IZOLACIJA IN LASTNOSTI REKOMBINANTNIH PROTEINOV ERILIZINA B IN PLEUROTOLIZINA B, PRIPRAVLJENIH V KVASOVKI Pichia pastoris

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE

Larisa Lara POPOŠEK

IZOLACIJA IN LASTNOSTI REKOMBINANTNIH PROTEINOV ERILIZINA B IN PLEUROTOLIZINA

B, PRIPRAVLJENIH V KVASOVKI Pichia pastoris

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE

Larisa Lara POPOŠEK

IZOLACIJA IN LASTNOSTI REKOMBINANTNIH PROTEINOV ERILIZINA B IN PLEUROTOLIZINA B, PRIPRAVLJENIH V

KVASOVKI Pichia pastoris MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT PROTEINS ERYLYSIN B AND PLEUROTOLYSIN B, PRODUCED

IN YEAST Pichia pastoris M. SC. THESIS

Master Study Programmes: Field Microbiology

Ljubljana, 2021

(3)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. II Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Mikrobiologija.

Delo je bilo opravljeno na Katedri za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov ter na Katedri za biokemijo Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorja magistrske naloge imenovala doc. dr.

Mateja Skočaja, za somentorico dr. Majo Grundner in recenzentko prof. dr. Kristino Sepčić.

Mentor: doc. dr. Matej SKOČAJ Somentorica: dr. Maja GRUNDNER Recenzentka: prof. dr. Kristina SEPČIĆ

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: izr. prof. dr. Matej BUTALA

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: doc. dr. Matej SKOČAJ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Član: dr. Maja GRUNDNER

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Kristina SEPČIĆ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Datum zagovora:

Larisa Lara Popošek

(4)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. III Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Du2

DK UDK 577.112:582.28(043)=163.6

KG rekombinantni proteini, proteini z domeno MACPF, erilizin B, pleurotolizin B, izolacija, kvasovke, Pichia pastoris

AV POPOŠEK, Larisa Lara, dipl. mikrobiol. (UN)

SA SKOČAJ, Matej (mentor), GRUNDNER, Maja (somentorica), SEPČIĆ, Kristina (recenzentka)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije LI 2021

IN IZOLACIJA IN LASTNOSTI REKOMBINANTNIH PROTEINOV ERILIZINA B IN PLEUROTOLIZINA B, PRIPRAVLJENIH V KVASOVKI Pichia pastoris TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija)

OP XII, 65 str., 25 pregl., 21 sl., 6 pril., 82 vir.

IJ SL JI sl/en

AI Proteina erilizin B (EryB) in pleurotolizin B (PlyB) sta 59 kDa velika proteina iz proteinske družine kompleksa, ki napade membrano/perforina (MACPF). Erilizin B je protein iz užitne gobe kraljevi ostrigar (Pleurotus eryngii), pleurotolizin B pa iz užitne gobe bukov ostrigar (P. ostreatus). V kombinaciji z egerolizinskim proteinskim partnerjem tvorita multimerne bikomponentne transmembranske pore v membranah, ki vsebujejo specifične lipidne receptorje, kar vodi v lizo tarčnih celic.

Te proteine lahko rekombinantno izražamo v bakteriji Escherichia coli, vendar se proteina ne zvijata pravilno in se skoncentrirata v inkluzijskih telescih, zaradi česar je potrebna izolacija telesc in dodatno zvijanje proteina. Proteina EryB in PlyB smo zato želeli izražati v kvasovki Pichia pastoris ob uporabi konstitutivno izraženega promotorja GAP in z uporabo ekspresijskega vektorja pGAPZαA. Pričakovali smo, da se bosta proteina izražala v topni obliki in ju bomo na koncu lahko izolirali v višjih koncentracijah. Izražanje obeh proteinov smo preverjali z različnimi metodami.

