UNIVERZA V LJUBLJANI
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE
Eva STARE
METAGENOMSKE VRSTE PREVOTEL V PREBAVNIH EKOSISTEMIH
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE
Eva STARE
METAGENOMSKE VRSTE PREVOTEL V PREBAVNIH EKOSISTEMIH
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija
METAGENOME DERIVED PUTATIVE PREVOTELLA SPECIES IN GUT ECOSYSTEMS
M. SC. THESIS
Master Study Programmes: Field Microbiology
Ljubljana, 2021
II
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Mikrobiologija. Delo je bilo opravljeno na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani, v laboratorijih Oddelka za zootehniko v času od 17. oktobra 2020 do 1. septembra 2021.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorja magistrskega dela imenovala doc. dr.
Tomaža Accetta, za recenzenta prof. dr. Blaža Stresa.
Mentor: doc. dr. Tomaž ACCETTO
Recenzent: prof. dr. Blaž STRES
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Gorazd AVGUŠTIN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Član: doc. dr. Tomaž ACCETTO
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Član: prof. dr. Blaž STRES
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum zagovora:
Eva Stare
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 579.25:575.112(043)=163.6
KG Prevotella, Prevotellaceae, vampni mikrobiom, vamp, prežvekovalci, prebavni sistem, metagenomika, metagenomske vrste, anaerobna tehnika, PCR, ANI, MLSA, TETRA, CAZY, filogenija
AV STARE, Eva, dipl. mikrobiol. (UN)
SA ACCETTO, Tomaž (mentor), STRES, Blaž (recenzent) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije LI 2021
IN METAGENOMSKE VRSTE PREVOTEL V PREBAVNIH EKOSISTEMIH TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija)
OP XXIV, 103 str., 27 pregl., 25 sl., 23 pril., 156 vir., 1 CD IJ sl
JI sl/en
AI Namen magistrskega dela je bil potrditi obstoj vrst iz rodu Prevotella, ki jih je napovedala študija metagenomske analize vampnih ekosistemov (Stewart in sod., 2019), kar smo morda dosegli z izolacijo enega seva. Hkrati smo izolirali vsaj pet novih vrst rodu Prevotella. Primerjali smo genome pridobljene iz metagenomov s tistimi iz izoliranih Prevotella in ugotovili, da imajo nekateri izmed prvih pomanjkanje številnih jedrnih genov za uspešno analizo MLSA kot tudi nenavadno visoko število encimov CAZY in velikost genoma. Večina MAG se tako uvršča med genome srednje kakovosti, ki niso najprimernejši izbor za študije filogenije. Na podlagi TETRA in ANIb naj bi združeni metagenomski odčitki Stewart in sod. predstavljali 161 ločenih vrst znotraj Prevotellaceae, v vampu ovna s področja Slovenije pa smo izolirali zgolj eno potencialno vrsto.
Kongruenca ribosomskih genov, ohranjena pri gojenih sevih, se ne odraža pri MAG, kjer so ti geni včasih najdeni celo v več kopijah. Menimo, da je analizo surovih odčitkov Stewart in sod. (2019) nujno potrebno ponoviti z različnimi individualnimi pristopi združevanja in razvrščanja odčitkov za kontrolo kvalitete.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION
ND Du2
DC UDC 579.25:575.112(043)=163.6
CX Prevotella, Prevotellaceae, rumen microbiom, rumen, ruminants, digestive system, metagenomics, metagenome-derived species, anaerobic techniques, PCR, ANI, MLSA, TETRA, CAZY, phylogeny
AU STARE, Eva
AA ACCETTO, Tomaž (supervisor), STRES, Blaž (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study in Microbiology PY 2021
TI METAGENOME DERIVED PUTATIVE PREVOTELLA SPECIES IN GUT ECOSYSTEMS
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Microbiology) NO XXIV, 103 p., 27 tab., 25 fig., 23 ann., 156 ref., 1 CD
LA sl AL sl/en
AB The main purpose of this Master's thesis was to confirm the existence of metagenome-derived Prevotella species of rumen ecosystems from Scotland (Stewart et al., 2019), which is speculated to be fulfilled with the isolation of one such specimen. At the same time, we managed to cultivate strains of at least five new Prevotella species. Comparison of Stewart metagenomes and cultivated isolates of Prevotella revealed a distinctive deviation with metagenome-derived species showing absence of multiple core genome genes needed for MLSA analysis. Moreover, many had high numbers of CAZY enzymes and unexpected genome sizes. The majority of MAG falls into a category of medium quality drafts, which are discouraged from use in phylogenetic studies. According to TETRA and ANIb, Stewart metagenomes represent 161 species within Prevotellaceae family. However, we have presumably isolated only one of them. Congruency of genes coding for ribosomal proteins, conserved in cultivated isolates of Prevotella is missing in most metagenome-derived species. In our judgement, complete analysis from raw reads obtained in Stewart et al. (2019) should be repeated, this time with multiple algorithm approach to assembly and binning of reads in order to account for quality control.
V
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO SLIK IX KAZALO PREGLEDNIC XI KAZALO PRILOG XIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XIX SLOVARČEK XXI
1 UVOD…...1
1.1 NAMEN MAGISTRSKEGA DELA...2
1.2 DELOVNE HIPOTEZE...2
2 PREGLED OBJAV...3
2.1 VAMPNI MIKROBIOM...3
2.1.1 Vampne bakterije...4
2.1.2 Ostali vampni mikroorganizmi...6
2.1.2.1 Vampne arheje...6
2.1.2.2 Vampne praživali...6
2.1.2.3 Vampni glive……….………..6
2.1.2.4 Vampni bakteriofagi...7
2.1.3 Razvoj vampnega mikrobioma prežvekovalcev...7
2.2 ROD PREVOTELLA...8
2.2.1 Vampne Prevotella...9
2.2.1.1 Kvantifikacija vampnih Prevotella...10
2.2.1.2 Kultivacija in izolacija vampnih bakterij...11
2.3 METAGENOMIKA...12
2.3.1. Tipičen potek metagenomskega projekta...13
2.3.1.1 Vzorčenje...13
2.3.1.2 Sekvenciranje...13
2.3.1.3 Sestavljanje...14
2.3.1.4 Razvrščanje sekvenc…………..………...15
2.3.1.5 Anotacija...15
2.3.1.6 Vrednotenje………...16
2.4 IDENTIFIKACIJA IN KARAKTERIZACIJA BAKTERIJ...17
2.4.1 MLSA...17
2.4.1.1 Kongruenca ribosomskih proteinov…………..………...………...……..17
2.4.2 Encimi CAZY……….………...………...20
2.5 INDEKSI ZA MERJENJE SORODNOSTI MED GENOMI…………...….…...20
2.5.1 Povprečna nukleotidna podobnost (ANI)……….………..………...21
2.5.2 Tetranukleotidni podpis (TETRA)………...……….….22
VI
2.5.3 Povprečna aminokislinska podobnost (AAI)...………..………..…..23
3 MATERIAL IN METODE……….….24
3.1. BIOINFORMACIJSKA ANALIZA………...……….…25
3.1.1 Izbor genomov in metagenomov……….………..……..…...25
3.1.1.1 Gojeni sevi Prevotellaceae………..………..25
3.1.1.2 MAG Prevotellaceae………....…28
3.1.2 Ugotavljanje filogenetskih razmerij med MAG in gojenimi Prevotella...29
3.1.2.1 Primerjalna genomska analiza rodu Prevotella z ANIm…...30
3.1.2.2 Primerjalna genomska analiza vseh 565 genomov s TETRA…...30
3.1.2.3 ANIb znotraj vseh genomskih skupin nastalih po TETRA…...30
3.1.2.4 Zmanjšanje redundance znotraj TETRA-ANIb genomskih skupin...….30
3.1.3 Anotacija genomov…...31
3.1.4 Analiza sekvenc multiplih lokusov (MLSA) (I) ...…...31
3.1.4.1 Izbor genov…...31
3.1.4.2 Roary analiza...…...31
3.1.4.3 Iskanje izbranih genov v naboru MAG z BLASTp…...32
3.1.4.3 Oblikovanje začetnih oligonukleotidov za izbrane gene……...32
3.1.4.3.1 Nabor genov za izdelavo začetnikov…...32
3.1.4.3.2 Dizajn začetnih oligonukleotidov…...33
3.1.5 Encimi CAZY……...…35
3.2 GOJITVENI DEL: IZOLACIJA SEVOV PREVOTELLA……...…35
3.2.1 Pridobitev svežega vampnega soka…………...35
3.2.2 Redčitvena vrsta in gojenje kolonij……...…..35
3.2.3 Morfološka karakterizacija kolonij ………...36
3.2.4 Verižna reakcija s polimerazo (PCR) …...36
