PRIMERJAVA DVEH qPCR SISTEMOV ZA UGOTAVLJANJE

EVKARIONTSKE DNK

Da bi ugotovili, v kolikšni meri para univerzalnih bakterijskih začetnih oligonukleotidov EUB 338F+518R in Nadkarni F+R pomnožujeta bakterijsko in evkariontsko DNK, smo naredili dve qPCR reakciji, pri čemer smo enkrat vzorce pomnoževali z enim parom začetnih oligonukleotidov in drugič z drugim. Pri obeh reakcijah smo v reakcijske mešanice dodajali znane količine bakterijske in evkariontske DNK, podane v številu kopij tarčne DNK.

Število kopij tarčne DNK smo ocenili po naslednjem postopku. Iz znane velikosti genoma organizma (v Mb) in molekularne teže baznega para (660 Da oziroma 1,09 × 10^-12 ng) smo izračunali maso genoma (v ng). Glede na koncentracijo DNK v vzorcu, ki smo jo izmerili spektrofotometrično z napravo NanoVue™ (GE Healthcare LifeSciences), smo izračunali, koliko genomov je v 1 µl raztopine DNK. Nato smo dobljeno število zmnožili s številom operonov 16S rRNK za bakterijski sev oziroma s številom kopij mitohondrijske 16S rDNK za evkariontske celice.

Pri izračunu števila kopij tarčne evkariontske DNK smo predpostavili, da ima diploidna evkariontska celica, poleg genoma, 2.500 kopij mitohondrijske 16S rDNK. Število kopij mitohondrijske DNK smo ocenili iz podatka, da lahko celica vsebuje tudi do 1.000 mitohondrijev (Cooper in Hausman, 2007), pri čemer smo upoštevali srednjo vrednost.

Vsak mitohondrij pa vsebuje od 2 do 10, v povprečju 5 (Satoh in Kuroiwa, 1991), kopij mitohondrijske DNK. Ker je v primerjavi z jedrno DNK kopij mitohondrijske DNK veliko več, smo število kopij jedrne DNK zanemarili.

Preglednica 11: Ocenjeno število kopij tarčne bakterijske in evkariontske DNK Velikost

*= vir NCBI, **= vir baza podatkov rrndb (Klappenbach in sod., 2001)

#= po delovni hipotezi je ob enem evkariontskem genomu prisotnih 2.500 kopij mitohondrijske 16S rDNK

V reakcijske mešanice smo dodajali bodisi samo bakterijsko DNK ali samo evkariontsko DNK, bodisi mešanice bakterijske in evkariontske DNK v potencialnih razmerjih tarčnih kopij 1:1, 1:5, 1:10 in 1:100 glede na dve izbrani redčitvi bakterijske DNK. Redčitvi bakterijske DNK smo izbrali na podlagi umeritvene krivulje, ki smo jo pripravili z osamljeno DNK bakterijskega seva B. thetaiotaomicron (Redčitev 1 = 111.317 kopij DNK/µl in Redčitev 2 = 22.263 kopij DNK/µl). Izbrani redčitvi sta ustrezali spodnjem rangu pričakovanih količin bakterijske DNK v vzorcih. Shema ocenjenih količin, ki smo jih dodajali v reakcijske mešanice, je predstavljena v preglednici 12. V prilogi H je količina DNK, ki smo jo dodajali v reakcijske mešanice poleg ocenjenega števila kopij tarčne DNK/µl, podana še v masi (ng/µl), ki smo jo izmerili spektrofotometrično.

