Razporeditev virusa GFLV po rastlini skozi sezono

Za določanje virusa GFLV se v največji meri uporablja serološka imuno-encimska metoda ELISA, katere dobra lastnost je, da je zaradi univerzalnosti protiteles zanesljiva v primeru zadostne koncentracije virusa v rastlinskem tkivu. V primeru neenakomerne porazdelitve virusa po rastlini in sezonskih spremembah virusnih koncentracij, je lahko določanje s testom ELISA v nekaterih delih sezone nezanesljivo (Bovey in sod., 1980; Rowhani in sod.

1992). Zato je za določanje virusa GFLV s testom ELISA pomembno najti najprimernejše tkivo vinske trte, kot tudi najprimernejši čas rastne sezone za vzorčenje, pri katerem dobimo najvišje izmerjene fotometrične vrednosti (Rowhani in sod., 1992). Kljub temu pa latentnih okužb z zelo nizko koncentracijo virusa s testom ELISA ne moremo določiti.

Cilj doktorskega dela je bil dobiti vpogled v razporeditev virusa po rastlini vinske trte skozi rastno sezono s pomočjo testa ELISA. Test ELISA je semi-kvantitativna metoda, ki omogoča ocenitev virusnega titra, kljub temu, da zaradi prisotnosti inhibitorjev (Walter in Etienne, 1987) ter robustne narave metode, fotometrični odčitek in virusni titer nista vedno direktno sorazmerna. Da ni vpliva inhibicije v problematičnih vzorcih korenin in floema je potrdila že Krsmanović (2010) s tem, da je vzorce redčila v ekstrakcijskem pufru za vinsko trto. Tako smo lahko nizke fotometrične odčitke pripisali dejanskim nizkim titrom virusa.

Virus smo s testom ELISA določili v vseh testiranih delih vinske trte: mladih in starejših listih, floemu, viticah, koreninah, socvetju in grozdju, kar je v skladu z dosedanjimi objavami, ki poročajo o prisotnosti virusa v mladih in starejših listih, vršičkih, žilah medčlenkov, koreninah, socvetju in grozdju manjšega števila testiranih trsov (Rowhani in sod., 1992; Walter in Etienne, 1987; Frantz in Walker, 1995). V literaturi nismo zasledili, da bi prisotnost virusa kadarkoli prej ugotavljali v viticah, kjer smo določili stalne in zelo visoke virusne titre, primerljive tistim v mladih listih in grozdih, kar si lahko razlagamo s tem, da so vitice pri vinski trti preobražena socvetja (imajo isti izvor kot grozd).

Med rastno sezono smo v vseh testiranih delih rastline, izključujoč korenine, najvišji virusni titer določili junija ter večinoma tudi julija, medtem ko je avgusta izrazito padel

(Slika 29). Septembra je virusni titer ponovno nekoliko narasel, z izjemo pri grozdju. Ta opažanja podpirajo izsledki raziskav na satRNA CymRSV (Pantaleo in Burgyan, 2008), ki pravijo, da je RNA utiševalni mehanizem aktivnejši pri visokih temperaturah (> 26°C), in je posledično zmanjšana akumulacija virusa.

Najizrazitejši padec virusnega titra med rastno sezono smo opazili v floemu, v nekaterih primerih je avgusta padel tudi pod mejo določljivosti. Hkrati je bil porast virusnega titra v floemu konec rastne sezone in izven nje (januarja) najočitnejši (Slika 26). To se ne ujema z opažanji iz leta 1992, ko so Rowhani in sod. dobili nizke vendar konstantno zanesljivo pozitivne rezultate pri testiranju floema poganjka okuženih rastlin V. rupestris sorte St.

George skozi rastno sezono. Na virusni titer vpliva veliko dejavnikov, med drugim najverjetneje tudi sorta gostiteljske rastline (Slika 31). Za naše razmere bi, v nasprotju z njimi, za določanje virusa GFLV s testom ELISA, odsvetovali vzorčenje floemskega tkiva med rastno sezono. Je pa floem še vedno edina in dobra možnost za določanje virusa GFLV izven rastne sezone.

Rowhani in sod. (1992) so si nizke vrednosti avgusta razlagali z neugodnimi vplivi visokih temperatur in pomanjkanjem padavin, ki naj bi vplivale na zmanjšanje replikacije virusa GFLV. Rezultati pridobljeni v Sloveniji kažejo na večji negativni vpliv daljšega sončnega sevanja in pomanjkanja padavin na replikacijo virusa GFLV v rastlinah, temperature pa naj ne bi imele večjega vpliva na pomnoževanje virusa (Krsmanović, 2010).