3.2.4.1 Priprava celičnega ekstrakta za PCR kolonij...….37
3.2.4.2 PCR kolonij…...37
3.2.4.2.1 Uporabljeni začetni oligonukleotidi…...37
3.2.4.2.2 Sestavine reakcij PCR………...………..39
3.2.4.3 Agarozna gelska elektroforeza………...39
3.2.5 Shranjevanje izoliranih sevov………...….39
3.2.6 Sekvenciranje po metodi Sangerja………...….40
3.2.6.1 Priprava vzorcev…………...40
3.2.6.1 Obdelava rezultatov sekvenciranja…...41
3.3 FILOGENETSKA ANALIZA……...….41
3.3.1 Analiza sekvenc multiplih lokusov (MLSA) (II)…...…….41
3.3.1.1 Združitev genov...….41
3.3.1.2 Poravnava sekvenc...…..41
3.3.1.3 Izbor metode filogenetske analize.…...41
3.3.2 BLASTN genov rplT, rpsC, rpsG...…42
VII
3.3.3. Filogenetska analiza 16S rRNA…...…42
3.4 MATERIAL………...42
3.4.1 Laboratorijski pribor…...…………..42
3.4.2. Laboratorijske naprave...…...………..42
3.4.3 Programska oprema…………...……..43
3.4.3.1 Programski paketi Linux Ubuntu………...43
3.4.4 Kemikalije…..…...43
3.4.5 Encimi…..…...44
3.4.6 Plini…..…...44
3.4.7 Pufri…..…...44
3.4.8 Komercialni seti…...…..44
3.4.9 Mikrobiološka gojišča in raztopine……...44
3.4.9.1 Gojišče M2…...….44
3.4.9.1.2 Priprava gojišča M2…...….44
3.4.9.1.1 Vampni sok za pripravo plošč M2…………...…46
4 REZULTATI Z RAZPRAVO…………...…47
4.1. BIOINFORMACIJSKA ANALIZA MAG ŠTUDIJE STEWART IN SOD. (2019a)………....………...47
4.1.1 Primerjalna genomska analiza MAG iz rodu Prevotella z ANIm……...47
4.1.2 Razvrščanje MAG, ki so bili uvrščeni med Prevotellaceae v skupine, ki ustrezajo vrstam ...47
4.1.2.1 Analiza pogostosti uporabe tetranukleotidnih podpisov (TETRA)…....47
4.1.2.2 Razvrščanjev skupine, ki ustrezajo posameznim vrstam...48
4.1.2.2.1 Prevotella copri iz MAG goveda spada v P. copri klado A……...49
4.1.2.2.2 Prevotella ruminicola kot najbolj zastopana vrsta v vampu……...51
4.1.2.2.3 Pojavnost Alloprevotella in Paraprevotella med MAG………...…52
4.1.2.3 Zmanjšanje redundance znotraj skupin…...…….52
4.1.2.4 ANIb kot preverjanje ločenosti genomskih skupin……...53
4.1.2.4.1 MAG ne predstavljajo raznolikosti izoliranih vampnih/črevesnih Prevotella…………...……...53
4.1.3 Anotacija vseh MAG….……...56
4.1.4 Nabor encimov CAZY...……...58
4.1.4.1 Nemetrično večrazsežnostno lestvičenje (NMDS) za prikaz podobnosti nabora CAZYmov…...…….. 62
4.2. KARAKTERIZACIJA IN IDENTIFIKACIJA SEVOV, IZOLIRANIH IZ VAMPNEGA SOKA OVNA…...… 66
4.2.1 Izolacija bakterijskih kolonij iz vampnega soka………...66
4.2.2. Hitra identifikacija Bacteroides in Prevotella……...…67
4.2.2.1 16S rRNA sekvenciranje…...…...…68
VIII
4.3. ANALIZA SEKVENC MULTIPLIH LOKUSOV (MLSA) …...…70
4.3.1 Geni rpoB, recA, gyrB, dnaJ……...70
4.3.2 Geni, identificirani kot skupni: odsotnost ribosomskih genov iz MAG...…70
4.3.2.1 Izbor genov za MLSA in oblikovanje začetnih oligonukleotidov...73
4.3.3 Združitev genov……...…..75
4.3.4 Filogenetska analiza………...75
4.4. ISKANJE MAG MED IZOLIRANIMI KOLONIJAMI………...….77
4.4.1 BLASTn ribosomskih genov gojenih Prevotella za ugotovitev meje podobnosti med vrstami………...….77
4.4.1.1 BLASTn ribosomskih genov MAG iz genomskih skupin, katerih predstavnik je gojen sev Prevotella...….80
4.4.2 BLASTn med gojenimi Prevotella in MAG genomskimi skupinami Prevotellaceae...81
4.4.3 Identifikacija novo izoliranih kolonij………... 82
5 SKLEPI………...…85
6 POVZETEK…...….……86
7 VIRI………...89
ZAHVALA
PRILOGE
IX
KAZALO SLIK
Slika 1: Diagram osnovnih korakov metabolizma ogljikovih hidratov v vampu prežvekovalca (Lallemand Animal Nutrition, 2021)………..…………3 Slika 2: Ilustracija osnovnih faz in procesov v vampu, pri katerih so ključni mikroorganizmi (Singh in sod., 2019)………....………...………....4 Slika 3: Sprememba relativne abundance bakterijskih družin v mikrobiomu telička od rojstva do odstavitve (Rey in sod., 2013)……….….……….…….…7 Slika 4: Sprememba relativne abundance bakterijskih rodov v mikrobiomu telička od rojstva do odstavitve (Rey in sod., 2013)………...……...…8 Slika 5: Parna primerjava razdalj med izvedenimi ML drevesi 16 ribosomskih proteinov 30 MAG iz CPR debla in 10 naključnih referenčnih bakterijskih RefSeq genomov (Garg in sod., 2021)………...………...19 Slika 6: Primerjava metode ANIm in ANIb (Richter in Rosselló-Móra, 2009)...…...22 Slika 7: Shema poteka gojitvenega dela eksperimenta………...………....….24 Slika 8: Shema poteka bioinformacijskega dela eksperimenta, opisanega pod poglavjem 3.1.2………...………..29 Slika 9: Precepljanje sevov za shranjevanje ob sočasnem prepihovanju s plinom CO2...…40 Slika 10: Pojavnost genomskih skupin glede na število MAG v skupini...………...48 Slika 11: Vročinska mapa ANIb genomov asociiranih s Prevotella copri, med katerimi je bila vrednost TETRA nad 99 % (Tett in sod., 2019)………...…….…..50 Slika 12: Filogenetsko drevo na podlagi celotnega genoma med P. copri in nekaterimi drugimi vrstami iz družine Prevotellaceae (Tett in sod., 2019)………...……….51 Slika 13: Vročinska mapa ANIb genomov asociiranih s P. ruminicola, med katerimi je bila vrednost TETRA nad 99 %.………...51 Slika 14: Škatla z brki za prikaz porazdelitve kvartilov za velikost genoma med MAG in gojenimi Prevotella...……….…58 Slika 15: Škatla z brki za prikaz porazdelitve kvartilov za število CDS med MAG in gojenimi Prevotella...………..58
X
Slika 16: Škatla z brki za prikaz porazdelitve kvartilov za število encimov CAZY med MAG in gojenimi Prevotella pred normalizacijo na velikost genoma.…...………..60 Slika 17: Škatla z brki za prikaz porazdelitve kvartilov za število encimov CAZY med MAG normalizirano glede na zaključenost genoma in gojenimi Prevotella...…...60 Slika 18: Škatla z brki za prikaz porazdelitve kvartilov za število encimov CAZY na Mb genoma med MAG in gojenimi Prevotella...……….60 Slika 19: NMDS metagenomskih skupin in gojenih sevov Prevotella …………....…..64 Slika 20: NMDS metagenomskih skupin in gojenih sevov Prevotella, kjer so predstavniki metagenomskih skupin označeni s krogi.…...………...………65 Slika 21: Kolonije, zrasle iz nacepitve 3×106 redčitve vampnega soka na trdnem gojišču M2.…...……….67 Slika 22: Nativni preparat neredčenega vampnega soka. ………...……….67 Slika 23: Filogenetsko drevo po metodi največjega verjetja (ML) z evolucijskim modelom GTR G+I za 16S rRNA (rrs) 26 gojenih Prevotella, dveh Bacteroides in 27 novo sekvenciranih izolatov iz naše študije...………..69 Slika 24: Tortni grafikon števila ohranjenih genov, ki so prisotni med 161 predstavniki genomskih skupin, ki so sestavljene zgolj iz MAG ...………...73 Slika 25: Filogenetsko drevo po metodi največjega verjetja (ML) z evolucijskim modelom GTR G+I za združitev rplT-rpsC-rpsG 41 gojenih Prevotella in 27 novo sekvenciranih izolatov...……….76
XI
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Preglednica najpomembnejših vampnih bakterijskih razgrajevalcev rastlinskih substratov ter metanogenih arhej (Singh in sod., 2019)………...……5 Preglednica 2: Pregled študij abundance rodu Prevotella in njenih gojenih predstavnikov………...11 Preglednica 3: Seznam 46 gojenih sevov rodu Prevotella, dveh Alloprevotella in dveh Paraprevotella z osnovnimi genomskimi podatki………....……....25 Preglednica 4: Nabor genov, izbranih za dizajn začetnih oligonukleotidov, urejenih glede na prevalenco med 187 primerjanimi MAG………....….…34 Preglednica 5: Seznam vseh devetih dizajniranih začetnih oligonukleotidov sintetiziranih pri Microsynth………..………..34 Preglednica 6: Uporabljeni začetni oligonukleotidi in njihove značilnosti……….38 Preglednica 7: Sestavine PCR reakcije glede na končni volumen.………...…...39 Preglednica 8: Gojišče M2 povzeto po DSMZ z modifikacijami……..….…..…..……45 Preglednica 9: Mineralna raztopina I, ki je sestavina M2 gojišča……….…..…....46 Preglednica 10: Mineralna raztopina II, ki je sestavina M2 gojišča………….…..……..46 Preglednica 11: Primerjava vrednosti ANIm in koeficienta TETRA za sporne primere...49 Preglednica 12: Skupine, ki naj bi predstavljale posamezne vrste z vsaj enim gojenim sevom………...………..……..54 Preglednica 13: Lastnosti vseh 519 MAG, ki spadajo v družino Prevotellaceae.……....56 Preglednica 14: Lastnosti gojenih neoralnih sevov Prevotella (n=42)………….……...56 Preglednica 15: Ekstremne vrednosti števila encimov CAZY med gojenimi Prevotellaceae (n=42) in MAG (n=519)………… ………....59 Preglednica 16: Primerjava števila encimov CAZY/Mb znotraj genomskih skupin, kjer je vsaj en član gojeni sev Prevotella...61 Preglednica 17: Pregled nacepitev vampnega soka………..………...66 Preglednica 18: Seznam identificiranih jedrnih genov med 67 gojenimi sevi Prevotella pri meji 89 % proteinske podobnosti s programom Roary...71
