UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Suzana KRALJ
PRIMERJAVA ADHEZINOV MED PATOGENIMI BAKTERIJAMI RODU Salmonella, Escherichia IN
Campylobacter
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Suzana KRALJ
PRIMERJAVA ADHEZINOV MED PATOGENIMI BAKTERIJAMI RODU Salmonella, Escherichia IN Campylobacter
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana
COMPARISON OF ADHESINS BETWEEN PATHOGENIC BACTERIA Salmonella, Escherichia AND Campylobacter
B. SC. THESIS
Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition
Ljubljana, 2021
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Živilstvo in prehrana.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za živilstvo je za mentorico diplomskega dela imenovala doc. dr. Anja Klančnik in za recenzentko doc. dr. Neža Čadež.
Mentorica: doc. dr. Anja KLANČNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Recenzentka: doc. dr. Neža ČADEŽ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik:
Mentorica:
Recenzentka:
Datum zagovora:
Suzana Kralj
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 579.67:614.31(043)=163.6
KG patogene bakterije, Salmonella, Escherichia, Campylobacter, biofilm, adhezini, strategija nadzora, varnost živil
AV KRALJ, Suzana
SA KLANČNIK, Anja (mentorica), ČADEŽ, Neža (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021
IN PRIMERJAVA ADHEZINOV MED PATOGENIMI BAKTERIJAMI RODU Salmonella, Escherichia IN Campylobacter
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana) OP VII, 28 str., 6 pregl., 7 sl., 60 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Adhezini so beljakovinske površinske strukture bakterij, ki se specifično vežejo na receptorje gostiteljske celice in na pritrjevalne površine. Najpogostejši receptorji oz.
tarčne molekule so različni glikoproteini in saharidni ostanki na površini celic gostitelja. Namen raziskave je primerjava različnih najpogostejših adhezinov patogenih bakterij rodu Salmonella, Escherichia in Campylobacter. Med njimi so najpogostejši fimbrijski adhezini, ki so tudi ključni za ireverzibilno pritrditev na površino. Bakterije rodu Campylobacter nimajo fimbrij oz. jih pri njih še niso odkrili, zato primerjava teh ni bila mogoča. Podobnosti adhezinov bakterij pa smo ugotovili pri vezavi na tarčne molekule kot so fibronektin, laminin in manoza. S to ugotovitvijo lahko sklepamo, da mehanizem vezave adhezinov lahko predstavlja novo potencialno strategijo nadzora nad patogenimi bakterijami, saj lahko tarčne molekule zamenjamo z različnimi učinkovinami. Poleg tega pa smo ugotovili, da imajo vsi trije rodovi bakterij izraženo flagelo, ki pripomore k adheziji na površino. Adhezini tako predstavljajo specifičen odtis vsakega rodu bakterij.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 579.67:614.31(043)=163.6
CX pathogenic bacteria, Salmonella, Escherichia, Campylobacter, biofilm, adhesins, control strategy, food safety
AU KRALJ, Suzana
AA KLANČNIK, Anja (supervisor), ČADEŽ, Neža (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2021
TI COMPARISON OF ADHESINS BETWEEN PATHOGENIC BACTERIA
Salmonella, Escherichia AND Campylobacter
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition) NO VII, 28 p., 6 tab., 7 fig., 60 ref.
LA sl AL sl/en
AB Adhesins are protein cell surface components or appendages of bacteria that enable adhesion to host cell receptors and adhesion surfaces. The most common targets (receptors) are various glycoproteins and sugar residues such as the mannose receptor. The aim of this work was to compare different adhesins between pathogenic bacteria Salmonella, Escherichia and Campylobacter. Fimbrial adhesins are the most abundand and play the major role in ireversible adhesion to the surface.
Bacteria of the genus Campylobacter do not have fimbriae (they have not yet been discovered), so the comparison between them was not possible. The similarity between adhesins that adhere to target molecules such as fibronectin, laminin and mannose was discovered. We concluded that adhesins represent a new potential control strategy to interfere with pathogenic bacteria. The target molecules can be replaced by different substances. Furthermore, we discovered that all the mentioned bacteria have expressed flagella, which contributes to adhesion. All adhesins represent a specific expression of individual bacteria.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VII KAZALO SLIK ... VII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... VII
1 UVOD ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 2
2.1 PATOGENE BAKTERIJE PRENOSLJIVE S HRANO ... 2
2.2 POTEK OKUŽBE PRI LJUDEH ... 2
2.2.1 Bakterije rodu Salmonella in okužbe, ki jih povzročajo ... 2
2.2.2 Bakterije vrste E. coli in toksikoinfekcije ... 3
2.2.3 Bakterije vrste Campylobacter jejuni in kampilobakterioza ... 4
2.3 BIOFILM IN FAZE NJEGOVE TVORBE ... 4
2.4 BIOFILM V PROIZVODNO-OSKRBOVALNI VERIGI ... 5
2.5 BAKTERIJSKI ADHEZINI... 6
2.5.1 Adhezini ... 6
2.5.2 Razdelitev adhezinov ... 7
2.5.2.1 Piliji ali fimbrije ... 7
2.5.2.2 Adhezini sposobni interakcije z glikoproteini ... 9
2.5.2.3 Nefimbrijski adhezini ... 9
2.5.3 Adhezini bakterij rodu Salmonella ... 10
2.5.3.1 Flagela in njena vloga pri adheziji ... 10
2.5.3.2 Fimbrijski adhezini ... 11
2.5.3.3 Nefimbrijski adhezini ... 12
2.5.4 Adhezini bakterij vrste E. coli ... 14
2.5.4.1 Flagela in njena vloga pri adheziji ... 14
2.5.4.2 Fimbrijski adhezini ... 14
2.5.4.3 Nefimbrijski adhezini ... 16
2.5.5 Adhezini bakterij rodu Campylobacter ... 17
2.5.5.1 Flagela in njegova vloga pri adheziji ... 18
2.5.5.2 Pravi in potencialni adhezini ... 18
2.6 PRIMERJAVA ADHEZINOV MED BAKTERIJAMI Salmonella, Escherichia IN Campylobacter ... 19
2.6.1 Primerjava flagelarnih adhezinov ... 19
2.6.2 Adhezija na različne komponente zunajceličnega matriksa gostiteljske celice
………19 2.6.3 Primerjava adhezinov po skupinah oz. mehanizmu izgradnje ... 21
2.7 ADHEZINI KOT POTENCIALNE TARČE NOVIH STRATEGIJ
NADZORA NAD PATOGENIMI BAKTERIJAMI ... 21 3 POVZETEK ... 23 4 VIRI ... 24 ZAHVALA1
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Adhezini bakterij rodu Salmonella (Dhakal in sod., 2015) ... 10
Preglednica 2: Adhezini bakterij E. coli (Dhakal in sod., 2015) ... 14
Preglednica 3: Dejavniki adhezije bakterij Campylobacter (Declan, 2015) ... 17
Preglednica 4: Flagelarni adhezini ... 19
Preglednica 5: Primerjava adhezinov glede na velikost in vezavo na tarčne molekule površine ... 20
Preglednica 6: Primerjava adhezinov glede na mehanizem izgradnje ... 21
KAZALO SLIK Slika 1: Število okužb z zoonozami in pojavnost le teh v Evropi v letu 2019 (EFSA, 2021) ... 3
Slika 2: Tvorba biofilma (Lianou in sod., 2020) ... 5
Slika 3: Razdelitev adhezinov po skupinah (Solanki in sod., 2018) ... 7
Slika 4: Fimbrij tipa 1 (adhezin FimH) (iGEM, 2008) ... 8
Slika 5: Avtotransportivni adhezin pri bakterijah Salmonella (Kingsley in sod., 2002) ... 13
Slika 6: Vezavna mesta bakterij na molekuli fibronektina (Vaca in sod., 2019) ... 20
Slika 7: Različne strategije uporabljene pri anti-adhezivni terapiji (Abraham in sod., 2014) ... 22
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI CUP šaperonsko-vratarska pot
ECM ekstracelularni matriks EPS eksopolisaharidi Fn fibronektin Ln laminin
1 UVOD
Patogeni mikroorganizmi se nahajajo povsod v okolju, zato tudi faze proizvodno- oskrbovalne verige živil ne sodijo med izjeme. Zaskrbljujoče je število okužb s patogenimi bakterijami, ki se prenašajo s hrano in posledično tudi naraščajoče število smrti. Eden od mehanizmov preživetja bakterij in zaščite pred neugodnimi pogoji je tvorba biofilma.
Planktonske celice se po adheziji na površino združujejo v mikrokolonije, izločajo zunajcelične polimerne snovi ter formirajo tridimenzionalno strukturo biofilma. To je kompleksen proces pri katerem glavno vlogo igrajo genetski mehanizmi, značilnosti pritrjevalnih površin in površina bakterijske celice. Med glavnimi patogenimi bakterijami, ki se prenašajo s hrano, povzročajo okužbe ter izbruhe bolezni in so sposobne tvorbe biofilma so bakterije rodov Salmonella, Escherichia in Campylobacter (Shi in Zhu, 2009).
Glavna izziva s katerimi se soočamo v živilski industriji sta: (i) nastanek mešanih biofilmov, ki so ubikvitarni in imajo povečano odpornost na sredstva za čiščenje ter razkuževanje ali protimikrobne snovi ter (ii) interakcije bakterij preko adhezinov, katerih glavna naloga je ireverzibilno pritrjevanje na površino ali na druge mikroorganizme.
