ACETILHOLINESTERAZNA AKTIVNOST V VODNEM EKSTRAKTU GOBE BUKOV OSTRIGAR (Pleurotus ostreatus)

PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Študijski program: Biologija in Kemija

TJAŠA BERGANT

Mentorica: doc. dr. Anita JEMEC Somentorica: prof. dr. Kristina SEPČIĆ

ACETILHOLINESTERAZNA AKTIVNOST V VODNEM EKSTRAKTU GOBE BUKOV OSTRIGAR (Pleurotus ostreatus)

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2016

ii

Diplomsko delo je zaključek dodiplomskega univerzitetnega študija biologije in kemije.

Opravljeno je bilo v laboratoriju Katedre za biokemijo na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete v Ljubljani.

Študijska komisija Pedagoške fakultete je 10. maja 2016 odobrila predlagano temo diplomske naloge z naslovom Acetilholinesterazna aktivnost v vodnem ekstraktu gobe bukov ostrigar (Pleurotus ostreatus).

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: doc. dr. Iztok TOMAŽIČ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Mentorica: doc. dr. Anita JEMEC

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Somentorica: prof. dr. Kristina SEPČIĆ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Recenzentka: prof. dr. Damjana DROBNE

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

iii

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK UDK 577:582.284.99(043.2)

KG bukov ostrigar/Pleurotus ostreatus/acetilholinesteraza/inhibicija AV BERGANT, Tjaša

SA JEMEC, Anita (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Program Kemija in Biologija

LI 2016

IN ACETILHOLINESTERAZNA AKTIVNOST V VODNEM EKSTRAKTU GOBE BUKOV OSTRIGAR (Pleurotus ostreatus)

TD Diplomsko delo (univerzitetni študij) OP VIII, 25 str., 11 sl., 32 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Zanimalo nas je, ali je v vodnem ekstraktu gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) mogoče zaznati aktivnost encima acetilholinesteraze (AChE), če kot substrat uporabimo acetiltioholinklorid (AChCl). Z dodatkom različnih koncentracij substrata in različnih inhibitorjev, smo želeli proučiti, v kolikšni meri ti vplivajo na aktivnost encima. Uspeli smo dokazati aktivnost encima AChE v vzorcih bukovega ostrigarja. Aktivnost je linearno naraščala s povečevanjem koncentracije substrata AChCl. Pri koncentraciji 1 mM AChCl inhibitorji eserin, neostigmin bromid in poli APS ne zavirajo aktivnosti encima. Predlagamo nadaljnje študije z drugimi substrati, ki vsebujejo tioholin ter študije inhibicije encima pri višjih koncentracijah substrata acetiltioholinklorida.

iv

KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Dn

DC UDC 577:582.284.99(043.2)

CX oyster mushroom/Pleurotus ostreatus/acetylcholinesterase/inhibition AU BERGANT, Tjaša

AA JEMEC, Anita (supervisor)

PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

PB University of Ljubljana, Faculty of Education, Biotehnical Faculty, Academic Study Programme Chemistry and Biology

PY 2016

TI ACETYLCHOLINESTERASE ACTIVITY IN WATER EXTRACT OF THE OYSTER MUSHROOM (Pleurotus ostreatus)

DT Graduation thesis (University studies) NO VIII, 25 p., 11 fig., 32 ref.

LA sl AL sl/en

AB We were interested to see, if there is a possibility to detect any activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) in the water extract of the oyster mushroom (Pleurotus ostreatus), if acetylthiocholine chloride (AChCl) is used as a substrate. We wished to study at what rate the enzyme activity is affected, if we add different concentrates of the substrate and different inhibitors. In samples of the oyster mushroom, activity of the enzyme AChE was successfully proven. The activity linearly grew in correspondance with increasing concentration of the AChCl substrate. Inhibitors eserine, neostigmine bromide, and poly APS at 1 mM concentration of AChCl, do not block the enzyme activity. We suggest further studies with other substrates, containing thiocholine. We also suggest studies of the enzyme inhibition at higher concentrations of substrate acetylthiocholine chloride.

v

KAZALO VSEBINE

1. UVOD ... - 1 -

1.1. Namen dela/raziskovalna vprašanja ... - 1 -

2. PREGLED OBJAV ... - 2 -

2.1. SPLOŠNE LASTNOSTI GOB ... - 2 -

2.1.1. Značilnosti bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) ... - 2 -

2.1.2. Interakcija rastline-glive ... - 3 -

2.2. ENCIM ACETILHOLINESTERAZA ... - 3 -

2.2.1. Biološka vloga ... - 3 -

2.2.2. Biokemijske značilnosti ... - 4 -

2.2.3. Substrati AChE ... - 5 -

2.2.4. Inhibitorji AChE ... - 6 -

2.2.5. Definicija in računanje encimske aktivnosti ... - 7 -

3. MATERIALI IN METODE ... - 8 -

3.1. KEMIKALIJE ... - 8 -

3.2. LABORATORIJSKA OPREMA ... - 8 -

3.3. PRIPRAVA VZORCEV GOBE (PLEUROTUS OSTREATUS) ... - 8 -

3.4. MERJENJE ENCIMSKE AKTIVNOSTI ACETILHOLINESTERAZE ... - 9 -

3.4.1. Vpliv različnih koncentracij substrata acetiltioholin klorida ... - 9 -

3.4.2. Test inhibicije aktivnosti encima ... - 10 -

3.4.3. Določanje količine proteinov ... - 11 -

4. REZULTATI ... - 13 -

4.1. AKTIVNOST ENCIMA ACETILHOLINESTERAZA V GOBAH ... - 13 -

4.2. VPLIV RAZLIČNIH KONCENTRACIJ SUBSTRATA ... - 15 -

4.3. VPLIV INHIBITORJEV NA AKTIVNOST ... - 17 -

5. RAZPRAVA ... - 19 -

5.1. AKTIVNOST ENCIMA ACETILHOLINESTERAZE V GOBAH ... - 19 -

5.2. VPLIV RAZLIČNIH KONCENTRACIJ SUBSTRATA ... - 19 -

5.3. VPLIV INHIBITORJEV NA AKTIVNOST ... - 19 -

6. SKLEPI ... - 21 -

vi

7. POVZETEK ... - 22 - 8. VIRI IN LITERATURA VSEBINE ... - 23 - 9. VIRI SLIK ... - 25 -

vii

KAZALO SLIK

Slika 1: 3D shematska predstavitev strukture encima AChE (Torpedo californica) ... - 5 -

Slika 2: Vrednosti absorbance v odvisnosti od časa pri endogeni reakciji ... - 13 -

Slika 3: Vrednosti absorbance v odvisnosti od časa ob dodatku 1mM AChCl ... - 14 -

Slika 4: Vrednosti absorbance za vodotopno AChE pri dodatku 0, 1, 3 in 5mM AChCl ... - 15 -

Slika 5: Vrednosti absorbance za celokupno AChE pri dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl ... - 15 -

Slika 6: Specifična aktivnost vodotopne AChE ob dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl. . ... - 16 -