XII
Preglednica 19: Pari sintetiziranih začetnih oligonukleotidov za šest genov, ki smo jih izbrali na podlagi poravnave multiplih sekvenc sevov Prevotella in preizkusili v PCR reakcijah z različnimi temperaturami hibridizacije (Th)……...…….…...……...…..74 Preglednica 20: Pari sintetiziranih začetnih oligonukleotidov, ki smo jih za MLSA izbrali na podlagi uspešne PCR reakcije………...………..………...….75 Preglednica 21: Vrednost ANIb ter podobnost ribosomskih genov (BLASTn) med gojenimi črevesnimi in vampnimi sevi Prevotella, ki spadajo v isto vrsto……...…...78 Preglednica 22: Vrednost ANIb ter podobnost ribosomskih genov (BLASTn) med gojenimi sevi Prevotella z višjo filogenetsko oddaljenostjo. Primerjava rezultata BLASTn med Bacteroides, Alloprevotella, Paraprevotella in Prevotella vrstami….….78 Preglednica 23: Najnižje vrednosti BLASTn znotraj rodu Prevotella……...………80 Preglednica 24: Vrednost ANIb ter podobnost ribosomskih genov (BLASTn) med gojenimi črevesnimi in vampnimi sevi Prevotella, ki spadajo v isto vrsto………..…….81 Preglednica 25: Trije pari MAG izmed 89 skupin, ki imajo najvišje vrednosti BLASTn rezultatov so primerjani glede na pripadajočo vrednost TETRA in ANIb celotnega genoma……….82 Preglednica 26: Vrednost BLASTn genov rplT, rpsC, rpsG med novo izoliranimi kolonijami in metagenomskimi skupinami, ki prikazujejo morebitno isto vrsto.…...83 Preglednica 27: Vrednost BLASTn genov rplT, rpsC, rpsG med novo izoliranimi kolonijami in metagenomskimi skupinami med najboljšimi zadetki BLASTn……..…..83
XIII
KAZALO PRILOG PRILOGA A: UKAZI IN SKRIPTI
Priloga A1: Ukaz, uporabljen za izvedbo ANIm analize genomov preko pyani Priloga A2: Ukaz, uporabljen za izvedbo TETRA analize genomov preko pyani Priloga A3: Ukaz, uporabljen za izvedbo ANIb analize genomov preko pyani Priloga A4: Ukaz, uporabljen za anotacijo genomov s programom Prokka
Priloga A5: Ukaz in pripadajoči skript za iskanje genov znotraj genoma z BLASTp Priloga A5.1: Datoteka (*poizv) za poizvedbo jedrnih genov z BLASTp iz priloge
7.5
Priloga A5.2: Datoteka (*poizv) za poizvedbo genov rpoB, recA, gyrB in dnaJ z BLASTp iz priloge 7.5
Priloga A6: Ukaz in pripadajoči skript za izpis sekvenc genov in njihovih oznak lokusa v posamezne tekstovne datoteke
Priloga A7: Ukaz za iskanje števila encimov posamezne družine CAZY znotraj genoma
Priloga A8: Ukazi za analizo NMDS repertoarja encimov CAZY v programu R Priloga A9: Ukazi za grafični prikaz NMDS analize repertoarja encimov CAZY v
programu R
Priloga A10: Ukazi za analizo BLASTn Priloga A10.1: Ukazi za analizo BLASTp
PRILOGA B: TETRA-ANIb SKUPINE, KI PREDSTAVLJAJO VRSTE
Priloga B1: Pregled 94 genomsko koherentnih skupin, predstavljajoč vrste, ki imajo vsaj dva člana.
Priloga B2: Pregled 101 genomskih skupin z singletoni, predstavljajoč vrste.
PRILOGA C (na CD): IZBOR GENOMOV
Priloga C1: Seznam vseh izbranih MAG z osnovno statistiko genoma, pripadnostjo ANIb-TETRA skupini ter številom encimov CAZY
Priloga C2: Seznam vseh izbranih gojenih sevov z osnovno statistiko genoma, pripadnostjo ANIb-TETRA skupini ter številom encimov CAZY
PRILOGA Č (na CD): ANIm SEVOV PREVOTELLA
Priloga Č1: Povprečna podobnost skupne DNA (ang. »percentage identity«) iz analize ANIm med 46 gojenimi sevi in 36 MAG uvrščenih v rod Prevotella Priloga Č2: Delež skupne DNA (ang. »alignment coverage«) iz analize ANIm med
46 gojenimi sevi in 36 MAG uvrščenih v rod Prevotella
Priloga Č3: Genomske skupine nastale iz rezultatov analize ANIm med 46 gojenimi sevi in 36 MAG uvrščenih v rod Prevotella
PRILOGA D (na CD): VROČINSKA MAPA VREDNOSTI ANIm ZA 82 BAKTERIJSKIH GENOMOV
XIV
PRILOGA E (na CD): REZULTATI ANALIZE TETRA
Priloga E1: Vrednosti korelacijskega koeficienta TETRA za 565 genomov.
Priloga E2: 44 skupin z vrednostjo korelacijskega koeficienta TETRA >0,99 in singletonov s koeficientom <0,99
PRILOGA F (na CD): VROČINSKA MAPA KORELACIJSKEGA KOEFICIENTA TETRA ZA 565 GENOMOV
PRILOGA G (na CD): VIZUALNI PREGLED POVPREČNE PODOBNOSTI GENOMA IN DELEŽA SKUPNE DNA ANALIZE ANIb
PRILOGA H (na CD): VREDNOSTI ANIb ANALIZE GENOMSKIH SKUPIN (ANIb- TETRA), KJER SO VREDNOSTI ≥95 % OBARVANE Z MODRO
PRILOGA I: SEZNAM VSEH SEVOV, VKLJUČENIH V ANALIZO NMDS ZA PREGLED PRISOTNOSTI ENCIMOV CAZY
PRILOGA J: PREGLED IZOLATOV
Priloga J1: Uspešno sekvencirani in identificirani izolati, uporabljeni v analizi MLSA
Priloga J2: Izolati, izločeni iz nadaljnje analize zaradi neuspešnega precepljanja ali neuspešnega 16S rRNA sekvenciranja
PRILOGA K: REZULTATI PCR ZA DOLOČITEV TEMPERATURE HIBRIDIZACIJE PAROV ZAČETNIKOV PrF/R, Bac32/708R TER PAROV ZA RIBOSOMSKE GENE
Priloga K1: Določitev Th za par začetnih nukleotidov Bac32F/708R (“Bac”) ter PrF& R (“Pr”) pri različnih temperaturah taljenja (48 °C, 52 °C, 56 °C)
Priloga K1.1: Določitev Th za par začetnih nukleotidov Bac32F/708R (“Bac”) ter PrF& R (“Pr”) pri temperaturi 50 °C
Priloga K2: Določitev Th za par začetnih nukleotidov PrF/R pri različnih temperaturah (66 °C, 68,5 °C, 71 °C)
Priloga K3: Določitev Th za dva para začetnih nukleotidov rpsB_F3/R3 (“rpsB1”) ter rpsG_F1/R1(“rpsG1”) pri različnih temperaturah (48 °C, 51 °C, 54 °C) Priloga K4: Določitev Th za tri pare začetnih nukleotidov rplB_F/R (“rplB”),
rpsC_F/R(“rpsC”) ter rplT_F1/R3 (“rplT1) pri različnih temperaturah (48 °C, 51
°C, 54 °C)
Priloga K5: Določitev Th za dva para začetnih nukleotidov rpsB_F5/R3 (“rpsB2”), rpsI_F/R(“rpsI”) pri različnih temperaturah (51 °C, 54 °C, 57 °C)
Priloga K6: Določitev Th za dva para začetnih nukleotidov rplB_F/R (“rplB”), rpsI_F/R(“rpsI”) pri različnih temperaturah (43 °C, 45 °C, 48 °C)
XV
PRILOGA L: REZULTATI PCR Z ZAČETNIKI Bac32F/708R IN PrF/PrR Priloga L1: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi Bac32F/708R (Bac) in PrF/PrR (Pr) z E1-1 (K1), E1-2 (K2), E1-3 (K3), E1-4 (K4), E1-5 (K5), E1-18 (K18)
Priloga L2: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi Bac32F/708R (Bac) in PrF/PrR (Pr) z E1-7 (K7), E1-8 (K8), E1-9 (K9), E1-11 (K10), E1-19 (K19), E1-12 (K12)
Priloga L3: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi Bac32F/708R (Bac) in PrF/PrR (Pr) z E1-31, E1-32, E3-20, E2-21, E2-22, E2- 23
Priloga L4: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi Bac32F/708R (Bac) in PrF/PrR (Pr) z E2-25, E2-26, E2-27, E2-28, E2-29, E3- 17, E3-18
Priloga L5: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi Bac32F/708R (Bac) in PrF/PrR (Pr) z E3-19, E1-33, E1-6, E1-10, E1-12, E1-d Priloga L6: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi Bac32F/708R (Bac) in PrF/PrR (Pr) z E1-1m, E2-a, E1-a, E1-c, E1-g, E1-16 Priloga L7: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi Bac32F/708R (Bac) in PrF/PrR (Pr) z E9-3, E8-25, E8-26, E8-28, E8-36, E8-39, E8-40