Namen raziskave je raziskati ter primerjati adhezine patogenih bakterij rodov Salmonella, Escherichia in Campylobacter z namenom ovrednotenja podobnosti ali razlik v njihovem mehanizmu, lokalizaciji, velikosti ter vezavi na tarčne molekule površine. S pridobljenim znanjem želimo ugotoviti, ali je adhezine možno uporabiti kot tarče novih strategij nadzora nad patogenimi bakterijami.
Glavne tri delovne hipoteze, ki smo si jih tekom izdelave diplomske naloge zadali so:
• Adhezini, beljakovinske strukture na površini bakterij, so specifični odtis vsake bakterije in je zato prepoznavanje ustreznih receptorskih molekul na gostiteljevem tkivu ali abiotski površini odvisno od rodu bakterije.
• Fimbrijski adhezini omogočajo kontakt s površino in imajo zato pomembno vlogo pri pritrjevanju bakterij.
• Adhezini so potencialne tarče pri novih strategijah nadzora patogenih bakterij, brez dodanega tveganja za razvoj odpornih sevov bakterij.
2 PREGLED OBJAV
2.1 PATOGENE BAKTERIJE PRENOSLJIVE S HRANO
Z naraščanjem števila prebivalcev se povečuje tudi število bolezni, katerih izvor okužbe se skriva v živilih. Sem spadajo patogeni mikroorganizmi kot so bakterije, glive, virusi in protozoji, prav tako pa se v živilih lahko nahajajo nevarni ostanki, pesticidi in alergeni, ki predstavljajo velik izziv v današnjem svetu (Franz in sod., 2018). Podatki Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) kažejo, da so kontaminirana živila izvor več kot 200 boleznim (od driske do raka). Globalno zaradi uživanja kontaminiranih živil letno zboli okoli 600 milijonov ljudi, od tega jih 420,000 umre (od tega v Evropi več kot 23 milijonov ljudi, življenje pa izgubi okoli 4700 ljudi na leto) (WHO, 2021). Znano je, da so biofilmi izvor takih okužb v kar 80 % primerov.
Patogene bakterije, ki najpogosteje povzročajo zoonoze (bolezni skupne živali in ljudem) so: Salmonella enterica, črevesni patotipi Escherichia coli, Campylobacter spp., Listeria, Shigella, Yersinia enterocolitica in Pseudomonas aeruginosa. Osredotočila se bom na prve tri, saj le te povzročajo največji delež alimentarnih infekcij in intoksikacij med bakterijami za katere je posledično potrebna hospitalizacija (Adley in Ryan, 2016).
2.2 POTEK OKUŽBE PRI LJUDEH
Prvi in tudi ključni korak za nastanek in razvoj bolezni je interakcija bakterij preko njihove površine, torej preko adhezinov. Večina okužb se prične z kolonizacijo mukoznih površin genitrourniarnega, gastrointestinalnega ali respiratornega trakta gostitelja. Gre za adhezijo na epitelijske celice ali na mucine, ki prekrivajo mukozne celice. Bakterije imajo na površini izražene adhezine, ki se vežejo na specifične receptorje površin pritrjevanja in tudi na površine drugih mikroorganizmov (Abraham in sod., 2014). Glavna obolenja, ki jih povzročajo bakterije Salmonella, E. coli in Campylobacter so: salmoneloza, črevesne okužbe z E. coli, toksikoinfekcija s Šiga toksinom in kampilobakterioza. Slika 1 prikazuje pojavnost in število novih primerov okužb z omenjenimi bakterijami v letu 2019.
2.2.1 Bakterije rodu Salmonella in okužbe, ki jih povzročajo
Salmonele so v naravi zelo razširjene in se kot črevesne bakterije nahajajo v različnih sesalcih, pticah in človeku. Poznanih je več kot 2.500 različnih serotipov salmonel.
Najpogosteje okužbo povzročita seva S. enterica serovar Enteritidis in S. enterica serovar Typhimurium. Salmonele lahko povzročijo dva tipa bolezni: netifusno salmonelozo in trebušni tifus oz. paratifus. Pri ljudeh se lahko razvijejo različne klinične slike črevesnih okužb (klicenoštvo brez simptomov, vnetje želodčne in črevesne sluznice z bruhanjem, drisko – akutni gastroenterokolitis, trebušni tifus, paratifus, bakteriemijo, sepso). V Evropi je bilo v letu 2019 potrjenih skoraj 90 tisoč oseb, ki so zbolele za salmonelozo. V tem letu je bila pojavnost okužb 20.00/100.000 ljudi in se v primerjavi z letom 2018 praktično ni spremenila (EFSA, 2021).
Po zaužitju kontaminiranega živila bakterije rodu Salmonella preživijo efekt želodčne kisline in uspešno preidejo skozi želodec, pri čemer so pomembni mehanizmi tolerance na kisline. Nato vstopijo v črevo, kjer morajo delovati kot protiutež peristaltiki in se pritrditi na
črevesne epitelne celice, ter tako uspešno kolonizirajo črevo. S pomočjo fimbrij nato preidejo mukozni sloj in se pritrdijo na epitelij oz. bolj natančno na celice M (z manj mukoznega sloja, glikokaliksa in majhnim mikrovili). Taka vezava jim omogoča prehod skozi bazalno membrano epitelijskih celic, v lumnu pa se nato namnožijo, kar vodi do okužbe.
Živila, ki predstavljajo največje tveganje za okužbe z bakterijami rodu Salmonella in predvsem za razvoj netifusne salmoneloze so: kontaminirano meso (predvsem perutninsko), jajca in jedi iz surovih jajc, kontaminirano surovo mleko, voda (fekalno onesnaženi viri pitne vode), sadje, zelenjava ali začimbe (Wagner in Hensel, 2011).
2.2.2 Bakterije vrste E. coli in toksikoinfekcije
Bakterije E. coli so naravno prisotne v normalni črevesni flori človeka in živali. Okužba z verocitotoksigenimi sevi E. coli (STEC) je bila v letu 2019 tretja najbolj pogosta zoonoza pri ljudeh, zanimivo je tudi, da se je število okužb v letih od 2015 do 2019 močno povečalo.
Na sliki 1 lahko vidimo, da je bilo v letu 2019 v Evropi potrjenih 7,775 primerov okužb s STEC/VTEC (pojavnost okužb 2.2/100.000 ljudi), v primerjavi s salmonelozo in kampilobakteriozo je pojavnost manjša. Vir okužbe za človeka so kontaminirana in nezadostno toplotno obdelana živila, kot so govedina, različni mesni izdelki, ali pa surova živila, kot so surovo mleko, zelenjava in sadje. Pogosto je vir okužbe tudi navzkrižna kontaminacija pri pripravi hrane, ali pa neposredni / posredni stik med ljudmi in živalmi (Yang in sod., 2017; EFSA, 2021).
Slika 1: Število okužb z zoonozami in pojavnost le teh v Evropi v letu 2019 (EFSA, 2021) Legenda: N- število novih primerov/leto
Večina sevov je nepatogena in tako neškodljiva človeku, vendar določeni enteropatogeni in enteroinvazivni sevi povzročajo resne bolezni, npr.: enteropatogeni sevi E. coli (EPEC), enterotoksigeni sevi E. coli (ETEC), enteroinvazivni sevi E. coli (EIEC) ter sevi, ki izločajo toksine Šiga, verocitotoksigeni sevi E. coli (STEC/VTEC) s podskupino enterohemoragičnih sevov (EHEC), enteroagregativni sevi E. coli (EAEC) in difuzno adherentni sevi E. coli (DAEC) (EFSA, 2021).
N=7,775
N=87,923
N= 220,682
0 10 20 30 40 50 60 70
STEC Salmoneloza Kampilobakterioza
Pojavnost okužb na 100.000 prebivalcev
Zoonoze
2.2.3 Bakterije vrste Campylobacter jejuni in kampilobakterioza
Kampilobaktri so bakterije, ki so tudi del črevesne mikroflore različnih ptičev, zato jih pogosto izolirajo iz perutnine, pa tudi drugih živali, predvsem prašičev in goveda. Za človeka in živali so patogene, vendar so okužene živali pogosto brez simptomov. Najpomembnejši sta termotolerantni vrsti C. jejuni in C. coli, ki povzročata črevesno okužbo kampilobakteriozo. Kampilobaktri so odgovorni za večino s hrano povezanih gastroenteritisov s pojavnostjo okužb 59,7 na 100.000 ljudi. Na človeka se bakterije prenašajo alimentarno: s kontaminiranim surovim mlekom bolnih živali, kontaminiranim toplotno nezadostno obdelanim mesom perutnine in mletim mesom, kontaminirano pitno vodo, direktnim kontaktom z okuženo živaljo (domačo in divjo). Med zakolom piščancev pogosto pride do poškodb črevesja in tako njegova vsebina pride v stik s piščančjim mesom.
Bakterije C. jejuni ne preživijo segrevanja nad 70 ℃ oz. pasterizacije in kuhanja, zato sta primarni izvor okužb kontaminirano nezadostno obdelano perutninsko meso (50 do 80 % primerov okužb) in kontaminirano mleko, pogosto so vzrok tudi navzkrižne kontaminacije pri pripravi hrane.
Mehanizem okužbe z bakterijami C. jejuni še ni poznan, poznani pa so ključni koraki.
