Modro obarvan in v prikazu verige je ORF8, rjavo obarvana pa je struktura ITGB1-Nt. Na levi strani je prikazana hidrofobna interakcijska površina, pri kateri so z rumeno obarvana hidrofobna področja, z modro po hidrofilna. Na desni je prikaz elektrostatske površine med proteinoma, kjer rdeča področja predstavljajo področja z negativnim nabojem, modra pa so pozitivno nabita področja.
Tabela 4: Ocena modela kompleksa ORF8-ITGB1-Ct na strežniku HADDOCK.
ITGB1-Ct
Ocena HADDOCK 49,0 +/- 12,4
Velikost skupka 7
RMSD-vrednost strukture z najnižjo energijo 5,2 +/- 0,0 Van der Waalsova energija -54,5 +/- 3,0
Elektrostatska energija -247,9 +/- 14,9 Energija desolvatacije -10,4 +/- 1,1 Energija kršitve omejitev 1634,5 +/- 134,8
Zakopana površina 2195,3 +/- 27,5
Ocena Z -0,7
29
Model strukture interakcije smo pregledali z ustreznim orodjem in pri tem ugotovili neposredno bližino stranske verige Leu84 iz B verige ORF8 ter Leu754 iz strukture ITGB1-Ct (slika 11). Druge obravnavane aminokisline v interakciji ne sodelujejo.
Pregled tipov interakcij pokaže, da je kompleks dobro hidrofobno in elektrostatsko stabiliziran v področju α-vijačnice (slika 12). Strukturi ne interagirata prek celotne površine vijačnice, pač pa samo prek koncev.
Slika 11. Model interakcije proteinov ORF8 z ITGB1-Ct. Z modro je predstavljen model ORF8, v katerem so s poimenovanjem označene obravnavane aminokisline.
Rdeče pa je obarvana struktura ITGB1-Ct. Iz prikaza z verigo sta izpostavljeni aminokislini Leu84 (ORF8) in Leu754 (ITGB1-Ct).
Slika 12. Hidrofobna in elektrostatska površina interakcije ORF8 z ITGB1-Ct. Z modro verigo je prikazana struktura ORF8, kot celotna hidrofobna ali elektrostatska površina pa ITGB1-Ct, skupaj z delom ORF. Na levi je prikaz hidrofobnih (rumena) in hidrofilnih (modra) kontaktov, na desni pa elektrostatska površina. Modro je obarvan pozitiven naboj, rdeče pa negativen.
30 4.2.5 TGFB1-Ct
Za opis interakcije med ORF8 in C-terminalno domeno TGFB1 smo izbrali model, napovedan s spletnim strežnikom ClusPro.
Model kompleksa je pripadal največjemu skupku, ki je vseboval 52 struktur. Najnižja energija skupka pa je bila -10.863 relativnih enot. Na strežniku PRODIGY smo izračunali jakost vezave kompleksa ter dobili rezultata ΔG = -16,3 kcal/mol ter KD = 1 × 10-12. Strukturo interakcije smo ročno pregledali z ozirom na obravnavane interakcije. Izmerili smo oddaljenost stranskih verig aminokislinskih ostankov Ser24 oziroma Tyr73 do najbližjega ostanka iz strukture TGFB1-Ct, s katerim bi lahko tvoril vez. V ORF8 verigi A je Tyr73 3,73 Å oddaljen od Tyr90, v verigi B pa je Leu84 3,47 Å oddaljen od Tyr65 iz TGFB1-Ct (slika 13).
Protein ORF8 se s komplementarno obliko veže v strukturo TGFB1 ter z njo tvori veliko interakcijsko površino. Strukturi se dobro ujemata in imata možnost dveh pomembnih kontaktov, kar je razvidno iz slike 14.
Slika 13. Meritve oddaljenosti med aminokislinskimi ostanki obeh proteinov. Z rumeno sta prikazani obe meritvi dolžin med ostanki, ki bi lahko sodelovali v vezi. Na levi strani je prikazana razdalja med Tyr73 verige A iz ORF8 (modra) in Tyr90 iz TGFB1, na levi strani pa je prikazana razdalja med Leu84 iz verige B in Tyr65 iz tarčnega proteina (vijolična).