Priloga L8: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi Bac32F/708R (Bac) z E12-1, E12-2, E12-2a, E12-3, E12-31, E12-28, E12-21, E12-20, E12-6, E12-10, E12-5, E12-13, E12-51, E12-46, E12-12, E12-45, E12- 39, E12-18, E12-17, E12-15, E12-16, E12-26
Priloga L9: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi Bac32F/708R (Bac) z E13-1, E13-3, E13-4, E13-5, E13-6, E13-12, E13-19, E13-20, E13-21, E13-25, E13-26, E13-27, E13-28, E13-32, E13-43, E14-2, E14- 7, E14-10, E14-34, E14-35, E14-41, E15-7, E15-11, E15-14, E15-19, E15-22, E15-23, E15-24
Priloga L10: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi PrF/PrR (Pr) z E13-1, E13-3, E13-4, E13-5, E13-6, E13-12, E13-19, E13-20, E13-21, E13-25, E13-26, E13-27, E13-28, E13-32, E13-43, E14-2, E14-7, E14- 10, E14-34, E14-35, E14-41, E15-7, E15-11, E15-14, E15-19, E15-22, E15- 23, E15-24
PRILOGA M: REZULTATI PCR Z ZAČETNIKI FD1/1492R
Priloga M1: PCR izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi FD1/1492R PCR z E2-25, E2-26, E2-27, E2-28, E2-29, E3-17, E3-18, E2-22
Priloga M2: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi FD1/1492R PCR z E2-23, E3-19, E1-10, E2-a, E1-a, E9-3, E8-25, E8-39 Priloga M3: PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi FD1/1492R PCR z E12-1, E12-2, E12-2a, E12-3, E12-5, E12-6, E12-13, E12- 16, E12-17, E12-20, E12-21, E12-26,E12-28, E12-31
XVI
Priloga M4: Očiščeni PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi
oligonukleotidi FD1/1492R PCR z E15-24, E12-12, E12-3, E12-5, E12-6, E12- 13, E12-16, E12-20
Priloga M5: Očiščeni PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi
oligonukleotidi FD1/1492R PCR z E12-15, E12-18, E12-26, E14-41, E12-34, E13-1, E13-3, E13-5, E13-12, E13-19, E13-21, E13-25, E13-27, E13-32, E15- 11, E15-14, E15-19, E15-22
Priloga M6: Očiščeni PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi
oligonukleotidi FD1/1492R PCR z E16-49, E13-21, E13-3, E16-25, E15-22, E16-35, E15-14, E12-10, E13-25, E12-46, E14-41, E15-11, E9-3, E12-12, E12- 21, E1-10
PRILOGA N: REZULTATI PCR Z ZAČETNIKI RIBOSOMSKIH GENOV
Priloga N1: Očiščeni PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi rpsC_F/R(“C”), rplT_F1/R3 (“T”) in rpsG_F1/R1(“G”).
Pomnožki so: 1- rpsG E1-10; 2- rpsG E16-49; 3- rpsC E15-19; 4- rpsC E3-19; 5- rpsC E14-41; 6- rpsC E2-28; vsi trije geni za E2-26, E2-23, E1-a.
Priloga N2: Očiščeni PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi rpsC_F/R(“C”), rplT_F1/R3 (“T”) in rpsG_F1/R1(“G”) za izolate E3-17, E15-22, E15-14, E16-25, E16-49, E1-10
Priloga N3: Očiščeni PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi rpsC_F/R(“C”), rplT_F1/R3 (“T”) in rpsG_F1/R1(“G”) za izolate E1-9, E3-18, E2-28, E13-3, E2-25, E14-34
Priloga N4: Očiščeni PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi rpsC_F/R(“C”), rplT_F1/R3 (“T”) in rpsG_F1/R1(“G”) za izolate E13-27, E9-3, E13-1, E15-24, E15-19, E14-41
Priloga N5: Očiščeni PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi rpsC_F/R(“C”), rplT_F1/R3 (“T”) in rpsG_F1/R1(“G”) za izolate E13-32, E13-25, E13-21, E12-46, E3-19, E2-27
Priloga N6: Očiščeni PCR pomnožki izoliranih kolonij z začetnimi oligonukleotidi rpsC_F/R(“C”), rplT_F1/R3 (“T”) in rpsG_F1/R1(“G”) za izolate E2-25, E2-26, E2-27, E2-28, E2-22, E2-29
PRILOGA O: KLASIFIKACIJA 16S rRNA IZOLATOV
Priloga O1: Rezultati klasifikacije sekvenciranih 16S rRNA izolatov z RDP Naive Bayesian rRNA Classifier. Izolati, identificirani drugače kakor Prevotella Priloga O2: Rezultati klasifikacije sekvenciranih 16S rRNA izolatov z RDP Naive Bayesian rRNA Classifier. Izolati, identificirani kot Prevotella
PRILOGE P (na CD): PORAVNAVE SEKVENC
Priloga P1: Poravnava gena 16S rRNA (ClustalW GOP 18,00 in GEP 8,00) za 26 gojenih sevov Prevotella, dveh Bacteroides in 27 novo sekvenciranih izolatov iz naše študije
XVII
Priloga P2: Poravnava združenih jedrnih genov 67 sevov Prevotella, identificiranih z Roary pri 89 % aminokislinski podobnosti
Priloga P3: Poravnava sekvenc gena rplT s ClustalW (GOP 15,00 in GEP 6,66) z izolati Prevotella (n=27) ter gojenimi sevi Prevotella asociiranimi s črevesnim ali vampnim mikrobiomom (n=41)
Priloga P4: Poravnava sekvenc gena rpsC s ClustalW (GOP 15,00 in GEP 6,66) z izolati Prevotella (n=27) ter gojenimi sevi Prevotella asociiranimi s črevesnim ali vampnim mikrobiomom (n=41)
Priloga P5: Poravnava sekvenc gena rpsG s ClustalW (GOP 15,00 in GEP 6,66) z izolati Prevotella (n=27) ter gojenimi sevi Prevotella asociiranimi s črevesnim ali vampnim mikrobiomom (n=41)
Priloga P6: Poravnava združenih sekvenc rplT-rpsC-rpsG s ClustalW (GOP 15,00 in GEP 6,66) z izolati Prevotella (n=27) ter gojenimi sevi Prevotella asociiranimi s črevesnim ali vampnim mikrobiomom (n=41)
PRILOGA R: IDENTIFIKACIJA LOKACIJ POSAMEZNIH GENOV V PORAVNAVI ZDRUŽENIH JEDRNIH GENOV 67 SEVOV PREVOTELLA, IDENTIFICIRANIH Z ROARY PRI 89 % AMINOKISLINSKI PODOBNOSTI
PRILOGA S: PREGLED PRISOTNOSTI 22 GENOV, OHRANJENIH ZNOTRAJ RODU PREVOTELLA
Priloga S1: Pregled prisotnosti 22 ohranjenih genov (Roary) med gojenimi Prevotellaceae
Priloga S1: Pregled prisotnosti 22 ohranjenih genov (Roary) med gojenimi Prevotellaceae
PRILOGA Š: FILOGENETSKA DREVESA
Priloga Š1: Filogenetsko drevo gena rplT (ClustalW) za 73 gojenih sevov Prevotella
Priloga Š2: Filogenetsko drevo gena rpsC (ClustalW) za 73 gojenih sevov Prevotella
Priloga Š3: Filogenetsko drevo gena rpsG (ClustalW) za 73 gojenih sevov Prevotella
Priloga Š4: Filogenetsko drevo združenih genov rplT-rpsC-rpsG (ClustalW) za 73 gojenih sevov Prevotella
Priloga Š5: Filogenetsko drevo gena rplT po metodi največjega verjetja (ML) z evolucijskim modelom GTR G+I 41 gojenih Prevotella in 27 novo sekvenciranih izolatov
Priloga Š5: Filogenetsko drevo gena rplT po metodi največjega verjetja (ML) z evolucijskim modelom GTR G+I 41 gojenih Prevotella in 27 novo sekvenciranih izolatov
Priloga Š6: Filogenetsko drevo gena rpsC po metodi največjega verjetja (ML) z evolucijskim modelom GTR G+I 41 gojenih Prevotella in 27 novo sekvenciranih izolatov
XVIII
Priloga Š7: Filogenetsko drevo gena rpsG po metodi največjega verjetja (ML) z evolucijskim modelom GTR G+I 41 gojenih Prevotella in 27 novo sekvenciranih izolatov
PRILOGA T: SEZNAM VRST ZA BLASTn
Priloga T1: Seznam vseh gojenih vrst, uporabljenih za primerjavo ujemanj nukleotidnih sekvenc ribosomskih genov rplT, rpsC, rpsG z BLASTn za analizo ribosomskih genov
Priloga T2: Seznam 89 MAG metagenomskih skupin, katerih predstavnik je bil MAG in so imele prisotne vse tri gene rplT, rpsC, rpsG s homologijo in dolžino vsaj 50 % glede na P. ruminicola 23 za analizo ribosomskih genov z BLASTn PRILOGA U: BLASTn RIBOSOMSKIH GENOV
Priloga U1: 51 metagenomskih skupin, ki so imeli za vsaj en ribosomski gen nad 90 % ujemanje nukleotidnih sekvenc
Priloga U2: 20 metagenomskih skupin, katerih ujemanje nukleotidnih sekvenc (BLASTn) za vse tri gene je <90 %
Priloga U3: 9 metagenomskih skupin, katerih BLASTn rezultat podobnosti namiguje, da so genomi himerni/napačno sestavljeni
PRILOGA V: BLASTn ANALIZA RIBOSOMSKIH GENOV MED 27 PREVOTELLA IZOLATI IN 89 METAGENOMSKIMI SKUPINAMI
XIX
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ad-hoc za specifičen namen
ANI povprečna nukleotidna podobnost (ang. »average nucleotide identity«) bp bazni pari (106 bp= Mbp)
CAZY encimi odgovorni za metabolizem ogljikovih hidratov (ang.
