3.6.1 Izolacija DNK
DNK smo izolirali iz vseh respiratornih vzorcev z aparatom Nordiag Arrow (Nordiag Arrow/DiaSorin Liaison IXT, DiaSorin, Saluggia, Italija), ki omogoča avtomatizirano izolacijo nukleinskih kislin iz različnih kliničnih vzorcev s pomočjo tehnologije magnetnih kroglic. Za izolacijo smo uporabili komercialni komplet BUGS'n BEADS (DiaSorin).
Kartuše tega kompleta so namenjene direktni izolaciji nukleinskih kislin bakterij in virusov iz različnih kliničnih vzorcev brez prehodne obdelave z encimi ali visoko temperaturo.
Magnetne kroglice kompleta BUGS'n BEADS imajo posebno površino, na katero se v začetku postopka izolacije oprimejo različni po Gramu pozitivni in po Gramu negativni bakterije ter virusi. Kasneje v postopku aparat spere okoliško snov in doda raztopino za lizo celic. Nukleinske kisline se vežejo na magnetne kroglice. Nevezan zunajcelični material aparat na koncu postopka spere in ostane le izolat nukleinskih kislin.
Vzorce smo pripravili tako, da smo 100 μL respiratorne kužnine suspendirali v 2 mL pufra PBS. V 1,5 mL veliko mikrocentrifugirko smo prenesli 700 μL suspendirane kužnine.
Močno viskozne izmečke smo predhodno obdelali, in sicer smo vzorcu dodali mešanico 2 % NALC + NaOH ter ga vorteksirali eno minuto. Nato smo ga inkubirali petnajst minut pri sobni temperaturi, centrifugirali deset minut pri 8.000 rpm in nato odstranili supernatant. Dodali smo 2 mL pufra PBS, vorteksirali, centrifugirali deset minut pri 8.000 rpm in odstranili supernatant. Sediment smo resuspendirali v 700 μL pufra PBS.
Nadaljnji postopek je potekal v aparatu po izbranem programu Bugs’n Beads 2.0. Izbrali smo volumen vzorca (700 µL) in izolata (100 µL). Na ustrezno mesto v aparatu smo vstavili črpalko z nastavkom in kartušo Bugs’n Beads. Kartušo smo preluknjali s kovinskim luknjačem. Vstavili smo vzorec in označeno mikrocentrifugirko za zbiranje izolata DNK. Po končanem programu smo odstranili mikrocentrifugirke z izolatom DNK in jih do uporabe shranili pri –20 °C.
3.6.2 In-house hkratni PCR
Pripravo in-house hkratnega testa PCR, specifičnega za bakterijo S. pneumoniae, smo opisali v predhodno objavljenem članku (Lužnik in sod., 2015). S testom smo bili zadovoljni, zato smo ga uporabili tudi v nadaljevanju raziskave doktorske disertacije. Test smo pripravili z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so bili objavljeni in ovrednoteni v strokovnih člankih (Preglednica 1).
Preglednica 1: Začetni oligonukleotidi, uporabljeni v verižni reakciji s polimerazo Table 1: Primers used in polimerase chain reaction
Par začetnih oligonukleotidov cpsA je oblikovan na osnovi 492 bp dolgega dobro ohranjenega zaporedja gena cpsA. Dolžina produkta PCR je 350 bp (Park in sod., 2010).
Zaporedje za par začetnih oligonukleotidov, specifičnih za gen lytA, je izbran iz 901 bp dolge dobro ohranjene regije gena lytA. Začetna oligonukleotida znotraj gena lytA nalegata na mesti od 306 bp do 326 bp in od 386 bp do 406 bp (McAvin in sod., 2001). Kot interno kontrolo smo vključili v reakcijo par začetnih oligonukleotidov, specifičnih za gen za malo ribosomsko podenoto RNK (16S-rRNA) (Prere in sod., 2011). Reakcijsko mešanico in pogoje reakcije PCR smo pripravili po navodilih proizvajalca reakcijske mešanice (PCR Master Mix (2 x), Fermentas/Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ZDA).
50 µL reakcijske zmesi je vsebovalo naslednje sestavine:
25 µL PCR Master Mix (2 x)
0,4 µM koncentracije obeh začetnih oligonukleotidov 14 µL vode
Začetni
oligonukleotid Zaporedje (5' -> 3') Dolžina PCR
produkta (bp) Vir
cpsA-382F ACGCAACTGACGAGTGTGAC 350 Park in sod. (2010)
cpsA-735R GATCGCGACACCGAACTAAT 350 Park in sod. (2010)
lytA-F ACGCAATCTAGCAGATGAAGC 101 McAvin in sod. (2001)
lytA-R TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC 101 McAvin in sod. (2001)
16S-rRNA -F TCAAATGAATTGACGGGGGC 478 Prere in sod. (2011)
16S-rRNA -R GGCCCGGGAACGTATTCAC 478 Prere in sod. (2011)
5 µL genomske DNK
PCR-reakcije smo izvedli na aparatu Thermocycler T3000 (Biometra GmbH, Goettingen, Nemčija). Verižno reakcijo pomnoževanja DNK v realnem času smo začeli s tremi minutami denaturacije pri 95 °C. Sledilo je 40 ciklov, sestavljenih iz:
-denaturacije 30 sekund pri 95 °C, -prileganja 30 sekund pri 52 °C, -podaljševanja 40 sekund pri 72 °C.