Slika 7: Specifična aktivnost celokupne AChE ob dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl. ... - 16 -

Slika 8: Vrednosti absorbance vodotopne AChE ob dodatku inhibitorjev eserina in ... - 17 -

Slika 9: Vrednosti absorbance celokupne AChE ob dodatku inhibitorjev eserina in ... - 17 -

Slika 10: Vrednosti absorbance vodotopne AChE ob dodatku inhibitorja poli APS ... - 18 -

Slika 11: Vrednosti absorbance celokupne AChE ob dodatku inhibitorja poli APS ... - 18 -

viii

SEZNAM KRATIC

AChE Acetilholinesteraza ACh Acetilholin

AChCl Acetiltioholin klorid ChE Holinesteraza BChE Butirilholinesteraza DTNB Ditiobisnitrobenzoat K-P pufer Kalij-fosfatni pufer dH2O Destilirana voda

- 1 -

1. UVOD

Acetilholinesteraza (AChE) je encim, ki ne sodeluje le pri prenosu živčnih signalov, ampak ima vlogo tudi pri drugih življenjsko pomembnih funkcijah (Karczmar, 2010), kot npr. pri prenosu spermijev in razvoju motorične ploščice (Massoulié in sod., 1993). Gre za enega izmed najhitrejših hidrolitičnih encimov, katerega aktivno mesto je posebej prilagojeno za proces hidrolize substrata acetilholina (ACh) (Houghton in sod., 2006).

Acetilholin najdemo pri vretenčarjih in členonožcih kot glavni nevrotransmiter, s pomočjo katerega se do živčnih celic prenašajo električni impulzi. Encim AChE se nahaja v holinergičnih sinapsah. Če je živčni prenašalec ACh, se sinapse imenujejo acetilholinske sinapse in prevladujejo pri večini živalskih skupin. Na postsinaptični membrani AChE razgradi ACh in s tem prekine prenos živčnega signala med celicama (Karczmar, 2010).

Dokazali pa so tudi prisotnost ACh v tkivih, ki niso povezana z živčnim sistemom (Karczmar, 2010). Šibka sinteza ACh je bila zaznana tudi v vzorcih gliv iz debla Basidiomycota (Horiuchi in sod., 2003). Zaradi odsotnosti živčnih sinaps v gobah, se pričakuje, da ti organizmi nimajo encima AChE, vendar pa obstajajo nekatere študije, ki nakazujejo na njegovo morebitno prisotnost (Karczmar, 2010). Na primer, v ekstraktih gliv rodu Aspergillus in Fusarium so zaznali aktivnost specifičnih esteraz, ki naj bi imele visoko afiniteto na tioholin ester etanojske kisline. Na osnovi tega obstaja verjetnost, da se v njih nahaja AChE (Mikhailova in sod., 1996).

1.1. Namen dela/raziskovalna vprašanja

Zanimalo nas je, ali je v vzorcu gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) mogoče zaznati aktivnost encima AChE, če kot substrat uporabimo acetiltioholin klorid (AChCl).

Predvidevali smo, da bomo pomerili aktivnost encima ter da bo njegova aktivnost odvisna od koncentracije substrata AChCl. Predvidevali smo tudi, da bodo različni inhibitorji zavirali aktivnost encima z različno intenziteto.

- 2 -

2. PREGLED OBJAV

2.1. SPLOŠNE LASTNOSTI GOB

Po biološki klasifikaciji gobe uvrščamo v kraljestvo gliv (Fungi), ki se deli na 6 debel:

Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Glomeromycota, Microsporidia in Zygomycota. Glive so nižji evkariontski organizmi in vključujejo raznovrstne organizme, (gobe, glive kvasovke, plesni, rje, tartufi…), ki naseljujejo tako zračni, vodni ali kopenski habitat (Kirk in sod., 2010). Celično steno gliv gradijo hitin in -glukani, ki zagotavljajo njeno trdnost, v notranjosti celice pa kot rezervne snovi skladiščijo olja in glikogen.

Bhadauria in sod. (2007), so razvili standardiziran protokol, po katerem je mogoče izolirati vse vrste proteinov, ki se nahajajo v proteomu, z manjšo kontaminacijo drugih molekul.

Zaradi trdne celične stene je učinkovita ekstrakcija proteinov, ključna za vse proteomske študije.

Telo glive predstavlja steljka, ki je lahko enocelična ali mnogocelična, grajena iz dolgih nitk - hif. Preplet hif tvori micelij (podgobje), nad površjem pa se razvijejo trosovniki, v katerih nastajajo trosi (spore), ki služijo nespolnemu razmnoževanju gliv. Razmnožujejo se sicer tudi spolno. Glive so heterotrofni organizmi in jih lahko uvrščamo med saprofite, parazite, simbionte ali patogene (Kirk in sod., 2010). Prehranjujejo se z direktno absorbcijo hranil, ki jo omogočajo številni ekstracelularni hidrolitični encimi, s katerimi razgradijo organski material (Burns in sod., 2013).

2.1.1. Značilnosti bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus)

Bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) širše uvrščamo v deblo Basidiomycota, saj njihove razmnoževalne strukture nastajajo na bazidiju - trosnem podstavku, kjer nastajajo trosi, s katerimi se razmnožujejo (Kirk in sod., 2010). Običajno raste v skupinah na bukovem lesu, prepoznamo pa ga po značilnem sivorjavem klobuku, v obliki školjke. Po načinu prehranjevanja je saprofitni heterotrof, kar pomeni, da hranila absorbira iz odmrlih ali razpadajočih organskih substratov, hkrati pa delujejo tudi kot razkrojevalci (Eger in sod., 1976).

Spada med ostrigarje, ki so ene izmed najbolj iskanih užitnih gob z visoko hranilno vrednostjo, krepijo imunski sistem in jih kot vir naravnih antimikrobnih snovi že vrsto let uporabljajo za zdravljenje bakterijskih okužb (Tehrani in sod., 2012).

- 3 -

Ostrigarji so bogat vir proteinov (več kot 30% na suho maso), ne vsebujejo holesterola in imajo znatne količine molekule lovastina, ki znižuje holesterol. Zaradi vsebnosti lovastina so ostrigarje uporabili za študijo zniževanja ravni holesterola (Stamets, 2005). Bukov ostrigar je zaradi enostavnega načina gojitve ter visoke vsebnosti raznovrstnih katalitičnih encimov (Giardina in sod., 2000), uporaben model za raziskave, tako na področju biokemije, biotehnologije in medicine (Rebolj in Sepčić, 2008).

2.1.2. Interakcija rastline-glive

Z ekološkega vidika rastline in mikorizne glive živijo v simbiontskem odnosu, saj glive zagotavljajo vir mineralnih snovi rastlinam, te pa jim nudijo ogljikove hidrate, ki jih glive same ne morejo sintetizirati. Zaradi odsotnosti živčnih sinaps v gobah, je komunikacija med rastlinami in glivami preko nevrotransmiterjev, še vedno neraziskana, kljub temu, da je bila prisotnost le-teh zaznana v nekaterih glivah in bakterijah rodu Rhizobium (Roshchina, V.V., 2016).

