Osamitev in ugotavljanje lastnosti novih sevov laktobacilov

Nove seve smo pridobili iz tekočine kisle repe, kislega mleka ali kislega zelja. Serijske razredčitve v fiziološki raztopini smo nanesli na agar MRS in inkubirali za 48 ur pri 37

°C v anaerobnih škatlah (Genbox, Biomerieux, Francija). Vse bele okrogle kolonije smo prečistili na gojišču MRS, posamezne kolonije pa precepili v tekoče gojišče MRS.

Celice za shranjevanje smo pridobili s centrifugiranjem in resuspendiranjem usedline v bujonu MRS s 30 % glicerola.

Za namnoževanje biomase smo kulture gojili pri 37 °C v tekočem gojišču MRS, v mikroaerofilnih razmerah, petrijeve plošče pa smo inkubirali v anaerobnih razmerah.

Kulture smo shranjevali v bujonu MRS s 30 % glicerola pri -80 °C, za daljše obdobje, oziroma pri -20 °C, za krajše obdobje.

3.2.1.2 Izolacija genomske DNK in določanje vrste s sekvenciranjem dela gena za 16S rRNK

- Priprava elektrokompetentnih celic sevov E. coli DH10β

Za pripravo elektrokompetentnih celic smo sev E.coli DH10β, shranjen pri temperaturi -80 °C, nacepili na agarne plošče 2TY in inkubirali preko noči pri temperaturi 37 °C. S posameznimi kolonijami smo inokulirali 7 ml gojišča 2TY in inkubirali s stresanjem preko noči pri temperaturi 37 °C (200 rpm). S tem inokulumom smo inokulirali 2 litrske Erlenmajerjeve steklenice s 400 ml gojišča 2TY (1 % inokulum). Celice smo gojili 2−3

ure s stresanjem (37 °C, 220 rpm). Celice so bile pripravljene, ko je OD600 dosegel 0,9.

Takrat smo celice v kivetah postavili na led za 20 min in centrifugirali (4 °C, 4000 rpm, 10 min). Po centrifugiranju smo celice dvakrat spirali z dH2O z 1 mM HEPES pH 7,0 in enkrat z 97,5 ml 10 % glicerolom z 1 mM HEPES pH 7,0 z vmesnim centrifugiranjem po vsakem koraku (4 °C, 4000 rpm, 10 min). Po zadnjem centrifugiranju so bile celice resuspendirane v 2,5 ml 10 % glicerola/1 mM HEPES pH 7,0. Tako pridobljeno raztopino celic smo razdelili v paralelke po 40 µl in jih shranili pri temperaturi -80 °C za nadaljnje poskuse.

- izolacijo genomske DNK L. plantarum sevov

Za izolacijo genomske DNK smo shranjene seve namnožili preko noči (16 ur) in inkubirali pri 37 °C v mikroaerofilnih razmerah. Nato smo sveže gojišče MRS inokulirali z 10 % prekonočne kulture ter jih gojili 5 ur pri 37 °C v mikroaerofilnih razmerah, da smo dobili celice v logaritemski fazi rasti. Celice smo izločili iz gojišča s centrifugiranjem. Genomsko DNK smo pridobili s pomočjo kompleta reagentov PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, ZDA). Izolacija je potekala v skladu z navodili izdelovalca kompleta, le da smo podaljšali inkubacijo z lizocimom na 45 min.

Vsa spiranja smo opravili dvakrat.

Del gena za 16S rRNK smo namnožili z verižno reakcijo s polimerazo (PCR), v kateri smo uporabili začetna oligonukleotida P1 (5'-GCGGCGTGCCTAATACATGC ) in P4 (5'-ATCTACGCATTTCACCGCTAC) (Klijn in sod., 1991). Pomnožek PCR smo očistili s komercialnim kompletom reagentov Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, ZDA). A-repi so bili dodani s polimerazo DreamTaq (30 μl očiščenega PCR-produkta, 5 μl PCR-pufra, 4 μl dNTP, 1 μl polimeraze DreamTaq (Thermo Scientific, ZDA), 72 °C, 30 min). Pomnožek PCR smo ponovno očistili.