Preglednica 12: Teoretično število kopij tarčne DNK, ki smo jih dodajali v reakcijske mešanice

Redčitev 1 Redčitev 2

EVK DNK (100 enot) 10.894.495 2.178.899

BAKT DNK (1 enota) 111.317 22.263

BAKT:EVK 1:1 111.317 108.945 22.263 21.789

BAKT:EVK 1:5 111.317 544.725 22.263 108.945

BAKT:EVK 1:10 111.317 1.089.450 22.263 217.890

BAKT:EVK 1:100 111.317 10.894.495 22.263 2.178.899

BAKT DNK – bakterijska DNK, EVK DNK – evkariontska DNK

V preglednici 13 so zbrani rezultati qPCR reakcij za obe redčitvi. Rezultat prestavlja povprečje dveh ponovitev na ploščici. Rezultati za obe ponovitvi s podano srednjo vrednostjo in standardno napako so zbrani v prilogi I. Na slikah 4 in 5 sta grafična prikaza rezultatov.

Preglednica 13: Rezultati qPCR reakcij pomnoževanja bakterijske DNK, evkariontske DNK in mešanic obeh v potencialnih razmerjih 1:1, 1:5, 1:10 in 1:100 s paroma univerzalnih bakterijskih začetnih oligonukleotidov Nadkarni F+R in EUB 338F+518R

Redčitev 1 Redčitev 2

Nadkarni F+R EUB 338F+518R Nadkarni F+R EUB 338F+518R

EVK DNK (1 enota) 378 19.038 559 4.434

BAKT:EVK 1:100 113.989 3.894.379 17.199 433.896

BAKT DNK – bakterijska DNK, EVK DNK – evkariontska DNK; *,** – vrednosti 111.317 in 22.263 sta bili definirani kot standard za umeritveno krivuljo qPCR reakcije.

Slika 4: Redčitev 1: Grafični prikaz rezultatov qPCR reakcij s paroma univerzalnih bakterijskih začetnih oligonukleotidov Nadkarni F+R (modri stolpci) in EUB 338F+518R (oranžni stolpci). EVK – evkariontska DNK, BAKT – bakterijska DNK. Rezultati so zaradi lažje ponazoritve prikazani na logaritemski skali.

Iz grafa na sliki 4 je razvidno, da pri pomnoževanju tarčnih odsekov iz same evkariontske DNK s parom začetnih oligonukleotidov EUB 338F+518R nastane večje število PCR produktov kot s parom Nadkarni F+R. Pri pomnoževanju s parom EUB 338F+518R smo pri dodatku ene enote evkariontske DNK zaznali 50-krat več, pri dodatku petih enot 233-krat več, pri dodatku desetih enot 320-233-krat več in pri dodatku stotih enot 459-233-krat več PCR produktov kot s parom začetnih oligonukleotidov Nadkarni F+R. Število PCR produktov se glede na dodano eno enoto evkariontske DNK pri paru Nadkarni F+R pri dodatku petih enot praktično ne spremeni, pri dodatku desetih enot se poveča za približno polovico, pri dodatku stotih enot pa za približno 19-krat. Par EUB 338F+518R pa na drugi strani tarčne odseke iz evkariontske DNK pomnožuje veliko učinkoviteje. Glede na eno enoto evkariontske DNK pri dodatku petih enot nastane približno 5-krat več PCR produkta, pri dodatku desetih enot 10-krat več produkta in pri dodatku stotih enot nastane kar 172-krat več PCR produkta pri pomnoževanju s parom EUB 338F+518R.

Pri pomnoževanju tarčnih odsekov iz mešanic bakterijske in evkariontske DNK smo prav tako zaznali večje število nastalih PCR produktov pri pomnoževanju s parom začetnih oligonukleotidov EUB 338F+518R kot s parom Nadkarni F+R. Pri pomnoževanju s parom EUB 338F+518R opazimo, da pride pri dodatku enake količine bakterijske in evkariontske DNK do nastanka približno polovice več PCR produkta, kot je dodanih kopij bakterijske DNK v reakcijski mešanici. Pri dodatku petkrat večje količine evkariontske DNK glede na količino dodane bakterijske DNK pride do 2,5-krat več produkta glede na število dodanih kopij bakterijske DNK. Pri desetkrat večji količini evkariontske DNK nastane 4-krat več produkta, pri stokrat večji količini evkariontske DNK pa 35-krat več produkta, kot če bi

1 Ekvivalent št. kopij DNK v qPCR reakciji (log)

Število kopij DNK v reakcijski mešanici

Nadkarni F+R EUB 338F+518R

bila v reakcijski mešanici sama bakterijska DNK, medtem ko pri pomnoževanju mešanice bakterijske in evkariontske DNK s parom Nadkarni F+R opazimo, da se kljub dodatku različnih količin evkariontske DNK rezultat qPCR reakcije bistveno ne spremeni.

