Hmelj (Humulus lupulus L.) je kmetijsko in ekonomsko pomembna rastlina, ki se v veliki večini goji za uporabo v pivovarski industriji, v manjši meri pa se uporablja v farmacevtski industriji. Pridelava hmelja je ekonomsko najpomembnejša v državah Nemčije, ZDA, Češke, Poljske, Anglije in Slovenije. Uspešno pridelavo hmelja otežujejo rastlinske patogene glive in plesnivke, ki so stalna in poglavitna grožnja svetovni varnosti hrane ter predstavljajo največjo skupino povzročiteljev bolezni pri rastlinah na svetu. Najbolj pogosti primeri teh so hmeljeva pepelovka (Podosphaera macularis), hmeljeva peronospora (Pseudoperonospora humuli) in verticiliska uvelost (Verticillium albo-atrum) (Mahaffee in sod., 2009). Pridelovalci hmelja se soočajo z agresivno vaskularno boleznijo, imenovano verticilijska uvelost, ki jo povzroča gliva Verticillium albo-atrum, proti kateri zaenkrat ne poznamo učinkovite zaščite. Edina poznana in najučinkovitejša obramba proti tej glivi so naravna odpornost gostitelja ter fitosanitarni ukrepi in kolobar z negostitelskimi rastlinami.
Študije obrambnih sistemov pri rastlinah pridobivajo na pomenu v zadnjih letih. Mnogo tovrstnih raziskav temelji na osnovi analize genske ekspresije, saj tako pridobimo vpogled v obrambne mehanizme rastline v različnih fazah stresa. Merjenje presežnosti izražanja genskih transkriptov pri genih, ki so vpleteni v obrambo rastline z metodo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času, je mogoče pri različnih vzorcih pri celi vrsti tarčnih genov. Metoda ima visoko občutljivost za zaznavanje razlik v količini mRNA, posledično pa se prav vse variacije pri vzorčenju, laboratorijskem delu, standardnih postopkih, kvaliteti rastlinskega materiala, učinkovitosti pomnoževanja in bioloških vzorcih odrazijo na končnem rezultatu. Zavoljo tega smo v magistrski nalogi uporabili metodo normalizacije diferencialno izraženih tarčnih genov s pomočjo referenčnih genov, katerih izražanje naj bi bilo v različnih eksperimentalnih bioloških pogojih skozi čas konstantno.
Analiza rastlinskih obrambnih mehanizmov na osnovi diferencialno izraženih genov je pomemben korak na poti razumevanja odpornosti rastlin na bolezni. V magistrski nalogi smo ovrednotili pomnoževanje 24 tarčnih zaporedij, ki predstavljajo domene 18 genov, potencialno odgovornih za obrambni odgovor in odpornost na verticilijsko uvelost hmelja.
V končni fazi smo analizirali 17 transkriptov tarčnih genov. Pri tem smo ovrednotili izražanje 4 referenčnih genov (CAC, DRH1, SAND, YLS8), ki so se v preliminarnih študjah diferencialne ekspresije genov pri hmelju izkazali za potencialno najboljše referenčne gene ob biotskem stresu (Štajner in sod., 2013). Geni so bili analizirani v koreninah in steblih pri odporni sorti hmelja Wye Target ter pri občutljivi sorti Celeia v treh časovnih točkah.
Izmerili smo relativno količino DNA glive v rastlinah v vseh rastlinskih delih in časovnih točkah.
1.1 NAMEN IN CILJI NALOGE
Osnovni namen raziskovalnega projekta je pridobiti boljši vpogled v mehanizme odgovora hmelja na okužbo z glivo Verticilium albo-atrum ter z metodo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času identificirati in potrditi vlogo izbranih genov, ki so potencialno vključeni v mehanizme odpornosti in obrambe rastline. Identifikacija takšnih genov bi lahko:
razkrila potencialne tarčne gene, ki bi lahko v prihodnosti bili uporabljeni kot markerski geni v žlahtnjenju hmelja z namenom razvoja odpornosti ter pri razvoju trajno odpornih sort hmelja,
pridobila nov, splošen vpogled v rastlinske mehanizme odpornosti in obrambe, ki bi lahko bili osnova za nadaljne podobne študije pri ostalih sortah, vrstah v interakciji rastlina-patogen ter razvoj ostalih pristopov za zatiranje.
Cilji naloge:
Kvantitativno ovrednotenje diferencialnega izražanja tarčnih genov, ki so potencialno vpleteni v obrambne mehanizme hmelja po okužbi s patogeno glivo V.
albo-atrum.
Ovrednoteje in validacija referenčnih genov z namenom identifikacije najstabilnejših, ki smo jih uporabili pri procesu normalizacije rezultata kvantitativnega pomnoževanja tarčnih genov
Preverjanje tarčnih zaporedij z uporabo spletnega orodja BLAST, z namenom pridobitve in potrditve informacije o molekularni vlogi pomnoženega fragmenta v hmelju in sorodnih vrstah
Kvantifikacija glivne DNA v koreninah in steblu dveh genotipov hmelja v treh časovnih točkah, s pomočjo kvantitativne reakcije s polimerazo v realnem času.
Za dosego osnovnih ciljev smo analizirali izražanje tarčnih genov pri dveh kultivarjih hmelja z različno stopnjo odpornosti na verticilijsko hmeljevo uvelost (odporen genotip Wye Target in občutljiv genotip Celeia) ter v treh različnih časovnih točkah po inokulaciji (6, 12 in 18 dpi). Poleg tega smo ovrednotili izražanje genov tudi v posameznih rastlinskih organih, in sicer v koreninah ter v steblih, saj se gliva primarno iz prsti razširja skozi korenine in preko žilnega sistema stebel (ksilema) po rastlini navzgor.
1.2 HIPOTEZE
Pričakujemo višjo izražanje tarčnih genov, ki so odgovorni za odpornost hmelja na glivo V.
albo-atrum. Pri neokuženih rastlinah pričakujemo znatno nižjo ekspresijo tarčnih genov za odpornost hmelja na glivo V. albo-atrum, kot pri okuženih rastlinah.
Ekspresija tarčnih genov, ki niso odgovorni za odpornost hmelja na glivo V. albo-atrum, bo ostala na osnovni ravni in ne bo povečana.
Ekspresija tarčnih genov, ki so odgovorni za odpornost hmelja na glivo V. albo-atrum, bo nižja pri neodporni sorti Celeia ter višja pri odporni sorti Wye Target.
Količina glive bo s časom po inokulaciji hitro naraščala in že zgodaj upadla v koreninah ter naraščala v stebelnih vzorcih. Vzorec kolonizacije bo različen pri odporni sorti Wye Target in občutljivi sorti Celeia in sicer bo količina glivne DNA pričakovano nižja v koreninah in steblu pri odporni sorti Wye Target.