Čas od odvzema vzorca do rezultata genotipizacije bacilov tuberkuloze je velikega pomena za kakovosten epidemiološki nadzor in analizo podatkov o prenosu bacilov tuberkuloze.
To je še posebno pomembno v državah, ki bolnike v začetnem obdobju zdravljenja, ko so najbolj kužni za okolico, zdravijo v bolnišnicah. Mednje spada tudi Slovenija. Takrat je pomembno, da imamo rezultat genotipizacije na voljo že v času, ko je bolnik še na zdravljenju v bolnišnici. V svetovnem merilu je naša raziskava prva prospektivna raziskava, ki je skušala dokazati možnost tipizacije bacilov tuberkuloze iz svežih kliničnih vzorcev s standardizirano metodo MIRU-VNTR/24, po protokolu za tipizacijo bacilov tuberkuloze iz bakterijske kulture. Tri predhodne raziskave so vsaka na svoj način želele dokazati možnost tipizacije neposredno iz vzorcev, vendar nobena od njih ni bila prospektivna na neselekcioniranih rutinskih vzorcih. Za razliko od naše raziskave je raziskava Mokrousova s sodelavci (Mokrousov in sod., 2009) za tipizacijo bacilov tuberkuloze iz izmečkov bolnikov s tuberkulozo, okuženih z virusom HIV iz Kirgizistana, uporabila metodo MIRU-VNTR/12. Tipizacijo so dopolnili z dodatnimi testiranji treh visoko variabilnih lokusov. V njihovi raziskavi ni podatka o mikroskopski pozitivnosti vzorcev, vendar lahko predvidevamo, da gre za visoko pozitivne vzorce, saj je bila v raziskavo vključena populacija v zaporih, kjer je pogosto bolnik zelo pozno odkrit in neustrezno zdravljen. Zelo dober potencial za neposredno tipizacijo izolatov iz sklopa M.
tuberculosis, iz zgodnjih kliničnih vzorcev, je pokazala študija iz leta 2012 (Alonso in sod., 2012). Raziskovalci so uspeli dobiti popoln genotip (24 mestna koda) za vse bolnike razen enega. Študija je bila izvedena retrospektivno na izbranih vzorcih, ki so bili visoko mikroskopsko pozitivni, zato tovrstni vzorci ne predstavljajo vsakdanjega nabora kliničnih vzorcev, pri katerih je lahko zelo spremenljiva mikroskopska pozitivnost, kakovost in količina. Raziskava, ki jo opisuje Alonso in sod. (2012) je vsebovala tudi čiščenje PCR produktov, kar je še dodatno pripomoglo k izboljšanju rezultata tipizacije, ne sovpada pa z dnevnim rutinskim delom v laboratoriju, kot je to prikazano v naši raziskavi.
Raziskava na Nizozemskem (De Beer in sod., 2014c) opisuje tipizacijo bacilov tuberkuloze na vzorcih bronhoalveolarne lavaže (BAL), v katere so dodali natančno določeno količino DNK (različne redčitve), nekaj izbranih izolatov M. tuberculosis. Tudi rezultati te raziskave ne odražajo realnega stanja tipizacije bacilov tuberkuloze v rutinskem laboratoriju za tuberkulozo. V svoji raziskavi so uporabili optimizirano različico metode MIRU-VNTR/24 in ne standardizirane oblike, kot smo to naredili v naši raziskavi. Kljub temu so bili njihovi odstotki popolnoma genotipiziranih izolatov nižji kot v naši raziskavi.
Hkrati je bila naša raziskava v svetovnem merilu tudi prva v katero smo vključili ne samo prve bolnikove vzorce, odvzete ob postavitvi diagnoze tuberkuloze, ampak pri vsakem od 26 bolnikov tudi do 10 dodatnih vzorcev, odvzetih po uvedbi zdravljenja do mikroskopske negativizacije bolnika. Tako smo dokazali uspešnost tipizacije tudi še več tednov po začetku zdravljenja.
Rezultati naše raziskave kažejo, da je uspešna tipizacija z metodo MIRU-VNTR/24 neposredno iz kliničnih vzorcev močno povezana s stopnjo mikroskopske pozitivnosti vzorcev. Kot je bilo pričakovati, je bila opažena višja korelacija (R = 0,654) med mikroskopsko pozitivnostjo in številom uspešno določenih lokusov v prvi skupini vzorcev, odvzetih ob postavitvi diagnoze, pred uvedbo zdravljenja (prvi vzorci, n = 26) (p = 0,0003), v primerjavi z drugo skupino vzorcev, odvzetih v približno tedenskih intervalih po uvedbi zdravljenja do mikroskopske negativizacije (nadaljnji vzorci, n = 53) (R = 0,415, p
= 0,002). Mnogi od vzorcev iz druge skupine so bili analizirani več tednov po začetku zdravljenja, ko je mikobakterijska DNK lahko že poškodovana. Kljub temu, smo v naši raziskavi tipizirali bacile tuberkuloze neposredno iz kliničnih vzorcev, tudi še več tednov
po začetku zdravljenja, vendar le v primeru, ko je bila mikroskopska pozitivnost vzorcev še vedno dovolj visoka.