Kampilobaktri preživijo pot skozi želodec, preidejo skozi mukozni sloj in se naselijo na epitelne celice črevesja (ilenium, jejnum, kolon). Nato se zgodi specifična adhezija med proteini in epitelnimi celicami, sledi ji invazija in translokacija bakterije (trans- ali paracelularna). Po internalizaciji preživijo s pomočjo zaščitnega vezikla. Kampilobaktri se namnožijo in sproščajo toksine, ki uničijo črevesne resice. Poškodbam črevesnega epitelija sledi izguba funkcije in vnetna reakcija (Kreiling in sod., 2020).
2.3 BIOFILM IN FAZE NJEGOVE TVORBE
Biofilm je skupek mikroorganizmov in njegovih zunajceličnih produktov (delujejo kot vezni člen), ki so običajno pritrjeni na živo (biotsko) na primer: površino črevesnih celic ali ne- živo (abiotsko) podlago na primer: plastika, polipropilen, nerjaveče jeklo, steklo, les, guma.
Mikroorganizmi se pritrdijo na površino v nekaj minutah in nato nadaljujejo rast v planktonski obliki, vendar večina v nekaj urah oz. dneh tvori biofilme, ki so tudi prevladujoča oblika življenja. Glavna oz. najbolj kritična točka pa je prav ta začetna (prehod iz reverzibilne v ireverzibilno) pritrditev mikrobnih celic na podlago, saj so le pritrjene zmožne oblikovati združbe. Tako se zagotovi preživetje in razmnoževanje.
Slika 2 prikazuje razvoj biofilma, ki je postopen in dinamičen proces sestavljen iz korakov:
(i) Povratna (reverzibilna) pritrditev planktonskih celic na površino s pomočjo tekočine ali gibljivosti;
(ii) Nepovratna (ireverzibilna) pritrditev (eksopolisaharidi (EPS), adhezini);
(iii) Rast mikrobnih celic in razvoj mikrobne združbe;
(iv) Razvoj zrelega biofilma (konstantna produkcija EPS, razvoj vodnih kanalčkov, por);
(v) Delni razpad biofilma in sprostitev mikrobnih celic, katere se naselijo na novo površino in formirajo biofilm (Lianou in sod., 2020).
Slika 2: Tvorba biofilma (Lianou in sod., 2020)
Prvi korak, ki vodi k nastanku biofilma je začetni kontakt prosto plavajočih planktonskih celic s površino oz. reverzibilna pritrditev. Celice se pritrdijo s pomočjo Van der Waalsovih sil, Brownovega gibanja, gravitacijskih sil in hidrofobnih učinkov, adhezija pa je odvisna od fizikalno-kemijskih in elektrostatičnih interakcij med bakterijsko ovojnico in substratom, ki je načeloma kondicioniran s procesno tekočino. V tej fazi je proces reverzibilen, saj pritrjeni mikroorganizmi še niso začeli procesa diferenciacije-serija morfoloških sprememb, ki vodijo do nastanka biofilma (veliko celic se odcepi od površine in se vrnejo k prostoživeči obliki življenja). Na bolj hrapavi površini (večja površina), je večja možnost za ireverzibilno pritrditev. Površina bakterijskih celic je hidrofobna, zato se raje pritrdijo na hidrofobne površine npr. plastika, teflon, cement, nerjaveče jeklo, les, akril kot na hidrofilne površine npr. steklo, kovine (Berne in sod., 2015; Dantas in sod., 2018). Če kolonizirane celice niso takoj za tem odstranjene, se ireverzibilno pritrdijo (adhezirajo) na površino s pomočjo adhezinov na flagelah, pilijih oz. fimbrijih. Prehod iz reverzibilne faze v ireverzibilno se dokončno zaključi s produkcijo ekstracelularnega matriksa (ECM), ki ima predvsem funkcijo vezave in zaščite celic. Začne se vzpostavljati arhitektura biofilma, tvori se zrel biofilm iz mikrokolonij in poteka nadaljnja sinteza ekstraceluarnih polimerov. Biofilm je tako tridimenzionalne oblike in, da doseže končno obliko oz. strukturo potrebuje vsaj periodo desetih dni. Na zorenje biofilma imajo vpliv okoljski dejavniki; rod/vrsta bakterije, ki ga sestavlja, fiziološka heterogenost in celična komunikacija (angl. quorum sensing).
V zadnji fazi nekatere celice zrelega biofilma v notranjosti odmrejo zaradi pomanjkanja hranil in akumulacije celičnih metabolitov, druge pa se še pravi čas odcepijo. Peto fazo disperzije pa lahko razdelimo na tri korake: (i) odcepitev celic iz zrelega biofilma, (ii) translokacija celic (iii) pritrditev celic na substrat na novi lokaciji (prenos iz abiotskih površin na biotske- črevesne celice, tanko črevo, kateri sledi okužba). Prvi korak disperzije je ključnega pomena pri razširjanju patogenih bakterij, zato je potrebno za preprečitev okužb bolj podrobno preučiti tudi mehanizme odcepitve (Joshua in sod, 2006).
2.4 BIOFILM V PROIZVODNO-OSKRBOVALNI VERIGI
Problem predstavljajo predvsem mešani biofilmi, kjer njegovo sestavo tvori več različnih vrst bakterij in je posledično tak biofilm zelo kompleksno grajen iz: EPS, proteinov, lipoproteinov ter zunajcelične DNK. Na učinkovitost postopkov čiščenja, razkuževanja in delovanja antibiotikov pa vpliva predvsem EPS, ki hkrati zadržuje hranilne snovi
(pomembno za vzdrževanje in rast biofilma) in predstavlja kar 90 % celote. Deluje tudi kot polprepustna membrana, saj prepušča hranilne snovi in kisik iz okolice, v nasprotni smeri pa vrača razgradne oz. odpadne snovi in ogljikov dioksid. Celice mikroorganizmov v mešanih biofilmih so bolj odporne na okoljske dejavnike: odpornost proti antibiotikom, oksidativen stres in stradanje v primerjavi s planktonskimi oblikami celic.
Tvorba biofilma v proizvodno-oskrbovalni verigi živil predstavlja stalni vir potencialnih kontaminacij živil in s tem tudi ogroženost varnosti in kakovosti živil. Biofilmi so odgovorni tudi za tehnične napake in okvaro opreme, otežen pretok v ceveh, povečanje stroškov proizvodnje in nenazadnje bolezni potrošnikov. V številnih industrijah pride do akumulacije organskih in anorganskih molekul (angl. conditioning film) iz živil, kar vodi v višje koncentracije hranil na inertni površini (na primer: beljakovine in/ali lipidi iz mleka se pritrdijo na površino cevi in tako se le ta kondicionira). To pa lahko poveča adhezivnost, saj se pri tem spremenijo fizikalno-kemične lastnosti površine. Na razvoj biofilma pa vplivajo še drugi dejavniki, kot so: (i) vrsta bakterij oz. njen genotip, (ii) prisotnost izrastkov flagela ali fimbrij; komponente celične membrane kot so polisaharidi, lipopolisaharidi, beljakovine (iii) lastnosti materialov površine, kot je elektrostatični naboj, hidrofobnost, hrapavost in topografija površine in (iv) okoljski parametri, kot je vrednost pH, koncentracije hranil- sestava substrata, O2, temperature in strižne sile. Pomembna je tudi interakcija med različnimi vrstami bakterij, saj le te lahko med sabo tekmujejo, sodelujejo ali pa imajo
»nevtralen« odnos (Yuan in sod., 2019). Moderne procesne linije ustvarjajo okolje, ki je zelo primerno za nastanek biofilma. Razlogi, ki ustvarjajo tako okolje so: kompleksnost procesnih obratov, dolgo trajajoči postopki, težnja po izdelavi velikih količin izdelkov in razpoložljivost velikih površin.
Pomen mešanih biofilmov je v ospredje prišel nedolgo nazaj. Le-ti se namreč nahajajo povsod, predvsem so problematične: mesna, mlečna, ribja industrija, varjenje piva, obrati za prehrano ljudi in industrija, ki proizvaja »ready to eat« izdelke. Težavna je predvsem njihova odstranitev. Kljub številnim sanitarnim ukrepom, patogene bakterije v biofilmih preživijo in služijo kot »shramba« mikrobne kontaminacije končnih produktov. Pomembnost preprečevanja navzkrižne kontaminacije (direktno na primer noži, rezalniki, tekoči trak;
indirektno na primer tla, odtoki) se je prav tako povečala, saj povzroča številne zdravstvene in ekonomske težave (Lianou in sod., 2020).
2.5 BAKTERIJSKI ADHEZINI 2.5.1 Adhezini
Adhezini so beljakovinske komponente celične površine oz. bakterijske površinske strukture s pomočjo katerih se bakterije lažje pritrdijo na ostale mikroorganizme ali na površine pritrjevanja. Poglavitna nevarnost s katero se bakterije srečajo v proizvodnih procesih je pretok tekočin, ker le ta odplavi nepritrjene bakterije in prepreči naselitev gostitelja.
Inhibicija adhezinov ali njihovih specifičnih receptorjev lahko prepreči virulenco bakterij.
Posledično so adhezini potencialne tarče za zmanjševanja bakterijskih okužb (Patel in sod., 2017). Bakterije z adhezijskimi strukturami prepoznajo receptorske molekule in se nanje vežejo. Imajo izredno veliko vlogo pri virulenci, vendar so tudi antigeni, ki v gostitelju
sprožijo imunski odziv. Zmožnost adhezije, interakcije s površinami in tvorba biofilma so ključne faze preživetja bakterij in posledično razmnoževanja znotraj gostitelja. Patogene bakterije nato izrazijo še preostale virulentne dejavnike, kar jim omogoča okužbo gostitelja.
