CEL I ZAKRES PRACY
2. Część doświadczalna
2.1 Aparatura i odczynniki
2.1.1 Oznaczanie LZO w próbkach powietrza, pyłu zawieszonego i kurzu oraz ftalanów w próbkach powietrza
2.1.1.1 Odczynniki i substancje wzorcowe
Wykaz zastosowanych substancji wzorcowych oraz odczynników wraz z ich akronimem lub skrótem, stopniem czystości oraz producentem przedstawiono w Tabeli 6.
Tabela 6. Spis odczynników i substancji wzorcowych wykorzystanych w trakcie oznaczeń LZO i ftalanów NAZWA SUBSTANCJI AKRONIM/
SKRÓT CZYSTOŚĆ PRODUCENT
oznaczanie ftalanów
ftalan dimetylu DMP ≥99%
Sigma-Aldrich, Niemcy ftalan dimetylu-3,4,5,6-d4 DMP-d4 98%
ftalan dietylu DEP ≥99%
ftalan diizobutylu DiBP 99%
ftalan dibutylu DBP 99%
ftalan di-n-heksylu DnHP ≥98 %
ftalan benzylu butylu BBP ≥99%
ftalan
di(2-etyloheksylu) DEHP ≥99%
ftalan di(2-etyloheksylu)- -3,4,5,6-d4
DEHP-d 98%
ftalan di-n-oktylu DnOP ≥98%
ftalan diizodecylu DiDP ≥99%
ftalan diizononylu DiNP ≥99%
oznaczanie LZO w pyle zawieszonym i kurzu filtry z włókien szklanych GF/A, Ø 25
mm - - GE Healthcare, USA
aceton - 99,8% Suprasolv, Dania
bezwodny siarczan magnezu - 98% POCH S.A., Polska
oznaczanie LZO w powietrzu, pyle zawieszonym i kurzu
4-bromofluorobenzen 4-BrFB 99,8% Dr. Ehrenstorfer GmbH,
Niemcy oznaczanie ftalanów w powietrzu oraz oznaczanie LZO w powietrzu, pyle zawieszonym i kurzu
silanizowana wata szklana - -
Sigma-Aldrich, Niemcy
metanol MeOH 99,8%
hel - 99,99997% Air Products, USA
2.1.1.2 Sprzęt laboratoryjny
W Tabeli 7 zestawiono wykaz zastosowanych sprzętów laboratoryjnych wykorzystanych do oznaczanie lotnych związków organicznych oraz ftalanów w wybranych matrycach.
Tabela 7. Wykaz sprzętów laboratoryjnych zastosowanych w badaniach LZO i ftalanów NAZWA SPRZĘTU
LABORATORYJNEGO
CHARAKTERYSTYKA PRODUCENT
oznaczanie ftalanów i LZO w powietrzu rurki sorpcyjne komercyjne rurki szklane
o długości 90 mm i Ø 6,35 mm, wypełnione 200 mg Tenax (polimeru tlenku 2,6-difenylo-p- fenylenu, o rozmiarze cząstek 180-
300 µm)
Shimadzu, Japonia
aspirator ASP-3 II automatyczny, dwukanałowy Lab Sp. z o. o, Polska termohigrometr Greisinger GMH 3330 automatyczny GHM GROUP, Niemcy
czujnik temperatury i wilgotności Greisinger 601700 TFS 0100 E
- GHM GROUP, Niemcy
oznaczanie LZO w pyle zawieszonym, kurzu puste rurki rurki szklane o długości 90 mm i Ø
6,35 mm
Shimadzu, Japonia suszarka laboratoryjna z konwekcją wymuszoną Binder, Niemcy
eksykator - -
cyklon, separator pyłów - SKC, UK
waga Adventurer Pro Analytica AV 264CM
analityczna, elektroniczna Ohaus, USA
pęsety - -
butelki szklane o objętości 1 l -
szkiełko zegarkowe - -
oznaczanie ftalanów i LZO w powietrzu, pyle zawieszonym, kurzu
mikrostrzykawki szklane o objętości 1-500 µl Hamilton, USA
łaźnia ultradźwiękowa IS-5,5 - Intersonic, Polska
fiolki szklane o objętości 1,5 ml Agilent, USA
2.1.1.3 Aparatura
W badaniu wykorzystano chromatograf gazowy GC-2010+ (Shimadzu, Japonia) sprzężony z termicznym desorberem TD-20 (Shimadzu, Japonia) i detektorem masowym MS- -QP2010 Ultra (Shimadzu, Japonia) [TD-GC/MS]. Ftalany w powietrzu oznaczano w trybie monitorowania wybranych jonów (SIM), natomiast LZO w próbkach powietrza, pyle zawieszonym i kurzu analizowano w trybie SCAN.
2.1.2 Identyfikacja wybranych cytostatyków w próbach moczu oraz badanie toksyczności próbek moczu wobec bakterii Vibrio fischeri
2.1.2.1 Odczynniki i substancje wzorcowe
W Tabeli 8 zestawiono substancje wykorzystane przy identyfikacji wybranych cytostatyków w moczu oraz do przeprowadzenia oceny toksyczności moczu. W badaniu z wykorzystaniem bakterii Vibrio fischerizastosowano komercyjnie dostępny test toksyczności ostrej Microtox® Acute Toxicity Test (Strategic Diagnostics Inc., USA). Natomiast w analizie na obecność leków przeciwnowotworowych użyto substancje stosowane u pacjentów
poddanych leczeniu chemioterapeutycznemu. Wykorzystano leki cytostatyczne, sporządzone w Aptece Szpitalnej Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego (UCK), Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego (GUMed), które pozostały po podaniu pacjentom w workach infuzyjnych.
