi (na primer Alu-elementi) ali z neponavljajočimi se komplementarnimi zaporedji, kanonična mesta spajanja, RNA-vezavni proteini (RBP).

Predlagani so trije modeli biogeneze circRNA, in sicer preko nastanka intermediata v obliki zanke, parjenja intronov in od RBP odvisna sinteza. Te modele lahko na splošno razdelimo na dva mehanizma: neposredno povratno spajanje in preskakovanje eksonov [6, 13]. Pri obeh mehanizmih do tvorbe krožne RNA pride, ko sta akceptor spoja, ki je bližje 5’-koncu, in donor spoja, ki je bližje 3’-koncu, dovolj blizu za tvorbo 5′-3′ fosfodiesterske vezi [15].

Pri cirkularizaciji preko zanke oziroma pri mehanizmu preskakovanja eksonov najprej pride do kanoničnega alternativnega spajanja, pri katerem navzdolnji ekson preskoči eksone in se poveže z zgornjim eksonom (slika 1). Pri tem nastane intermediat v obliki zanke, ki poleg introna vsebuje enega ali več eksonov. V tej strukturi se približata dva nesosednja eksona, kar povzroči kovalentno povezavo med spodnjim donorjem in zgornjim akceptorjem spoja ter nastanek ElciRNA ali ecircRNA preko odstranitve introna [13, 14] .

(22)

Slika 1: Model sinteze circRNA preko nastanka intermediata v obliki zanke. V prvem koraku poteče alternativno izrezovanje. Donor spoja na 3’-koncu eksona 1 se kovalentno poveže z akceptorjem spoja na 5’-koncu eksona 4 preko preskakovanja eksonov. Pri tem nastane intermediat v obliki zanke. Spajalno telesce nato izreže introne iz intermediata in oblikuje circRNA [9]. Slika je bila narejena s pomočjo BioRender.com.

Pri modelih parjenja intronov in od RBP odvisne sinteze najprej pride do povratnega spajanja. Dva robna introna, ki se nahajata okoli cirkularizirajočih se eksonov, se približata zaradi parjenja baz med obrnjenimi ponavljajočimi se zaporedji (kot so Alu-elementi), ali zaradi dimerizacije RBP (slika 2) [13]. Nato 2’- OH skupina razvejitvenega mesta napade 3'-spojitveno mesto in donor spoja napade 5'-spojitveno mesto. Tako nastane ElciRNA ali ecircRNA, če se na ciklično molekulo veže spajalno telesce in izreže eksone [6, 14].

(23)

Slika 2: Mehanizem neposrednega povratnega spajanja: model parjenja intronov in z RBP posredovane sinteze circRNA. Parjenje baz komplementarnih zaporedij ali dimerizacija RBP približajo navzdolnji donor spoja navzgornjemu akceptorju spoja. Nato poteče povratno spajanje in oblikuje se circRNA [6]. Slika je bila narejena s pomočjo BioRender.com.

RNA-vezavni proteini lahko delujejo kot aktivatorji ali inhibitorji sinteze circRNA.

Nekateri RBP zmanjšajo razdaljo med donorjem in akceptorjem spoja preko vezave na določene motive v robnih intronih in na ta način olajšajo nastanek circRNA. Taki proteini so QKI (angl. quaking), FUS (angl. RNA-binding protein FUS), MBNL1 (angl. muscleblind-like protein 1), NF90/NF110 (angl. nuclear factor 90/nuclear factor 110), HNRNPL (angl. heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L). Nasprotno ADAR1 (angl. double-stranded RNA-specific adenosine deaminase 1) preprečuje nastanek circRNA preko deaminacije adenina v inozin in posledične destabilizacije parjenja baz med ALU-elementi.

Podobno lahko tudi DHX9 (angl. ATP-dependent RNA helicase A), ki vsebuje

(24)

RNA-vezavno domeno in RNA-helikazno domeno, zmanjša sintezo circRNA preko vezave na Alu-elemente [4, 11, 16, 17].

Podobno kot pri sintezi linearnih RNA, za katero je značilno alternativno spajanje, lahko pri sintezi circRNA pride do alternativne cirkularizacije. Povezovanje različnih komplementarnih zaporedij lahko povzroči nastanek številnih prepisov circRNA iz enega gena. Ta proces pa je verjetno vrstno specifičen, saj se porazdelitev komplementarnih zaporedij med vrstami razlikuje [9, 13].

1.2.3 Funkcije krožnih RNA

Do danes je bilo odkritih na tisoče krožnih RNA, vendar so bile funkcije preučene le pri nekaterih [6].

Za številne circRNA so ugotovili, da lahko delujejo kot gobe, ki vežejo mikro RNA (miRNA) [6]. Mikro RNA so povprečno 22 nukleotidov dolge, evolucijsko ohranjene, enoverižne, nekodirajoče RNA molekule, ki se vežejo na tarčno mRNA in preprečujejo sintezo proteinov [18, 19]. Ugotovili so, da imajo circRNA številna vezavna mesta za miRNA, kar pomeni, da lahko posredno regulirajo translacijo mRNA. CircRNA vežejo miRNA, kar preprečuje njihovo interakcijo z mRNA in omogoči sintezo proteina [11]. Ena molekula circRNA lahko veže eno ali več različnih miRNA preko različnih miRNA vezavnih mest [15]. Krožna RNA CDR1as je, na primer, sestavljena iz enega eksona in vsebuje 63 vezavnih mest za miR-7. Z vezavo miR-7 CDR1as zmanjša aktivnost miRNA in s tem poveča izražanje njenih tarčnih genov, na primer SNCA (angl. alpha-synuclein) [20].

Poleg miRNA se lahko circRNA vežejo tudi na proteine. Določene circRNA lahko delujejo kot proteinske vabe, pri tem se vežejo na določene RBP in zavirajo njihovo biološko aktivnost [17]. Circ-Foxo3 lahko na primer v citoplazmi zadrži s senescenso povezane proteine ID1 in E2F1 in s stresom povezane proteine, na primer HIF1a (angl. hypoxia-inducible factor 1-alpha). S tem povzroči subcelično translokacijo teh proteinov, ki blokira njihovo delovanje in spodbuja senescenco [21]. Nekatere circRNA lahko interagirajo tudi z več proteini hkrati. Take circRNA lahko olajšajo sestavljanje velikih proteinskih kompleksov iz dveh ali več proteinov, kot je na primer kompleks encim-substrat [17]. Circ-Foxo3 lahko na primer tvori trojni kompleks z od ciklina odvisno kinazo CDK2 in njenim negativnim regulatorjem p21. Ta vezava preprečuje nastanek kompleksa ciklin E/CDK2 in posledično blokira prehod celic iz G1 v S-fazo. Poleg tega nastanek terciarnega kompleksa ojača interakcijo in inhibicijo CDK2 s p21. Posledično je napredovanje celičnega cikla zaustavljeno v fazi G1 in ne more preiti v fazo S [22].

Zaradi odsotnosti bistvenih elementov za od kape odvisno prevajanje, 5’-kape in poliA repa, circRNA veljajo za nekodirajoče RNA, vendar so se v zadnjem času pojavili dokazi, da se lahko tudi circRNA prevedejo v proteine [23]. Funkcionalni pomen večine peptidov, prevedenih iz circRNA, ostaja neznan. Peptidi,

(25)

prevedeni iz circRNA, so pogosto okrnjene različice kanoničnih proteinov brez bistvenih funkcionalnih domen, zato verjetno delujejo kot proteinske izooblike, vabe ali modulatorji proteinskih kompleksov [6, 17]. Nekatere študije kažejo, da je za prevajanje circRNA potrebno notranje mesto za vezavo ribosoma (IRES) [23]. Odprti bralni okvir z IRES naj bi vsebovale številne circRNA, vendar so le za nekaj circRNA, kot so circ-ZNF609, circMbl, circ-FBXW7, circPINTexon2 in circ- SHPRH pokazali, da se lahko res prevedejo v proteine [6]. Druge študije kažejo, da je za prevajanje dovolj prisotnost N6-metiladenozina (m6A) v 5’-neprevajajoči se regiji [24]. Abe in sodelavci pa so pokazali, da za prevajanje circRNA nista potrebna IRES in m6A. V tem primeru je mehanizem prevajanja podoben mehanizmu kotalečega se kroga [25].