Slika 5: Redčitev 2: Grafični prikaz rezultatov qPCR reakcij s paroma univerzalnih bakterijskih začetnih oligonukleotidov Nadkarni F+R (modri stolpci) in EUB 338F+518R (oranžni stolpci). EVK – evkariontska DNK, BAKT – bakterijska DNK. Rezultati so zaradi lažje ponazoritve prikazani na logaritemski skali.

Iz grafa na sliki 5 je razvidno, da tudi pri nižjem številu kopij same evkariontske DNK v reakcijski mešanici par začetnih oligonukleotidov EUB 338F+518R to pomnožuje bolj učinkovito kot par Nadkarni F+R. Zopet lahko opazimo, da nastane pri pomnoževanju s parom EUB 338F+518R več PCR produkta kot pri pomnoževanju evkariontske DNK s parom Nadkarni F+R. Vendar je razlika tokrat manjša in doseže največjo vrednost pri stotih enotah evkariontske DNK, ko je ta razlika približno 100-kratna.

Pri mešanicah bakterijske in evkariontske DNK lahko opazimo, da ima pri pomnoževanju s parom začetnih oligonukleotidov Nadkarni F+R dodatek evkariontske DNK inhibitorni učinek na pomnoževanje bakterijske DNK. Ne glede na količinsko razmerje bakterijske in evkariontske DNK v mešanici nastane manjše število PCR produktov, kot je bilo dodanih kopij bakterijske DNK. Tudi pri mešanici nastane s parom začetnih oligonukleotdiov EUB 338F+518R več PCR produkta kot pri paru Nadkarni F+R. Pri dodatku enake količine bakterijske in evkariontske DNK je ta razlika približno 2-kratna, pri dodatku petih enot 3-kratna, pri dodatku desetih enot je ta razlika 4,5-kratna. Pri dodatku stotih enot nastane s parom EUB 339F+518R že približno 25-krat več PCR produkta kot s parom Nadkarni Ekvivalent št. kopij DNK v qPCR reakciji (log)

Število kopij DNK v reakcijski mešanici

Nadkarni F+R EUB 338F+518R

Povzamemo lahko, da ima dodatek evkariontske DNK pri pomnoževanju s parom začetnih oligonukleotidov Nadkarni F+R dvojno vlogo. Pri manjši količini bakterijske DNK v reakcijski mešanici deluje dodatek evkariontske DNK inhibitorno na pomnoževanje bakterijske DNK, medtem ko pri dodatku same evkariontske DNK, predvsem če je te veliko, deluje kot tarčna DNK za pomnoževanje. Glede na dobljene rezultate sklepamo, da je v spodnjem rangu pričakovanih količin bakterijske DNK v vzorcih sistem za ugotavljanje skupnega števila bakterij Nadkarni F+R bolj zanesljiv in daje boljši približek pričakovanim rezultatom. S sistemom Nadkarni F+R namreč dobimo rezultat, ki je za največ 30 % nižji od pričakovanega, medtem ko s sistem EUB 338F+518R zaznamo tudi do 500 % več produkta DNK, kot bi ga pričakovali glede na število dodanih kopij bakterijske DNK.

Iz rezultatov za Redčitev 1 (priloga I1) ugotovimo, da je nihanje med ponovitvami istega vzorca pri pomnoževanju z obema paroma začetnih oligonukleotidov v rangu do 20 %. Pri Redčitvi 2 (priloga I2) pa je to nihanje pri pomnoževanju s parom Nadkarni F+R lahko do 200 %.