»Carbohydrate-Active enZYmes«)
CDS regija gena, ki kodira protein (ang. »coding sequence«)
CRISPR družina zaporedij v bakterijah in arhejah, ki kodirajo ekvivalent imunskega sistema bakterij in arhej (ang. »clustered regularly interspaced short palindromic repeats«)
DDH DNA-DNA hibridizacija dNTP deoksinukleotid trifosfat
eDNA ekstracelularna oz. zunajcelična DNA EDTA etilendiamintetraocetna kislina
FDR napačna stopnja odkritja je kriterij pri p-statistiki (ang. »false discovery rate«), ki p-vrednost prikroji za lažno pozitivne rezultate
GEP kazen za podaljševanje vrzeli (ang. »gap extension penalty«) genom. genomski/h
GIT gastrointestinalni trakt
GOP kazen za odpiranje vrzeli (ang. »gap opening penalty«) GTR G+I splošni časovno reverzibilni model nukleotidne substitucije z
upoštevanjem gama distribucije in deleža invariabilnih mest (ang.
general time reversible + gamma distribution + invariable sites«) MAG genomi pridobljeni iz metagenomskih podatkov (ang. »Metagenome-
Assembled Genome«)
ML metoda največjega verjetja (ang. »maximum likelihood«) MLSA analiza sekvenc multiplih lokusov (ang. »MultiLocus Sequence
Analysis«)
NGS naslednja generacija sekvenciranja (ang. »next generation sequencing«) NMDS nemetrično večrazsežnostno lestvičenje
normal. normalizirano/normalizacija
XX
NZ Nova Zelandija
OGRI indeksi za merjenje sorodnosti med genomi (ang. »Overall Genome Relatedness Indices«)
OTU operacijska taksonomska enota (ang. »operational taxonomic unit«) PCR verižna reakcija s polimerazo (ang. »polymerase chain reaction«) PUL lokus za privzem in razgradnjo polisaharidov (ang. »Polysaccharide
Utilization Loci«)
Rcf relativna centrifugalna sila rRNA ribosomska RNA
RUG MAG asociirani z vampom (ang. »Rumen-Uncultured Genomes«), uporabljeni v imenovanju genomov MAG
tmRNA RNA, ki združuje lastnosti prenašalne (tRNA) in obveščevalne (mRNA) molekule, kar omogoča reševanje blokiranih ribosomskih kompleksov Tris tris(hidroksimetil)aminometan
tRNA prenašalna RNA, ki omogoča prevajanje mRNA v aminokislinsko zaporedje (ang. »transfer RNA«)
VFA kratkoverižne maščobne kisline (ang. »volatile fatty acids«) viz. to je; kot sledi
XXI SLOVARČEK
ANI Povprečna nukleotidna podobnost homolognih regij med dvema genomoma, tj. indeks za izračun stopnje
podobnosti med genomi. Temelji lahko na blast (ANIb) ali MUMmer (ANIm) algoritmu.
Anotacija genoma Proces identifikacije lokacij genomskih elementov in kodirajočih regij v genomu in pripis njihovih funkcij.
BLAST (n/p) (ang. »The Basic Local Alignment Search Tool«) je program za iskanje regij lokalne podobnosti oz.
primerjavo ujemanj med sekvencami. Iskane sekvence se primerjajo glede na sekvenčno bazo proteinskih
(BLASTp) ali nukleotidnih sekvenc (BLASTn).
CD-HIT Algoritem, ki uredi podobne proteine/DNA v gruče glede na določen prag podobnosti. Vsaka gruča ima enega reprezentativnega predstavnika (protein/DNA sekvenca).
ClustalW Progresivna metoda poravnave, kjer se sekvence z najvišjo vrednostjo podobnosti poravnajo prve, na nastalo
poravnavo se postopoma dodajajo nove, vedno bolj oddaljene sekvence. S pomočjo vodilnega drevesa (ang.
“guide tree”) se doseže globalna poravnava sekvenc.
CMAG Zaključen genom s povezanimi konci in brez vrzeli, pridobljen iz metagenomske študije.
Degenerirani začetniki Mešanica oligonukleotidnih začetnikov z različnimi sekvencami, kjer je na določenih položajih prisotna različna baza. To omogoča, da imajo začetniki kljub zelo podobni sekvenci nekatera mesta heterogena in s tem pokrijejo različne kombinacije nukleotidov za enako proteinsko sekvenco (sinonimne mutacije).
Delež invariablinih mest Delež mest v sekvenci, kjer ne opazimo raznolikosti, najbrž zaradi ohranjanja biološke funkcije.
Delež skupne DNA (ang. »alignment coverage«), ki je definiran kot koeficient med dolžino poravnave med genomoma in dolžino
referenčnega genoma.
Denzitometrija (gela) Analitična metoda, ki se v molekularni biologiji uporablja za kvantifikacijo mase DNA produkta v gelih.
DNA knjižnica Knjižnica se pripravi tako, da se na vse DNA fragmente pritrdi adapterje, potrebne za sekvenciranje.
XXII
DNA-DNA hibridizacija Metoda v molekularni biologiji, s katero ugotavljamo stopnjo podobnosti glede na sekvenco baz v DNA pri dveh organizmih. Večja kot je sposobnost tvorbe hibrida, tj.
dvojne vijačnice, večja je podobnost med genomoma.
Zlati standard za delineacijo bakterijskih vrst v 20.
stoletju.
Endosimbioza Endosimbiont je organizem, ki živi znotraj celice/telesa drugega organizma, običajno v mutualističnem razmerju.
e-vrednost Pričakovana vrednost (ang. »expected value«), ki jo uporabljamo v blast analizi. Navaja število zadetkov s podobno vrednostjo podobnosti, ki bi jih našli naključno ob iskanju v bazi enake velikosti.
Gama distribucija Distribucija deleža mest v sekvenci glede na hitrost spreminjanja oz. mutacij. Navaja se z vrednostjo
parametra, običajno α (α<1 močna variacija hitrosti med različnimi mesti oz. višja kot je α, manjša je heterogenost).
Genospecies Vrsta, definirana na podlagi genoma (npr. ANI med 93 oz.
94 % in 95 %).
Genotipizacija Pomembno orodje pri določanju podvrst, sevov, genospeciesov z uporabo genetskih markerjev.
Heterologno izražanje Izražanje gena v gostiteljskem organizmu, katerega genom tega gena naravno ne kodira.
Hevristična metoda Metoda za reševanje težav, ki ne zagotavlja najbolj optimalne rešitve, vendar se z nizom približnih izidov približa sprejemljivemu končnemu izidu.
Hmmscan Algoritem za iskanje proteinskih sekvenc po različnih bazah proteinskih profilov za njihovo klasifikacijo.
In-silico V virtualnem okolju oz. računalniško
Jedrni genom Set homolognih genov, ki so prisotni v vsakem izmed analiziranih genomov znotraj vrste.
Kongruenca Skladnost, ujemanje
Kontig soseska: združeni, prekrivajoči se odčitki DNA pridobljeni z NGS, ki skupaj sestavljajo daljšo, konsenzno regijo DNA in čigar zaporedje baz je znano z visokim zaupanjem.
MCL Markov algoritem gručanja (ang. »Markov CLuster algorithm«), ki identificira individualne gruče znotraj seta podatkov glede na podobnost sekvenc.
XXIII
Metoda največjega verjetja Metoda za rekonstrukcijo filogenetskih dreves, ki primerja možna filogenetska drevesa na podlagi sposobnosti
napovedi razmerij med podatki. Izbrano je drevo, ki ima največjo verjetnost napovedi seta podatkov.
MIMAG Minimalni standardi za opis kakovosti genoma (ang:
»Minimum Information about a Metagene-Assembled Genome«), pri čemer so glavni kriteriji kakovost sestavljanja, zaključenost in kontaminacija.
Mobilni genetski element Segment DNA, ki kodira encime in druge proteine, ki posredujejo premikanje segmenta znotraj genoma
(znotrajcelično) ali med genomi drugih celic (medcelično).
Mednje spadajo transpozoni, plazmidi, bakteriofagni elementi, integroni itd.
Monotipska vrsta Vrsta brez podvrst ali drugih nižjih taksonov.
MUMmer algoritem za hitro izvedbo poravnav celotnih genomov N50 Mera za kakovost sestavljenih genomov, ki so
fragmentirani v kontige različnih dolžin. N50 je dolžina najkrajšega kontiga ob 50 % celotne dolžine genoma. Vsaj 50 % baz v sestavi je tako del kontigov z dolžino
ekvivalentno N50 ali več.
Odstotek G+C Odstotek gvanina in citozina v sekvenci DNA/RNA glede na vse štiri baze. Nasprotno od odstotka adenina in
timina/uracila.