EIciRNA in ciRNA, ki se nahajajo pretežno v jedru, lahko služijo kot regulatorji transkripcije starševskih genov [7]. Na primer circEIF3J in circPAIP2 se lahko preko RNA-RNA interakcij vežejo na mali jedrni ribonukleoprotein (snRNP) U1.

Nastali kompleks lahko interagira s polimerazo II na promotorjih starševskih genov za povečanje izražanja teh genov [26].

Tudi ecircRNA lahko vplivajo na transkripcijo, poleg tega pa na alternativno izrezovanje in translacijo. CircMbl nastane iz drugega eksona izrezovalnega faktorja MBNL1 (angl. muscleblind-like protein 1). Robni introni circMbl imajo veliko vezavnih mest za MBNL1. Vezava MBNL1 na ta mesta spodbuja nastanek zanke in sintezo circMbl. Posledično obstaja avtoregulacija, pri kateri presežek MBNL1 zmanjša nastajanje lastne mRNA s spodbujanjem biogeneze circRNA, circRNA pa deluje kot goba in z vezavo izloči odvečni MBNL1 [27].

V človeških fibroblastih 34 % krožnih RNA z enim eksonom vsebuje začetno mesto prevajanja. To nakazuje, da lahko circRNA onemogočijo prevajanje zaradi pomanjkanja začetnega mesta v mRNA. Na tak način ecircRNA igrajo ključno vlogo pri uravnavanju izražanja proteinov [28]. Primer je circRNA, ki se sintetizira iz gena za mišji formin-1, in vsebuje začetno mesto prevajanja. Linearni transkript v tem primeru ostane brez začetnega mesta prevajanja in izražanje formina-1 se zmanjša [9].

1.2.4 CircRNA in HCC

Zaradi stabilnega povišanega izražanja circRNA in njihove prisotnosti v velikih količinah v človeških telesnih tekočinah, kot so plazma, slina in eksosomi, so circRNA idealni biološki označevalci pri raku [14]. Dokazano je, da je uravnavanje izražanja številnih circRNA pri raku spremenjeno, a je zelo malo znanega o mehanizmih, preko katerih circRNA vplivajo na patogenezo in napredovanje raka [17]. CircRNA lahko vplivajo na napredovanje HCC z modulacijo proliferacije, apoptoze, migracije in invazije preko vezave na miRNA ali na proteine, ključne za razvoj raka [5]. Več študij je pokazalo, da lahko circRNA vplivajo na razvoj raka preko regulacije tarčnih genov in številnih signalnih poti [17]. Poleg tega

(26)

imajo circRNA potencial za prevajanje v proteine ali peptide, ki sodelujejo pri razvoju raka [4].

Krožna RNA hsa_circ_0005075 ima, na primer, vezavna mesta za štiri miRNA, hsa-miR-23b-5p, hsa-miR-93-3p, hsa-miR-581 in hsa-miR-23a-5p, njeno izražanje pa je v korelaciji z velikostjo tumorja. To nakazuje, da lahko hsa_circ_0005075 spodbuja rast tumorja. Poleg tega so z analizo metabolnih poti in genske ontologije ugotovili, da je hsa_circ_0005075 povezana s celično adhezijo, ki močno vpliva na celično proliferacijo, invazijo in metastaziranje. Na podlagi teh ugotovitev lahko hsa_circ_0005075 označimo kot nov biološki označevalec za HCC [29].

Krožna RNA cSMARCA5 (hsa_circ_0001445) ima prav tako vezavna mesta za miRNA, vendar za razliko od hsa_circ_0005075 deluje kot zaviralec rasti tumorja.

Ta krožna RNA se veže na miR-17-3p in miR-181b-5p ter s tem preprečuje njihovo vezavo na druge zaviralce tumorja. Na tak način cSMARCA5 zavira proliferacijo in migracijo celic HCC. Poleg tega se lahko cSMARCA5 uporablja kot biološki označevalec, saj je njeno izražanje pri HCC zmanjšano [30].

Krožna RNA circZKSCAN1 (hsa_circ_0001727) je v velikem številu prisotna v možganih in jetrih. Njeno izražanje pa je zmanjšano pri HCC in je v korelaciji s številom tumorjev, cirozo, vaskularno invazijo in tipom tumorjev. Prekomerno izražanje circZKSCAN1 inhibira proliferacijo, migracijo in invazijo celic HCC tako in vitro kot in vivo. Najverjetneje circZKSCAN1 deluje preko vezave miRNA.

Analiza metabolnih poti KEGG (angl. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) je pokazala, da je circZKSCAN1 povezana s fosfatidilinozitol 3- kinazno potjo, migracijo, aktinskim citoskeletom, adhezijo in citokinsko interakcijo. Tako je circZKSCAN1 še ena krožna RNA, ki lahko služi kot biološki označevalec HCC [31].

Krožna RNA circβ-katenin kodira 370 aminokislinskih ostankov dolgo izoformo β- katenina (β-katenin-370aa), ki lahko z aktiviranjem signalne poti Wnt vpliva na napredovanje HCC. Izoforma β-katenin-370aa kompetitivno interagira z GSK3β (angl. glycogen synthase kinase-3 beta), s tem preprečuje, da bi se GSK3β vezal na β-katenin in posledično onemogoči fosforilacijo in razgradnjo β-katenina, ki jo povzroča GSK3β [32].

RNA-vezavni proteini

RNA-vezavni proteini so proteini, ki se v celicah vežejo na dvoverižno ali enoverižno RNA in sodelujejo pri tvorbi ribonukleoproteinskih (RNP) kompleksov.

Interakcije RBP z RNA segajo od interakcij enega proteina z eno molekulo RNA do sestavljanja več RBP in molekul RNA v komplekse, kot je spajalno telesce.

RBP so vključeni v različne pomembne celične procese, celični transport, lokalizacijo, razvoj, diferenciacijo in metabolizem ter igrajo ključno vlogo pri vzdrževanju homeostaze izražanja genov [33, 34].

(27)

Konvencionalni RBP prepoznajo značilno zaporedje ali strukturni motiv RNA in se nanj vežejo z RNA-vezavno domeno, kot sta RNA-prepoznavni motiv (RRM) in K homologna (KH) domena [35]. RRM so dolgi približno 80 aminokislinskih ostankov in zviti v kompaktno globularno domeno, ki vsebuje antiparalelno b- ploskev iz štirih b-trakov in dve a-vijačnici [36]. KH domene so dolge približno 70 aminokislinskih ostankov in sestavljene iz treh a-vijačnic in treh b-trakov, ki so pri evkariontskih proteinih običajno organizirane v antiparalelno b-ploskev [37].

Nekateri RBP vsebujejo hkrati več RNA-vezavnih domen, kar dodatno poveča afiniteto RBP za RNA in specifičnost vezave. Poleg RNA-vezavnih domen številni RBP vsebujejo tudi domene, ki omogočajo interakcije z drugimi proteini in sestavljanje velikih RNP kompleksov [38].

