Rozprawa doktorska / PhD thesis - PPM GUMed

Tomaszowi Śledzińskiemu za merytoryczną opiekę i wsparcie.Składam podziękowania współautorom za pomoc w badaniach będących podstawą publikacji. Badania wykonano w ramach projektu Narodowego Centrum Nauki (OPUS 6 2013/11/B/NZ5/00118) oraz POWR I026/17-00 (POWER 2) współfinansowanego ze środków Programu Operacyjnego Wiedza Edukacja Rozwój ze środków Fundusz Społeczny Europejski w Katedrze i Katedrze Biochemii Farmaceutycznej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego.

Wykaz skrótów

Wykaz prac wchodzących w skład rozprawy doktorskiej

Streszczenie

Abstrakt

Wstęp

Metabolizm kwasów tłuszczowych

Zmiany w poziomie ekspresji i aktywności wyżej wymienionych enzymów biorących udział w transformacji FA mogą wpływać na skład ilościowy i jakościowy FA we krwi. Z punktu widzenia metabolizmu FA najważniejsze wydają się być wątroba i tkanka tłuszczowa, dlatego w pracy skupiono się na komórkach tych narządów. Głównymi elementami tego szlaku są apolipoproteina B100 (kodowana przez gen ApoB) i mikrosomalne białko przenoszące TAG (MTTP) (ryc. 2).

W regionach promotorowych genów metabolizmu FA zidentyfikowano wiele motywów umożliwiających wiązanie różnych czynników transkrypcyjnych, w tym białko wiążące wzmacniacz CCAAT (C/EBP), białko wiążące element odpowiedzi sterolowej (SREBP), czynnik jądrowy 1 (NF- 1), transkrypcję Sp1, białko aktywatorowe 1 (AP1), jądrowy czynnik hepatocytów 4 (HNF4) i receptor aktywowany przez proliferatory peroksysomów (PPAR) [ 42 - 44 ]. Co więcej, badania przeprowadzone w ostatnich latach sugerują, że aktywność enzymów metabolizujących FA może zmieniać się w odpowiedzi na stosunek cytozolu pomiędzy utlenioną formą dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NAD+) a zredukowaną formą dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADH). Profil FA, czyli skład ilościowy i jakościowy FA, ​​ma istotny wpływ na utrzymanie równowagi metabolicznej organizmu.

Na przykład zmiany aktywności FADS powiązano z chorobą niedokrwienną serca, chorobą Leśniowskiego-Crohna, zespołem metabolicznym i otyłością [47–.

Przewlekła choroba nerek

Na przykład ekspresja FADS1 i FADS2 została zmniejszona po suplementacji różnymi PUFA zarówno w modelach eksperymentalnych in vitro, jak i in vivo [38 – 41]. Biorąc pod uwagę złożoną rolę, jaką pełnią FA w organizmie, zmiany w profilu FA mogą mieć poważne konsekwencje dla regulacji wielu procesów zachodzących w organizmie, zarówno tych związanych z podstawowym metabolizmem, jak i procesów związanych z rozwojem różnych stanów patologicznych. Różne badania, w tym naszego zespołu, wykazały zmiany w proporcjach poszczególnych grup FA w surowicy pacjentów z ChAD, w tym zmniejszenie poziomu n-3 PUFA i wzrost poziomu MUFA wraz z progresją choroby [64-66] .

Ponadto badania naszego zespołu wykazały, że w surowicy pacjentów z PChN wzrasta także zawartość atypowego FA z grupą cykliczną – kwasu metylenoheksadekanowego (CPOA2H) [67]. Na przykład kwas 2-heksylo-cyklopropanodekanowy zwiększa aktywność ludzkiej cyklooksygenazy, kwas cis-9,10-metylenoheksadekanowy hamuje aktywność ATPazy aktomiozyny w mięśniu sercowym świnki morskiej, syntetyczna pochodna linolowego FA zawierająca dwa pierścienie cyklopropanowe, 2-pentylocyklopropylometylo)-cyklopropylo]- oktanowa kinaza białkowa C [76-78]. Dyslipidemia obserwowana u pacjentów z PChN jest jednym z czynników ryzyka wystąpienia chorób towarzyszących, w tym chorób układu krążenia [57,79,80].