Bakterije različnih rodov izrazijo različno število in količino adhezinov, prav tako so le ti izredno specifični za posamezen rod. Bolj patogene bakterije izrazijo več adhezinov na površini. Kritično vlogo pa imajo pri začetni fazi nastanka biofilmov, ki so tudi glavni vzrok bakterijskih okužb človeka. Adhezija na abiotske površine je večinoma povezana z nespecifičnimi interakcijami, na biotskih pa je specifična med receptorjem in ligandom.
(Berne in sod., 2015).
2.5.2 Razdelitev adhezinov
Glavni adhezini, ki omogočajo pritrditev na površino in ostale mikroorganizme so različne fimbrije, flagel, lipopolisharidni sloj, kapsula, lektini, številni proteini in lipooligosaharidi.
Razdeljeni so v skupine adhezinov (slika 3):
(i) Fimbriji/Pili: šaperonsko-vratarska pot, kurliji (angl. nucleation/participation), tip IV;
(ii) Adhezini sposobni interakcije z glikoproteini;
(iii) Nefimbrijski adhezni, nameščeni neposredno v celično steno bakterije.
Slika 3: Razdelitev adhezinov po skupinah (Solanki in sod., 2018)
2.5.2.1 Piliji ali fimbrije
Prva skupina so piliji ali fimbrije, ki so tanki, neflagelarni, filamentozni, spiralno zaviti organeli nahajajoč se na površini bakterij, tako po Gramu negativnih kot po Gramu pozitivnih bakterijah. Dolge so od nekaj μm pa do > 20 μm, premer pa variira < 2 do 11 nm.
Fimbrijski adhezini se nahajajo na koncu dolge paličaste beljakovinske strukture oz.
fimbrije. So pomemben kolonizacijski dejavnik šele v gostitelju (in ne v okolju) in se zato njihova sinteza vrši šele pri temperaturi okoli 37 °C. Na površini ene bakterije je približno od 200 do 1000 fimbrij, vsaka fimbrija pa je zgrajena iz približno 1000 proteinskih podenot
velikosti od 15 do 25 kDa (pomembne za imunološke lastnosti fimbrij) (Starčič Erjavec in Žgur-Bertok, 2014). Imajo številne funkcije: invazija, celična agregacija oz. povezovanje celic, konjugacija, predstavljajo receptorje za bakteriofage, pritrjevanje na abiotske in biotske površine, sinteza biofilma in omogočanje gibanja, ki je neodvisno od flagel. Delimo jih na več podskupin, odvisno od njihovega mehanizma: (i) šaperonsko-vratarska pot, adhezini CUP (angl. CUP- chaperone- usher pathway), (ii) fimbrije tipa IV (sestavljanje tipa fimbrij IV) in (iii) kurli (dodatna celična nukleacija/ obarjalna pot) (Solanki in sod., 2018).
Adhezini CUP: Izmed vseh podskupin najbolj znani in so najdeni pri večini bakterij v obliki dolgih in tankih paličic. Fimbrije so zgrajene iz ponavljujočih se proteinskih podenot. Na površini bakterijskih celic sta za izgradnjo fimbrij zadolžena: zunajmembranski protein(vratarji) in periplazmatski šaperon. Predstavnika sta FimD in FimC, kar lahko jasno vidimo na sliki 4. Na koncu fimbrij pa se nahaja adhezin (na sliki 4 je to FimH). S pomočjo tega mehanizma so zgrajeni tudi nekateri nefimbrijski adhezini. Najbolje so opisani pri enterobakterijah in nekaterih po Gramu negativnih bakterijah. V E. coli je znanih kar 38 različnih adhezinov CUP, najbolj prepoznavna pa sta: fimbrij tipa 1 (slika 4) in P pili (Solanki in sod., 2018).
Slika 4: Fimbrij tipa 1 (adhezin FimH) (iGEM, 2008)
Fimbrije tipa IV: so multifunkcionalni organeli, ki omogočajo rojenje po površini (angl.
twitching), povezovanje celic, ter pritrditev in prenos DNK. Imajo obliko dolgih (1-4 μm) in tankih (6-8 nm) filamentov, ki so sestavljeni iz številnih homopolimernih beljakovinskih podenot (15-20 kDa). Nahajajo se na eni strani bakterijske celice. Lahko prenesejo silo 100 pN (pomembno za adhezijo). Pri obeh (CUP in fimbrijah tipa IV) se na koncu fimbrije nahaja dodatna adhezivna enota, vendar je pri slednjih potrebna še komponenta notranje celične membrane. Fimbrije tipa IV se delijo: (i) tip IVa in (ii) tip IVb. Pilinske podenote tipa 4a so zgrajene iz 145 do 160 aminokislin (AK). Podenote imajo nekaj posebnosti na primer:
vsebujejo vodilno sekvenco (5-6 AK), ki se tekom izgradnje fimbrija odcepi; N-metil- fenilalanin je prvi ostanek, ki se odcepi tekom »zorenja« podenot; N-domena fimbrije je hidrofobna. Pilini tipa IVb pa so nekoliko večji (180-238 AK) in imajo daljšo vodilno sekvenco (15-30 AK). Za razliko od fimbrij tipa IVa tu tekom »zorenja« nastane drug metiliziran ostanek (na primer: pri BfpA je to N-metil-levcin).
Kurliji: Predstavljajo skupino funkcionalnih amiloidov (netopni vlaknasti agregati beljakovin, ki jih sestavljajo beta ploskve). Sestavljeni so iz komponent zunajceličnega matriksa (beljakovin, celuloze in dodatnega »neznanega« polisaharida). Struktura kurlijev je izredno stabilna, za njihovo uničenje je potrebno »močno« kemično tretiranje. Temeljni korak pri sestavljanju le-teh je agregacija, katera se zgodi na celični površini (vse se dogaja na zunanji membrani). Kurliji so različno dolge (6-12 nm) tanke (<2 nm) fimbrije. Vežejo se na različne beljakovine: plazminogen, fibronektin (Fn). Imajo različne funkcije: adhezija na različne gostiteljske celice in tkiva, kolonizirajo inertne površine, sodelujejo pri celični agregaciji in formaciji biofilma. Eden izmed predstavnikov je CsgA, ki se nahaja v E. coli.
Imajo veliko vlogo pri izgradnji mešanih biofilmov (E. coli, Salmonella, Citrobacter) (Zhou in sod., 2012; Dhakal in sod., 2015).
2.5.2.2 Adhezini sposobni interakcije z glikoproteini
Glikoprotein je sestavljena beljakovina, ki je kovalentno povezana z oligosaharidom. Oba tako gostitelj kot patogen imata na svoji površini lahko izražene beljakovine, ki imajo vezan specifičen oligomerni oz. glikanski del. Bakterije rodu Campylobacter imajo predvsem take vrste adhezinov (na primer CadF, ki se veže z fibronektinom).
2.5.2.3 Nefimbrijski adhezini
V nasprotju s polimernimi fimbrijami, so nefimbrijski adhezini kratke monomerne ali trimerne proteinske strukture. Nahajajo se neposredno v celični steni bakterij, zaradi majhnosti so izrednega pomena za tesni stik med bakterijsko celico in substratom. Glede na različni poti izražanja, adhezine pri po Gram negativih bakterijah delimo na dve podskupini:
adhezini sekrecije tipa 1 (T1SS) in adhezini sekrecije tipa 5 (T5SS). Prvi je heteromerni kompleks sestavljen iz 3 komponent: notranje membranski transporter ABC; fuzijski protein v periplazmatskem prostoru; ter pore v zunanji membrani. Primer takega adhezina je: BapA (S. enterica). Mehanizem sekrecije nefimbrijskih adhezinov tipa 5 pa sestavljata glavna koraka: prenos proteinov iz citoplazme do periplazme s pomočjo translokaze; ter prenos proteinov preko zunanje membrane s pomočjo porina v obliki β-sodčka.
Na splošno pa nefimbijske adhezine delimo na:
(i) Trimerni avtotransporterski adhezini (TAA) sestavljeni iz C-terminalna domena (formira poro v zunanji membrani), N-terminalna domena (za sekrecijo preko notranje membrane) in prenašalna domena (prenos skozi zunanje membrane), primer: antigen 43 pri bakterijah E. coli.
(ii) Integralni zunanji membranski adhezini (OMP): Vsebujejo β-sodček, primer: pri bakterijah E. coli: OmpA se veže na receptor Ecgp (glikoprotein).
(iii) Adhezini sekrecije tipa 3 (T3SS): predvsem pri Gram negativnih bakterijah.
Bakterije s tem tipom sekrecije adhezinov tvorijo lastne ligande in receptorje.
(Solanki in sod., 2018).
V nadaljevanju bom najprej predstavila adhezine posameznih bakterij rodu Salmonella, sledili jim bodo adhezini bakterij rodu E. coli, nazadnje pa bom predstavila še adhezine bakterij C. jejuni. Nato pa bom naredila primerjavo med adhezini omenjenih treh bakterij, pri čemer se bom osredotočila na primerjavo med adhezini predstavljenimi v tem poglavju, njihovih tarčnih molekul na površini, velikosti in flagelarnih adhezinov.
2.5.3 Adhezini bakterij rodu Salmonella
Na površini bakterij rodu Salmonella so oblikovana tri antigena mesta: antigen skupine O na celici (somatski antigeni), antigen skupine K na kapsuli (kapsularni antigeni) in antigen skupine H na flagelah (flagelarni antigeni). Protitelesa prepoznajo specifične antigene, ki se nahajajo na površini bakterij (Adamič in sod., 2003).