Preko vezave na RNA RBP vplivajo na skoraj vse korake posttranskripcijske regulacije, uravnavajo alternativno izrezovanje RNA, poliadenilacijo, stabilnost in razgradnjo RNA, lokalizacijo oziroma transport RNA iz jedra ter prevajanje [39].

Poleg tega RBP uravnavajo izražanje različnih onkogenov in zato domnevajo, da predstavljajo možne terapevtske tarče za različne rake. Mehanizmi, s katerimi RBP vplivajo na tumorogenezo, še niso popolnoma razjasnjeni [40].

1.3.1 NONO

Protein NONO (angl. non-POU domain-containing octamer-binding protein) je DNA- in RNA-vezavni protein, ki sodeluje v številnih celičnih procesih. Je jedrni protein z maso 54,232 kDa in dolžino 471 aminokislinskih ostankov. Izraža se v srcu, možganih, placenti, pljučih, jetrih, skeletnih mišicah, ledvicah in pankreasu [41].

Skupaj s paralogi SFPQ (angl. splicing factor, proline- and glutamine-rich) in PSPC1 (angl. paraspeckle component 1) NONO spada v družino DBHS (angl.

Drosophila behavior human splicing). Ti proteini imajo dve domeni RRM in na več načinov uravnavajo izražanje genov, vplivajo na aktivacijo in inhibicijo, prepisovanje, alternativno izrezovanje, stabilizacijo in transport RNA. Proteini NONO, SFPQ in PSPC1 so skupaj z drugimi faktorji spajanja pre-mRNA, transkripcijskimi faktorji in s heterogenimi jedrnimi ribonukleoproteini sestavni deli parapeg, znotrajjedrnih telesc, sestavljenih na dolgi nekodirajoči RNA Neat1 [42].

Izražanje NONO je spremenjeno pri številnih rakih, med drugim je povečano tudi pri HCC [43]. Visoka raven izražanja NONO je močno povezana s slabim preživetjem, kar nakazuje, da ima NONO pomembno vlogo pri razvoju HCC.

Študije so pokazale, da NONO interagira in s tem stabilizira hipoksija inducibilne faktorje HIF-1 in HIF-2, kar povzroči aktivacijo prepisovanja tarčnih genov HIF-1 in HIF-2. Poleg tega se NONO veže na pre-mRNA in mRNA, ki se prepiše iz teh genov, in pri tem sodeluje pri izrezovanju oziroma stabilizaciji zrele mRNA.

Posledično imajo rakave celice boljšo prilagodljivost in sposobnost preživetja v

(28)

Protein NONO spodbuja karcinogenezo pri raku jeter tudi preko spremembe spajanja mRNA proteina BIN1 (angl. bridging intagrator 1). V normalnih celicah se sintetizira krajša izoforma proteina BIN1, povečano izražanje NONO pa povzroči spremembo v spajanju in nastanek daljše izoforme BIN1, ki vsebuje ekson 12a in deluje kot onkogen preko vezave in stabilizacije PLK1 (angl. polo- like kinase 1) [45].

Poleg tega NONO spodbuja razvoj HCC preko zvišanja sinteze maščobnih kislin.

Protein NONO veže in stabilizira mRNA ATP-citrat sintaze. Povečano izražanje encima pa spodbuja sintezo maščobnih kislin, ki ima ključno patogeno vlogo pri razvoju številnih vrst raka [46].

1.3.2 PCBP2

Protein družine policitozin-vezavnih proteinov PCBP2 (angl. poly(rC)-binding protein 2) je DNA- in RNA-vezavni protein, ki se najpogosteje veže na s citozini bogate regije enoverižnih nukleinskih kislin. Nahaja se večinoma v jedru celic.

Protein PCBP2 sodeluje pri alternativnem izrezovanju in drugih procesih metabolizma RNA, regulaciji izražanja genov, odzivu na virusne okužbe in s proteasomi posredovanem katabolizmu proteinov. Dolg je 365 aminokislinskih ostankov, njegova masa pa je 38,580 kDa. Protein vsebuje tri KH domene, ki sodelujejo pri prepoznavi in vezavi na s citozini bogate regije [47].

Izražanje PCBP2 je povečano pri različnih vrstah raka in tudi pri HCC. Njegovo povečano izražanje pa je močno povezano s slabo prognozo in spodbuja celično proliferacijo [48]. Protein PCBP2 neposredno interagira s proteinom YAP (angl.

YES-associated protein) preko vezave domene WW, ki je prisotna na YAP, in WW-vezavne domene, ki jo ima PCBP2 med KH2 in KH3 domenama. WW- vezavna domena je odgovorna za regulacijo ubikvitinacije tarčnih proteinov z domeno WW. Zato povezava YAP in PCBP2 povzroči inhibicijo onkogene aktivnosti proteina YAP preko njegove ubikvitinacije in posledične razgradnje.

Posredno PCBP2 interagira tudi s TFCP2 (angl. transcription factor CP2), kofaktorjem YAP, ki spodbuja od YAP-odvisno malignost. Vezava PCBP2 na TFCP2 povzroči ubikvitinacijo in razgradnjo slednjega [49].

(29)

2 Namen dela in hipoteze

Izražanje številnih circRNA je spremenjeno pri različnih vrstah raka, tudi pri HCC.

Čeprav je mehanizem sinteze krožnih RNA dobro opisan, je zelo malo znanega o regulaciji tega procesa. Eden od načinov sinteze circRNA je z RBP posredovana sinteza. Da bi določili regulatorje izražanja circRNA pri HCC, so s pomočjo bioinformatskih metod analizirali zaporedja circRNA, izražanje katerih je povečano pri HCC, in našli obogatene RBP-vezavne motive v bližini mest spajanja. Tako so določili proteine, ki bi potencialno lahko vplivali na sintezo krožnih RNA pri HCC. In vitro vezavo nekaterih proteinov (NONO, PCBP1, PCBP2 in hnRNPK) so potrdili tudi s pomočjo podatkovne zbirke ENCODE [50].

Namen diplomske naloge je bil preveriti rezultate in silico analiz v in vitro poizkusu in preučiti vlogo proteinov NONO in PCBP2 pri uravnavanju izražanja izbranih circRNA, ki imajo spremenjeno izražanje v tumorjih raka jeter. Naša hipoteza je bila, da proteina NONO in PCBP2 vplivata na izražanje circRNA.

(30)
(31)

3 Materiali in metode

Kemikalije

Seznam kemikalij, uporabljenih pri eksperimentalnem delu, je prikazan v tabeli 1.

Tabela 1: Seznam uporabljenih kemikalij in standardov.