Razumevanje ekspresije, funkcije in regulacije celotnega seta proteinov, ki jih kodira glivni genom, bi tako predstavljalo nepogrešljive informacije pri razumevanju interakcij med rastlinami in glivami (Bhadauria in sod., 2007).

2.2. ENCIM ACETILHOLINESTERAZA

2.2.1. Biološka vloga

Acetilholinesteraza je eden izmed najbolj učinkovitih in najhitreje delujočih encimov živčnega sistema (Houghton in sod., 2006). Nahaja se tako na holinergičnih kot na živčno- mišičnih sinapsah, kjer poteka razgradnja ACh in tako nosi pomembno vlogo pri prenosu živčnih signalov, poleg tega pa opravlja vrsto drugih, življenjsko pomembnih funkcij (Karczmar, 2010), kot npr. prenos spermijev in razvoj motorične ploščice (Massoulié, 1993). Mnoge študije so dokazale, da je AChE vključena v rast aksonov, po katerih se prevajajo živčni signali (Downes in Granto, 2004). Čeprav je v času embrionalnega razvoja srca pred oživčenjem vloga AChE nenavadna, je bila njena aktivnost zaznana v embrijih podgan in piščancev (Nakamura in sod., 1994).

- 4 -

Iz večjega števila rodov kraljestva gliv so uspeli izolirati snovi z močno AChE inhibitorno aktivnostjo (Houghton in sod., 2006), zato bi bila prisotnost AChE v glivah še toliko bolj presenetljiva, kljub potrjeni prisotnosti ACh v glivah (Horiuchi in sod., 2003).

2.2.2. Biokemijske značilnosti

Acetilholinesteraza je hidrokatalitični encim, ki vpliva na razgradnjo nevrotransmiterja ACh, zato ga uvrščamo med hidrolazne encime (Sussman in sod., 2010). V družino holinesteraz (ChE) spadata dva tipa, AChE in pseudoholinesteraze (Silman in Futerman, 1987). Vretenčarji imajo dva encima: AChE najdemo v mnogih vrstah prevajalnih tkiv, kot so mišična tkiva, centralno in periferno živčno tkivo ter v motoričnih in senzoričnih vlaknih ter butirilholinesteraza (BChE), ki jo najdemo v serumu, jetrih, ledvicah, koži in prebavnem traktu in je substratno dokaj nespecifičen encim (Silman in Futerman, 1987).

Nevretenčarji in žuželke imajo le eno vrsto ChE, ki je po katalitičnih lastnostih nekje med AChE in BChE (Stojan in sod., 2008), kar pomeni, da v različnih taksonomskih skupinah najdemo različne tipe ChE.

Acetilholinesteraza obstaja v raznovrstnih molekulskih oblikah, ki imajo podobne katalitične lastnosti, a se razlikujejo v načinu vezave na celično površino (Silman, 1987).

Kot rezultat raznolikosti kemijskih struktur so nekatere oblike encima hidrofobne, spet druge hidrofilne. Hidrofilne oblike se nahajajo znotraj celice, pritrjene na bazalno lamino, kjer z razgradnjo uravnavajo presežne koncentracije znotrajceličnega ACh (Robaire in Kato, 1973). Hidrofobni encimi, vezani v lipidni dvosloj plazemske membrane, pa biološko aktivnost ACh preprečijo tako, da ga na sinaptični špranji razgradijo na acetat in holin. Za hitro inaktivacijo ACh, so ti nameščeni v postsinaptične membrane, kjer so v neposredni bližini receptorjev(Houghton in sod., 2006).

Sussman (1991) je s pomočjo AChE, izolirane iz tkiva električnega organa električnega skata Torpedo californica, prvi določil tridimenzionalno strukturo AChE (slika 1), ki ustreza tako mišji kot človeški AChE.

- 5 -

Slika 1: 3D shematska predstavitev strukture encima AChE (Torpedo californica) (vir: Annals of Neurosciences, 2008)

2.2.3. Substrati AChE

Na vezavo substrata z encimom vpliva tako specifičnost, kot tudi dostopnost substrata (Berg in sod., 2002). Poleg substratov pa se na aktivno mesto encima AChE lahko vežejo tudi inhibitorji, ki zavirajo delovanje tega encima (Houghton in sod., 2006). Vsak encim ima aktivno mesto, ki predstavlja vezavno regijo za substrat, kjer poteka kataliza. Aktivno mesto AChE se nahaja na dnu 2 nm globokega žepa in sestoji iz dveh podregij: esterazne in anionske podregije (Sussman in sod., 2010).

Anionska podregija je večinoma sestavljena iz aromatskih in negativno nabitih aminokislin, pomembnih za stabilizacijo in vezavo ACh, kamor pa se vežejo tudi številni inhibitorji (Houghton in sod., 2006). Po vezavi ACh na anionsko regijo, se na esterazni podregiji prične hidrolitični razpad, pri čemer se estrske vezi pretrgajo in povzročijo razpad na acetat in holin. Po razpadu, molekula vode reagira z novonastalo acetilirano obliko AChE, iz katere nastane ponovno aktiven encim (Sussman in sod., 2010). Na vhodu v aktivni center (žep) se nahaja še periferno anionsko mesto, ki je odgovorno za inhibicijo s substratom, in na katerega se ravno tako lahko vežejo različni inhibitorji.

Čeprav je AChE specifičen encim, je poleg hidrolize ACh, sposoben hidrolizirati številne druge estre. Medtem ko hidroliza naravnih substratov poteka skozi vse stopnje z enako hitrostjo, je pri določenih substratih ena stopnja ponavadi omejujoča, zato ti redko dosežejo prehodno stanje. Ločimo dve vrsti substratov: tisti substrati, ki so preveliki in ne dosežejo prehodnega stanja, in majhni substrati, ki se vežejo v aktivno mesto, kjer

- 6 -

acilirajo serin, a se potem ne odcepijo več (Stojan in sod., 2008). Predstavniki obeh so inhibitorji AChE (Harel in sod., 1992).

Naravni substrat za vezavo na AChE je ACh, njegov analog pa je acetiltioholin (Ellman in sod., 1961). Na AChE pa se vežejo tudi drugi substrati, kot so: acetiltioholin klorid, acetiltioholin jodid, butiriltioholin, propioniltioholin in ostali (Stojan in sod., 2008).

2.2.4. Inhibitorji AChE

Inhibitorji AChE so lahko naravnega ali umetnega izvora. Glede na način delovanja ločimo reverzibilne in ireverzibilne inhibitorje.

Ireverzibilni inhibitorji z vezavo na encim trajno ustavijo delovanje encima (Houghton in sod., 2006). Sem spadajo insekticidi, pesticidi in živčni bojni strupi (Stojan in sod., 2008), ki se kovalentno vežejo z esteraznim mestom. AChE tako deluje kot tarča za nekatere najmočnejše toksine, vključno z insekticidi, kačjimi strupi in kemičnim orožjem (Soreq in Seidman, 2001). Akutna zastrupitev z inhibitorji AChE v centralnih in perifernih holinergičnih sinapsah lahko hitro pripelje do mišičnih krčev, v nadaljevanju tudi do mišične ohromelosti (Rosenberry, 1975).