Ponadto zmiany w profilu lipidowym mogą aktywnie uczestniczyć w pogorszeniu czynności nerek, przyczyniając się w ten sposób do progresji choroby [79,81]. Badania poza nefrologią wskazują, że FA mogą wpływać na wiele szlaków metabolicznych zaangażowanych w metabolizm lipidów i lipoprotein. Dietetyczny FA może wpływać na poziom ekspresji genów biorących udział w metabolizmie lipidów, zatem prawdopodobne wydaje się postawienie hipotezy, że zmiany w profilu FA związane z przebiegiem PChN mogą również wpływać na ich metabolizm [87,88], ale aby to potwierdzić, badania w poziom molekularny obu komórek jest z pewnością niezbędny.

Białko to odgrywa również ważną rolę w regulacji odporności i stanu zapalnego, które są ściśle powiązane ze stresem oksydacyjnym i dysfunkcją nabłonka, co może wpływać na ryzyko chorób sercowo-naczyniowych [95-97]. Wcześniejsze badania, w tym naszego zespołu, wykazały, że u pacjentów z PChN stężenie leptyny w surowicy jest podwyższone w porównaniu z poziomem u osób zdrowych [98-100]. Poziom leptyny może odgrywać ważną rolę w kilku komórkach nerek, w tym komórkach mezangialnych, śródbłonku naczyń i podocytach. Na przykład leptyna hamuje ekspresję nefryny, podocyny, podoplaniny i podokaliksyny – cząsteczek tworzących specyficzną cytoarchitekturę podocytów, niezbędną do prawidłowego funkcjonowania komórek nerek. funkcjonowanie bariery filtracyjnej kłębuszkowej [97].

Późne stadia PChN wiążą się z niedożywieniem białkowo-energetycznym, a ponieważ leptyna tłumi poczucie apetytu, jej zwiększone stężenie może przyczyniać się do pogłębienia zaburzeń apetytu i dalszego pogorszenia stanu odżywienia chorych [102]. Podwyższone stężenie leptyny i zmiany w profilu FA to czynniki, które mogą mieć związek z patogenezą i powikłaniami PChN, jednak jak dotąd w żadnym badaniu nie podjęto próby zbadania związku między nimi, dlatego w ramach badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej , wpływ nieprawidłowego profilu FA na poziom leptyny.

Cel pracy

Najważniejsze wyniki

Zmiany ekspresji genów związanych z metabolizmem lipidów w hepatocytach w modelu in

ACC – karboksylaza acetylo-CoA, FASN – syntaza kwasów tłuszczowych, SCD1 – desaturaza stearoilo-CoA, ELOVL6 – elongaza kwasów tłuszczowych 6, DGAT1 – acylotransferaza diacyloglicerolu 1, MTTP – mikrosomalne białko przenoszące triacyloglicerol, ApoB, apolyApopoproteina, ApoB, apolyApopoproteina SREBP1 – sterol białko wiążące element odpowiedzi [Na podstawie: Załącznik C]. Dodatek AA do komórek HepG2 spowodował wzrost ekspresji FASN, przy jednoczesnym obniżeniu poziomu mRNA genów odpowiedzialnych za transformację FA (desaturacja i elongacja). ACC – karboksylaza acetylo-CoA, FASN – syntaza kwasów tłuszczowych, SCD1 – desaturaza stearoilo-CoA, ELOVL6 – elongaza kwasów tłuszczowych 6, DGAT1 – acylotransferaza diacyloglicerolu 1, MTTP – mikrosomalne białko przenoszące triacyloglicerol, ApoB, apolyApopoproteina, ApoB, apolyApopoproteina SREBP1 – sterol białko wiążące element odpowiedzi [Na podstawie: Załącznik C].