Patogeneza salmonel je povezana s virulentnimi dejavniki, ki vključuje različne tipe adhezinov, kapsulo, plazmid in flagelo. Salmonele so razvile številne fimbrijske adhezine, ki ji omogočajo različne strategije adhezije na površino celic. Poznanih je več kot 38 skupkov genov (angl. fimbrial gene cluster, FGC), ki kodirajo različne fimbrije. Njene fimbrijske adhezine lahko razdelimo med vse glavne mehanizme: adhezini CUP, adhezini kurliji in adhezini tip sekrecije št. 4, slednji so najmanj pogosti pri salmonelah. Glavni adhezini bakterij rodu Salmonella so predstavljeni v preglednici 1.
Preglednica 1: Adhezini bakterij rodu Salmonella (Dhakal in sod., 2015)
Legenda: *adhezin CUP: vratar/šaperon; T1SS: periplazmatski protein/ABC prenašalec oz. ATP-aza/ zunanji membranski protein; **potencialen
2.5.3.1 Flagela in njena vloga pri adheziji
Flagela omogoča gibanje in sodeluje pri infekciji, tvorbi biofilma in nenazadnje pri adheziji.
Veže se na različne lipidne komponente membrane (holesterol, fosfolipide, sulfolipide, gangliozide – GM1 in aGM1). Sestavljena je iz več kot 20 tisoč podenot flagelina. Večina serotipov S. enterica ima izražena enega izmed dveh flagelinov: FliC ali FliB. So primarna tarča imunskega sistema, zato so bakterije razvile mehanizme prekrivanja s katerimi preprečijo njihovo prepoznavanje. Med posttranslacijske modifikacije sodi glikolizacija flagelina. Ta igra pomembno vlogo pri adheziji, tvorbi biofilma in imitaciji glikanov na površini gostitelja. (Horstmann in sod., 2020).
Mehanizem Struktura Adhezin Proteini potrebni za izgradnjo*
Fimbrijski adhezini
Šaperonsko-vratarska pot (CUP) Tip 1 FimH FimC/FimD Pef pili PefA PefD/PefC
Std StdA StdD/StdC
Lpf LpfD LpfB/LpfC
Alternativna CUP Tcf SafA SafB/SafC
Kurli Tafi AgfG/AgfE/AgfF
T2SS (tip IV) IVb PilS Okoli 11 proteinov
Nefimbrijski adhezini
T1SS Sii SiiE SiiC/SiiF/SiiB
Bap BapA BapD/BapC/BapB
Avtotransportivni proteini Mis MisL druge komponente
Shd ShdA druge komponente
Sad** SadA
Zunaj membranski proteini Pag PagN
2.5.3.2 Fimbrijski adhezini
Najbolj znan adhezin je FimH, ki nastane po šaperonsko-vratarski poti in spada med fimbrije tipa 1. Pot izgradnje podenot se začne v citoplazmi, kjer po glavni sekrecijski poti, s pomočjo beljakovin SecDF/YajC in kompleksa SecYEG (transmembranska beljakovina) poteče transport le teh preko notranje membrane celice. Energijo, ki je potrebna za potek oz. prenos prepilin peptidaze v periplazmo, je pridobljena tekom ATP hidrolize (katalizirana s pomočjo SecA). Peptidaza tekom translokacije cepi vez -Gly-Phe- in s tem sprosti N-terminal sekrecijsko sekvenco. V periplazmi poteka interakcija specifičnih šaperonov, kar prepreči hitro degradacijo preko peptidaz in prezgodnjo izgradnjo fimbrijskih podenot v periplazmi.
Šaperoni nato te podenote prenesejo do vratarja (integralna zunajmembranska beljakovina), ki koordinira izgradnjo fimbrij na površini bakterijske celice. Na koncu fimbrije se nahaja vezavno mesto, kamor se pritrdi receptor gostitelja. Eden izmed takih adhezinov je tudi FimH, ki se nahaja na konici fimbrije, veže se na ostanke manoze (le-ti se na primer nahajajo na eritrocitih) in glikoprotein-2 (M celice oz. membranske epitelijske celice). C-terminalna domena je potrebna za integracijo FimH na organele, N-terminalna domena pa ima afiniteto do receptorjev. Pri bakterijah rodu S. Thyphimurim so odkrili nizko adhezivne (podobna adhezivnost kot FimH pri S. Enteritidis) in visoko adhezivne fimbrije FimH. Adhezin FimH pa je od vsakega serotipa in vrste salmonele malo razlikuje (Wagner in Hensel, 2011).
Adhezini pili Saf (angl. Salmonella atypical fimbriae) so zgrajeni po alternativni šaperonsko-vratarski poti. Pili je zgrajen iz glavne podenote SafA (nekaj sto kopij podenot) in adhezina SafD. SafD ne vsebuje N-domene in je na koncu fimbrije prisoten v »osamljeni«
obliki (nima kopij).
Primarna funkcija nekaterih fimbrijskih adhezinov pa ni tvorba biofilma, vendar so ključni pri mehanizmu patogenosti salmonel. Le-ta je dosežena preko vezave na specifičen receptor na gostiteljski celici. Receptorji so večinoma različni membranski proteini, ostanki sladkorjev ali lipidne strukture. Vendar imajo vsi do sedaj znane fimbrije bakterij Salmonella funkcijo lektina (beljakovine, ki prepoznajo in vežejo ogljikove hidrate). Posledično salmonele lahko kolonizirajo črevesje in vdrejo v celico s pomočjo drugih beljakovin (Desai, 2011). Adhezin StdA se veže na α(1-2)fukoziliran receptor, adhezin PefA se veže na antigen Lewis krvne skupine (Chessa in sod., 2009).
Naslednji adhezin se veže na receptor Peyerjevih plošč (limfatični folikli v vitem črevesu), gre se za dolgo polarno fimbrijo adhezina Lpf (podoben sistem kot fimbrije tipa št. 4). Te plošče predstavljajo vstop za salmonele, kar je ključno za okužbo gostitelja.
Kurliji so tako imenovane tanke agregativne fimbrije pri salmonelah se imenujejo Tafi. So fimbrijski adhezini s premerom 3-4 nm in vodijo do avto-agregacije bakterij Salmonella, nastanka biofilma in adhezije na različne površine. Pri bakterijah Salmonella, je Tafi kodiran z dvema operonoma (agfDEFG in agfBA). AgfD je transkripcijski regulator, AgfBA predstavlja fimbrijske podenote in AgfEFG je odgovoren za sestavo celotne fimbrije v zunanji membrani (Barnhart in Chapman, 2006). Tafi se veže na različne beljakovine ECM, kot sta fibronektin in laminin (Wagner in Hensel, 2011). Salmonele se z njimi lahko pritrdijo na kultivirane mišje intestinalne celice, na abiotske površine (npr. teflon, nerjaveče jeklo) in rastline, ki so lahko razlog za prenos iz živali na živali (Barak in sod.,2005).
Fimbrije tipa IV so bili zaznani samo pri človeškem serotipu Typhi. Zapis 11 genov, ki so potrebni za izgradnjo pilija tipa IV PilS, se nahaja na pil operonu, ki je lokaliziran na otoku patogenosti 7 (SPI – Salmonella pathogenicity islands). Potrebni so za adhezijo in vstop v človeške intestinalne celice. Podenote fimbrija se združijo v periplazmi na notranji membrani in so izločene s sekretinom (polipeptidni hormon) na zunanjo membrano kot intakten fimbrij. Fimbrij spada v podskupino tipa IVb. Pilinska podenota PilS gre do periplazme po glavni sekrecijski poti (kot pri CUP), kjer se zasidrajo v notranjo membrano.
Prepilin peptidaza PilU loči N-terminalno sekvenco. Energija za polimerizacijo pilusa je pridobljena s pomočjo ATP-aze. Sestavljen pilus je nato preko sekretina PilQ izločen na zunanjo membrano. Dodatna retrakcijska ATP-aza depolimerizira pilus in reciklira pilinske podenote tako, da jih vgradi v notranjo membrano (Zhang in sod., 2000).
2.5.3.3 Nefimbrijski adhezini
Sem spadajo mono- in oligomerni adhezini, ki so izločeni po sekrecijski poti tipa 1 ali preko lastnega transporta skozi bakterijske membrane. Zaenkrat sta znana samo dva adhezina sekrecijskega tipa 1 (T1SS) pri bakterijah vrste S. enterica in sicer adhezina SiiE in BapA (ang. biofilm associated protein). Slednja spadata med največje proteine proteoma salmonele in sta v zunajcelično okolje izločena preko sistema T1SS. Sistem T1SS je sestavljen iz:
tridelnega kompleksa treh beljakovin, ki se nahajajo na notranji membrani (ABC- ATP- vezajoča kasetna beljakovina/ ABC prenašalec), periplazemskem prostoru (MFP – membranska fuzijska beljakovina) in zunanji membrani (OMP- zunanje membranski protein). Skupaj tvorijo kanal in omogočajo transport substratov T1SS. Sistem T1SS je dokončan, ko prenašalec ABC prepozna signal substratnega proteina C-konca. Energijo za transport omogoča ATP hidrolaza. Sistem T1SS izloča različne substratne proteine od hemolizinov do zunajceličnih encimov. Tekom izločanja morajo biti taki adhezini pritrjeni na bakterijsko ovojnico (da potrdijo svojo vlogo adhezina) in premostiti razdaljo med bakterijo in biotsko ali abiotsko površino. Zato morajo biti izločeni adhezini v interakciji s proteinom v membrani ali biti začasno pritrjeni na sistem T1SS. Adhezin Bap je bolj raziskan pri bakterijah Staphylococcus aureus. Gre za površinski protein, ki je ključen za formacijo biofilma. Protein Bap iz bakterij S. aureus ima v primerjavi z BapA iz bakterij S. enterica kar 29 % sekvenc enakih (Latasa in sod., 2005).