Rezultati naše raziskave so pokazali, da je stopnja uspešnosti tipizacije odvisna tudi od nekaterih značilnosti posameznega kliničnega vzorca. Visoka količina sluzi, sline ali nekaterih zaviralcev v vzorcu (hrana, zdravila…) lahko zniža učinkovitost tipizacije zaradi poškodovane DNK, oziroma zmanjšane količine izločene (ekstrakcija) DNK iz vzorca.
Vsaj dva bolnika s svojimi vzorci nakazujeta na potrditev te domneve. Pri prvem bolniku smo zbrali 11 kliničnih vzorcev (od prvega dne, ko je bil bolnik odkrit kot nov primer tuberkuloze do 83 dne), ki so bili različno mikroskopsko pozitivni (3+, 1+, 2ARB, 1ARB).
Samo enega vzorca, odvzetega 28 dan po postavitvi diagnoze, mikroskopsko pozitivnega 1+, ni bilo mogoče popolnoma tipizirati, pri vseh ostalih vzorcih smo dobili popoln genotip (Preglednica 18, bolnik KSA). V popolnem nasprotju pa so bili rezultati tipizacije drugega bolnika, pri katerem smo zbrali 7 kliničnih vzorcev, v časovnem obdobju od tretjega dne po določitvi, da gre za novoodkritega bolnika s tuberkulozo, pa do 43 dne. Mikroskopska pozitivnost vzorcev je bila prav tako, kot pri prvem bolniku zelo različna (1+, 2ARB, 1ARB in NEG). V tem primeru, niti en vzorec ni bil tipiziran uspešno, kar pomeni, da niti pri enem vzorcu nismo uspeli pridobiti popoln 24-mestni genotip (Preglednica 18, bolnik HHA). Ti rezultati kažejo, da raziskave, v katerih niso vključeni vsakdanji klinični vzorci, ne kažejo pravega stanja možnosti tipizacije bacilov tuberkuloze iz kliničnih vzorcev, v katerih se nahajajo številne snovi, ki lahko zavirajo uspešnost tipizacije.
Naši rezultati so na nivoju bolnika pokazali uspešnost tipizacije v 69,2 %. Pri 18 bolnikih, od skupno 26, smo uspeli pridobiti popoln genotip pri enem izmed vzorcev. Pri ostalih osmih bolnikih smo uspeli tipizirati najmanj 16 lokusov od skupno 24.
V primerih, ko je genotip nepopoln je pomembno vedeti kakšno vlogo ima posamezen lokus pri uvrščanju genotipa v genetsko družino. V ta namen smo analizirali 919 slovenskih izolatov in ovrednotili pomen posameznega lokusa (pogostost alela na lokusu).
Primerjalna analiza je pokazala različno stopnjo pomembnosti, glede na lokus. Lokus 4156, ki je bil pri naših vzorcih najbolj pogosto manjkajoč lokus, je pokazal zelo nizko raznolikost svojih alelov, kar pomeni, da bi lahko tudi brez podatka o tem lokusu z veliko
verjetnostjo genotip uvrstili v določeno genetsko družino. V nasprotju z njim pa je lokus 2163b pokazal eno najvišjih stopenj alelne raznolikosti med slovenskimi izolati. V primeru, da je manjkajoči lokus 2163b, je zelo težko zanesljivo razvrstiti nek genotip v genetsko družino.
Seveda se moč razvrščanja v genetske družine zmanjšuje z naraščanjem števila manjkajočih lokusov. Pomembno je, da lahko celo nepopolne rezultate genotipizacije, s precejšnjim številom manjkajočih lokusov, izkoriščamo za hitro izključitev suma navzkrižne kontaminacije ali prenosa tuberkuloze.
Da bi uvedli tovrstno tipizacijo bacilov tuberkuloze iz kliničnih vzorcev v dnevno prakso, smo ovrednotili tipizacijo tudi iz stroškovnega vidika. Upoštevajoč le ceno reagentov se je cena tipizacije enega izolata gibala okoli 60€, v kolikor tipizacije ni bilo potrebno ponoviti.
Ob nezmožnosti tipiziranja vseh lokusov v prvem poskusu se je cena tipizacije enega izolata podvojila. Analiza je pokazala, da je tipizacija direktno iz kliničnih vzorcev upravičena le v primeru, ko je vzorec dovolj visoko mikroskopsko pozitiven (3+, 2+) in je uspešnost tipizacije zadovoljivo visoka. Takšen način tipizacije, nam lahko omogoča, hitro izključitev suma navzkrižne kontaminacije ali odkritje nedavnega prenosa tuberkuloze med bolniki.
Naša prospektivna raziskava na kliničnih vzorcih je pokazala, da je tipizacija bacilov tuberkuloze s standardizirano metodo MIRU-VNTR/24, prvotno opisano za bakterijsko kulturo, lahko zelo uspešna v primeru, ko je vzorec mikroskopsko dovolj pozitiven. Čeprav bi bilo možno še uspešneje tipizirati bacile tuberkuloze v primeru, da bi standardizirano metodo optimizirali (očiščevanje PCR produktov), smo z našo raziskavo želeli dokazati, da je lahko tipizacija uspešna tudi ob uporabi vsakdanjih protokolov, brez optimizacije, in da lahko z omenjeno metodo, hitro razrešimo nekatera epidemiološka vprašanja, ki potrebujejo nujno obravnavo (Bidovec-Stojkovič in sod., 2014). S tem smo tudi potrdili našo tretjo zastavljeno hipotezo.