Kemikalija Proizvajalec

10 mM dNTP Thermo Fisher Scientific

AccuStain Solution N NanoEnTek

AccuStain Solution T NanoEnTek

Agaroza Sigma-Aldrich

Akrilamid/bisakrilamid Amresco

APS Merck

DMEM Sigma-Aldrich

DMSO Sigma-Aldrich

DTT Thermo Fisher Scientific

EDTA Sigma-Aldrich

Etanol Kefo

Etidijev Bromid (5 mg/mL) Sigma-Aldrich

Fetusni serum goveda Sigma-Aldrich

GenJetTM In Vitro DNA Transfection Reagent Sigma-Aldrich

Glicin Merck

Glikogen (5 mg/mL) Ambion

Goveji serumski albumin Sigma-Aldrich

HEPES Sigma-Aldrich

Immobilon Classico Western HRP substrate Millipore Inhibitorji proteaz cOmplete ULTRA Roche

Izopropanol Sigma-Aldrich

KCl Merck

Kloroform Carlo Erba Reagents

Komplet reagentov Pierce™ BCA Protein Assay Kit

Thermo Fisher Scientific

Metanol Honeywell

NaCl Merck

NaDS Sigma-Aldrich

Naklučni začetni nukleotidi Promega

Nonidet-40 Sigma-Aldrich

(32)

Kemikalija Proizvajalec Penicilin-streptomicin (10.000 U/mL penicilina in

10 mg/mL streptomicina)

Sigma-Aldrich

Posneto mleko v prahu Pomurske mlekarne

RNaseZAP Thermo Fisher Scientific

SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate

Thermo Fisher Scientific

SYBR Green I Master Sigma-Aldrich

TEMED Sigma-Aldrich

TRI reagent Sigma-Aldrich

Tripsin-EDTA (0.5 g/L prašičjega tripsina in 0.2 g/L EDTA•4Na)

Sigma-Aldrich

Tween20 Sigma-Aldrich

Velikostni standard PageRuler Prestained

Protein Ladder, od 10 do 180 kDa Thermo Fisher Scientific Velikostni standard GeneRuler 100 bp DNA

Ladder

Thermo Fisher Scientific

Voda za injekcije B. Braun

Pufri

Pri delu smo uporabljali pufre, navedene v tabeli 2.

Tabela 2: Seznam uporabljenih pufrov.

Pufer Sestava/proizvajalec

1-kratni elektroforezni pufer 25 mM Tris, 190 mM glicin, 0.1% NaDS 1-kratni TBE 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM borova

kislina, 2 mM EDTA 1,0 M Tris-HCl (pH 6,8) 1,0 M Tris, pH = 6,8 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 1,5 M Tris, pH = 8,8 10-kratni DNazni pufer Thermo Fisher Scientific

10-kratni TBS 200 mM Tris, 1500 mM NaCl, pH = 7,6 4-kratni nanašalni pufer Laemmli 2,8 mM NaDS, 200 mM Tris-HCl (pH 6,8),

40 % glicerol, 588 mM β-merkaptoetanol, 50 mM EDTA, 0,012 mM bromfenol modro 5-kratni RT pufer Thermo Fisher Scientific

6-kratni nanašalni pufer za AGE Thermo Fisher Scientific

HEPES 1 M HEPES, pH = 7,5

Lizni pufer 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 0,1

mM EDTA, 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,5 % Nonidet-40

(33)

Pufer Sestava/proizvajalec

PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM

Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4 Pufer za izolacijo jedrne frakcije 20 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 1

mM EDTA, 1 mM DTT Pufer za odstranjevanje protiteles

(pH 2,2) 200 mM glicin, 3,5 mM NaDS, 1% Tween

20

Pufer za prenos Western 25 mM Tris, 190 mM glicin, 20% metanol

TBST 100 mL 10-kratnega TBS, 900 mL dH2O,

1 mL Tween 20 Encimi

Uporabljeni encimi so navedeni v tabeli 3.

Tabela 3: Seznam uporabljenih encimov.

Encim Proizvajalec

DNaza I (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific RT Maxima (200 U/µL) Thermo Fisher Scientific

Protitelesa

Protitelesa, uporabljena pri prenosu western in imunodetekciji, so navedena v tabeli 4.

Tabela 4: Seznam uporabljenih protiteles.

Protitelo Proizvajalec

Primarna

Zajčje protitelo (IgG) proti V5-oznaki Sigma-Aldrich Mišje protitelo (IgG) proti FLAG-oznaki Sigma-Aldrich Mišje protitelo (IgG) proti GAPDH Abcam

Mišje protitelo (IgG) proti lamin A/C Santa Cruz Sekundarna

Kozje protitelo proti mišjim IgG konjugirano s HRP

Santa Cruz Kozje protitelo proti zajčjim IgG konjugirano s

HRP

Santa Cruz

Laboratorijska oprema

Pri delu smo uporabljali naprave, navedene v tabeli 5, in pripomočke, navedene v tabeli 6.

(34)

Tabela 5: Seznam uporabljenih naprav.

Naprava Proizvajalec

2100 Bioanalyzer Instrument Agilent

Aspirator Millipore

Brezprašna komora Iskra PIO

Centrifuga Eppendorf

Centrifuga Tehtnica

Inkubator MCO-19AIC Sanyo

Magnetno mešalo IKA

Mikroskop InCellis Bertin Instruments

Namizna centrifuga FastGene® Mini Centrifuge Nippon genetics Europe Naprava za PCR SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Naprava za qPCR LightCycler® 480 Roche

Naprava za slikanje agaroznega gela Uvidok Uvitec

Naprava za slikanje membran LAS 4000 Fujifilm Life Science USA Naprava za štetje celic ADAM-MC™ Digital Bio

pH-meter Eutech

PowerPac™ Basic Bio-Rad

Spektrofotometer Epoch Biotek

Spektrofotometer NanoDrop™ One/OneC Thermo Fisher Scientific

Stresalnik Stuart SSL3 Stuart

Svetlobni mikroskop CKX41 Olympus

Tehtnica KERN & SOHN GmbH

Termoblok ThermoMixer C Eppendorf

Vibracijski mešalnik MS 3 digital IKA

Vodna kopel Memmert

(35)

Tabela 6: Seznam uporabljenih pripomočkov.

Pripomoček Proizvajalec

Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent

Centrifugirke – 15 mL in 50 mL TPP

Čip za štetje celic AccuChip NanoEnTek

Elektroforezne kadičke Bio-Rad

Gojitvene posodice – 25 cm2 in 75 cm2 TPP

Krioviale TPP

Membrana PVDF Millipore

Mikrocentrifugirke – 1,5 mL Eppendorf

Mikrotitrske plošče – s 96 in 384 vdolbinicami 4titude

Nastavki za pipete Eppendorf

Nastavki za pipete s filtri Starlab

Optična folija 4titude

Parafilm Bemis

Pipete Starlab

Plošča s 6 vdolbinicami Eppendorf

Serološke pipete Sarstedt

Škatla z izopropanolom Mr. Frosty™ Freezing Container

Thermo Fisher Scientific

Strgala TPP

Stripi za PCR 4titude

Sesalske celične linije

Pri izvedbi diplomske naloge smo uporabljali sesalsko celično linijo Huh-7. Huh- 7 je humana hepatocelularna celična linija, vzpostavljena leta 1982. Pripravljena je bila iz dobro diferenciranih epitelijskih tumorskih celic, ki so jih izolirali iz jetrnega tumorja 57-letnega Japonca [51, 52]. Celice Huh-7 se pogosto uporablja za preučevanje hepatocelularnega karcinoma in virusa hepatitisa C [53].

(36)

Vektorji

Za prekomerno izražanje proteina NONO smo celice Huh-7 transficirali z ekspresijskim vektorjem FLAG-p54 (neprofitni repozitorij Addgene) (slika 3).

Slika 3: Vektorska karta FLAG-p54. Vektorska karta je bila narejena s pomočjo programa SnapGene.

Kot negativno kontrolo smo uporabili vektor brez zapisa za NONO pControl (Center za funkcijsko genomiko in biočipe, IBKMG, UL MF) (slika 4). Vektor je bil pripravljen iz vektorja FLAG-p54 z restrikcijo z XbaI in HindIII ter s sledečo vstavitvijo kasete, zaporedja nukleotidov, ki omogoča ligacijo vektorja (tabela 7).

(37)

Slika 4: Vektorska karta pControl. Vektorska karta je bila narejena s pomočjo programa SnapGene.

Tabela 7: Zaporedje kasete za pripravo pControl.