Reverzibilni inhibitorji pa delovanje encima zavirajo le, ko so vezani nanj, sicer se lahko od encima odcepijo (Houghton in sod., 2006). Reverzibilni acetilholinesterazni inhibitorji imajo širok spekter uporabe v medicini, saj naj bi njihovo delovanje vplivalo na zdravljenje zelene mrene, mišične oslabelosti ter Alzheimerjeve bolezni (Houghton in sod., 2006).

Eserin (fizostigmin) je alkaloidna spojina iz skupine karbamatov in je značilen za kalabarski bob (Physostigma venenosum). Že leta nazaj so razvili vodotopne spojine, analogne fizostigminu z daljšo razpolovno dobo, ki so bile uporabljene za zdravljenje.

Čeprav so eserin včasih pogosteje uporabljali kot strup, je danes uporaben predvsem za zdravljenje zelene mrene (Houghton in sod., 2006).

Neostigmin (prostigmin, vagostigmin) je reverzibilen inhibitor, ki stimulira nikotinske in mukarinske receptorje, sam pa se veže na aktivna mesta encima. Izboljša mišični tonus pri ljudeh z mišično oslabelostjo, uporablja pa se tudi po anesteziji za sprostitev mišic (Houghton in sod., 2006).

- 7 -

Polimeri 3-alkilpiridinijevih soli, poznani pod kratico poli APS, so vodotopne spojine, izolirane iz morske spužve Reniera sarai, s širokim spektrom bioloških aktivnosti. Imajo antimikrobne učinke, delujejo citotoksično in so poznani kot acetilholinesterazni inhibitorji (Turk in sod., 2008). Gre za specifične nekompetitivne inhibitorje AChE, ki se vežejo na periferno aktivno mesto AChE (Sepčić in sod., 1998).

2.2.5. Definicija in računanje encimske aktivnosti

Encimi so biološki katalizatorji kemičnih reakcij v živih organizmih. Ti s svojim delovanjem zvišujejo hitrost reakcije, a pri tem ne vplivajo na ravnotežje reakcije in se pri reakciji ne porabljajo. Encim z vezavo substrata najprej tvori kompleks encim-substrat, šele nato poteče reakcija pretvorbe substrata v produkt. S hitrostjo encimskih reakcij in aktivnostjo encimov se ukvarja posebna veda - encimska kinetika (Berg in sod., 2002).

Aktivnost encima merimo s spektrofotometrično metodo po Ellmanu (Ellman in sod., 1961). Iz izmerjene absorbance, lahko po Beer-Lambertovem zakonu, določimo koncentracijo produkta, ki nastane pri encimsko katalizirani razgradnji substrata (Nelson in sod., 2008).

[𝑷] = 𝑨 𝜺 𝒍

[P]= koncentracija produkta, A= absorbanca, 𝜀= ekstinkcijski koeficient, l= dolžina optične poti

Iz koncentracije nastalega produkta v časovni enoti, lahko določimo hitrost encimske reakcije. Ta je podana s količino nastalega produkta ali s količino razgrajenega substrata, na enoto časa (Nelson in sod., 2008). Pri merjenju je potrebno nadzirati številne dejavnike, ki lahko vplivajo na hitrost encimske reakcije. To so: koncentracija substrata in encima, pH, temperatura, aktivatorji in inhibitorji (Berg in sod., 2002). Encimsko aktivnost dobimo, če hitrost encimske reakcije množimo z volumnom uporabljenega vzorca (Nelson in sod., 2008).

Specifično aktivnost encima določimo tako, da količino nastalega produkta delimo z maso proteinov v encimskem vzorcu.

- 8 -

3. MATERIALI IN METODE

3.1. KEMIKALIJE

 Kalij-fosfatni (K-P) pufer (50 mM, pH 7.0)

 10% Triton X-100,

 Ellmanov reagent (DTNB)

 1 M acetiltioholin klorid (AChCl)

 Eserin (M= 275.35 g/mol)

 Neostigmin bromid (M=303.20 g/mol)

 Poli APS (M=14.7 kDa)

 BSA Protein Assay (Pierce)

3.2. LABORATORIJSKA OPREMA

 Warring blender homogenizer

 Potter-Elvehjem homogenizer

 centrifuga Eppendorf 5810 R (Nemčija)

 centrifugirke

 2 ml in 5ml epice

 mikropipeta

 čitalec mikrotitrskih plošč Anthos (Velika Britanija)

 čitalec mikrotitrskih plošč BioTek CYTATION 3 (ZDA)

 mikrotitrne plošče

3.3. PRIPRAVA VZORCEV GOBE (PLEUROTUS OSTREATUS)

Za laboratorijsko delo smo si izbrali vzorec gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus), seva Plo5. Najprej smo pripravili vzorce (homogenate) gobe v fosfatnem pufru. Gre za mehanski postopek izolacije celičnih komponent, pri čemer razbijemo celične membrane, da se celični organeli izločijo v okolje. Zatehtali smo 100 g vzorca gob, katerim smo predhodno odstranili bete. S pomočjo Warring blenderja smo vzorec homogenizirali v 200 ml K-P pufra (50 mM, pH 7.0). Homogenat smo ves čas hranili na ledu, da smo s tem

- 9 -

preprečili proteolitsko razgradnjo. Nato smo v Potter-Elvehjem homogenizerju napravili 10 pasaž in dobljen homogenat enakomerno razdelili v dve čaši ter inkubirali na ledu.

V prvo čašo (označeno s črko V- ta predstavlja vodotopne encime, ki so se pri ekstrakciji sprostili v medij) smo dali 25 ml homogenata in 75 ml K-P pufra (50 mM, pH 7.0). V drugo čašo (označeno s črko T- ta predstavlja vse encime, ki so se pri ekstrakciji sprostili v medij, tako vodotopne kot membranske) pa smo dali 25 ml vzorca in 75 ml K-P pufra (50 mM, pH 7.0) s Tritonom. Za pripravo 75 ml tega pufra z 0.5% Tritonom smo v 71.25 ml pufra dodali 3.75 ml 10% Tritona. Detergent Triton razbije celične membrane, pri čemer se ekstrahirajo membranski proteini.

Homogenate smo dali na led za 30 minut ter jih nato enakomerno razdelili v centrifugirke, ki smo jih označili enako kot homogenate. Centrifugirali smo 30 min na 15000 obratov pri 4°. V sedimentu tako ostanejo gostejše in težje molekule, lažje pa ostanejo v supernatantu (Berg in sod., 2002). V supernatantu se nahaja veliko število vodotopnih proteinov in smo ga zato uporabili kot vir AChE, katere aktivnost želimo pomeriti.

Supernatante smo prelili v 2 ml in 5 ml epice ter jih inkubirali na ledu do ponovne uporabe.