Najvišji virusni titer smo izmerili v mladih listih ter viticah skozi vso rastno sezono (Sliki 23 in 25). Tudi starejši listi so se izkazali kot dober rastlinski material za dokazovanje virusa GFLV s testom ELISA, kljub temu da so imeli nekoliko nižji in med rastlinami manj konsistenten virusni titer, kar se sklada z rezultati Bouyahia in sod. (2003), ki so ugotovili očitno višanje virusnega titra od bazalnih (starejših) do apikalnih (mlajših) listov.

Ti rezultati so v skladu z rezultati Rowhani in sod. (1992), ki so določili največ virusa GFLV v aktivno rastočem tkivu vinske trte (mladi listi in vršički poganjka) v začetku rastne sezone (od brstenja do julija). Hkrati pa so, tako kot mi, dokazali nizek virusni titer v dormantnih poganjkih (dormantni popki, floem, žagovina), iz njih inducirani mladi poganjki pa so imeli veliko višji titer virusa GFLV (Rowhani in sod., 1992; Walter in Etienne, 1987).

Ta opažanja nam orisujejo spreminjanje koncentracije virusa po rastlini. V pomladnih mesecih je virusa največ v aktivno rastočih delih rastlin, kjer so ugodni pogoji za hitro pomnoževanje virusa, tako so ta tkiva tudi primeren rastlinski material za dokazovanje

virusa GFLV s testom ELISA (Slika 29). V jesenskih mesecih se virus začne kopičiti v žilah olesenelih poganjkov, kjer najverjetneje prezimi, kar sklepamo iz zelo nizkega virusnega titra v floemu znotraj rastne sezone in povečanja virusnega titra v floemu konec rasne sezone in najvišjim virusnim titrom v dormantnih poganjkih izven rastne sezone.

V socvetju/grozdju se je virusni titer skozi rastno sezono spreminjal s spreminjanjem fiziologije in morfologije grozda. Pri rastlinah sorte Refošk iz Komna junija v socvetju nismo določili virusa, za kar nimamo obrazložitve, saj je bil njegov titer pri ostalih štirih trsih zelo visok. V vseh testiranih rastlinah smo največ virusa določili julija v nezrelih zelenih jagodah, kot poročajo že Rowhani in sod. (1992), medtem ko je virusni titer avgusta padel, vendar so bili rezultati zanesljivo pozitivni, medtem ko so bili rezultati septembra slabši in manj zanesljivi (Slika 28). Ta trend bi lahko pripisali aktivnemu namnoževanju virusa v zelenih jagodah, ki se je prenehalo v času dozorevanja jagod. Po tej teoriji je količina virusa v jagodi ostala enaka, vendar se je z večanjem celic in posledično jagod količina virusa, na isto enoto testiranega materiala, sorazmerno zmanjšala. Ker je bila količina začetnega materiala vedno manjša od cele zrele jagode, smo testirali le del mesa in kožice ene jagode. Pri vzorčenju grozdja bi bilo torej zanimivo ločiti še kožico, meso in pečke ter testirati vsak del grozda posebej ter tako določiti razporeditev virusa GFLV v jagodi. Hkrati nimamo realne slike o tem ali je v vseh jagodah enega grozda oz.

vseh grozdih na rastlini podoben virusni titer. Za to bi bilo potrebno testirati večje število jagod na več grozdih.

V koreninah smo določili nizke in večinoma raznolike virusne titre med rastlinami skozi celo rastno sezono. Kljub temu lahko rečemo, da smo najvišje virusne titre v koreninah izmerili julija, najnižje pa avgusta (Slika 27). Koreninski sistem vinske trte sestavljajo stare in mlade korenine. Trs vse življenje razvija mnogo mladih koreninic, hkrati pa naravno odmira del starih korenin. Mlade koreninice, s časom razvijejo sekundarno strukturo in olesenijo. Vzorčenje korenin vinske trte, še posebej mladih, je težavno saj so zelo težko dostopne. Najverjetnejši razlog za veliko variiranje izmerjenih vrednosti je, da smo vzorčili različne tipe korenin. Če je to res, sta vsaj dva razloga za razlike: homogenizacija pri starejših, olesenelih koreninah je zahtevnejša in verjetno manj učinkovita kot pri mladih, prav tako pa je mogoče, da so vsebnosti virusa v različnih tipih korenin različne.

5.1.2 Določanje virusa GFLV skozi rastno sezono v trsih različnih sort