Spremljali smo hitrost rasti kvasovke P. pastoris in proteina skušali zaznati s poliakrilamidno gelsko elektroforezo ter s prenosom western, vendar proteinov nismo zaznali. Erilizin B in PlyB sta v kombinaciji z egerolizinskim partnerjem ostreolizinom A6 hemolitična, zato smo njuno prisotnost v gojišču preverili tudi s testom hemolize, vendar do lize eritrocitov ni prišlo. Na podlagi vseh rezultatov zato sklepamo, da kvasovka P. pastoris z ekspresijskim vektorjem pGAPZαA ni primeren ekspresijski sistem za pridobivanje rekombinantnih proteinov EryB in PlyB.

(5)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. IV Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Du2

DC UDK 577.112:582.28(043)=163.6

CX recombinant proteins, MACPF proteins, erylysin B, pleurotolysin B, isolation, yeasts, Pichia pastoris

AU POPOŠEK, Larisa Lara, dipl. mikrobiol. (UN)

AA SKOČAJ, Matej (supervisor), GRUNDNER, Maja (co-advisor), SEPČIĆ, Kristina (reviewer)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study in Microbiology PY 2021

TI ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT PROTEINS ERYLYSIN B AND PLEUROTOLYSIN B, PRODUCED IN YEAST Pichia pastoris

DT M. SC. Thesis (Master Study Programmes: Field Microbiology) NO XII, 65 p., 25 tab., 21 fig., 6 ann., 82 ref.

LA sl AL sl/en

AB Proteins erylysin B (EryB) from king oyster mushroom (Pleurotus eryngii) and pleurotolysin B (PlyB) from oyster mushroom (P. ostreatus) are 59 kDa proteins belonging to MACPF protein superfamily. The combination of these proteins and an appropriate aegerolysin protein partner forms bi-component multimeric transmembrane pore in membranes with specific lipid receptors. Erylysin B and PlyB can be expressed recombinantly in bacteria Escherichia coli, but they do not fold properly and are found in inclusion bodies. Therefore, the inclusion bodies need to be isolated and the proteins refolded to gain active proteins. The goal of our research was to express soluble EryB and PlyB in the yeast Pichia pastoris in higher concentrations. We monitored the expression of recombinant proteins EryB and PlyB with several tests, including gel electrophoresis and Western blot. Erylysin B and PlyB are lytic in the presence of aegerolysin protein partner ostreolysin A6, therefore the presence of proteins in the media was tested by monitoring the hemolysis.The lysis of erythrocytes did not occur, so we concluded that the yeast P. pastoris in the combination with pGAPZαA expression vector is not a suitable expression system for the production of recombinant EryB and PlyB.

(6)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. V Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III

KEY WORDS DOCUMENTATION IV

KAZALO VSEBINE V

KAZALO SLIK VIII

KAZALO PREGLEDNIC IX

KAZALO PRILOG X

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XI

1 UVOD 1

1.1 NAMENDELA 1

1.2 DELOVNIHIPOTEZI 2

2 PREGLED OBJAV 3

2.1 POROTVORNIGLIVNIPROTEINI 3

2.2 SUPERDRUŽINAPROTEINOVZDOMENOMACPF 3

2.3 EGEROLIZINI 4

2.3.1 Bukov ostrigar (Pleurotus ostreatus) 4

2.3.2 Kraljevi ostrigar (Pleurotus eryngii) 5

2.4 NASTANEKPORE 6

2.5 CELIČNEMEMBRANEINLIPIDNIRAFTI 8

2.6 BIOLOŠKAVLOGAEGEROLIZINOV 8

2.7 BIOTEHNOLOŠKEAPLIKACIJEEGEROLIZINOV 9

2.7.1 Detekcija lipidnih raftov 9

2.7.2 Označevanje lipidov in uporaba citolitičnih kompleksov pri organizmih, ki

vsebujejo CPE 9

2.7.3 Zatiranje škodljivcev in uporaba biopesticidov 9

2.7.4 Zatiranje tumorskih celic 10

2.8 KVASOVKAPICHIA PASTORIS 10

2.8.1 Pot uporabe metanola 11

2.8.2 Pichia pastoris kot ekspresijski sistem 11

2.8.3 Promotorji 13

2.8.4 Sevi 14

2.8.5 Ekspresijski vektorji in selekcijski označevalci 15

2.8.6 Zeocin 15

2.8.7 Ekspresijski plazmidni vektor pGAPZαA 15

2.8.8 Integracija vektorja pGAPZαA z vnesenim fragmentom v genom kvasovke

Pichia pastoris 16

2.8.9 Sekretorno izražanje rekombinantnih proteinov 18

3 MATERIAL IN METODE 19

3.1 MATERIAL 19

(7)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. VI Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