3.4. MERJENJE ENCIMSKE AKTIVNOSTI ACETILHOLINESTERAZE

V supernatantih homogenatov smo pomerili aktivnost encima s pomočjo Ellmanove metode (1961). Gre za posredno metodo, kjer se meri absorbanca rumeno obarvanega produkta, kot posledica reakcije med tioholinom (produkt hidrolize AChCl) in Ellmanovim reagentom (ditiobisnitrobenzoat, DTNB):

tioholin + ditiobisnitrobenzoat ---- tionitrobenzoat + ditioholinnitrobenzoat (rumeno obarvanje)

Nastali reakcijski produkt absorbira pri 405 nm, zato absorbanco merimo pri tej valovni dolžini.

3.4.1. Vpliv različnih koncentracij substrata acetiltioholin klorida

Najprej smo 40 minut merili absorbanco pri 405 nm za t.i. endogeno reakcijo, pri čemer smo ugotavljali, ali sam vzorec reagira z Ellmanovim reagentom, brez dodatka substrata AChCl.

- 10 - Reakcijsko mešanico smo pripravili po spodnji shemi:

 100 l Ellmanovega reagenta

 50 l vzorca ali 50 l K-P pufra (50 mM, pH 7.0) v primeru slepega vzorca

 30 l K-P pufra (50 mM, pH 7.0)

Za pripravo 1 L Ellmanovega reagenta smo odtehtali 91 mg DTNB (Sigma) in 37.5 mg natrijevega hidrogenkarbonata (Sigma), dodali 100 ml 250 mM K-P pufra in dolili destilirano vodo (dH20) do oznake 1 L ter raztopili kemikalije s stresanjem.

Po 40 minutah merjenja smo dodali AChCl, z različnimi končnimi koncentracijami: 1, 3 in 5 mM. Dodali smo torej 20 l 10, 30 in 50 mM raztopin AChCl. Merili smo absorbanco pri 405 nm, 15 minut. Za vsako posamezno reakcijsko mešanico nanešeno na plošče, smo napravili po 3 paralelne meritve.

V vsaki meritvi smo izmerili tudi reakcijo brez vzorca, samo z dodatkom 0, 1, 3 in 5 mM AChCl, t.i. slepi vzorec.

3.4.2. Test inhibicije aktivnosti encima

V nadaljnjih poskusih nas je zanimalo, ali različni inhibitorji zavirajo delovanje AChE.

Pripravili smo reakcijsko mešanico, tako kot v poskusih z različnimi koncentracijami AChCl, le da smo tu uporabili le AChCl, s končno koncentracijo 1 mM.

Najprej smo izvedli t.i. endogeno reakcijo, z reakcijsko mešanico po spodnji shemi:

 100 l Ellmanovega reagenta (enaka koncentracija DTNB kot v točki 3.4.1.)

 50 l vzorca ali 50 l K-P pufra (50 mM, pH 7.0) v primeru slepega vzorca

 10 l K-P pufra (50 mM, pH 7.0)

Po 40 minutah smo nato dodali še: 20 l inhibitorja, potem pa še 20 l 10 mM AChCl.

Uporabili smo inhibitorje eserin, neostigmin bromid in poli APS. Pripravili smo raztopine inhibitorja eserina in neostigmin bromida s končnima koncentracijama 0.1 in 0.01 mM ter raztopine poli APS s končnimi koncentracijami 10, 1 in 0.1 g/mL. Redčitve smo delali v K-P pufru (50 mM, pH 7.0).

Za kontrolni vzorec smo uporabili substrat AChCl s končno koncentracijo 1 mM, brez dodatka inhibitorja.

- 11 - a) PRIPRAVA RAZTOPIN ESERINA:

Najprej pripravimo 100 mM raztopino eserina, tako da zatehtamo 1.9 mg eserina v 69 l etanola. Nato iz te raztopine pripravimo 1 mM ter 0.1 mM raztopino eserina v K-P pufru (50 mM, pH 7.0). Pri reakcijah smo dodali 20 l teh raztopin s koncentracijo 1 in 0.1 mM in dobili končni koncentraciji 0.1 in 0.01 mM.

b) PRIPRAVA RAZTOPIN NEOSTIGMIN BROMIDA:

Najprej pripravimo 100 mM raztopino neostigmin bromida, tako da zatehtamo 8.9 mg neostigmin bromida v 293.7 l vode. Nato iz te raztopine pripravimo 1 mM ter 0.1 mM raztopino eserina v K-P pufru (50 mM pH 7.0). Pri reakcijah smo dodali 20

l teh raztopin s koncentracijo 1 in 0.1 mM in dobili končni koncentraciji 0.1 in 0.01 mM.

c) PRIPRAVA RAZTOPIN POLI APS:

Najprej iz založne raztopine poli APS s koncentracijo 1000 g/ml pripravimo 100 mM raztopino v K-P pufru (50 mM pH 7.0). Nato iz te raztopine pripravimo raztopini s koncentracijo 10 g/ml in 1 g/ml. Pri reakcijah smo dodali 20 l teh raztopin s koncentracijo 100, 10 in 1 mM in dobili končne koncentracije 10, 1 in 0.1 g/ml.

Pripravljene raztopine premešamo z vrtičnikom in hranimo na ledu.

3.4.3. Določanje količine proteinov

Supernatant, ki smo ga uporabili za kvantifikacijo encimske aktivnosti, je bil uporabljen za kvantifikacijo vsebnosti proteinov. Uporabili smo metodo z reagenti BSA Protein Assay (Pierce). Količino proteinov v supernatantu smo določili z umeritveno krivuljo, ki smo jo preračunali iz absorpcije standardov z znano koncentracijo proteinov.

Za pripravo standardov smo uporabili založno raztopino govejega serumskega albumina (BSA, Sigma). Iz založne raztopine z 200 mg/ml BSA smo z redčenjem z dH2O pripravili standarde z 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0.125 in 0 mg/ml BSA. Absorbanco standardov smo, enako kot tisto od vzorcev, izmerili v treh paralelkah.

V treh paralelkah smo 20 μl supernatanta nanesli na mikrotitrsko ploščo in dodali 200 μl mešanice reagentov A in B BSA Protein Assay (Pierce). Reagenta A in B sta bila zmešana v

- 12 -

razmerju 50:1, glede na navodila proizvajalca. Mikrotitrska plošča z vzorci je bila inkubirana 30 minut na 37°C. Za slepi poskus je bila uporabljena dH2O. Absorbanco smo izmerili na 562 nm valovne dolžine na čitalcu mikrotitrskih plošč BioTek CYTATION 3.

- 13 -

4. REZULTATI

4.1. AKTIVNOST ENCIMA ACETILHOLINESTERAZA V GOBAH a) Endogena reakcija

Najprej smo izvedli endogeno reakcijo slepega vzorca, vzorca z vodotopno AChE in vzorca s celokupno AChE. Vrednosti izmerjene absorbance prikazuje slika 2.

Pri slepem vzorcu so vrednosti enake in se v času skorajda ne spreminjajo ter so nižje od vrednosti pri dodanih vzorcih. Vrednosti pri celokupni in vodotopni AChE pa nekoliko naraščajo. Tako začetne kot končne vrednosti so za vodotopno AChE višje od tistih za celokupno AChE.