Smerno

zaporedje AGCTTGGCGGTTCCGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCTCT Protismerno

zaporedje CTAGAGAGCCTCCGCTACCGCCTCCACCGGAACCGCCA

(38)

Za prekomerno izražanje proteina PCBP2 smo celice transficirali z ekspresijskim vektrorjem pT7-V5-SBP-C1-PCBP2 (Center za funkcijsko genomiko in biočipe, IBKMG, UL MF), ki je bil pripravljen iz vektorja pT7-V5-SBP-C1-HshnRNPK (neprofitni repozitorij Addgene) z restrikcijo z XhoI in EcoRI ter sledečo ligacijo zapisa za izoformo 5 proteina PCBP2 (slika 5).

Slika 5: Vektorska karta pT7-V5-SBP-C1-PCBP2. Vektorska karta je bila narejena s pomočjo programa SnapGene.

Kontrolne vzorce smo v tem primeru transficirali z vektorjem brez zapisa za PCBP2 pT7-V5-SBP-C1 (Center za funkcijsko genomiko in biočipe, IBKMG, UL MF) (slika 6). Vektor je bil pripravljen iz vektorja pT7-V5-SBP-C1-HshnRNPK z restrikcijo z XhoI in EcoRI ter s sledečo ligacijo kasete (tabela 8).

(39)

Slika 6: Vektorska karta pT7-V5-SBP-C1. Vektorska karta je bila narejena s pomočjo programa SnapGene.

Tabela 8: Zaporedje kasete za pripravo pT7-V5-SBP-C1.

Smerno zaporedje

TCGAGGGCGGTTCCGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCTCG Protismerno

zaporedje

AATTCGAGCCTCCGCTACCGCCTCCACCGGAACCGCCC

Za oceno uspešnosti transfekcije smo celice transficirali z vektorjema z zapisom za izboljšani zeleni fliorescenčni protein (eGFP), pcDNA3-eGFP (Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino) (slika 7) ali pLenti-CMV-MCS- GFP-SV-puro (neprofitni repozitorij Addgene) (slika 8).

(40)

Slika 7: Vektorska karta pcDNA3-eGFP. Vektorska karta je bila narejena s pomočjo programa SnapGene.

(41)

Slika 8: Vektorska karta pLenti-CMV-MCS-GFP-SV-puro. Vektorska karta je bila narejena s pomočjo programa SnapGene.

(42)

Začetni oligonukleotidi

Zaporedja uporabljenih začetnih oligonukleotidov so navedena v tabeli 9.

Tabela 9: Zaporedja uporabljenih začetnih oligonukleotidov.

circRNA Zaporedje smernega začetnega oligonukleotida

Zaporedje protismernega začetnega oligonukleotida hsa_circ_0008016 TATGCTTGCGTAACCAGCAGC CCAGGGCTGGGCTGAAACAT hsa_circ_0008274

prvi par

AAAAGCTGCTGCCAGAATTGTC AGAGACTTAATGGCGACTTGGT

hsa_circ_0008274 drugi par

AAAGCTGCTGCCAGAATTGTC TCACACCACAGCCAGTCTTG

hsa_circ_0040921 ATGACCGCATGAAGATCGCA GCTCGATGCTGTGCTGTAGA hsa_circ_0014879 CCAGCGTCTCCTTCAGTGAATC TTTGCTGTAGCCAGCCTTTCC hsa_circ_0062682 GTCCTCCACCATGAAGACCTC CTTCAGCGACAGGTTAGCG hsa_circ_0001955 TGGTGCATCTGCAATAACTCG ATTTCCCACATGGTCCAAAGT hsa_circ_0048492 CACTCAGGCACCGTCTGC CAGGGGCTGAAGATGAAGGG hsa_circ_0001917 TCTCTGAAAGTGCCAAAGACCT GCCGAGTTTTCTTTTGAGGC hsa_circ_0028196 CAGTGCCCATTAGCCCTTGA TGCATGATACACCAAAAGCTGG hsa_circ_0062022 CGGGGTCAACACGTTCTTTG CACGGGCACCTGCTTCTC Gen Zaporedje smernega

začetnega oligonukleotida

Zaporedje protismernega začetnega oligonukleotida ACTB CCAACCGCGAGAAGATGA CCAGAGGCGTACAGGGATAG RPLP0 TGCATCAGTACCCCATTCTATCA AAGGTGTAATCCGTCTCCACAAGA NONO GGCAGGCGAAGTCTTCATTCA TGGCAATCTCCGCTAGGGT PCBP2 CTTTGGCTGGACCCACTAATG CCCTGTACTCTCTCGTATTTCCT

Delo s sesalskimi celicami

Delo s celicami je potekalo v celičnem laboratoriju. Vse poskuse smo izvajali aseptično v brezprašni komori.

3.9.1 Gojenje celic

Celice smo gojili v inkubatorju pri stalni temperaturi 37 °C, atmosferi s 5 % CO2

in 100 % zračni vlažnosti. Za gojenje celic smo uporabljali plastične gojitvene posodice dveh velikosti T25 in T75. Gojitvena površina posodic je bila premazana s polimerom, ki omogoča boljšo adhezijo celic.

Za gojenje celic smo uporabljali kompletno gojišče. Pripravili smo ga iz osnovnega gojišča DMEM z visoko vsebnostjo glukoze (angl. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose) z dodatkom 10 % (v/v) fetusnega seruma goveda (FBS) in 1 % (v/v) antibiotika penicilin-streptomicin. Kompletno gojišče omogoča optimalno rast sesalskih celic, saj vsebuje rastne faktorje,

(43)

vitamine in potrebna hranila. Dodan antibiotik pa preprečuje rast bakterij in gliv v primeru kontaminacije.

Celice smo vzdrževali v nizkih pasažah. Po odmrzovanju smo jih presadili največ desetkrat in jih nato zavrgli. Celice smo presadili in redčili (precepili), ko so le-te dosegle 90 % konfluentnost. Da bi jim zagotovili zadostne koncentracije vseh potrebnih snovi, smo gojišče menjali na 2-3 dni, če je bila konfluentnost prenizka za precepljanje. Vsa gojišča smo pred uporabo na celicah segreli v vodni kopeli na 37 °C.

3.9.2 Odmrzovanje celic

Kadar nismo izvajali poskusov, so bile celice zamrznjene in shranjene na - 80 °C.

Za gojenje celic smo jih morali najprej odmrzniti.

Krioviale z zamrznjenimi celicami, ki so bile shranjene na - 80 °C, smo najprej prenesli v vodno kopel. Celice smo delno odmrznili, tako da je sredica ostala zaledenela. Vsebino kriovial smo nato prenesli v 5 mL osnovnega gojišča DMEM in nastalo suspenzijo centrifugirali 5 min pri 700 vrt/min. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant, usedlino resuspendirali v 5 mL kompletnega gojišča in suspenzijo prenesli v gojitvene posodice T25. Celice smo nato prenesli v inkubator in inkubirali pri 37 °C.

3.9.3 Subkultivacija celic

Kompletno gojišče in tripsin-EDTA smo v vodni kopeli segreli na 37 °C. Iz gojitvenih posodic s celicami smo z aspiracijsko pipeto odsesali gojišče in celice sprali z enakim volumnom fosfatnega pufra z NaCl (PBS), kot je bilo prej gojišča.

Po odstranitvi PBS smo na celice dodali ustrezen volumen tripsin-EDTA in celice 5 min inkubirali na sobni temperaturi. Dodatek tripsina je povzročil, da so se celice odlepile od površine gojitvene posodice. Stanje celic smo po 5 min preverili z mikroskopom. Če inkubacija na sobni temperaturi ni bila učinkovita in se celice niso odlepile, smo posodice prestavili v inkubator na 37 °C. Celotni čas inkubacije v tripsinu ni smel biti daljši od 10 min. Po koncu inkubacije smo dodali 3-kratni volumen kompletnega gojišča, kar je inaktiviralo tripsin. Celice smo s kompletnim gojiščem sprali s podlagi, celično suspenzijo prenesli v centrifugirko in centrifugirali 5 min pri 700 vrt/min. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant in usedlino resuspendirali v potrebnem volumnu kompletnega gojišča.