Drugi prepoznan je adhezin SiiE. Na lokusu (točno mesto na DNK, kjer se nahajajo geni) otoka patogenosti 4 se nahaja genski zapis za proteine SiiA-SiiF. SiiA in SiiB sta lokalizirana v notranji membrani in nista potrebna za sintezo in sekrecijo SiiE. Kljub temu se je izkazalo, da je njuna vloga ključna pri virulenci preko oralnega vnosa pri miših. Njuno delovanje pripomore k invaziji polariziranih celic. Do sedaj še niso odkrili podobnih proteinov SiiA in SiiB, zato so za razumevanje njune funkcije potrebne nadaljne raziskave. Proteini SiiC, SiiD in SiiF imajo vlogo pri konstrukciji sistema T1SS. Protein SiiF je notranje membranska ATP-aza (prenašalec ABC), SiiD ima vlogo periplazemskega fuzijskega proteina (MFP), SiiC pa zunanjega membranskega proteina (OMP). Pritrditev na površino bakterijske celice je ključna, da lahko SiiE deluje kot adhezin. Odkrili so, da je sestavljen iz 53 ponavljajočih se imunoglobulinskih (Ig) domen, kar posledično pomeni zelo velik in dolg protein. Med Ig52 in Ig53 se nahaja domnevno nezložen segment. Adhezin je velik kar 595 kDa. Ta dolžina lahko seže dlje oz. čez sloj antigena O v LPS pri bakterijah Salmonella. Krajšanje SiiE korelira z zmanjšano invazivnostjo. Prispevka SiiE k adheziji dolgo niso priznavali, saj se je pri adheziji na nepolarizirane celične linije HeLa izkazal za nepomembnega.
Nasprotujoče dokaze pa so nato potrdili na modelu s polariziranimi epitelijskimi celicami (mikrovili, tesni stiki), ki so bili precej podobni sestavi črevesnih celic. Tam je SiiE imel ključno vlogo pri adheziji. Dokazano je, da proteini SiiA-F sodelujejo pri prvem kontaktu bakterije Salmonella in gostitelja (Gerlach in sod., 2008)
Protein PagN (ang. PhoP activated gene N) je zunaj membranski protein in spada med putativne adhezine. Spada med hemaglutinine, to so glikoproteini, ki povzročijo aglutinacijo eritrocitov. Prispeval naj bi k adheziji na sesalske celice.
Autotransportivni adhezini se delijo na dve kategoriji (i) monomerni proteini (ii) trimerni autotransportivni adhezini, kot so podani na sliki 5.
Slika 5: Avtotransportivni adhezin pri bakterijah Salmonella (Kingsley in sod., 2002)
Iz družine autotransportivnih adhezinov so opisani trije. ShdA in MisL spadata med monomerne adhezine, medtem ko potencialen adhezin SadA spada med autotransportivne adhezine. Prenašalna domena tega je sestavljena iz »stalk« domene, ki z povezovanjem α- vijačnic tvori motiv obvite vijačnice (angl. helical coiled-coils), ta definira dolžino adhezina) in glavne domene. Dokazov za njegov pomen pri adheziji do sedaj še ni, njegove strukture lastnosti pa ga uvrščajo med avtotransportivne adhezine.
Vloga adhezinov ShdA in MisL pa je bila dokazana eksperimentalno. ShdA ima gen za svoj zapis lociran na otoku CS54. Podatki raziskav kažejo kar 92 % prekrivanje sekvence prenašalne domene z drugimi iz družine autotransportivnih adhezinov, na primer z adhezinom AIDA v bakterijah E. coli. ShdA se veže na Fn. Na sliki 6 pa vidimo, da je ta interakcija lahko prekinjena s heparinom, ker se tudi ta veže na enako vezavno mesto Fn kot ShdA (Kingsley in sod, 2002). Heparin – vezavno mesto 2, ki se veže na Fn dokazuje njegovo anti-adhezivno aktivnost (Fukai in sod., 1997).
Autotransportivni adhezin MisL je kodiran z genom v SPI3 in ima podobne značilnosti kot ShdA. Tudi adhezin MisL se veže na Fn. Adhezina MisL in ShdA pa se različno vežeta z drugimi ekstacelularnimi proteini, kot sta kolagen IV in kolagen I. (Dorsey in sod., 2005;
Kingsley in sod., 2002). Adhezin MisL je potreben za kolonizacijo črevesja v miših in piščancih.
To nakazuje na sinergistično delovanje adhezinov MisL in ShdA, vendar ta povezava še ni dokazana. Zelo pomembno je dejstvo, da se veliko adhezinov salmonel veže na proteine ECM. Te interakcije se zdijo ključne za kolonizacijo tanjšega (zmanjšanega) črevesnega epitelija, kjer so ti proteini še toliko bolj izpostavljeni (Dorsey in sod., 2005).
2.5.4 Adhezini bakterij vrste E. coli
Bakterije E. coli spadajo v družino Enterobacteriacea in so po Gramu negativne paličice.
Posamezne tipe ločimo na osnovi antigenov O-K-H. Antigen O je lipopolisaharid na zunanji celični ovojnici; antigeni K so kapsularni polisaharidi, antigeni H so flagelarni proteini. V nalogi se bom osredotočala na adhezine črevesnih bakterij E. coli (IPEC): EPEC, ETEC, enterohemoragični tip E. coli H7:O157 (EHEC), EIEC, adherentni invazivni (AIEC), EAEC in DAEC, ki povzročajo hude alimentarne toksikoinfekcije.Za lažjo primerjavo v naslednjem poglavju bom omenila tudi adhezine uropatogene E. coli (UPEC), saj so le ti zelo dobro opisani. Ti tipi bakterij E. coli se na gostiteljske epitelijske celice pritrdijo s pomočjo flagele ter fimbrij in nefimbrijskih struktur, ki so predstavljeni v preglednici 2.
2.5.4.1 Flagela in njena vloga pri adheziji
Bakterije E. coli imajo flagele razporejene po celotni celični površini, ki so kategorizirane v različne serotipe H na podlagi sero-reaktivnosti antigenske domene FliC (sinonimi flaF, hag). Flagela je sestavljena iz več tisoč kopij le tega. Patotip lahko vsebuje različne serotipe H in podobni serotipi H serotipi so lahko najdeni v več kot enem patotipu. Sprva so mislili, da ima flagela domnevno vlogo pri adheziji oz. ima vlogo pri invaziji. Giron in sod. (2002) so dokazali, da se EPEC z izraženo flagelo H2 ali H6 veže na celice HeLa in tam tvori mikrokolonije. Inaktivirali so tudi gen fliCH6, kar se je izkazalo v zmanjšani adheziji EPEC in dodatni potrditvi njene vloge pri adheziji. V drugi študiji so dokazali adhezivno funkcijo flagele H6 pri bakterijah EPEC in flagele H7 pri bakterijah EHEC. Te so se vezale na mucin (glikoprotein, ki ga izločajo specifične epitelijske celice in tvorijo mukozni sloj, ki služi kot obramba pred infekcijami). Kot mucin pa tudi druge komponente ECM (laminin, kolagen, Fn) delujejo kot receptorji za bakterije E. coli., S. enterica in S. aureus (Erdem in sod., 2007).
2.5.4.2 Fimbrijski adhezini
Tekom let so adhezine velikokrat preimenovali, zato imajo nekateri številna imena. Številni tipi bakterij E. coli nosijo plazmide na katerih so zapisi za fimbrijske adhezine kot so: F4 (K88), F5 (K99) in fimbrija Bfp. Nekateri zapisi za adhezine pa se nahajajo na kromosomu npr. F41, Pap, Sfa (Nagy in sod., 2005).
Preglednica 2: Adhezini bakterij E. coli (Dhakal in sod., 2015)
Mehanizem Struktura Adhezin Proteini potrebni za izgradnjo Serotip Fimbrijski adhezini
Šaperonsko vratarska pot
(CUP) P pili PapG PapD/PapC UPEC
Tip 1 FimH FimC/FimD UPEC
Lpf LpfD LpfB/LpfC črevesni serotipi
K88 pili FaeE/FaeD ETEC
K99 pili FanE/FanD ETEC
Ecp EcpD
Alternativni CUP CS1 CooD CooB/CooC ETEC
Kurli Curli CsgG/CsgE/CsgF Večina serotipov
T2SS (tip IV) Tip IVb BfpA >20 proteinov EPEC
Nefimbrijski adhezini
T3SS Esp pili Intimin? Okoli 20 proteinov (intimin, Tir) EPEC, EHEC
Autotransportivni adhezini Ag43 EPEC, EHEC
AIDA TibA
Fimbrije so zgrajene po več različnih mehanizmih. Pri bakterijah E. coli je pot največkrat šaperonsko – vratarska, izmed teh pa prevladujejo fimbrije tipa 1. Skupek genov fim kodira strukturne komponente fimbrijskih organelov in regulatorjev, katere lahko vidimo na sliki 4: adhezin FimH (pri UPEC), glavno enoto fimbrije FimA, periplazmatski šaperon FimC, zunajmembranski protein FimD in dva vmesna proteina FimG in FimF. Adhezin FimH je zgrajen iz fimbrijske oz. C-domene (veže fimbrij z adhezinom) in lektinske oz. N-domene CRD (angl. carbohydrate recognition domain), ki se specifično prilega saharidu (manozidi).