Operacijska taksonomska enota Delovna definicija za ozko sorodne organizme, določena na podlagi podobnosti sekvence DNA ORFani Geni brez znanega homologa v drugih evolucijskih vejah.
Ortolognost Homologne sekvence so ortologne, če izvirajo iz starševske sekvence, ki je zaradi speciacije organizma rezultirala v dveh kopijah hčerinskih sekvenc.
Osnutek genoma Sekvenca genoma z manjšo točnostjo, kakor končani genom, nekateri deli so manjkajoči, na napačni lokaciji ali orientaciji v genomu (ang. »draft genome«).
Pan genom Set vseh homolognih genov, najdenih v analiziranih genomih znotraj vrste. Pan genom sestavljajo jedrni genom, vrstno specifični genom, pridobljeni (variabilni) genom.
Parna dereplikacija Proces iskanja podvojenih sekvenc v setu podatkov in njihova redukcija (ang. »pairwise dereplication«).
XXIV
Pearsonov koeficient korelacije Mera za linearno asociacijo dveh spremenljivk.
Vrednost >0 nakazuje na pozitivno, <0 pa negativno asociacijo.
PUL CAZYmi specializirani za privzem in razgradnjo so pri Bacteroides urejeni v kolokalizirane genske skupke imenovane PUL (ang. »polysaccharide utilization loci«), regulirani z enotnim transkripcijskim faktorjem.
p-vrednost Mera statistične značilnosti oz. mera za preverjanje ničte hipoteze (H0) proti alternativni hipotezi (Ha). H0
predpostavlja, da razlik/povezave/vpliva med podatki.
Nižja kot je p-vrednost, večja je statistična značilnost opažene razlike/povezave/vpliva med podatki.
Sosestava Sestavljanje odčitkov iz združenih odčitkov vseh vzorcev hkrati (ang: »co-assembly«).
TETRA Indeks za merjenje sorodnosti med genomi, ki primerja pogostost vseh 256 možnih kombinacij tetranukleotidnih podpisov. Bolj sorodni genomi imajo bolj podobno kombinacijo podpisov.
Vročinska mapa Vizualizacijska tehnika za prikaz magnitude vrednosti podatkov s pomočjo barve v dvodimenzionalnem prostoru.
To omogoča hiter pregled gručanja podatkov.
Z-vrednost Absolutna z-vrednost (tudi standardna vrednost) predstavlja razdaljo med vrednostjo x in povprečjem populacije vrednosti, izraženo v enotah standardne deviacije (σ).
1 1 UVOD
Prežvekovalci so rastlinojedi sesalci, ki so svoje ime pridobili po posebni strukturi njihovega želodca, specializiranega za učinkovito razgradnjo rastlinske hrane. Želodec je sestavljen iz štirih delov. Prva dva sta kapica (retikulum) in vamp, kjer poteka anaerobna mikrobna razgradnja, pri čemer bakterije s svojim repertoarjem encimov rastlinski material razgradijo do kratkoverižnih maščobnih kislin (vir energije za prežvekovalca), ogljikovega dioksida invodika. Slednja dva plina za svojo rast izkoristijo metanogene arheje in pri tem proizvajajo metan, ki ga žival izriga. S tem onemogočijo tudi povratno inhibicijo vodika v fermentaciji. Masa, ki zdaj sestoji iz neprebavljenega rastlinskega materiala in mikrobne biomase, potuje v prebiralnik (omasum). Ta nadzira, da velikost delcev, ki potuje v pravi želodec oz. siriščnik (abomasum) ni prevelika. Neprebavljeni material in mikrobna biomasa sta v siriščniku tarča kisline in prebavnih encimov za vir proteinov in s tem rast živali. Med prežvekovalce spada približno 200 vrst, razvrščenih v šest družin, Bovidae (govedo, koze, ovce, antilope), Cervidae (jelenjad), Giraffidae (žirafe), Antilocapridae (vilorog), Moschidae (pižmar) ter Tragulidae (mali malajski kančil). Ocenjena velikost populacije udomačenih prežvekovalcev je bila leta 2010 okoli 3,57 milijarde v primerjavi s 50-kratno nižjim številom divjih prežvekovalcev. Kar 95 % udomačenih prežvekovalcev v živinoreji predstavljajo govedo, koze ter ovce, ki posledično tudi največ pripomorejo k izpustom metana (Hackmann in Spain, 2010).
Živinoreja je poleg zagotavljanja prehranske oskrbe ljudi z visokokvalitetnim proteinskim virom tudi izjemno pomemben antropogeni vir emisij toplogrednih plinov.
Tvorba metana ni zgolj okoljski problem, temveč predstavlja tudi 2-12 % izgube energije za prežvekovalca, pri čemer so se razlike v vampni združbi izkazale za enega izmed razlogov v variaciji tvorbe metana in izkoristka pretvorbe krme v koristno energijo. To je eden izmed razlogov, zakaj je razumevanje mikrobne združbe ključnega pomena (Henderson in sod., 2015).
Bakterije iz okoli dvajsetih vrst rodu Prevotella so v vampu eden izmed najbolj dominantnih rodov s ključnimi vlogami pri metabolizmu ogljikovih hidratov, njihova prisotnost pa naj bi pri govedu vplivala tudi na izpust metana. Metagenomska analiza vampnih ekosistemov je pokazala, da raznolikost predstavnikov vrst rodu Prevotella v vampu ni znana. Iz metagenomskih podatkov vampa različnih prežvekovalcev so nedavno rekonstruirali nepopolne genome za več deset novih vrst. Kljub predvideni natančnosti metode je dejanski obstoj teh vrst vprašljiv, saj študij, ki bi z izolacijo potrdile te tako imenovane »metagenomske bine«, pravzaprav ni. Z izolacijo ne bi potrdili zgolj natančnosti bioinformacijske napovedi, temveč pridobili tudi seve za funkcionalno analizo-testiranje dejanskih fenotipov.
2 1.1 NAMEN MAGISTRSKEGA DELA
Iz vampa ovna izolirati ali seve vrst Prevotella, katerih genome so pridobili v obsežnih metagenomskih študijah vampa goveda (Stewart in sod., 2019a) ali seve Prevotella povsem novih vrst. Ugotavljati kvaliteto genomov, pridobljenih iz metagenomskih podatkov.
1.2. DELOVNE HIPOTEZE
H1: V vampu ovna s področja Slovenije so prisotne vrste Prevotella, ki so jih zaznali z metagenomskimi študijami v vampu goveda na Škotskem (Stewart in sod., 2019a).
H2: Združevanje metagenomskih odčitkov zanesljivo napove genome vrst Prevotella.
3 2 PREGLED OBJAV
2.1 VAMPNI MIKROBIOM
Prežvekovalci s skoraj 200 različnimi vrstami na Zemlji, med katere spadajo govedo, ovce, koze, jelenjad, losi, antilope, žirafe in nekatere druge vrste so med najbolj uspešnimi rastlinojedimi sesalci. Razvoj različnih anatomij vampa in sposobnost uspevati v širokem obsegu različnih rastlinskih vrst sta jim v evoluciji omogočila zavzeti različne habitate in klimatske pasove. Prav njihova sposobnost pretvorbe rastlinskega materiala v visokokakovostno beljakovinsko hrano, kot sta meso in mleko, je bila tudi glavni razlog za njihovo udomačitev (Hackmann in Spain, 2010).
Vampni mikrobiom je izjemno raznolika in kompleksna združba bakterij, arhej, praživali, bakteriofagov, kvasovk in nitastih gliv kolokaliziranih pri visoki gostoti, sestavljeni iz približno 1010-1011 bakterij/ml, 106 praživali/ml, 103 gliv/ml in 109 - 1010 bakteriofagov/ml vampnega soka (Klieve in sod., 2004; Singh in sod., 2019).
Mikroorganizmi prisotni v vampu so večinoma specializirani za hidrolizo polisaharidov ali fermentacijo nastalih sladkorjev, zato se pričakuje, da so mikrobni konzorciji v različnih prežvekovalcih funkcionalno podobni.
Slika 1: Diagram osnovnih korakov metabolizma ogljikovih hidratov v vampu prežvekovalca (KMK okrajš. kratkoverižne maščobne kisline) (Lallemand Animal Nutrition, 2021)
4
Slika 2: Ilustracija osnovnih faz in procesov v vampu, pri katerih so ključni mikroorganizmi (Singh in sod., 2019)
Vampni pH variira med 5,7 do 7,3 glede na koncentracijo fosfatnih in bikarbonatnih ionov prisotnih v slini (Singh in sod., 2019). Temperatura variira med 36-41 °C, odvisno od vrste in fiziološkega stanja živali (Singh in sod., 2019).
Vamp je habitat s kompleksno mikrobno združbo, ki je esencialna za biološko pretvorbo krme, ki je drugače neprebavljiva za gostiteljsko žival. Prežvekovalci namreč sami niso sposobni proizvodnje encimov, potrebnih za metabolizem kompleksnih polisaharidov (Henderson in sod., 2015). Rastlinska biomasa se tako primarno fermentira do lahko hlapnih (kratkoverižnih) maščobnih kislin (VFA), ki služijo kot glavni vir energije prežvekovalcem (Bekele in sod., 2009). Vampne bakterije so številčno najbolj zastopane in so odgovorne za velik del razgradnje rastlinskih vlaknin (Koike in Kobayashi, 2009). Poleg tega sintetizirajo tudi B vitamine (Bi in sod., 2018). Beljakovine za rast in razvoj živali izhajajo iz same mikrobne biomase.