Suspenzijo smo prenesli v nove gojitvene posodice in dodali ustrezen volumen kompletnega gojišča.

3.9.4 Zamrzovanje celic

Najprej smo pripravili medij za zamrzovanje, tako da smo zmešali FBS in dimetilsulfoksid (DMSO) v razmerju 9:1. Celično suspenzijo, pripravljeno po protokolu za subkultivacijo celic (poglavje 3.9.4), smo centrifugirali 5 min pri 700 vrt/min, supernatant odstranili in usedlino resuspendirali v ustreznem volumnu

(44)

medija za zamrzovanje. Po 1 mL homogene suspenzije smo prenesli v krioviale, jih postavili v škatlo Mr. Frosty, napolnjeno z izopropanolom, in nato škatlo hitro prenesli na - 80 °C.

DMSO je krioprotektant, ki pri zamrzovanju preprečuje nastanek kristalov, ki bi lahko poškodovali membrane celic. Spojina je pri sobni temperaturi citotoksična, zato moramo po dodatku DMSO celice čimprej prenesti v krioviale in jih zamrzniti.

3.9.5 Štetje celic

Pri določenih poskusih je bistvenega pomena preraščenost posodice za gojenje, zato je potrebno pred začetkom poskusa nasaditi točno določeno število celic.

Določena konfluentnost celic je ključna za uspešno izvedbo transfekcije, zato smo morali pred nasaditvijo celic za nadaljnjo transfekcijo določiti njihovo število.

Za štetje celic smo uporabili napravo ADAM-MC™.

ADAM-MC™ je avtomatski števec, ki poleg štetja celic omogoča tudi določanje viabilnosti le-teh. Delovanje naprave temelji na fluorescentni mikroskopiji. Celice pred štetjem obarvamo s fluorescentnim barvilom, propidijevim jodidom (PI). PI je interkalator, veže se na DNA in obarva jedra tarčnih celic. Barvilo lahko vstopi le v celice s poškodovanimi membranami ali z neaktivnim metabolizmom, posledično lahko obarva le jedra neviabilnih celic.

Za barvanje celic smo uporabili dve raztopini. AccuStain Solution T se uporablja za štetje vseh celic, saj poleg barvila PI vsebuje lizno raztopino, ki povzroči lizo viabilnih celic in omogoči njihovo obarvanje. AccuStain Solution N pa se uporablja za štetje neviabilnih celic. Vsebuje barvilo PI in PBS in obarva samo neviabilne celice [54].

Iz gojitvenih posodic s celicami smo najprej odstranili gojišče, celice sprali z enakim volumnom PBS in dodali 2 mL tripsin-EDTA. Po inkubaciji s tripsinom smo encim inaktivirali z dodatkom 3-kratnega volumna kompletnega gojišča in celice sprali s podlage. Suspenzijo smo prenesli v centrifugirko in dobro premešali z vibracijskim mešalnikom. Po 25 µL homogene suspenzije smo prenesli v dve mikrocentrifugirki. V eno mikrocentrifugirko smo suspenziji dodali 25 µL AccuStain Solution T, v drugo pa 25 µL AccuStain Solution N. Mešanici smo premešali z nastavkom pipete in nanesli dvakrat po 12,5 µL vsake mešanice v ustrezne luknjice na čip za štetje celic AccuChip. Čip smo vstavili v napravo ADAM-MC™, ki je preštela obarvane celice in izpisala podatke o številu vseh celic, številu neviabilnih celic, razliko med temi števili in izračunan odstotek viabilnosti celic v vzorcu.

Transfekcija celic

Transfekcija je način vnosa tujega genskega materiala v evkariontske celice, pri čemer se spremenijo njihove lastnosti. Za vnos genskega zapisa za preučevana

(45)

proteina smo uporabili ekspresijska vektorja. Kot negativno kontrolo smo uporabili vektorje brez zapisov za izbrane proteine.

Pri pripravi diplomske naloge smo celice prehodno transficirali. Pri prehodni transfekciji tuji genski material ne vstopa v genom. Pri celični liniji Huh-7 ne pride do pomnoževanja vnešenih vektorjev in se zato med delitvijo celic vektorji ne prenašajo iz generacije v generacijo. Vnesena nukleinska kislina se med delitvijo zato redči in vsaka hčerinska celica prejme manj genskega materiala.

Transfekcijo smo izvajali z uporabo reagenta GenJet™ In Vitro DNA Transfection Reagent (Ver. II). Delovanje reagenta temelji na tehnologiji biorazgradljivih polimerov kovalentno povezanih s kationskimi lipidi. Reagent tvori kompleks s plazmidno DNA, ki vstopi v celice z endocitozo. Po vstopu kompleks razpade, kationski polimer se razgradi v citoplazmi, plazmid pa vstopi v jedro (slika 9).

Slika 9: Grafični prikaz delovanja reagenta GenJet™ In Vitro DNA Transfection Reagent (Ver. II) [55].

Transfekcijo smo izvajali v triplikatih po protokolu optimiziranem za celice Huh-7.

Celice smo 24 ur pred transfekcijo nasadili na gojitveno ploščo s šestimi vdolbinicami. V vsako vdolbinico smo nasadili 500.000 celic, da je bila konfluentnost celic naslednji dan približno 90 %. Eno uro pred transfekcijo smo celicam zamenjali gojišče. Z asperacijsko pipeto smo odsesali staro gojišče in v vsako vdolbinico dodali 1 mL svežega kompletnega gojišča. Za vsako vdolbinico z nacepljenimi celicami smo razredčili 2 µg plazmidne DNA v 100 µL osnovnega gojišča DMEM in dobro premešali z nastavkom za pipete. Nato smo posebej za vsako vdolbinico razredčili 6 µL GenJetTM reagenta v 100 µL osnovnega gojišča in prav tako dobro premešali z nastavkom. Takoj po mešanju smo celoten

(46)

volumen razredčenega reagenta prenesli v mikrocentrifugirko z razredčeno plazmidno DNA. Mešanico smo premešali s pipeto in 15 min inkubirali na sobni temperaturi. Za redčenje DNA in reagenta smo uporabili osnovno gojišče DMEM, saj omogoča tvorbo kompleksov optimalne velikosti. Po inkubaciji smo na celice v vsako vdolbinico počasi po kapljicah ob istočasnem mešanju odpipetirali po 200 µL mešanice. Po dodatku mešanice smo plošče še enkrat dobro premešali in jih prenesli v inkubator na 37 °C. Po 5-urni inkubaciji smo odstranili gojišče, ki je vsebovalo komplekse, in v vsako vdolbinico dodali 3 mL kompletnega gojišča.

48 ur po transfekciji smo celice iz gojitvene plošče s 6 vdolbinicami presadili v gojitvene posodice T25.

Ocena učinkovitosti transfekcije

Učinkovitost transfekcije smo ocenili s fluorescentno mikroskopijo. S pomočjo mikroskopa InCellis smo spremljali zeleno fluorescenco v celicah, ki so bile transficirane z vektorji z zapisom za eGFP, pcDNA3-eGFP ali pLenti-CMV-MCS- GFP-SV-puro. Kot negativno kontrolo smo uporabili celice, ki so bile transficirane z drugimi vektorji. Učinkovitost transfekcije smo določali 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Za boljšo vizualizacijo smo za čas merjenja s celic odstranili kompletno gojišče in jim dodali enak volumen PBS, saj vsebuje kompletno gojišče barvni pH-indikator, ki zmanjša kontrastnost slike. Učinkovitost transfekcije je enaka ocenjenemu deležu fluorescirajočih celic. Predpostavili smo, da je bila učinkovitost transfekcije z vektorji pLenti-CMV-MCS-GFP-SV- puro ali pcDNA3-eGFP enaka učinkovitosti transfekcije z drugimi vektorji, saj so bili pogoji transfekcije in inkubacije vseh celic enake.