Ti manolizirani receptorji se nahajajo na različnih tipih celic. Fimbrija je zgrajena iz 500- 3000 podenot FimA (dolžina fimbrije je 6-7 nm). Mutanti z inaktiviranim genom fim so izkazali močno zmanjšanje adhezije na abiotske površine kot je polvinilklorid (PVC) (Volkan in sod., 2015).
Fimbrije tipa 1 se vežejo na D-manozo, laminin, kolagen, fibronektin in abiotske površine.
P-pili (pri UPEC) so zgrajeni po šaperonsko – vratarski poti. So nitaste heteropolimerne strukture na površini bakterijskih celic. Glavna enota P-fimbrij je PapA (angl. pilus associated with pyelonephritis), sestavljajo pa jo še manjše podenote PapF, PapK, PapG in vrh pilina PapE. Vsi so locirani na vrhu fimbrije. Vlogo adhezina ima PapG, vendar sta za uspešno vezavo na gostiteljsko celico potrebna obe podenoti, tako PapG in PapF. Podenota PapK se nahaja na vrhu fimbrije, označuje konec rasti polimeraPapE. Adhezin PapG se veže na receptor α-D-galaktopiranozil-(1-4)-β-D-galaktopiranozid (Galα(1-4)-Gal), ki sestavlja glikolipide prisotne na eritrocitih in ledvičnih celicah (Antão in sod., 2009; Volkan in sod., 2015).
Lpf (angl. long polar fimbriae) so dolge polarne fimbrije. Zapis se nahaja na 4-5 genih (lpf A, B, C in D; nekatere vrste nosijo duplikat D*). Funkcije proteinov so naslednje: LpfA je glavna enota fimbrije, LpfB je šaperon, LpfC pa je zunanji membranski protein oz. vratar.
LpfD pa je manjša podenota fimbrije. LpfD* pa je opisan kot regulator oz. dodatna fimbrijska podenota, ki naj bi se vezal na manozo (Ross in sod., 2015).
K88 in K99 sta fimbrija širine 2 do 4 nm zgrajena po mehanizmu šaperon-vratar. Adhezirajo se na receptorje intestinalnih celic. Sta virulentna dejavnika pri bakterijah ETEC. Njuno ime izhaja iz napačnega predvidevanja, da gre za kapsularne antigene na površini celice (antigeni K). Po strukturi so tanki in fleksibilni. Adhezivne značilnosti so za razliko od ostalih povezane z glavnimi podenotami fimbrija (točno določene podenote posvečene adheziji ni).
Receptorji na katere se adhezin veže: glikoproteini, mucini, glikolipidi (NeuGc(α2- 3)Gal(β1-4)Glc) (Nagy in sod., 2005; Dhakal in sod., 2015).
CS1 (angl. coli surface antigen 1) pili so zgrajeni po alternativni šaperonsko-vratarski poti.
Odkriti so pri večini ETEC. Adhezin CS1 je polimer glavne pilinske enote CooA. Ostale komponente, ki ga gradijo so še CooB, CooC in CooD. Vlogo adhezina ima CooD, ki je lociran na vrhu fimbrije. CooC ima vloga vratarja, CooB ima vlogo šaperona. Slednji je v pomoč pri stabilizaciji CooC oz. vratarja, kar je redkost pri sistemu CUP. Zaradi
»specialnih« periplazmatskih šaperonov (drugačni od klasičnih šaperonov) potrebnih za izgradnjo celotnega fimbrija se temu mehanizmu reče alternativni (Volkan in sod., 2015).
Ecp (ang. E. coli common pilus), kodiran na operonu ecpRABCDE. Spada med najpogostejše fimbrijske adhezine (adhezin CUP), saj je prisoten pri večini vrst bakterij E.
coli. Raziskave kažejo, da ima dvojno vlogo, pri zgodnjih fazah nastanka biofilma in
prepoznavi gostiteljske celice. Mutanti brez epc operona se niso pritrdili na hidrofobne abiotske površine in tvorili biofilma. Prav tako se mutanti niso vezali na epitelijske celice, kar pomeni, da je Ecp eden izmed adherentnih faktorjev pri E. coli. Ecp operon pa je prisoten tudi pri mnogih drugih patogenih enterobakterijah. Glavno enoto Ecp predstavlja protein EcpA (18 kDa), ki se nahaja na celotni dolžini fimbrije. Vlogo dejanskega adhezina pa ima podenota EcpD, ki se nahaja na koncu fimbrije (Rendon in sod., 2007; Garnett in sod., 2012).
Ecp deluje v sinergiji z adhezinom Bfp (angl. bundle-forming pilus) tekom adhezije (Saldana in sod., 2009).
Fimbrije tipa IV: Bfp spada med adhezine fimbrij tipa IV. Ima vlogo pri formaciji mikrokolonij in interakciji med celicami. Khursigara in sod. (2001) so odkrili, da Bfp prepozna fosfoetanolamin na gostiteljski celici in se nanj veže. Nove raziskave pa kažejo, da se Bfp veže kot lektin in se tako pritrdi na receptor z N-acetilalktozaminom (Hyland in sod., 2007).
Kurliji: Curli je zgrajen iz vsaj 6 proteinov, katerih zapis se nahaja na operonih csgBA in csg DEFG. CsgF je regulator operona csgBA, vsi proteini razen CsgD vsebujejo sekundarne signalne sekvence za traslokacijo v periplazmo. Protein CsgG je protein zunanje membrane, potreben za sekrecijo podenot curlija (CsgA in CsgB). CsgB združuje CsgA enote v vlakno.
CsgE in CsgF pa sta v interakciji s CsgG nujno potrebna za uspešno sestavljen curli. Veže se lahko z različnimi proteini kot so: fibronektin, laminin, TLR2 (potreben za aktivacijo imunskega sistema), plazminogen, fibrinogen, factor XII, kininogen. Zanimiva je tudi njihova vloga pri adheziji na rastlinske celice oz. njihova fitopatogenost. Najbolj optimalna ekspresija curlijev je pri 26 °C (temperatura pri kateri rastejo rastline). Sev E. coli K-12 , ki pretirano izraža curlije, so se pritrdile na kalčke, medtem ko mutacije genov csgA in csgD niso vplivale na adherenco bakterij E. coli 0157:H7. To pomeni, da imajo patogeni izolati več različnih adhezinov za pritrditev na rastlinsko celico, medtem ko jih sev E. coli K-12 nima (Van Houdt in Michiels, 2005).
2.5.4.3 Nefimbrijski adhezini
Bakterije EPEC so glavne povzročiteljice otroške diareje in poškodb na gostiteljski celici.
Kolonizirajo črevesno epitelno sluznico, kjer se pritrdi na enterocite (nastanek lezij). Ima sekrecijsko aparaturo tipa III in preko njega se izločijo in injicirajo glavne efektorske molekule v citosol gostiteljske celice. Za adhezijo bakterije EPEC uporablja model lokalne adherence, preko adherentnega faktorja EAF. Ta faktor je kodiran na plazmidu (omenjen zgoraj Bfp-pili tipa IV). Imajo pa tudi kromosomske otoke patogenosti na katerih je zapis za sekrecijske proteine EspA, EspB, EspD, EspF, intimin in translocirajoči receptor Tir (najprej so mislili, da je membranski protein gostiteljske celice). Ta je vstavljen v gostiteljsko plazmalemo in služi kot receptor za adhezin intimin. Točna funkcija vseh sekrecijskih proteinov ni znana. Znano pa je, da se protein EspA polimerizira in tvori transportni kanal, ki povezuje gostitelja in sekrecijski aparat (Kenny in sod, 1997).
Intimin je prvi opisan adhezin EPEC in spada med zunaj membranske proteine
Autotransportivni adhezini (sekrecija tipa V): pri E. coli so odkrili 3 adhezine, ki spadajo v to družino. Ti predstavniki so Ag43, AIDA in TibA.
Ag43 je specifičen antigen, ki se razlikuje od posamezne vrste E. coli. Njegova naloga ni popolnoma znana, zato ga uvršamo med putativne adhezine. Ima pa nekaj značilnosti adhezinov: (i) fazno variacija (regulacija izražanja genov-operon), (ii) podobnosti sekvence z mnogimi adhezini, (iii) agregacija bakterijskih celic in (iv) se veže na sesalske celice.
AIDA (angl. adhesin involved in diffuse adherence) je zunanje membranski protein in adhezin, ki je vključen v difuzno adhezijo nekaterih vrst E. coli. Po celični površini je enakomerno razporejen in ne tvori filamentoznih vlaken oz. fimbrij.
Zapis za naslednjega se nahaja na bakterijskem kromosomu (za razlike od prejšnjih, ki se nahajajo na plazmidu), gre se za autotransportivni adhezin TibA. Od prejšnjih dveh iz te družine se precej razlikuje, saj je le ta glikoliziran. Glikoprotein je lokaliziran na površino in je prvi opisan take vrste pri E. coli (Henderson in sod., 2001).