Slika 2: Vrednosti absorbance v odvisnosti od časa pri endogeni reakciji 0.0000

0.0500 0.1000 0.1500 0.2000 0.2500 0.3000 0.3500 0.4000 0.4500 0.5000

30 90 150 210 270 330 390 450 510 570 630 690 750 810 870 Absorbanca (A405nm)

Čas [s]

Slepi vzorec

Celokupna AChE

Vodotopna AChE

- 14 - b) reakcija po dodatku 1 mM AChCl

Po dodatku 1mM substrata AChCl izmerjene vrednosti absorbance, v primerjavi z vrednostmi pri endogeni reakciji za celokupno in vodotopno AChE, bolj strmo naraščajo.

Pri slepem vzorcu ob dodatku substrata ne opažamo večjih sprememb. (Slika 3)

Slika 3: Vrednosti absorbance v odvisnosti od časa ob dodatku 1mM AChCl 0.0000

0.0500 0.1000 0.1500 0.2000 0.2500 0.3000 0.3500 0.4000 0.4500 0.5000

30 120 210 300 390 480 570 660 750 840 930 1020 1110 1200 1290 1380 1470 1560 1650 1740

Absorbanca (A405nm)

Čas[s]

Slepi vzorec

Celokupna AChE

Vodotopna AChE

- 15 -

4.2. VPLIV RAZLIČNIH KONCENTRACIJ SUBSTRATA

Meritve smo izvedli še z različnimi koncentracijami substrata: 0, 1, 3 in 5 mM. Tako pri vzorcih z vodotopno AChE (slika 4) kot celokupno AChE (slika 5) smo opazili, da višje kot so koncentracije dodanega substrata, višje so spremembe vrednosti absorbance (večji je naklon krivulje).

Slika 4: Vrednosti absorbance za vodotopno AChE pri dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl

Slika 5: Vrednosti absorbance za celokupno AChE pri dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl 0.2000

0.2500 0.3000 0.3500 0.4000 0.4500 0.5000

30 150 270 390 510 630 750 870 990 1110 1230 1350 1470 1590 1710 1830 1950 2070 2190 2310

Absorbanca (A405nm)

Čas [s]

0mM 1mM 3mM 5mM

0.2000 0.2500 0.3000 0.3500 0.4000 0.4500 0.5000

30 150 270 390 510 630 750 870 990 1110 1230 1350 1470 1590 1710 1830 1950 2070 2190 2310

Absorbanca (A405nm)

Čas [s]

0mM 1mM 3mM 5mM

- 16 -

Vrednosti absorbance ob dodatku 1, 3 in 5 mM AChCl linearno naraščajo; izjema so vzorci, kjer substrata nismo dodali – tam se vrednosti ne spreminjajo oz. nekoliko padajo.

Specifična aktivnost vodotopne AChE (slika 6) se ob dodatku 1 mM AChCl ne razlikuje od specifične aktivnosti encima, kjer substrata nismo dodali oz. se celo nekoliko zniža v primeru celokupne AChE (slika 7). Specifična aktivnost vodotopne AChE narašča z naraščajočo koncentracijo dodanega substrata (slika 6). Enako velja za vzorec celokupne AChE (slika 7). Specifični aktivnosti vodotopne in celokupne AChE sta primerljivi.

Slika 6: Specifična aktivnost vodotopne AChE ob dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl. Prikazana je povprečna vrednost treh meritev in ustrezajoča standardna deviacija

Slika 7: Specifična aktivnost celokupne AChE ob dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl. Prikazana je povprečna vrednost treh meritev in ustrezajoča standardna deviacija

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

0 1 3 5

Specifična aktivnost encima [nmol/mg*min]

Koncentracija AChCl [mM]

Aktivnost encima

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

0 1 3 5

Specfična aktivnost encima [nmol/mg*min]

Koncentracija AChCl [mM]

Aktivnost encima

- 17 -

4.3. VPLIV INHIBITORJEV NA AKTIVNOST

Meritve smo izvedli še z dodatkom inhibitorjev različnih koncentracij, z 1 mM AChCl, da bi ugotovili, ali ti zavirajo delovanje encima. Izmerjene vrednosti absorbance za vodotopno AChE (slika 8) in celokupno AChE (slika 9), ob dodatku eserina in neostigmin bromida kažejo, da inhibitorja s koncentracijo 0.01 in 0.1 mM, ne zavirata njegovega delovanja.

Slika 8: Vrednosti absorbance vodotopne AChE ob dodatku inhibitorjev eserina in neostigmin bromida

Slika 9: Vrednosti absorbance celokupne AChE ob dodatku inhibitorjev eserina in neostigmin bromida

0.1500 0.2000 0.2500 0.3000 0.3500 0.4000 0.4500 0.5000

30 180 330 480 630 780 930 1080 1230 1380 1530 1680 1830 1980 2130 2280

Absorbanca [A405nm]

Čas [s]

0.1 mM eserin

0.01 mM eserin

0.1 mM neostigmin bromid

0.01 mM neostigmin bromid

Vzorec brez inhibitorjev

0.1500 0.2000 0.2500 0.3000 0.3500 0.4000 0.4500 0.5000

30 180 330 480 630 780 930 1080 1230 1380 1530 1680 1830 1980 2130 2280

Absorbanca [A405nm]

Čas [s]

0.1 mM eserin

0.01 mM eserin

0.1 mM neostigmin bromid

0.01 mM

neostigmin bromid Vzorec brez inhibitorjev

- 18 -

Tudi ob dodatku inhibitorja poli APS vrednosti absorbance pri vodotopni AChE (slika 10) in celokupni AChE (slika 11) kažejo na to, da poli APS pri nobeni izmed uporabljenih koncentracij, ne inhibira delovanja encima.

Slika 10: Vrednosti absorbance vodotopne AChE ob dodatku inhibitorja poli APS

Slika 11: Vrednosti absorbance celokupne AChE ob dodatku inhibitorja poli APS 0.1500

0.2000 0.2500 0.3000 0.3500 0.4000 0.4500 0.5000

30 150 270 390 510 630 750 870 990 1110 1230 1350 1470 1590 1710 1830 1950 2070 2190 2310

Absorbanca [A405nm]

Čas [s]

10 ug/mL 1 ug/mL 0.1 ug/mL 0 ug/mL

0.1500 0.2000 0.2500 0.3000 0.3500 0.4000 0.4500 0.5000

30 150 270 390 510 630 750 870 990 1110 1230 1350 1470 1590 1710 1830 1950 2070 2190 2310

Absorbanca [A405nm]

Čas [s]

10 ug/mL 1 ug/mL 0.1 ug/mL 0 ug/mL

- 19 -

5. RAZPRAVA

V diplomskem delu smo proučevali aktivnost encima AChE v vzorcu gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus), ob dodatku različnih koncentracij substrata AChCl in različnih inhibitorjev. Zanimalo nas je, kako na aktivnost encima vpliva koncentracija uporabljenega substrata ter v kolikšni meri različni inhibitorji zavirajo delovanje encima.