2.1.1 Vampne bakterije
Za napredek v vampni mikrobiologiji je veliko prispeval ameriški mikrobiolog Robert Edward Hungate (1966, 1969) z razvojem tehnik za izolacijo in kultivacijo anaerobnih mikroorganizmov ter razvojem anaerobnih gojišč (Hungate, 1950). Večina danes poznanih vampnih bakterij pripada enemu izmed štirih debel viz. Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria in Spirochaetes (Singh in sod., 2019).
Vampne mikroorganizme lahko razdelimo v različne funkcionalne skupine. Med primarne razgrajevalce rastlinskih substratov spadajo celulolitični, amilolitični in pektinolitični mikroorganizmi. Sekundarni fermentorji metabolizirajo produkte nastale s primarno fermentacijo, npr. izraba laktata s strani Selenomonas ruminatum, ko heksoz ni več na voljo. Tretji proces je metanogeneza, kjer metanogene arheje izkoriščajo vodik, ki je pogost produkt fermentacije in tvorijo metan (CH4).
5
Preglednica 1: Preglednica najpomembnejših vampnih bakterijskih razgrajevalcev rastlinskih substratov ter metanogenih arhej (Singh in sod., 2019)
Rastlinski substrat Najpomembnejši fermentorji
Celuloza Bacteroides succinogenes, Clostridium cellobioparum, Clostridium longisporum, Clostridium lochheadii, Eubacterium cellulosolvens, Cillobacterium
cellulosolvens, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens Hemiceluloza Eubacterium xylanophilum, Butyrivibrio fibrisolvens, Prevotella bryantii,
Prevotella ruminicola
Škrob Bacteroides amylophilus, Streptococcus bovis, Ruminobacter amylophilus, Prevotella ruminicola
Heksoze Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp., Succinivibrio dextrinosolvens, Succinivibrio amylolytica, Selenomonas ruminantium, Treponema zioleckii Pektin Lachnospira multiparus, Treponema saccharophilum
Proteini Clostridium sp., Megasphaera elsdenii, Peptostreptococcus anaerobius, Prevotella bryantii, Prevotella ruminicola , Ruminobacter amylophilus Mimozin
(razgradnja) Synergistes jonesii, Streptococcus lutetiensis, Clostridium butyricum, Lactobacillus vitulinus, Butyrivibrio fibrisolvens
Oksalati Oxalobacter formigenes, Moorella thermoacetica Fitična kislina Mitsuokella multiacidus, Prevotella ruminicola
Tanini/polifenoli Enterobacter ludwigii, Eubacterium oxidoreducens, Klebsiella oxytoca, Lactobacillus sp., Lonepinella koalarum, Selenomonas ruminantium, Streptococcus spp.
Metanogeneza Methanobrevibacter ruminantium, Methanobacterium formicicum, Methanosarcina barkeri, Methanomicrobium mobile
Primerjalne analize knjižnic vampne bakterijske 16S rRNA so pokazale, da dominirata dve debli: Firmucutes ter Bacteroidetes, v katero spada tudi rod Prevotella (Edwards in sod., 2004).
Gojene bakterije razkrivajo le majhen delež celotne bakterijske diverzitete vampa.
Edwards in sod. (2004) omenjajo, da naj bi imelo le 11 % OTU zaznanih v vampu gojenega predstavnika. Z vključitvijo nedavnega Hungate projekta se ocenjuje, da ima na nivoju rodu kar 75 % vampnih bakterijskih taksonov reprezentativnega gojenega predstavnika (Seshadri in sod., 2018).
Prehrana je eden izmed glavnih dejavnikov, ki vplivajo na sestavo vampnega mikrobioma. Prehrana, osnovana na senu, promovira rast fibrolitičnih in celulolitičnih bakterij, medtem ko dodajanje žit in hrane v obliki koncentrata spodbuja rast amilolitičnih bakterij (Bi in sod., 2018). Bekele in sod. (2010) poročajo, da je tudi pri ovcah številčnost Prevotella naraščala in F. succinogenes, R. albus in R. flavefaciens padala z višanjem koncentrata v dieti.
6
V industrijski živinoreji je večanje energijske gostote krme pogost način za rejenje živali in izboljšanje njihove produktivnosti. Med glavni metodi spadata spreminjanje razmerja sena in krmnega koncentrata ali spreminjanje energetske gostote, pri čemer se razmerje seno-krmni koncentrat ne spremeni (Carberry in sod., 2012). Spreminjanje razmerij mrve in krmnega koncentrata spremeni sestavo vampne združbe in lahko vodi v poslabšanje zdravja živali. Vnos visokega deleža žitaric, bogatih z lahko prebavljivim škrobom vodi v proizvodnjo laktata. Posledica tega je lahko drastičen upad pH vampne vsebine (pod pH 5,5), čemur pravimo vampna acidoza, ki je za žival lahko smrtna. Prav vampna acidoza je pomemben primer interakcije med vampnimi mikroorganizmi in krmo, ki je ključnega pomena za optimalen metabolizem in s tem produkcijo (Tajima in sod., 2001).
Henderson in sod. (2015) so v analizi 16S rRNA več kot 700 vzorcev iz 32 vrst divjih in udomačenih prežvekovalcev iz 35 držav ugotovili, da kljub različnim prežvekovalcem, prehranskim strategijam, lokaciji in navsezadnje podnebju, obstaja enoten jedrni mikrobiom. Sedem najpogostejših bakterijskih skupin je predstavljalo 67 % vseh sekvenc in so bile najdene v vseh vzorcih. To so bili rodovi Prevotella, Butyrivibrio, Ruminococcus, kot tudi neklasificirani rodovi Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bacteroidales in Clostridiales. Pregled najbolj prevalentnih bakterijskih operacijskih taksonomskih enot oz. OTU (n= 77) je pokazal, da je lahko zgolj 14 % OTU uvrščenih med znane vrste, medtem ko jih 70 % ne dosega niti formalno določenega rodu.
2.1.2 Ostali vampni mikroorganizmi
2.1.2.1 Vampne arheje
Skoraj vse prisotne arheje (108-9/ml vampnega soka) so metanogene, pri čemer je večina hidrogenotrofnih in manjši delež acetoklastičnih (Wang in sod., 2017). Ti mikroorganizmi izrabljajo H2 (vodik) in CO2 (ogljikov dioksid), nastala z visoko mikrobno aktivnostjo drugih mikroorganizmov in proizvajajo CH4. Na splošno ta interakcija prežvekovalcu koristi, saj preprečuje akumulacijo vodika in s tem povratno inhibicijo fermentacijskih procesov. Približno 17 % globalnih emisij metana prihaja iz živinoreje, poleg tega metan predstavlja med 2-12 % izgube energije za prežvekovalca (Patra in sod., 2017). Ta izguba nastane zaradi visokega števila redukcijskih ekvivalentov (način hranjenja za čim hitrejšo rast živine), ki končajo v obliki metana.
2.1.2.2 Vampne praživali
Med praživalmi so v vampu najpogostejši in najpomembnejši ciliati (>106/g vampne vsebine), ki prispevajo kar 50 % celotne mikrobne biomase (Piela in sod., 2010). Vloga praživali je še vedno tema debate, saj njihova prisotnost ni ključna za preživetje prežvekovalca. Kljub temu igrajo pomembno vlogo pri nadzoru bakterijske populacije, razgradnji rastlinskega materiala in preprečevanju presežka laktata (Newbold in sod., 2015).
7 2.1.2.3 Vampne glive
Vampne glive iz debla Neocallimastigomycota so posebne v smislu občutljivosti za kisik, saj so do zdaj edini identificirani obligatno anaerobni predstavniki kraljestva gliv. Poleg bakterij so v glavnem primarni kolonizatorji rastlinskega materiala, kjer z rizoidnimi hifami prodrejo v rastlinske delce in s tem povečajo površino za delovanje bakterijskih in glivnih encimov (Singh in sod., 2019). Večina anaerobnih gliv je asociiranih s (poli)celulosomskimi kompleksi, ki omogočajo razgradnjo lignoceluloze in hemiceluloze.
2.1.2.4 Vampni bakteriofagi
Bakteriofagi kontrolirajo bakterijsko populacijo in pripomorejo k horizontalnemu genskem prenosu, po drugi strani pa zmanjšujejo učinkovitost pretvorbe energije in omogočajo prenos genov za toksine in rezistence na antibiotike (Singh in sod., 2019).
2.1.3 Razvoj vampnega mikrobioma prežvekovalcev
Mikrobna kolonizacija gastrointestinalnega trakta sesalcev se začne zelo zgodaj in je v času razvoja priča nekaterim fluktuacijam. Primarni mikrobiom je mešanica mikrobioma okolja, s katerim je mladič v stiku, kar vključuje nožnico pri rojstvu, stik s kožo pri sesanju, negovanje s strani mame, stik s fecesom v čredi kot tudi uživanje kolostruma oziroma mleka z internim mikrobiomom (Rey in sod., 2013). Drastična sprememba se pri sesalcih zgodi ob prehodu iz materinega mleka na trdo hrano (Dill-McFarland in sod., 2019). Ko se telički začnejo prehranjevati s trdno hrano, to prinaša nov fermentabilen material, ki močno spremeni strukturo vampnega mikrobioma. Pri starosti 2 dni predstavljajo Proteobacteria, Bacteroidetes in Firmicutes 70 %, 14 % in 11 % vseh sekvenc (slika 3). Nato številčnost Proteobacteria pade in pri 15 dneh starosti Bacteroidetes že postanejo dominantne. Znotraj Bacteroidetes so Bacteroides v prvih 10 dneh starosti številčen del mikrobioma, nato pa se njihovo število zniža in ohranja okoli 1 %. Hkrati postanejo Prevotella povsem dominanten rod v vampu (slika 4). Ob vsem tem se je treba zavedati o funkcionalni redundanci bakterijskih rodov, predvsem v zgodnjem razvoju vampa telička, kjer je fluktuacija mikrobiote velika. Vampne metabolne procese lahko pokrivajo različni, filogenetsko oddaljeni mikroorganizmi s podobnim naborom encimov.