2.5.5 Adhezini bakterij rodu Campylobacter
Kampilobaktri so po Gramu negativne, nesporogene, tanke, spiralno zavite (0,2-0,8 μm x 0,5-5 μm), mikroaerofilne bakterije, ki živijo kot komenzali v gastrointestinalnem traktu večine domačih in divjih ptičev in sesalcev. Adhezija na gastrointestinalne epitelne celice je predpogoj za kolonizacijo, ki je pogojena z adhezini na bakterijski površini. Večina vrst kampilobaktrov ima mono- ali bipolarni flagel na enem ali obeh koncih celice. V primerjavi z bakterijami rodu Salmonella in Escherichia je o virulentnih dejavnikih bakterije rodu Campylobacter znano veliko manj. Predvidevajo, da imajo adhezini predstavljeni v preglednici 3 (večina potencialni): flagel (FlaA – flagelin A), PEB1, PEB3, CapA, HtrA, FlpA, JlpA, MOMP (poglavitni protein zunanje membrane) in CadF vlogo pri adheziji, vendar njihova vloga pri kolonizaciji in razvoju bolezni ni poznana.
Številni glikani se nahajajo na površini C. jejuni. Za interakcijo z gostiteljem pa so še posebej pomembni lipopolisaharidi (LPS) in lipooligosaharidi (LOS) z vezano sialično kislino (N- acetilnevraminska kislina) pri nekaterih vrstah. LPS in LOS sta sestavljena iz lipida A (dve glukozaminski enoti in različnih maščobnih kislin) in osnove iz poli- in oligosaharidov, ki so strukturno različni (Declan, 2015).
Preglednica 3: Dejavniki adhezije bakterij Campylobacter (Declan, 2015)
Virulentni dejavniki Funkcija/lokacija Receptorji na gostiteljski celici
CadF* Zunaj membranski protein Fibronektin(Fn)
CapA Lipoprotein z avtotransportivno
funkcijo ND
JlpA* Lipoprotein HSP90a
Peb1 Periplazmatski protein ND
Peb 3 Transportni protein ND
Peb4 Šaperon ND
Cjl349c Lipoprotein (na površini) Domnevno se veže na Fn in fibrinogen
FlpA* Protein, ki se veže z Fn Fibronektin
MOMP Zunaj membranski protein ND
FlaA Sestavlja konec flagele ND
FlgE Sestavlja flagelo ND
HtrA Termotoleranten-omogoča preživetje ND Legenda: *so pravi adhezini (ostali so potencialni); ND-ni definirano
2.5.5.1 Flagela in njegova vloga pri adheziji
Sprva so mislili, da flagela nima vloge pri adheziji. Vendar so nove študije dokazale, da ima ključno vlogo pri začetni adheziji na površino, saj se brez njega bakterije ne pritrdijo na površino. Zunanji filament flagele sestavljata flagelin A (FlaA) in flagelin B (FlaB). Vlogo adhezina ima FlaA, ki se pritrdi na intestinalne celice. Flagela poleg adhezije omogoča gibanje, ima vlogo pri internalizaciji, formaciji biofilma in sekreciji proteinov pomembnih za invazijo gostitelja (Grant in sod., 1993; Svensson in sod., 2014).
FlgE (ang. flagellar hook protein E) je protein, ki je sestavni del flagele. Prispeva k gibljivosti. Aerobni pogoji so optimalni za njegovo ekspresijo, zato naj bi prispeval k adheziji na piščančjo kožo v aerobnih razmerah. V raziskavi so preučevali vezavo FlgE na CSA (ang. chicken serum albumin), ki spada med proteine prisotne na piščančji koži (Tanigucki in sod., 2021).
2.5.5.2 Pravi in potencialni adhezini
MOMP (angl. major outer membrane protein, 43-kDa) je porinski protein, ki omogoča prenos hidrofilnih molekul skozi zunanjo membrano, prav tako zagotavlja strukturno stabilnost zunanje membrane, izmed vseh adhezinov najbolj variabilen med različnimi sevi C. jejuni. Prispeva k adheziji na epitelijske celice, kolonizaciji piščancev in formaciji biofilma.
CadF (angl. Campylobacter adhesion protein to fibronectin) je zunaj membranski protein, ki se veže na fibronektin. Fibronektin je glikoprotein velikosti 220 kDa, ki je prisoten v bazalni membrani in mukoznem sloju intestinalnega epitelija. Konkel in sod. (2005) so prvič identificirali vezavno mesto domene fibronektina in CadF. Gre se za sekvenco 4 aminokislin (Phe-Arg-Leu-Ser). Vezava na fibronektin aktivira receptor β-integrin, kar rezultira v fosforilaciji receptorja rastnega faktorja. Le ta sproži signalizacijo proteinov Cia, ki aktivirajo GTP-aze Rac1 in Cdc42. Začne se internalizacija kampilobaktra z spremembo citoskeleta (polimerizacija aktinskih filamentov) in formacijo gibljive celične površine. Vsi ti koraki so potrebni za vstop v gostiteljsko celico. Monteville in sod. (2003) so s cadF mutanti kampilobaktrov dokazali zmanjšano internalizacijo le teh v humane intestinalne celice INT407. Ugotovili so, da je kombinacija adhezina CadF skupaj s proteinom CiaB in JlpA (Jejuni lipoprotein A) pomembna za fibrinonektin-vezujočo adhezijo in vstop v gostiteljsko celico (Young in sod., 2007).
FlpA (ang. Fibronectin-like protein A) je proteinski adhezin, ki se veže na fibronektin (vezavno mesto sestavljeno iz 9 aminokislin) (Flanagan in sod., 2009). Oba adhezina FlpA in CadF sta potrebna za adhezijo C. jejuni in za prenos Cia efektorskih proteinov v citosol tarčnih celic gostitelja. To sproži signalno pot, ki je potrebna za invazijo (Talukdar in sod., 2020).
Še eden izmed zunaj membranskih adhezinov je CapA (ang. Campylobacter adhesion protein A). Gre se za površinsko izražen lipoprotein z avtotransportivno funkcijo, ki je prav tako pomemben pri adheziji humanih epitelijskih celic kot tudi za kolonizacijo piščancev.
(Ashgar, 2007; Flanagan in sod., 2009).
Med proteine, ki se vežejo na periplazmo spadajo proteini Peb1, 3 in 4 (angl. periplasmatic- binding protein). Peb1 je periplazmatski protein najden pri bakterijah C. jejuni in C. coli.
Peb4 je sprva veljal za adhezin, raziskave pa so pokazale, da ima vlogo šaperona in prenaša CadF na zunanjo membrano. Peb3 pa je transportni protein, vključen v utilizacijo 3- fosfoglicerata.
Eden izmed bolj raziskanih je tudi adhezin JlpA (angl. jejuni lipoprotein A). Lociran je v notranji celični membrani. Gre za glikoliziran lipoprotein, ki se veže na protein vročinskega šoka (HSP90a). Vezava sproži aktivacijo NF-kappaB in p38 MAP kinaze, posledica pa je inflamatoren/ imunski odziv gostitelja (kampilobakterioza) (Jin in sod., 2003).
Za rast kampilobaktrov pri višjih temperaturah je odgovoren protein HtrA (angl. high temperature requirement protein A). Omogoča razcepitev E-kadherina in okludina, ki sta komponenti tesnega stika med celicami. Prav tako je potreben za pravilen potek adhezije oz.
pravilno zlaganje adhezinov, invazije, proliferacije v aerobnih razmerah in izražanje proteazne aktivnosti (Kreling in sod., 2020).
2.6 PRIMERJAVA ADHEZINOV MED BAKTERIJAMI SALMONELLA,
ESCHERICHIA IN CAMPYLOBACTER 2.6.1 Primerjava flagelarnih adhezinov
Kampilobaktri se na površino ali druge mikroorganizme ne pritrjujejo s fimbrijami oz. pili kot to počnejo druge po Gramu negativne bakterije kot sta E. coli in Salmonella. Posledično primerjava fimbrij vseh treh bakterij ni mogoča. Vse tri pa imajo izraženo flagelo, katere podenote kažejo adhezivne lastnosti, vendar le te ne moremo uvrstiti v katero izmed zgoraj naštetih skupin adhezinov. Primerjava flagelarnih adhezinov med bakterijami S.
Typhimurium, E. coli ter C. jejuni je zbrana v preglednici 4.
Preglednica 4: Flagelarni adhezini
Bakterija Flagela/protein Tarča (receptor)
S. Typhimurium Flagela, F Epiteljske celice črevesja, holesterol
FliC Holesterol, gangliozidi, fosfolipidi, sulfolipidi E. coli Flagela/ H2, H6 celice HeLa, Caco-2, IPEC, fibronektin
FliC Intestinalni mukus, laminin, kolagen, mucini, Caco- 2(EtpA-adhezin), glukonat
C. jejuni Flagela, FlaA, FlgN Epiteljske celice črevesja
Flagela vseh treh je prvotno namenjena gibanju, vendar se je izkazalo, da ima tudi druge funkcije, kot sta adhezija in invazija predvsem črevesnih celic.
2.6.2 Adhezija na različne komponente zunajceličnega matriksa gostiteljske celice ECM je zelo dinamična struktura s številnimi funkcijami (struktura, postavitev celične bariere, signalizacije, regulacije fizioloških procesov). Sestavljena je iz številnih makromolekul kot so proteoglikani in glikoproteini, ki se izločajo lokalno. Najbolj se bom osredotočila na: fibronektin, kolagen, elastin, vitronektin in saharidne ostanke. Primerjava adhezinov med bakterijami S. Typhimurium, E. coli ter C. jejuni je zbrana v preglednici 5.