31 4.2.6 TGFB1-LAP
Model za razlago interakcije med ORF8 in proteinom TGFB1-LAP je bil napovedan z usmerjenim molekulskim sidranjem na strežniku HADDOCK. Pripisani so mu bili parametri za oceno modela, ki so prikazani v tabeli 5. Dodatno smo vezavno afiniteto določili še na strežniku PRODIGY in dobili Gibbsovo prosto energijo ter disociacijsko konstanto. Vrednosti sta bili ΔG = -11,9 kcal/mol in KD = 1,7 × 10-9.
Strukturo interakcije smo pregledali v programu za vizualizacijo proteinov ChimeraX 1.2.5 in iskali možne interakcije prek za nas pomembnih aminokislin (slika 15).
Slika 14. Napovedan model interakcije med ORF8 in TGFB1-Ct. V pogledu površine in vijolično obarvana je struktura proteina TGFB1. V kompleksu sodeluje modro obarvan protein ORF8, ki je na desni prikazan kot veriga z označenimi obravnavanimi aminokislinami, na desni pa kot površina. V obeh modelih sta oranžno pobarvani aminokislini, ki sta del interakcijske površine.
Tabela 5: Ocena modela kompleksa ORF8-TGFB1-LAP na strežniku HADDOCK.
TGFB1-LAP
Ocena HADDOCK 60,1 +/- 16,5
Velikost skupka 9
RMSD-vrednost strukture z najnižjo energijo 1,2 +/- 1,4 Van der Waalsova energija -71,0 +/- 5,0
Elektrostatska energija -312,2 +/- 40,0 Energija desolvatacije -32,7 +/- 3,6 Energija kršitve omejitev 2263,2 +/- 200,7
Zakopana površina 2484,5 +/- 202,8
Ocena Z -1,5
32
V bližini interakcijske površine znotraj 5 Å ni bilo nobene od obravnavanih aminokislin.
Prav tako je vidna tudi precejšnja oddaljenost med strukturama (slika 15).
Za analizo stabilizacije smo model strukture prikazali kot površino hidrofobnih kontaktov in elektrostatskih interakcij. Vidna je neskladnost površin s prostorom brez interakcij med molekulama. Stične površine so na robovih, kjer je opazna elektrostatska interakcija (slika 16).
Slika 15. Prikaz modela interakcije med ORF8 in TGFB1-LAP. Z vijolično površino je prikazana struktura proteina TGFB1-LAP, z modro verigo pa struktura proteina ORF8. Pomembni aminokislinski ostanki so poimenovani.
Slika 16. Hidrofobni in elektrostatski prikaz interakcijske površine. Z modro verigo je prikazana struktura ORF8, z vijolično pa struktura proteina TGFB-LAP. Na levi strani je prikaz hidrofobnih interakcij, ki so obarvane z rumeno in modrih hidrofilnih delov. Na desni strani pa je elektrostatska površina, kjer je pozitiven naboj strukture obarvan modro, negativen pa rdeče.
33 4.2.7 TGFB1
Najboljši model, ki razloži interakcijo virusnega proteina ORF8 s celotno pro-obliko TGFB1, je bil napovedan na strežniku ClusPro.
Model kompleksa je pripadal največjemu skupku, ki je vseboval 59 struktur, najnižja energija pa je bila -12.741 relativnih enot. Zanimala nas je afiniteta vezave proteinov, zato smo jo izračunali na strežniku PRODIGY. Rezultat je pokazal ΔG = -14,0 kcal/mol in KD = 5,2 × 10-11.
Napovedano strukturo smo pregledali v ustreznem programu in iskali možnost interakcije prek aminokislin, ki bi razložile rezultate eksperimentalne analize interakcije. Vse obravnavane aminokisline so zunaj interakcijske površine in ne doprinesejo k stabilizaciji kompleksa. ORF8 se veže na vijačnico, ki gleda iz ravnine (slika 17).
Zanimala nas je skladnost vezave na celotno molekulo in posamezno podenoto, zato smo strukturo C-končne podenote z vezanim ORF8 strukturno poravnali na celotno molekulo TGFB1. ORF8 vezavni mesti se v C-končni podenoti in v celotni molekuli razlikujeta (slika 18).
Slika 17. Napovedan model interakcije med ORF8 in proteinom TGFB1. Z modro