Očiščen produkt smo ligirali s kompletom TA Coloning (Invitrogen, ZDA) (2 μl PCR 2.1 vektorja, 1 μl ligaze, 1 μl pufra za ligacijo, 6 μl očiščenega PCR-produkta, čez noč na 4° C) ter izvedli elektroporacijo s predpripravljenimi kompetentnimi celicami E. coli DH10β. 2 µl ligacijske reakcije smo dodali kompetentnim celicam, jih obdelali z elektroporacijo, zmešali z 1 ml gojišča 2TY ter inkubirali 45 min pri 37 °C. Celice smo izločili s centrifugiranjem (5000 rpm, 3 min), pri čemer smo 800 μl supernatanta zavrgli. Preostanek je bil resuspendiran in nacepljen na agar 2TY z X-gal, IPTG in kanamicinom (preglednica 1). Plošče z agarjem smo inkubirali čez noč pri 37 °C. Zrasle posamezne bele kolonije smo preko noči gojili pri 37 °C v tekočem gojišču 2TY z ampicilinom (preglednica 1). Plazmide smo izolirali iz kulture s pomočjo kompleta reagentov GenElute™ Plasmid Miniprep Kit (Sigma, ZDA). Restrikcija je bila narejena z encimom EcoRI (Fast Digest, Thermo Scientfic, ZDA) in fragmenti, pregledani na agaroznem gelu (dolžina približno 700 bp). Po 6 fragmentov vsakega seva, ki so imeli pravo dolžino, smo poslali na sekvenciranje (Macrogen, Seoul, Korea). Pridobljena zaporedja smo s pomočjo orodja NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) primerjali z zaporedji v genski banki NCBI ter na podlagi tega ugotovili vrsto.

3.2.1.3 Primerjava sevov z gelsko elektroforezo v pulzirajočem polju (PFGE)

Šest sevov L. plantarum smo gojili preko noči v gojišču MRS z 10 g/l glicina (0,1 % inokulum, 37 °C) in jim naslednji dan dodali kloramfenikol (preglednica 1) in inkubirali še dodatno uro pri 37 °C. Bakterijske celice smo izločili s pomočjo centrifugiranja in jih sprali s pufrom za protoplaste brez saharoze, v skladu s protokolom za pripravo protoplastov (Singhvi in sod., 2010). Naslednje spiranje je potekalo s pufrom za protoplaste s saharozo (PB). Usedlino s celicami smo resuspendirali v 500 µl PB ter prenesli 100 µl v 400 µl PB z dodanim lizocimom (10 mg/ml) in mutanolizinom (40 U/ml). Celice smo inkubirali 2 uri pri 37 °C ter jim nato dodali 500 µl 2 % agaroze z nizkim tališčem (Biorad, ZDA). Z mešanico smo napolnili model za pripravo agaroznih blokov. Ko so se strdili, smo jih odstranili iz modela in prenesli v pufer za lizo (6 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 M NaCl, 0,5 M EDTA, 1 % natrijev lauril sarkozin, lizocim 5 mg/ml) za 60 min pri 37 °C. Bloke smo nato dvakrat po 15 minut spirali s 50 mM EDTA (pH 9,5) in prenesli v pufer (25 mM EDTA, pH 9,5, 1 % natrijev lauril sarkozin) s proteinazo K (1 mg/ml). Po 24 urah inkubacije na 50 °C z rahlim mešanjem smo bloke sprali 4-krat po 30 min na ledu s TE-pufrom (pH 8). Bloke smo nato do uporabe hranili pri 4 °C v 0,5 M EDTA (pH 9,5). Pred restrikcijo smo jih 3-krat po 30 min na ledu spirali s sterilno ddH2O in nato še za 30 min na sobni temperaturi z restrikcijskim pufrom. Restrikcijo smo izvedli z restrikcijskim encimom SfiI (5 µl/blok, Thermo Scientific, ZDA). Fragmente DNK smo ločili v 1-odstotnem agaroznem gelu s Chef Mapper elektroforeznim sistemom (Biorad, ZDA). Elektroforeza je potekala 23 ur in 52 min v 0,5-kratnem TBE-pufru na 14 °C. Začetni pulzni čas je bil 1,19 s in končni 63,80 s. Po končani elektroforezi smo gel barvali 1 uro v TBE-pufru z dodanim barvilom za barvanje gelov (SaybrSafe, Invitrogen, ZDA).

3.2.1.4 Odpornost proti antibiotikom

Ugotavljali smo minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) antibiotikov ampicilin (AM), gentamicin (GM), kanamicin (KM), streptomicin (SM), eritromicin (EM), klindamicin (CM), kloramfenikol (CL), vankomicin (VA) in tetraciklin (TC), ki jih navajajo v smernicah EFSA za ugotavljanje občutljivosti bakterijskih sevov za antibiotike (2012). V vsako ploščo s polmerom 9 cm smo nalili 25 ml trdnega gojišča Mueller Hinton (90 %) + MRS (10 %). Plošče z agarjem smo dobro osušili ter nanesli prekonočne celice kultur, ki smo jih zbrali s centrifugiranjem in resuspendirali v fiziološki raztopini, da smo dosegli OD pri 600 nm okoli 0,3. Na vsako ploščo smo s sterilno vatirano palčko nacepili 100 μl suspenzije ter na površino položili po en trak za gradientom antibiotikov E-Test® (BioMerieux, Francija) (slika 12). Plošče smo inkubirali 48 ur pri 37 °C v anaerobnih razmerah in rezultate interpretirali v skladu z navodili proizvajalca ter priporočili EFSA (2012).

Slika 12: Ugotavljanje antibiotične odpornosti s pomočjo E-test®-a.

Figure 12: Antibiotic resistance determination with use of E-test®.

3.2.2 Stres, povezan s stacionarno fazo rasti