Slika 3: Sprememba relativne abundance bakterijskih družin v mikrobiomu telička od rojstva do odstavitve.
Barvno kodirana lestvica starosti predstavlja sestavo prehrane (temno modra kolostrum; svetlo modra mleko; zelena rastlinski material) (Rey in sod., 2013)
8
Slika 4: Sprememba relativne abundance bakterijskih rodov v mikrobiomu telička od rojstva do odstavitve.
Barvno kodirana lestvica starosti predstavlja sestavo prehrane (temno modra kolostrum; svetlo modra mleko; zelena rastlinski material) (Rey in sod., 2013)
2.2 ROD PREVOTELLA
Rod Bacteroides je sprva predstavljal fenotipsko in filogenetsko heterogeno skupino po Gramu negativnih, nesporulirajočih anaerobnih bakterij, ki proizvajajo sukcinat. Prvega predstavnika rodu Bacteroides sta opisala Veillon in Zuber leta 1898, in sicer kot Bacteroides fragilis. Prvi predstavnik Prevotella pa je bil leta 1921 opisan kot Bacteroides melaninogenica (danes Prevotella melaninogenica) s strani raziskovalcev Oliver in Wherry. Leta 1990 je bil rod Bacteroides namreč uradno reklasificiran v tri ločene rodove, glede na njihovo sposobnost fermentacije ogljikovih hidratov. Močno saharolitične, nepigmentirane bakterije so ostale v rodu Bacteroides, asaharolitične in pigmentirane so premestili v rod Porphyromonas, preostale so zmerno saharolitične, nepigmentirane (danes vemo, da so tudi pigmentirane) bakterije, občutljive za žolčne soli, ki so jih združili pod rod Prevotella (Shah in Collins, 1990). Danes jih poznamo kot
9
nemobilne obligatne anaerobe v obliki pleomorfnih palčk oz. kokobacilov (Shah in Collins, 1990). Trenutno je znotraj rodu uradno priznanih 55 vrst (Parte in sod., 2020).
Različni sevi Prevotella so bili izolirani iz številnih okolij, vključujoč vamp, gastrointestinalni trakt herbivorov in omnivorov, ustna votlina človeka – tako zdrava (Könönen, 1993) kot nezdrava (Downes in sod., 2005); ustna votlina živali (Takada in sod., 2010), kožni ognojki (Hsu in sod., 2009), riževo polje (Ueki in sod., 2007) kot tudi bakterijska vaginoza (Randis in Ratner, 2019).
Najštevilčnejše bakterije človeškega črevesja pripadajo dvem deblom, Firmicutes in Bacteroidetes. Znotraj slednjega za prevlado tekmujeta dva, domnevno antagonistična rodova Bacteroides in Prevotella. Črevesne Prevotella močno dominirajo predvsem pri ne-zahodnih populacijah oz. vegetarijancih, katerih prehrana temelji na rastlinskem materialu (Ley, 2016). Nasprotno, v zahodnih populacijah večino bakteroidet črevesja predstavljajo Bacteroides, medtem ko Prevotella najdemo predvsem v ustni votlini (Ley, 2016). Prisotnost Prevotella v črevesju je bila v nekaterih študijah povezana s pozitivnimi učinki na zdravje, po drugi strani pa je bila prisotnost nekaterih sevov, predvsem Prevotella copri povezana z vnetnimi boleznimi (Scher in sod., 2013; Ley, 2016).
2.2.1 Vampne Prevotella
Rod Prevotella predstavlja enega najbolj dominantnih rodov znotraj vampa (Stevenson in Weimer, 2007), z glavnimi vlogami pri metabolizmu ogljikovih hidratov (Gasparič in sod., 1995), kakor metabolizmu dušika (Bladen in sod., 1961). Te bakterije so sposobne izkoriščati škrob, druge necelulozne polisaharide kot tudi enostavne sladkorje za vir energije. Glavni fermentacijski produkt je sukcinat, ki je preko drugih bakterijskih vrst v vampu hitro dekarboksiliran do propionata, katerega prežvekovalec lahko preko jetrne glukoneogeneze uporabi kot vir energije (Blackburn in Hungate, 1963; Purushe in sod., 2010).
Zanimivo je, da so Aguilar-Marin in sod. (2020) opazili povezavo med večjo prisotnostjo vampnih Prevotella z manjšimi izpusti metana iz kolumbijskih bufalov. Prav tako so na podlagi 16S rRNA iz delcev neprebavljene krme pri vampu krav mlekaric dominirale sekvence sorodne Prevotella (Whitford in sod., 1998), kar kaže na to, da so vključene pri razgradnji vlaknin.
Klonirane knjižnice 16S rRNA genov, pridobljenih iz vzorcev vampa iz različnih živalskih vrst, lokacij ter prehranskih strategij kažejo, da so prevotele ubikvitarne in numerično prevladujoče neodvisno od geografskih lokacije kot tudi prehranske strategije.
Rod v vampu številčno prevlada tako v živini, hranjeni s senom kot žiti (Henderson in sod., 2015).
Bakterijski izolati, predstavljajoč skupino vampnih Prevotella so bili prvotno opisani s strani Bryant in sod. (1958), ki so jih na osnovi zahteve po heminu razdelili na dvoje podvrst: Bacteroides ruminicola ssp. ruminicola (tipski sev B. ruminicola ssp. ruminicola 23) in Bacteroides ruminicola ssp. brevis (tipski sev B. ruminicola ssp. brevis GA33).
Avguštin in sod. (1997) so bili prvi, ki so predlagali diferenciacijo vampnih Prevotella v
10
štiri različne vrste: Prevotella ruminicola, Prevotella brevis, Prevotella bryantii in Prevotella albensis. V detajlni analizi 16S rRNA so Ramšak in sod. (2000) pokazali, da sta P. ruminicola in P. brevis del grozda, sestavljenega izrecno iz vampnih izolatov, medtem ko sta P. bryantii in P. albensis v grozdu s Prevotella iz drugih ekoloških niš, kot je npr. ustna votlina.
P. ruminicola naj bi bila glede na svojo količino in repertoar peptidaz med glavnimi producenti amonija iz hidroliziranih proteinov v vampu. To je pomembno predvsem zato, ker je amonij preferenčen vir dušika za vampne bakterije (Pittman in Bryant, 1964). Vir amonija v vampu je v glavnem deaminacija aminokislin (Bladen in sod., 1961).
2.2.1.1 Kvantifikacija vampnih Prevotella
Študije na podlagi gojitvenih metod navajajo, da ta bakterija predstavlja okoli 40-70 % izoliranih sevov (Van Gylswyk, 1990). V visokih deležih so prisotne tudi v prebavnem traktu drugih živali, ki se hranijo z rastlinskim materialom npr. prašiči, perutnina in človek (Purushe in sod., 2010).
V 16S rRNA študiji bakterijske diverzitete vampa (Edwards, 2004) se je izkazalo, da je P. ruminicola najbolj prevalentna OTU. Nekaj let kasneje sta Stevenson in Weimer (2007) poročala, da Prevotella zavzema 42-60 % bakterijskih 16S rRNA kopij vampnega vzorca krav, od tega je zgolj 2-4 % kopij pripadalo klasičnim gojenim vampnih vrstam, to so P. bryantii, P. ruminicola in P. brevis. Nekateri so to število kritizirali, češ da so bili uporabljeni začetni oligonukleotidi premalo specifični (Bekele in sod., 2010).
Wood in sod. (1998) so ocenili, da sta v vampu šestih ovac in eni kravi Prevotella/Bacteroides skupno zavzemala med 12-62 % celotne bakterijske 16S rRNA.
Ponovno se je izkazalo, da večina ribotipov Prevotella ni podobna gojenim vrstam.
Bekele in sod. (2010) so s PCR v realnem času preučili relativno zastopanost Prevotella treh ovac. Povprečna abundanca Prevotella je variirala med 13,5-19,7 %, P. bryantii in P. ruminicola pa naj bi zavzemale zgolj 0,6 % in 3,8 % vseh sekvenc, v tem vrstnem redu, kar predstavlja približno četrtino sekvenc znotraj rodu. Poleg tega avtorji opozarjajo na obstoj različnih OTU Prevotella, ki so odvisni od prehrane.
Za vampni vrsti P. albensis ter P. brevis se je do sedaj izkazalo, da predstavljata le zanemarljiv delež sekvenc v vampu tako ovac (Bekele in sod., 2010), kakor krav (Stevenson in Weier, 2007).
Razlike v relativni kvantifikaciji tako posameznih OTU Prevotella kot celotnega rodu so verjetno posledica različne diete (razmerje med koncentratom in krmo), vrste živali, starosti, izbire začetnih oligonukleotidov in drugih dejavnikov, ki so variirali med študijami (Bekele in sod., 2010). Pri izdelavi klonalnih 16S rRNA knjižnic pridobljenih iz metagenomskih vzorcev z reakcijo PCR pomnožimo regijo gena za 16S rRNA. Z večanjem števila ciklov v reakciji PCR se pojavi nevarnost izmaličenja dejanske biodiverzitete. Kakorkoli, številne študije jasno nakazujejo, da je velik delež sevov Prevotella še nekultiviranih.