3.1.1 Laboratorijska oprema in aparature 19

3.1.2 Kemikalije in komercialni pufri 20

3.1.3 Raztopine, pufri in gojišča 21

3.1.4 Uporabljeni komercialni kompleti reagentov 22

3.1.5 Encimi in antibiotiki 22

3.1.6 Raztopljeni antibiotiki 23

3.1.7 Plazmidni vektorji 23

3.1.8 Začetni oligonukleotidi 23

3.1.9 Genski zapisi 23

3.1.10 Protitelesa 23

3.1.11 Mikroorganizmi 24

3.2 METODE 24

3.2.1 Oblikovanje zaporedij za izražanje rekombinantnih EryB in PlyB 24

3.2.2 Priprava ekspresijskega vektorja pGAPZαA 24

3.2.2.1 Transformacija in namnoževanje vektorja pGAPZαA v E. coli DH5α 24

3.2.2.2 Izolacija plazmidnega vektorja pGAPZαA 25

3.2.2.3 Rezanje plazmidnega vektorja pGAPZαA 25

3.2.2.4 Agarozna gelska elektroforeza 26

3.2.2.5 Čiščenje rezanega plazmida pGAPZAαA 26

3.2.3 Priprava zaporedij za eryB in plyB 26

3.2.3.1 Transformacija in namnoževanje plazmida pUC57, ki vsebuje zapis za sintezo eryB

in plyB v bakeriji E. coli DH5α 26

3.2.3.2 Izolacija plazmidov pUC57 +eryB in pUC57 + plyB 27 3.2.3.3 Priprava trajnikov plazmidov pUC57 +eryB in pUC57 + plyB 27 3.2.3.4 Rezanje zaporedij za eryB in plyB iz plazmidov pUC57 +eryB in pUC57 + plyB 27

3.2.3.5 Agarozna gelska elektroforeza 27

3.2.3.6 Čiščenje rezanih fragmentov z zapisom za EryB in PlyB 27 3.2.4 Priprava konstruktov pGAPZαA + eryB in pGAPZαA + plyB 27 3.2.4.1 Ligacija rezanega plazmida pGAPZαA in rezanih fragmentov eryB in plyB 27

3.2.5 Transformacija konstrukta v E. coli DH5α 28

3.2.6 Izolacija rekombinantnih plazmidov, kontrolna restrikcija in sekveniranje 29 3.2.7 Priprava ekspresijskega sistema za izražanje proteinov EryB in PlyB 29

3.2.7.1 Priprava kvasovke Pichia pastoris 29

3.2.8 Rezanje konstruktov pGAPZαA + eryB, pGAPZαA + plyB in pGAPZαA 29

3.2.9 Elektroporacija kvasovke P. pastoris 29

3.2.10 Preverjanje vnosa konstruktov v kvasovko Pichia pastoris s pomočjo metode

PCR 30

3.2.11 Izražanje proteinov EryB in PlyB 34

3.2.12 Izolacija rekombinantnih EryB in PlyB z nikelj-afinitetno kromatografijo 35 3.2.13 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS (NaDS-PAGE) in

prenos western 35

(8)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. VII Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

3.2.14 Hemolitični test 37

3.2.15 Bioinformatska analiza 37

4 REZULTATI 38

4.1 NAČRTOVANJE NUKLEOTIDNIH ZAPOREDIJ ZA REKOMBINANTNA

PROTEINAERILIZINBINPLUROTOLIZINB 38

4.2 PRIPRAVAREKOBINANTNIHKONSTRUKTOV 38

4.2.1 Izolacija in restrikcija plazmidov pUC57 + eryB in pUC57 + plyB 38 4.2.2 Izolacija in restrikcija plazmida pGAPZαA 38 4.2.3 Ligacija rezanega plazmida pGAPZαA in rezanih fragmentov eryB in plyB 39 4.2.4 Transformacija rekombinantnih vektorjev pGAPZαA + eryB in pGAPZαA +