PCR smo zaključili z desetimi minutami podaljševanja verige DNK pri 72 °C in ohlajanjem na 4 °C.
PCR-produkte smo pregledali z agarozno gelsko elektroforezo na predpripravljenih dvaodstotnih agaroznih gelih E-gel (Invitrogen/Life Technologies, Kalifornija, ZDA).
Poleg produktov PCR smo na gel nanesli tudi lestvico 100 bp (Sigma-Aldrich, Missouri, ZDA), ki vsebuje deset enakomerno razporejenih fragmentov dolžine 100 bp do 1000 bp.
Vzorce, pri katerih na gelu ni bilo lise za interno kontrolo, smo zamrznili in ponovili test PCR. Če tudi po ponovljeni reakciji na gelu ni bilo lise interne kontrole, smo vzorcu pripisali neveljaven rezultat.
3.6.3 In-house PCR v realnem času
In-house PCR v realnem času, pripravljen po principu TaqMan in specifičen za bakterijo S.
pneumoniae, smo pripravili z uporabo začetnih oligonukleotidov in fluorescenčno označenih sond, ki so bili objavljeni in ovrednoteni v strokovnih člankih (Preglednica 2).
Preglednica 2: Začetni oligonukleotidi in fluorescenčno označeni sondi, uporabljeni v verižni reakciji s polimerazo v realnem času
Table 2: Primers and probes used in real-time polymerase chain reaction Začetni
oligonukleotid Zaporedje (5' -> 3') Dolžina PCR produkta (bp) Vir
lytA-F ACGCAATCTAGCAGATGAAGC 101 McAvin in sod. (2001)
lytA-R TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC 101 McAvin in sod. (2001)
Bak-F TCCTACGGGAGGCAGCAGT 466 Nadkarni in sod. (2002)
Bak-R GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT 466 Nadkarni in sod. (2002)
Sonda
lytA-probe Cy5-TTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGG / McAvin in sod. (2001)
Bak-probe FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC / Nadkarni in sod. (2002)
Zaporedje za par začetnih oligonukleotidov, specifičnih za gen lytA, in fluorescenčno označeno sondo smo izbrali iz 901 bp dolge dobro ohranjene regije gena lytA. Začetna oligonukleotida znotraj gena lytA nalegata na mesti od 306 bp do 326 bp in od 386 bp do 406 bp. Fluorescenčna sonda, označena z barvilom Cy5, je nalegala na gen lytA od mesta 330 do 354 (McAvin in sod., 2001). Kot interno kontrolo smo vključili par začetnih oligonukleotidov in sondo širokega spektra Bak. Ta set začetnih oligonukleotidov in sonde so raziskovalci določili s poravnavo zaporedij genov 16S rRNA večine poznanih bakterijskih skupin in izbire najustreznejšega zaporedja s pomočjo ustrezne programske opreme (Nadkarni in sod., 2002).
Reakcijsko mešanico in pogoje PCR-reakcije v realnem času smo pripravili po navodilih proizvajalca reakcijske mešanice Maxima Probe qPCR Master Mix (2 x) (Fermentas/Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, ZDA). Za vsak vzorec smo pripravili dve reakcijski mešanici in izvedli dve reakciji PCR. V prvi smo uporabili začetne oligonukleotide, specifične za S. pneumoniae, in v drugi začetne oligonukleotide širokega bakterijskega spektra.
25 µL reakcijska zmes je vsebovala naslednje sestavine:
12,5 µL Maxima Probe qPCR Master Mix (2 x) 0,4 µM koncentracije obeh začetnih oligonukleotidov 0,2 µM koncentracije označene sonde
7,5 µL vode
2,5 µL genomske DNK
PCR v realnem času smo izvedli na aparatu Cepheid Smartcycler (Cepheid, Kalifornija, ZDA). Verižno reakcijo pomnoževanja DNK v realnem času smo začeli z desetimi minutami denaturacije pri 95 °C. Sledilo je 40 ciklov, sestavljenih iz:
-denaturacije 15 sekund pri 95 °C, -prileganja 30 sekund pri 60 °C, -podaljševanja 30 sekund pri 72 °C.
Vzorce, pri katerih ni bilo rezultata interne kontrole, smo zamrznili in ponovili test qPCR.
Če tudi po ponovljeni reakciji ni bilo rezultata interne kontrole, smo vzorcu pripisali neveljaven rezultat.