Verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR)

Verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR) temelji na metodi verižne reakcije s polimerazo (PCR), ki jo je razvil Kary Mullis v osemdesetih letih prejšnjega stoletja (Valasek and Repa, 2005). Pri tej metodi specifičen del DNA pomnožujemo z DNA polimerazo in specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, ter tako lahko naredimo več kot milijardo kopij. PCR v realnem času prav tako kot navadno PCR reakcijo sestavljajo trije glavni koraki, ki vključujejo denaturacijo pri kateri pride do razklenitve dvoverižne DNA, prileganje pri katerem pride do vezave začetnega oligonukleotida na enoverižno DNA matrico, ter podaljševanje pri katerem DNA polimeraza sintetizira novo verigo vzdolž DNA matrice in nastane nova dvoverižna DNA. V vsakem ciklu naj bi tako imeli dvakrat več produkta kot v predhodnem ciklu, vendar se to dejansko ne zgodi, ker se po določenem številu ciklov med reakcijo reagenti porabijo in reakcija doseže plato. DNA se učinkovito podvaja samo do platoja, zato z metodo PCR v realnem času merimo produkt v eksponentni fazi, ko je pomnoževanje DNA še učinkovito. Meritve produkta so sorazmerne začetni količini DNA, zato PCR v realnem času omogoča kvantifikacijo.

Metoda PCR v realnem času tako združuje podvojevanje DNA in detekcijo pomnoženih

produktov, zato za detekcijo produkta gelska elektroforeza ni več potrebna (Valasek in Repa, 2005).

V praksi metoda deluje tako, da kamera zazna svetlobo, ki je sproščena iz fluorokroma vezanega v novo sintetizirani PCR produkt. Interkalirajoča barvila so najbolj pogosta metoda za detekcijo pomnožene DNA. Absorbirajo svetlobo nižje valovne dolžine in oddajajo svetlobo višje valovne dolžine. Njihova flourescenca se močno poveča ob vezavi na dvovijačno DNA, zato količina dsDNA vpliva na intenziteto signala. Prvotno se je kot barvilo uporabljal etidijev bromid, kasneje pa ga je nadomestilo barvilo SYBR green, ki ima večjo afiniteto do dvoverižne DNA. Slabost fluorescentnih barvil je ta, da se vežejo nespecifično, torej se barvilo veže na dsDNA neodvisno od nukleotidnega zaporedja produkta, torej tudi na npr. dimere začetnih oligonukleotidov (Gachon in sod., 2004).

Vendar specifičnost vezave lahko preverimo z analizo disociacijske krivulje pomnoženega produkta, določitvijo tališča produkta, ali z gelsko elektroforezo. Pri specifičnih metodah zanavanja pa imamo poleg dveh začetnih oligonukleotidov v reakciji tudi sondo, ki se komplementarno veže s tarčnim zaporedjem med oba začetna oligonukleotida. Sonde so specifične za določeno zaporedje in imajo 5' in 3' konce označene s flourescentnima barviloma. Na enem koncu ima sonda poročevalec (ang. reporter) in na drugem dušilec (ang. quencher). Ob vezavi sonde na tarčno zaporedje sta flourescentni barvili blizu skupaj in dušilec lahko absorbira poročevalski signal. Pojav imenujemo prenos fluorescentne resonančne energije (FRET, flourescent resonance energy transfer) (Valasek in Repa, 2005).

Začetni oligonukleotidi so pomemben parameter, ki lahko močno vpliva na uspešnost metode PCR v realnem času, še posebej ko uporabljamo interkalirajoča barvila kot metodo zaznavanja pomnoženih produktov. Prihaja lahko do napak, kot so komplementarna hibridizacija na 3' koncu znotraj samega zaporedja ali do hibridizacije med začetnimi oligonukleotidi. Na trgu je veliko plačljivih in neplačljivih računalniških programov, ki po svojih algoritmih izračunajo pomembne lastnosti začetnih oligonukleotidov in na ta način ocenijo njihovo ustreznost.

Fluorescenca reakcijske zmesi, ki se meri med samo reakcijo, nam omogoča prikaz namnoževanja produkta v realnem času. Graf pomnoževanja dobimo tako, da izrišemo krivuljo odvisnosti fluorescence od števila ciklov reakcije. Delimo ga na tri faze: bazna linija, eksponentna faza in plato. Za pridobivanje podatkov je primerna le eksponentna faza, v kateri flourescenca linearno narašča z namnoževanjem produkta. V analizah rezultatov, pridobljenih s PCR v realnem času, pozitivno reakcijo detektiramo s kopičenjem fluorescenčnega signala. Prag je količina signala, ki kaže na statistično značilno povečanje signala glede na signal bazne linije. Običajno ga inštrumenti samodejno nastavijo na vrednost, ki je desetkrat večja od standardne deviacije vrednosti flourescence v bazni liniji. Lahko pa je nastavljena ročno na poljubno vrednost. Pražni

cikel (ang. treshold cycle, Ct) je cikel, pri katerem fluorescenca preseže nastavljeni prag.

Vrednost Ct je obratno sorazmerna začetni količini DNA (Caraguel in sod., 2011; Huggett in sod., 2005).

Pri metodi PCR v realnem času poznamo absolutni in relativni način kvantifikacije. Z absolutno kvantifikacijo določimo količino tarčne molekule v neznanem vzorcu s pomočjo umeritvene krivulje. Pri relativni kvantifikaciji pa določimo razliko v izražanju tarčnega gena v neznanem vzorcu, v primerjavi z izražanjem tarčnega gena v referenčnem vzorcu.

Pri relativni kvantifikaciji ne potrebujemo umeritvene krivulje, vendar obstajajo različni matematični modeli, na podlagi katerih določimo količino tarčne molekule (Gachon in sod., 2004).

Pri rastlinskih študijah lahko metodo PCR v realnem času aplikativno uporabimo na dva načina: za detekcijo in kvantifikacijo tuje DNA (patogenih in simbiotskih mikroorganizmov rastlin, transgenih organizmov, GMO), ter pri študijah genske ekspresije (Gachon in sod., 2004). Pri oljki sorte 'Leccino' so Galla in sod. (2009) s pomočjo metode real time PCR preučevali ekspresijo 86 genov v treh različnih stadijih razvoja oljčnega plodu. Prav tako so Muzzalupo in sod. (2012) z metodo real time PCR preučevali ekspresijo LOX gena pri plodovih oljk vzorčenih v različnih razvojnih fazah, ter vpliv tega gena na prisotnost aromatičnih spojin v oljčnem olju. Alagna in sod. (2012) so v plodovih oljk merili koncentracije glavnih fenolnih spojin, kot so olevropein, demetilolevropein, 3–4 DHPEA-EDA, ligstrozid, tirozol, hidroksitrozol, verbaskozid in lignani. Prisotnost njihove mRNA so preučevali pri plodovih vzorčenih na dvanajstih sortah oljk v treh različnih fazah razvoja.