plyB v E. coli DH5α 39

4.3 PRIPRAVAEKSPRESIJSKIHSISTEMOV 40

4.3.1 Priprava in transformacija kvasovke P. Pastoris s konstrukti pGAPZαA + eryB,

pGAPZαA + plyB in pGAPZαA 40

4.3.2 Integracija konstruktov pGAPZαA + eryB, pGAPZαA + plyB in pGAPZαA 42

4.4 VERIŽNAREAKCIJASPOLIMERAZO 42

4.4.1 Sestavljanje začetnih oligonukleotidov in genotipizacija s pomočjo verižne

reakcije s polimerazo 42

4.5 IZRAŽANJEPROTEINOVERYBINPLYB 44

4.6 SPREMLJANJEIZRAŽANJAREKOMBINANTNIHPROTEINOV 45

4.6.1 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata 45 4.6.2 Analiza izražanja proteinov s prenosom western 47

4.6.3 Hemolitična aktivnost 47

4.6.4 Bioinformatska analiza 48

5 RAZPRAVA 49

6 SKLEPI 55

7 POVZETEK 56

8 VIRI 58

ZAHVALA PRILOGE

(9)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. VIII Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

KAZALO SLIK

Slika 1. Kristalna struktura komponent citolitičnega kompleksa PlyA/PlyB (Lukoyanova in

sod., 2015). 7

Slika 2. Shematski prikaz nastanka transmembranske pore (Lukoyanova in sod., 2015). 7 Slika 3. Uporaba metanola kot vira ogljika v P. pastoris (Juturu in Wu., 2018). 11 Slika 4: Plazmidna mapa vektorja pGAPZα A (Invitrogen, 2010). 16 Slika 5: Slika homologne rekombinacije (Invitrogen, 2010). 17 Slika 6: Integracija več zaporednih konstruktov v genom kvasovke Pichia pastoris

(Invitrogen, 2010). 17

Slika 7: Shematski prikaz sekretorne poti izločanja proteinov iz kvasovke P. pastoris

(Delic in sod., 2013). 18

Slika 8: Domenska struktura pričakovanih genov EryB in PlyB. 24 Slika 9: Shematski prikaz PCR konstrukta pGAPZαA v genomu kvasovke. 32 Slika 10: Shematski prikaz PCR konstrukta pGAPZαA+EryB/ pGAPZαA+PlyB v genomu

kvasovke. 32

Slika 11: Shematski prikaz stičnega PCR. 34

Slika 12: Shema poteka verižnih reakcij s polimerazo. 34

Slika 13: Restrikcija plazmidov pUC57 + eryB in pUC57 + plyB in pGAPZαA. 39 Slika 14. Kontrolna restrikcija rekombinantnih vektorjev pGAPZαA +eryB in pGAPZαA +

plyB. 40

Slika 15: Restrikcija rekombinantnih plazmidov z encimom BspHI. 41 Slika 16: Zaznavanje rekombinantnih kolonij z standardnim PCR. 43 Slika 17: Stični PCR za preverjanje iskanih rekombinanntih kolonij. 44

Slika 18: Rastne krivulje P. pastoris seva GS115. 45

Slika 19: Poliakrilamidna gelska elektroforeza rekombinantnih proteinov. 46 Slika 20: Membrana PVDF po prenosu rekombinantnih proteinov. 47

Slika 21: Hemolitični test. 48

(10)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. IX Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Egerolizini in njihovi proteinski partnerji z domeno MACPF izolirani iz gliv ter njihovi lipidni receptorji (+, vezava na lipidno tarčo; n.d., ni določeno). 6 Preglednica 2: Primerjava ekspresijskih sistemov bakterije in kvasovke. 13 Preglednica 3: Najpogosteje uporabljeni promotorji P. pastoris. 14 Preglednica 4: Gostiteljski sevi P. pastoris (prirejeno po Batt, 2014). 15 Preglednica 5: Seznam uporabljene laboratorijske opreme in aparatur. 19 Preglednica 6: Seznam uporabljenih kemikalij in komercialnih pufrov. 20 Preglednica 7: Seznam uporabljenih raztopin, pufrov in gojišč in njihova sestava. 21 Preglednica 8: Seznam uporabljenih komercialnih kompletov. 22 Preglednica 9: Seznam uporabljenih encimov in antibiotikov. 22 Preglednica 10: Koncentracija shranjenih raztopljenih antibiotikov in njihove delovne

koncentracije. 23

Preglednica 11: Seznam uporabljenih plazmidnih vektorjev. 23 Preglednica 12: Seznam uporabljenih začetnih oligonukleotidov. 23