Delo s proteini 3.12.1 Izolacija proteinov

Izolacijo proteinov smo izvedli 72 ur po transfekciji. Pred začetkom protokola smo pripravili pufersko raztopino HEPES s pH 7,5, lizni pufer in pufer za izolacijo jedrne frakcije. Pred začetkom izolacije proteinov smo v 10 mL liznega pufra in 10 mL pufra za izolacijo jedrne frakcije dodali po eno tableto inhibitorjev proteaz cOmplete ULTRA, ki inhibirajo cisteinske, serinske, aspartatne proteaze in metaloproteaze. Pufra smo nato dobro premešali z vibracijskim mešalnikom do popolne raztopitve tablet. Vse uporabljene kemikalije smo pred uporabo ohladili.

Po protokolu smo najprej izolirali citoplazemsko frakcijo. Iz gojitvenih posodic smo odsesali kompletno gojišče in celice sprali z enakim volumnom PBS. Po odstranitvi PBS smo na celice dodali 1 mL liznega pufra z inhibitorji proteaz in s strgalom zdrgnili celice s podlage. Celice smo nato s pipeto splaknili s površine in jih hkrati resuspendirali. Celotni volumen nastale suspenzije smo prenesli v mikrocentrifugirke in jih takoj postavili na led. Naprej smo celoten postopek izvajali na ledu. Celice smo na ledu inkubirali 15-20 min, vmes smo jih večkrat

(47)

premešali z vibracijskim mešalnikom. Po koncu inkubacije smo celice še enkrat dobro premešali in jih centrifugirali 10 min na 4 °C pri hitrosti 12.000 g. Po centrifugiranju smo supernatant, ki je predstavljal citoplazemsko frakcijo, prenesli v nove mikrocentrifugirke in ga shranili na - 80 °C do nadaljnje uporabe.

Usedlino, ki je nastala pri centrifugiranju, smo najprej trikrat sprali z 1 mL liznega pufra brez dodanih inhibitorjev proteaz. Nato smo ga resuspendirali v pufru za izolacijo jedrne frakcije z inhibitorji proteaz, najprej s pomočjo pipete, nato še s pomočjo vibracijskega mešalnika. V primeru izolacije proteinov iz celic, transficiranih z vektorji pControl in FLAG-p54, smo za resuspendiranje uporabili 250 µL pufra, v primeru pT7-V5-SBP-C1 in pT7-V5-SBP-C1-PCBP2 pa smo uporabili 125 µL pufra za višjo koncentracijo proteinov v jedrni frakciji. Suspenzijo smo 30 min inkubirali na ledu in jo nato 15 min centrifugirali na 4 °C pri 12.000 g.

Po centrifugiranju smo supernatant, ki je predstavljal jedrno frakcijo, prenesli v nove mikrocentrifugirke in ga shranili na - 80 °C do nadaljnje uporabe.

3.12.2 Določanje koncentracije proteinov

Koncentracijo proteinov smo določali s testom BCA (angl. bicinchoninic acid assay), ki temelji na sposobnosti proteinov, da reducirajo Cu2+ do Cu1+ v alkalni raztopini. V prvem koraku poteče biuretska reakcija, pri kateri se bakrov ion poveže s proteini, tako nastane svetlo moder kompleks, bakrov ion pa se reducira. V drugem koraku se na reduciran bakrov ion Cu1+ vežeta dve molekuli bikinhonske kisline in pri tem nastane vijolično obarvan kompleks. Nastali vodotopni produkt absorbira svetlobo z valovno dolžino 562 nm, njegova količina je odvisna od količine nastalih Cu1+ ionov, vsebnost katerih pa je odvisna od koncentracije proteinov. Na redukcijo najbolj vplivajo cisteinski, triptofanski in tirozinski aminokislinski ostanki [56].

Za merjenje koncentracije smo uporabili Pierce™ BCA Protein Assay Kit, ki vsebuje dva reagenta (reagent A in reagent B). Delovni reagent smo pripravili tako, da smo zmešali reagent A in reagent B v razmerju 50:1. Meritve smo izvajali v mikrotitrski plošči s 96 vdolbinicami. V vdolbinice smo odpipetirali po 10 µL standardov ali vzorcev, ki smo jih nanesli v duplikatih. Za standarde smo uporabili raztopine govejega serumskega albumina (BSA) z znano koncentracijo, in sicer 2000 µg/mL, 1500 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 25 µg/mL in 0 µg/mL (slepi vzorec). Za meritev koncentracije proteinov v citoplazemski frakciji so bile standardne raztopine pripravljene z liznim pufrom, v primeru jedrne frakcije pa s pufrom za jedrno frakcijo. Vsem standardom in vsem vzorcem smo kar se da hitro, da ne bi prišlo do bistvenih razlik v času inkubacije, dodali 200 µL delovnega reagenta, ploščo 30 s stresali na stresalniku za mikrotitrske plošče in jo nato prenesli v inkubator na 37 °C. Po 30 min inkubacije smo s pomočjo spektrofotometra Epoch izmerili absorbanco pri 562 nm.

(48)

Absorbanco standardov smo uporabili za izračun umeritvene krivulje, ki smo ji določili enačbo:

y=kx+n,

kjer je y absorbanca vzorca, x pa njegova koncentracija.

S pomočjo enačbe umeritvene krivulje smo na podlagi izmerjene absorbance vzorcev izračunali koncentracije proteinov v njih.

3.12.3 NaDS-PAGE

S pomočjo poliakrilamidne gelske elektroforeze v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS-PAGE) smo proteine ločili glede na njihovo molekulsko maso. Izvajali smo diskontinuirano elektroforezo. Uporabili smo 4 % zbiralni in 10

% ločevalni gel debeline 1 mm. Zamreženost ločevalnega gela smo izbrali glede na pričakovano velikost prekomerno izraženih proteinov. Sestava gelov je navedena v tabeli 10. Poleg zamreženosti sta se gela razlikovala tudi v vrednosti pH.

Tabela 10: Sestava ločevalnega in zbiralnega gela za NaDS-PAGE.

10 % (10 mL) 4 % (5 mL)

dH20 4,79 mL 3,43 mL

1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 2,5 mL /

1,0 M Tris-HCl (pH 6,8) / 0,63 mL

10 % (w/v) NaDS 100 µL 50 µL

40 % (w/v)

akrilamid/bisakrilamid (29:1) 2,5 mL 0,5 mL

10 % (w/v) APS 100 µL 50 µL

TEMED 6 µL 5 µL

Najprej smo sestavili napravo za vlivanje gela. Stekelca smo vstavili v nosilec in z vodo preverili, da sestavljena naprava ne pušča. V dveh centrifugirkah smo zmešali vse sestavine gelov razen tetrametiletilendiamina (TEMED), saj ta deluje kot aktivator in ga zato dodamo neposredno pred vlivanjem gela.

Akrilamid/bisakrilamid (AA) smo dodajali v digestoriju, ker je v monomerni obliki izjemno toksičen. Nato smo odlili vodo izmed stekelc, dodali TEMED v ločevalni gel, ga premešali in odpipetirali med stekelca. Na ločevalni gel smo odpipetirali izopropanol, da je bil zgornji rob gela raven. Ko se je ločevalni gel strdil, smo odlili izopropanol, dodali TEMED v zbiralni gel, ga premešali in odpipetirali do vrha stekelc. Med stekelca smo nato previdno vstavili glavniček.