Podsumowując, OA (przedstawiciel MUFA), której zawartość wzrasta w surowicy chorych na PChN, w hepatocytach w modelu in vitro, spowodowała wzrost ekspresji większości genów biorących udział w syntezie FA i TAG (ACC, FASN, SCD1, DGAT1) i uwalnianie VLDL (ApoB, MTTP). ). Po 48-godzinnym okresie inkubacji zaobserwowano, że w komórkach hodowanych w FA suplementowanym od pacjentów z PChN, poziom mRNA genów odpowiedzialnych za syntezę FA oraz ich desaturację i elongację (ACC, FASN, SCD1, ELOV6), a także wzrosła liczba genów zaangażowanych w syntezę TAG (DGAT1) i tworzenie VLDL (MTTP). Poziomy mRNA dla wybranych genów w komórkach HepG2 uzupełnione pełnym profilem kwasów tłuszczowych w surowicy osób kontrolnych (kontrolnych) i pacjentów z CKD w stadium 5 (CKD 5).

ACC – karboksylaza acetylo-CoA, FASN – syntaza kwasów tłuszczowych, SCD1 – desaturaza stearoilo-CoA, ELOVL6 – elongaza kwasów tłuszczowych 6, DGAT1 – acylotransferaza diacyloglicerolu 1, MTTP – mikrosomalne białko przenoszące triacyloglicerol, ApoB, apolyApopoproteina, ApoB, apolyApopoproteina SREBP1 – sterol białko wiążące element odpowiedzi. Wyniki wykazały, że w pożywce, w której hodowano komórki wzbogaconej pełnym profilem FA od pacjentów z PChN, zawartość TAG była ponad 6-krotnie wyższa niż w pożywce, w której hodowano hepatocyty uzupełnionej FA od osób kontrolnych (ryc. 7). ) ). Powyższe wyniki wskazują, że zmieniony profil FA u chorych na PChN może prowadzić do zwiększonej syntezy TAG i ich uwalniania w postaci VLDL z wątroby.

FASN – syntaza kwasów tłuszczowych, SCD1 – desaturaza stearoilo-CoA, DGAT1 – acylotransferaza diacyloglicerolu 1, MTTP – mikrosomalne białko przenoszące triacyloglicerol, ApoB – apolipoproteina B, SREBP1 – białko wiążące element odpowiedzi sterolowej 1, PPAR – receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów, ACC – acetyl -karboksylaza CoA, ELOVL6 - elongaza kwasu tłuszczowego 6, HMGCR - reduktaza HMG-CoA, HMGCS1 - syntaza HMGCoA, SREBP2 - białko wiążące element odpowiedzi sterolowej [Na podstawie: Załącznik D]. Analiza Western blot poziomów białka syntazy kwasów tłuszczowych (FASN) i desaturazy stearoilo-CoA (SCD1) w komórkach HepG2 hodowanych w obecności kwasu metylenoheksadekanowego (CPOA2H) [Na podstawie: Załącznika D]. W doświadczeniu badany FA podawano do dojrzałych (zróżnicowanych) adipocytów 3T3-L1, a następnie po 48 godzinach oceniano poziom ekspresji wybranych genów.

Sugeruje to, że możliwy wpływ CPOA2H na stężenie lipidów w surowicy pacjentów z PChN wynika ze zwiększonej ich syntezy w wątrobie, a nie w tkance tłuszczowej. Biorąc jednak pod uwagę, że wątroba jest głównym miejscem syntezy FA i TAG u człowieka, zmniejszona ekspresja genów związanych z lipogenezą w adipocytach może mieć wtórny wpływ na ilość lipidów w surowicy pacjentów z PChN [116]. Może to oznaczać, że zwiększone stężenie CPOA2H w surowicy pacjentów z PChN nie tylko przyczynia się do wzrostu stężenia TAG, ale także do wzrostu stężenia leptyny.

FASN – syntaza kwasów tłuszczowych, SCD1 – desaturaza stearoilo-CoA, DGAT1 – acylotransferaza diacyloglicerolu 1, SREBP1 – białko wiążące element odpowiedzi sterolowej, PPARG – receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów, LEP – leptyna, ADIPOQ na bazie receptora D [adiponektyny].