V skladu s podatki iz literature in opravljenih meritev smo prišli do naslednjih ugotovitev.

5.1. AKTIVNOST ENCIMA ACETILHOLINESTERAZE V GOBAH a) Endogena reakcija

Vrednosti absorbance v vzorcih so višje od tistih pri slepem vzorcu, saj endogena reakcija nakazuje, da so v vzorcu prisotne SH skupine, ki jih ima veliko proteinov.

b) Reakcija po dodatku 1mM AChCl

Po dodatku 1 mM substrata AChCl so vrednosti absorbance v vzorcih bolj strmo naraščale, kar pomeni, da se v vzorcu nahaja encim, ki je povzročil razgradnjo substrata. Sklepamo, da smo pomerili encim AChE.

5.2. VPLIV RAZLIČNIH KONCENTRACIJ SUBSTRATA

Ob povišanih koncentracijah substrata, spremembe absorbance linearno naraščajo, kar pomeni, da na aktivnost encima vpliva koncentracija dodanega substrata. Izmerjene koncentracije so zelo nizke oziroma komaj zaznavne v primerjavi z drugimi organizmi, npr.

1000x manjše od AChE v glavah čebel (Boily in sod., 2013).

Predlagamo nadaljevanje študije z uporabo drugih analognih substratov, kot sta propionilholin klorid in butirilholin klorid.

5.3. VPLIV INHIBITORJEV NA AKTIVNOST

Zanimalo nas je, ali se v našem vzorcu res nahaja encim AChE, zato smo vzorcem dodali inhibitorje eserin, neostigmin bromid in poli APS, ki so specifični inhibitorji tega encima (Houghton in sod., 2006). Za kontrolo smo vzeli vzorec brez dodanega inhibitorja, z 1 mM koncentracijo substrata AChCl. Vrednosti kontrolnega vzorca in vzorcev AChE z dodanimi inhibitorji, se ne razlikujejo, vrednosti absorbance pa se kljub dodatku inhibitorjev povečujejo, kar pomeni, da se substrat porablja. Predvidevamo, da nobeden od inhibitorjev ne zavira delovanja encima pri 1 mM koncentraciji AChCl. Predlagamo

- 20 -

nadaljnje študije z večjimi koncentracijami AChCl, kjer bo osnovna aktivnost AChE večja in bo tako možno spremljati inhibicijo encima z dodanimi inhibitorji.

Delovanje ChE pri vretenčarjih je sicer zavrto pri koncentracijah 10 m fizostigmina (Usdin in Karczmar, 1970), kar ustreza najnižji koncentraciji eserina, ki smo ga uporabili – 0.01 mM, a ta ne velja za inhibicijo AChE v glivah. Poskusili smo tudi z višjo koncentracijo, a ta ni povzročila inhibicije encima. Encimu AChE, izoliranem iz govejih eritrocitov, se ob dodatku različnih koncentracij eserina pri 1 mM koncentraciji substrata, aktivnost ravno tako ni bistveno spremenila (Winteringham in Fowler, 1966), kar pomeni, da eserin na to vrsto AChE ne deluje zaviralno.

Grandič in sod. (2012) navajajo, da pri nizkih koncentracijah neostigmina (1 m), uporabljenega na vzorcu mladih miši, ta ni popolnoma inhibiral AChE aktivnosti. Čeprav smo v našem vzorcu uporabili višje koncentracije neostigmina (0.01 ter 0.1 mM), ta ni inhibiral aktivnosti AChE.

Inhibitor APS 12-2 je sintetičen polimer z molsko maso 14.7 kDa, ki je strukturno analogen naravnemu polimeru poli APS in na aktivnost encima AChE vpliva že v nanomolarnih koncentracijah preko delovanja na periferno anionsko mesto (Sepčič in sod., 1998). Tudi ob uporabi tega inhibitorja nismo opazili inhibicije encimske aktivnosti v naših ekstraktih.

- 21 -

6. SKLEPI

V vzorcu bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) je mogoče zaznati aktivnost encima acetilholinesteraze, če kot substrat uporabimo acetiltioholin klorid.

Aktivnost encima je odvisna od koncentracije substrata acetiltioholin klorida. Pri višjih koncentracijah je aktivnost encima višja.

Inhibitorji eserin, neostigmin bromid in poli APS pri 1 mM koncentraciji dodanega substrata acetiltioholin klorida, ne zavirajo aktivnosti encima, ker je aktivnost pri tej koncentraciji substrata že v osnovi zelo nizka.

- 22 -

7. POVZETEK

Acetilholinesteraza (AChE) je encim, ki na postsinaptični membrani razgradi acetilholin (ACh) in s tem prekine prenos živčnega signala. Encim se nahaja v holinergičnih sinapsah, prisotnost ACh pa so dokazali tudi v tkivih, ki niso povezana z živčnim sistemom. Šibka sinteza ACh je bila zaznana tudi v vzorcih gliv iz debla Basidiomycota, a je zaradi odsotnosti živčnih sinaps v gobah pričakovati, da ti organizmi nimajo encima AChE.

Zanimalo nas je, ali je v vodnem ekstraktu gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) mogoče zaznati aktivnost AChE, če kot substrat uporabimo acetiltioholin klorid (AChCl). Z dodatkom različnih koncentracij substrata in različnih inhibitorjev, smo želeli proučiti, v kolikšni meri ti vplivajo na aktivnost encima.

Delo je potekalo v laboratoriju na Katedri za biokemijo na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete v Ljubljani. S spektrofotometrično metodo po Ellmanu smo proučevali aktivnost AChE, pri čemer smo opravili meritve absorbance pri 405 nm ter iz dobljenih vrednosti izračunali aktivnost encima. Pomerili smo tudi koncentracijo proteinov v vzorcih.

Uspeli smo dokazati aktivnost encima AChE v vzorcih bukovega ostrigarja. Aktivnost je lineano naraščala s povečevanjem koncentracije substrata AChCl. Pri koncentraciji 1 mM AChCl inhibitorji eserin, neostigmin bromid in poli APS ne zavirajo aktivnosti encima.

Predlagamo nadaljnje študije z drugimi substrati, ki vsebujejo tioholin ter študije inhibicije encima pri višjih koncentracijah substrata acetiltioholin klorida.

Ključne besede: bukov ostrigar, Pleurotus ostreatus, acetilholinesteraza, inhibicija

- 23 -

8. VIRI IN LITERATURA VSEBINE

Berg, J.M., Tyzmoczko, J.L., &Stryer, L. (2002). Biochemistry. New York: W.H. Freeman.

Bhadauria V., Zhao W.S., Wang L.X., Zhang Y., Liu J.H., Yang J., Kong L.A., Peng Y.L. (2007).