Med polimerizacijo gelov smo pripravili vzorce za nanos. 3 µg izoliranih proteinov smo dodali 5 µL 4-kratnega nanašalnega pufra Laemmli in dopolnili z liznim

(49)

pufrom oziroma pufrom za jedrno frakcijo do 20 µL. V primeru priprave vzorcev iz citoplazemske frakcije smo uporabili lizni pufer, v primeru jedrne pa pufer za izolacijo jedrne frakcije. Pripravljene vzorce smo nato 5 min inkubirali pri 95 °C in kratko centrifugirali.

Ko je zbiralni gel polimeriziral, smo previdno odstranili glavničke in stekelca z geli prenesli v elektroforezno napravo. V kadičke smo nalili 1-kratni elektroforezni pufer, da so bila stekelca popolnoma potopljena. V žepke gelov smo nato nanesli celoten volumen pripravljenih vzorcev. Na vsak gel smo nanesli tudi 5 µL velikostnega standarda PageRuler Prestained Protein Ladder. Elektroforeza je potekala najprej 10 min pri 70 V, nato pa pri 120 V. Zaključili smo, ko je proteinska fronta skoraj dosegla roba gela.

3.12.4 Prenos western in imunodetekcija

Prenos western je metoda, s katero proteine iz poliakrilamidnega gela prenesemo na membrano. Pri našem delu smo proteine prenašali na polivinil difluoridno (PVDF) membrano, ki pred prenosom potrebuje aktivacijo z metanolom. Za aktivacijo smo membrano PVDF najprej 15 s inkubirali v metanolu, nato 2 min v vodi Milli-Q in 5 min v pufru za prenos. Kaseto smo pripravili v skladu s sliko 10. Kaseto smo nato previdno zaprli in jo vstavili v napravo za prenos western. Pri tem smo bili pozorni, da je bila kaseta pravilno orientirana. V kadičko smo do oznake nalili 1-kratni pufer za prenos in jo pokrili s pokrovom. Prenos je potekal čez noč pri konstantnem toku 100 mA.

Slika 10: Shema sestavljanja kasete za prenos Western.

Po končanem prenosu smo membrano previdno prenesli v plastično posodico in jo 1 uro blokirali v 5 % raztopini mleka v prahu v pufru TBST pri sobni temperaturi in ob konstantnem stresanju. Po blokiranju smo membrano enkrat sprali s pufrom TBST.

(50)

Na isti membrani smo želeli detektirati več proteinov z različnimi protitelesi, in sicer prekomerno izraženi protein in kontrolo nanosa, lamin A/C ali GAPDH (angl.

glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). Zato smo membrano previdno razrezali, tako da je bil vsak detektiran protein na ločenem kosu membrane.

Mesto razreza membrane smo določili na podlagi pričakovane velikosti proteinov.

Sledila je inkubacija s primarnimi protitelesi, ki je potekala 1,5 ure na sobni temperaturi pri rahlem stresanju. Primarna protitelesa smo predhodno redčili v 1

% raztopini mleka v pufru TBST, in sicer protitelesa proti FLAG-oznaki in lamin A/C 1:1000, proti V5-oznaki 1:4000 in proti GAPDH 1:50.000. Protitelesa proti FLAG-oznaki so bila že konjugirana z reporterskim encimom hrenovo peroksidazo (HRP), zato smo membrano s proteinom NONO v času inkubacije ostalih membran s primarnimi protitelesi stresali na 4 °C v pufru TBST. Po koncu inkubacije smo membrane sprali s TBST, in sicer štirikrat po 5 min. Sledila je 1- urna inkubacija s sekundarnimi protitelesi, označenimi s HRP, pri sobni temperaturi in ob rahlem stresanju. Sekundarna protitelesa smo predhodno redčili 1:2000 v 1 % mleku v TBST. Istočasno smo inkubirali tudi membrano s proteinom NONO s protitelesi proti FLAG-oznaki. Po inkubaciji smo membrane ponovno sprali s TBST (4-krat po 5 min).

Naslednji korak je bila detekcija na napravi LAS 4000. Membrane smo 5 min inkubirali v temi pri sobni temperaturi z reagentom Immobilon Classico Western HRP substrate. Po inkubaciji smo odstranili odvečni reagent in sestavili skupaj posamezne dele razrezane membrane. Membrano smo prenesli v LAS 4000 za opazovanje kemiluminiscence in naredili slike membran. Čas izpostavitve žarkom smo sproti prilagajali glede na signal. V primeru da kemiluminiscence nismo zaznali, smo uporabili močnejši reagent SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate. Ta reagent smo pripravili tako, da smo zmešali Luminol/Enhancer in Stable Peroxide Buffer v razmerju 1:1 in ga nato nanesli na membrano. Naprej je postopek potekal enako kot pri Immobilon Classico Western HRP substrate.

Oba reagenta vsebujeta substrat za HRP, luminol, in vodikov peroksid. HRP, ki je vezan na protitelesa, katalizira redukcijo H202, reakcija pa je sklopljena z oksidacijo luminola. Pri tej reakciji pride do kemiluniscence, ki jo zaznamo [57].

3.12.5 Odstranjevanje protiteles iz membran

Če so bili proteini, ki smo jih želeli detektirati z različnimi protitelesi, podobne velikosti, membrane nismo mogli natančno razrezati. V tem primeru smo najprej izvedli imunodetekcijo enega proteina, nato odstranili vezana protitelesa z membrane in izvedli še imunodetekcijo drugega proteina. Pri našem delu smo odstranili protitelesa proti V5-oznaki in nato vezali protitelesa proti GAPDH.

Najprej smo pripravili pufer za odstranjevanje protiteles. Membrano smo inkubirali v pripravljenem pufru 10 min pri sobni temperaturi, nato smo zamenjali

Reference

POVEZANI DOKUMENTI

Vsako meritev smo opravili tako, da smo najprej s pomočjo šiviljskega metra izmerili do lžino in širino največjega lista, potem s pomočjo kalkulatorja in šiviljskega

V letu 2004 smo v okviru naše diplomske naloge na Ljubljanskem barju, na travniku zveze Arrhenatherion, izvedli raziskavo, s katero smo želeli ugotoviti, kako večletna pogostnost

Zastavili smo protokol izolacije miRNA, sinteze komplementarne DNA (cDNA) ter kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) in uspešno izolirali 5 različnih molekul miRNA, ki

Slika 17: Količina miR172a v primerjavi s COX-mRNA v odvisnosti od uporabljene metode izolacije RNA pri dveh analiziranih vzorcih RNA sort krompirja Désirée in PW363.. Slika

Slika 15: Agarozna gelska elektroforeza izolirane RNA iz vzorcev abscizinskega območja listov paradižnika s kompletom RNeasy Micro Kit....

20  Slika 7: Primerjava izmerjenih koncentracij virusne RNA (kopij RNA/ml) iz 5 pozitivnih vzorcev humane krvi po ročni in po avtomatski izolaciji.... 37  Slika 8:

Priloga A: Primerjava izolacije virusne RNA s sprostitvijo virusov po testu ELISA in s kompletom RNeasy Plant Mini Kit iz ekstraktov listov različnih vzorcev vinske trte, ki smo

V jetrih bolnikov okuženih s HCV smo pokazali, da so se vse 4 izbrane mikro RNA izražale v FFPE vzorcih jeter pri bolnikih okuženih z različnimi genotipi virusa HCV, in, da