Zmieniony profil kwasów tłuszczowych a poziom ekspresji leptyny

Jednakże kwasy DHA i AA, których zawartość w surowicy pacjentów z PChN jest obniżona, zmniejszają poziom ekspresji LEP w sposób zależny od dawki (ryc. 13b). Względny poziom mRNA leptyny w komórkach 3T3-L1 inkubowanych przez 48 h z dodatkiem kwasu palmitynowego (PA) i kwasu oleinowego (OA) (a) oraz kwasu arachidonowego (AA) i kwasu dokozaheksaenowego (DHA) (b) . Poziomy wielu FA we krwi pacjentów z PChN zmieniają się jednocześnie, dlatego kolejnym etapem badań była ocena ogólnego wpływu wszystkich zaburzeń w składzie FA w surowicy na poziom ekspresji leptyny.

Z tego powodu wszystkie FA w surowicy wyizolowano od losowo wybranych 10 pacjentów z zaawansowaną PChN i od losowo wybranych 10 osób z grupy kontrolnej. Inkubacja adipocytów z preparatem zawierającym pełny profil FA od pacjentów z zaawansowaną PChN spowodowała istotny wzrost poziomu mRNA LEP w porównaniu z poziomem ekspresji obserwowanym w adipocytach hodowanych z dodatkiem pełnego profilu FA osób zdrowych (ryc. 14). Względny poziom mRNA leptyny (LEP) w adipocytach 3T3-L1 hodowanych przez 48 godzin z pełnym profilem kwasów tłuszczowych ekstrahowanym z surowicy zdrowych ochotników (kontrola) i pacjentów z zaawansowaną chorobą nerek (CKD).

Powyższe wyniki po raz pierwszy pokazują, że zmieniony profil FA w surowicy obserwowany u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek zwiększa ekspresję leptyny w adipocytach.

Wnioski

Piśmiennictwo

Dietary pattern regulates fatty acid desaturase 1 gene expression in Indian pregnant women to spare overall long-chain polyunsaturated fatty acid levels. Dietary arachidonic acid and docosahexaenoic acid regulate hepatic fatty acid desaturase (FADS) alternative transcript expression in suckling piglets. Prevalence of chronic kidney disease in a representative sample of the Polish population: results of the NATPOL 2011 survey.

Metabolic abnormalities in chronic kidney disease contributing to cardiovascular disease and nutritional initiatives that may reduce risk. Serum fatty acid patterns, insulin sensitivity, and metabolic syndrome in individuals with chronic kidney disease. Abnormalities of serum omega-3 fatty acid composition in dialysis patients and their associations with fat mass.

Marine n-3 polyunsaturated fatty acids in patients with end-stage renal failure and in subjects without renal disease: a comparative study. Characterization and analysis of the cotton cyclopropane fatty acid synthase family and their contribution to cyclopropane fatty acid synthesis. Fatty acid regulation of liver X receptors (LXR) and peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) in HEK293 cells*.

Association between plasma levels of Klotho protein, osteocalcin, leptin, adiponectin and bone mineral density in patients with chronic kidney disease. Elevated serum leptin, adiponectin, and leptin-adiponectin ratio are associated with chronic kidney disease in Asian adults. Association of elevated serum leptin with improved anemia and malnutrition in patients with stage 5 CKD after parathyroidectomy.

Increased expression of the leptin gene in adipose tissue of patients with chronic kidney disease - the possible role of an abnormal serum fatty acid profile. Direct and indirect mechanisms for regulation of fatty acid synthase gene expression by liver X receptors.

Załączniki

• Załącznik A
• Załącznik B
• Załącznik C
• Załącznik D

Zmiany w profilu kwasów tłuszczowych mogą przyczyniać się do dyslipidemii w przewlekłej chorobie nerek poprzez wpływ na metabolizm hepatocytów. Aleksandra Czumaj, Tomasz Śledziński, Juan-Jesus Carrero, Piotr Stepnowski, Małgorzata Sikorska-Wiśniewska, Michał Chmielewski, Adriana Mika.