Tabela 8. Wykaz odczynników i substancji wzorcowych wykorzystanych do identyfikacji cytostatyków oraz do oceny toksyczności moczu w bioteście Microtox®
NAZWA ZASTOSOWANIE SKŁAD/CZYSTOŚĆ PRODUCENT
badanie toksyczności próbek moczu wobec bakterii Vibrio fischeri Microtox® Acute
Reagent
liofilizowane szczepy bakterii bioluminescencyjnych
bakterie Vibrio fischeri
Strategic Diagnostics Inc.,
USA Microtox®
Reconstitution Solution
roztwór regeneracyjny
do rehydratacji bakterii - Microtox® Diluent roztwór do wykonywania kolejnych
rozcieńczeń analizowanej próbki 2% roztwór NaCl Microtox® Osmotic
Adjusting Solution
roztwór zapewniający bakteriom
optymalne ciśnienie osmotyczne 22% roztwór NaCl siedmiowodny
siarczan cynku
ocena jakości bakterii
Vibrio fischeri 98% Stanlab, Polska
kwas solny korygowanie pH próbki 35-38% POCH, Polska
identyfikacja wybranych cytostatyków w próbach moczu
woda faza ruchoma ≥99,9%
Sigma-Aldrich, Niemcy
metanol faza ruchoma ≥99,9%
octan amonu modyfikator fazy ruchomej ≥99%
dichlorometan rozpuszczalnik do ekstrakcji
cytostatyków ≥99,9%
octan etylu rozpuszczalnik do ekstrakcji
cytostatyków z moczu >99,8%
azot gaz suszący/gaz do odparowywania
próbki ≥99,9995% generator azotu
powietrze gaz grzewczy ≥99,9995% generator powietrza
argon gaz rozpylający 99,99999% Linde, Polska
cytarabina
substancje wzorcowe - Apteka Szpitalna
UCK, GUMed daunorubicyna
winkrystyna kladrybina dakarbazyna
etopozyd bendamustyna
winblastyna cyklofosfamid
tamoksyfen metotreksat
2.1.2.2 Sprzęt laboratoryjny
Podczas oceny toksyczności ostrej w teście Microtox® oraz do identyfikacji cytostatyków w próbkach moczu wykorzystano następujący sprzęt laboratoryjny zestawiony w Tabeli 9.
Tabela 9. Sprzęt laboratoryjny wykorzystany do wykonania testu Microtox® i analizy cytostatyków NAZWA SPRZĘTU
LABORATORYJNEGO CHARAKTERYSTYKA PRODUCENT
badanie toksyczności próbek moczu wobec bakterii Vibrio fischeri
Disposable Glass Cuvettes szklane kuwety do analizatora Microtox® Strategic Diagnostics Inc., USA identyfikacja wybranych cytostatyków w próbach moczu
butelki szklane o pojemności 10, 100, 1000, 20000 ml - generator azotu Genius NM32LA wytwornica azotu
Peak Scientific, UK generator powietrza wytwornica powietrza
łaźnia ultradźwiękowa IS-5,5
firmy - Intersonic, Polska
fiolki szklane o objętości 1,5 ml Agilent, USA
strzykawki szklane o objętości 10, 100, 500 ul Hamilton, USA rozdzielacze szklane, gruszkowe o objętości 500 ml, z
teflonowym kranem -
koncentrator próbek zestaw do odparowywania ekstraktów rozpuszczalnikowych w strumieniu gazu
obojętnego Dan LAB©, Polska
badanie toksyczności próbek moczu wobec bakterii Vibrio fischeri i identyfikacja wybranych cytostatyków w próbach moczu
moczówki pojemniki plastikowe o pojemności 100 ml -
zlewki szklane o pojemności 100-500 ml -
pH-metr HI 208-02 elektroda pH HI 1291D Hanna Instruments,
Rumunia pipety Transferpette® automatyczne o objętości 10-5000 µl Brand, Niemcy
tipsy sterylne końcówki do pipet -
waga Adventurer Pro Analytica
AV 264CM analityczna, elektroniczna Ohaus, USA
2.1.2.3 Aparatura
Do pomiaru toksyczności ostrej moczu w teście Microtox® wykorzystano analizator Microtox® Model 500 (Strategic Diagnostics Inc., USA). Laboratoryjny fotometr pełnił funkcje analizatora, jak również inkubatora. Pomiar wykonywany był przy długości fali 490 nm.
Identyfikację wybranych cytostatyków w próbach moczu przeprowadzono za pomocą chromatografu cieczowego sprzężonego z podwójnym detektorem masowym (LC-MS/MS) [Shimadzu, Japonia]. W skład zestawu wchodził: automatyczny podajnik próbki (SIL30-AC), pompa (DGU-20A), mikser fazy ruchomej (LC30-AD), moduł komunikacyjny (CBM-20A), termostatowany piec (CTO-20AC) oraz detektor z potrójnym kwadrupolem (LC-MS 8050) z metodą jonizacji cząstek ESI (Electrospray Ionization – jonizacja przez elektrorozpylanie).
Pomiary wykonywano w trybie (SIM) monitorowania wybranych jonów (analizowano jony dodatnie).