Advances in fungal proteomics. Microbiological Research, 162, 93–200. doi:

10.1016/j.micres.2007.03.001

Boily, M., Sarrasin, B., Deblois, C., Aras, P., Chagnon, M. (2013). Acetycholinesterase in honey bees (Apis mellifera) exposed to neonicotinoids, atrazine and glyphosate:

laboratoy and field experiments. Environ. Sci. Pollur. Res. Int. 20(8), 5603-5614.

doi: 10.1007/s11356-013-1568-2

Burns, Richard G., DeForest, Jared L., Marxsen, Jürgen, Sinsabaugh, Robert L., Stromberger, MaryE., Wallenstein, Matthew D., Weintraub, Michael N., Zoppini, Annamaria (2013). Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry, 58, 216–234.

Downes, G.B, Granto, M. (2004). Acetylcholinesterase function is dispensable for sensary neurite growth but is critical for neuromuscular synapse stability. Dev Bio. 270, 232 – 245.

Eger, G., Eden, G. & Wissig, E. (1976). Pleurotus ostreatus – breeding potential of a new cultivated mushroom. Theoretical and Applied Genetics, 47, 155–163.

Ellman, L.G., Courtney, K.D., Andres Jr., V., Featherstone, R.M. (1961). A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology, 7(2), 88–95.

Giardina, P., Fontanella, B., Rivieccio, V., Sannia, G. (2000). Manganase peroxidase isoenzymes produced by Pleurotus ostreatus grown on wood sawdust. Archives of Biochemistry and Biophyics, 376, 171-179.

Grandič, M., Araoz, R., Molgo, J., Turk, T., Sepčić, K., Benoit,. E, Frangež, R. (2013). Toxicity of the synthetic polymeric 3- alkylpyridinium salt (APS3) is due to specific block of nicotinic acetylcholine receptors. Toxicology. 303, 25-33.

Harel, M., Sussman, J.L., Krejci, E. (1992). Conversion of acetylcholinesterase to butyrylcholinesterase: modeling and mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (22), 10827–10831.

Horiuchi, Y., Kimura, R., Kato, N., Fujii, T., Seki, M., Endo, T.,Kato, T., Kawashima, K.

(2003). Evolutional study on acetylcholine expression. Life Sciences. 72, 1745–

1756.

- 24 -

Houghton, J. P., Ren, Y., Howes, J. M. (2006). Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi. Natural product reports, 23(2), 181-199.

Karczmar,G. A. (2010). Cholinesterases (ChEs) and the cholinergic system in ontogenesis and phylogenesis, and non-classical roles of cholinesterases—A review. Chemico- Biological Interactions, 187(1-3),34-43.

Kirk P., Cannon P., Minter D., Stalpers J. (2010). Dictionary of the fungi. 10. izdaja. Oxon.

CABI

Massoulié, J., Pezzementi, L., Bon, S., Krejci, E., Vallette, F.M. (1993). Molecular and cellular biology of cholinesterase. Prog. Neurobiol. 41, 31–91.

Mikhailova, R.V., Lobanok, A.G., Zakharenko, I.N. (1996). Specific esterases of Aspergillus and Fusarium Fungi. Applied Biochemistry and Microbiology, 33(5), 437-440.

Nakamura, T., Ikedia, T., Shimokaura, I. (1994). Distribution of acetylcholinesterase actively in the rat embryonic heart with reference to HNK 1 immunoreactivity in the conduction tissue. Anat Embryol. 190, 367 –373.

Nelson, D. L., Lehninger, A. L., & Cox, M. M. (2008). Lehninger principles of biochemistry.

New York: W. H. Freeman.

Rebolj, K., Sepčić, K. (2008). Ostreolysin, a Cytolytic Protein from Culinary-Medicinal Oyster Mushroom Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) P.Kumm. (Agaricomycetideae), and Its Potential Use in Medicine and Biotechnology. International Journal of Medicinal Mushrooms, 4, 293-302.

Robaire, B., Kato, G. (1973). Some differences between soluble and membrane-bound acetycholinesterase from Electrophorus electricus. Febs letters. 38(1), 1-4.

Rosenberry, T.L. (1975). Acetylcholinesterase. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 43, 103–

218.

Roshchina, V.V. (2016). New trends and perspectives in the evolution of neurotransmitters in microbial, plant, and animal cells. Microbial Endocrinology:

Interkingdom Signaling in Infectious Disease and Health, Advances in Experimental Medicine and Biology, 874, 25-77. doi: 10.1007/978-3-319-20215-0_2

Sepčić, K., Marcel, V., Klaebe, A., Turk, T., Šuput, D., Fournier, D. (1998). Inhibition of acetylcholinesterase by an alkylpyridinium polymer from the marine sponge, Reniera sarai. Biochim Biophys Acta. 1387, 217-225.

Silman, I., Futerman, A.H. (1987). Modes of attachment of acetylcholinesterase to the surface membrane. Eur J Biochem. 170. 11–22.

Soreq, H., Seidman, S. (2001). Acetylcholinesterase – new roles for an old actor. Nat Rev Neurosci. 2, 294 -302.

- 25 -

Stamets, E. P. (2005). Notes on nutritional properites of culinary - medicinal mushrooms.

International journal of medicinal mushrooms, 7(1-2), 103-110.

doi: 10.1615/IntJMedMushr.v7.i12.100

Stojan, J., Stojan, R., Stojan, Ž. (2008). Holin-esteraze:struktura, delovanje ter inhibicija z naravnimi in sintetičnimi strupi. Med razgl. 47, 293-307.

Sussman, J.L. , Dvir, H., Silman, I., Harel, M., Rosenberry, L. T. (2010). Acetycholinesterase:

From 3D structure to function. Chem Biol Interact. 187(1-3), 10-22. doi:

10.1016/j.cbi.2010.01.042

Tehrani, M.H.H., Elham, F., Nejad, M.H.K., Mehregan, H., Hakemi-Valac, M. (2012).

Search for Proteins in the Liquid Extract of Edible Mushroom, Agaricus bisporus, and Studying their Antibacterial Effects. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 11 (1), 145-150.

Turk, T., Sepčić, K., Mancini, I., Guella, G. (2008). 3-Alkylpyridinium and 3-alkylpyridine compounds from marine sponges, their synthesis, biological activites and potential use. Atta-ur-Rahman, Studies in natural product Chemistry; Bioactive natural products (Part O), Studies in natural products chemistry. 35, 355-397.

Usdin, E., Karczmar, A.G. (1970). Anticholinesterase Agents. Oxford: Pergamon Press. 61 Winteringham, F.P.W., Fowler, K.S. (1966). Substrate and dilution effects on the inhibition

of acetylcholinesterase by carbamates. Biochem. J. 101, 127-135.

9. VIRI SLIK

3D structure AChE. (n.d.). Retrieved August 18, 2016, from

http://annalsofneurosciences.org/journal/index.php/annal/article/viewArticle/95/

200#F1

Najprej bi se rada zahvalila moji mentorici doc. dr. Aniti Jemec, ki me je usmerjala tako pri laboratorijskem delu, kot pri pisanju diplomskega dela. Hvala za vso pomoč, napotke in nasvete.

Zahvala gre tudi Alenki Malovrh, ki mi je bila v veliko pomoč pri laboratorijskem delu.

Posebna zahvala pa gre tudi mojemu fantu in domačim, ki so mi ves čas stali ob strani in me spodbujali v času študija.