Preglednica 13: Seznam uporabljenih genov. 23

Preglednica 14: Seznam uporabljenih protiteles. 23

Preglednica 15: Seznam uporabljenih bakterijskih in kvasnih sevov. 24

Preglednica 16: Sestava restrikcijske mešanice. 26

Preglednica 17: Sestava ligacijske mešanice. 28

Preglednica 18: Reagenti za verižno reakcijo s polimerazo. 31 Preglednica 19: Pogoji za pomnoževanje zaporedij z DreamTaq polimerazo. 31

Preglednica 20: Reagenti za PCR. 33

Preglednica 21: Pogoji za pomnoževanje zaporedij z DreamTaq polimerazo z PCR. 33 Preglednica 22: Sestava ločevalnega in nanašalnega gela za NaDS-PAGE. 36 Preglednica 23: Število transformant na selektivnem gojišču YPD z dodanim zeocinom. 42 Preglednica 24: Število pozitivnih klonov po stičnem PCR. 44 Preglednica 25: Načrt hemolitične ploščice in rezultati hemolize. 48

(11)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. X Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

KAZALO PRILOG

Priloga A: Nukleotidno zaporedje fragmenta ERYB, optimizirano za kvasovko Pichia pastoris, z označenimi restrikcijskimi mesti

Priloga B: Aminokislinsko zaporedje zrelega rekombinantenga proteina EryB

Priloga C: Nukleotidno zaporedje fragmenta PLYB, optimiziranega za kvasovko Pichia pastoris, z označenima restrikcijskima mestoma

Priloga D: Aminokislinko zaporedje zrelega rekombinantnega proteina PlyB Priloga E: 1 kb lestvica (Thermo Fisher Scientific)

Priloga F: Proteinska lestvica (PageRuler Prestained Protein Ladder, Thermo Fisher Scientific)

(12)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. XI Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

% (m/v) masni delež

% (v/v) volumski delež

APS amonijev persulfat

Amp ampicilin

bp bazni par

BSA goveji serumski albumin (ang. Bovine Serum Albumine)

CPE ceramid fosfoetanolamin (ang. Ceramide Phosphoethanolamine) C-terminalni konec karboksilni konec proteina

Da Dalton

E. coli Escherichia coli

ER endoplazemski retikulum

EryA erilizina A

EryB erilizin B

eryB gen za protein EryB

GA Golgijev aparat

His histidin

Hol holesterol

stični PCR Stična verižna reakcija s polimerazo

LB gojišče Luria Bertani

MACPF kompleks, ki napade membrano/perforin (ang., Membrane Attack Complex/PerForin)

m mili

M molarnost

MQ utra čista voda

NaDS natrijev dodecil sulfat

Ni-NTA nikelj-kelatna afinitetna kromatografska kolona N-terminalni konec aminski konec proteina

OD600 optična gostota pri valovni dolžini 600 nm (ang. Optical density) obr./min obrati na minuto

OlyA6 ostreolizin A6

K. paffi (P. pastoris) Komagatella paffi (Pichia pastoris)

PAOX1 promotor encima alkoholne oksidaze I

PGAP promotor encima gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze PCR verižna reakcija s polimerazo

PlyA pleurotolizin A

PlyA2 pleurotolizin A2

PlyB pleurotolizin B

plyB gen za protein pleurotolizin B

(13)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. XII Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

pGAPZAαA plazmidni vektor pGAPZAαA

NaDS-PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (ang. PolyacrylAmide Gel Electrophoresis in the presence of sodium dodecil sulphate)

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SM sfingomielin

TEMED N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin (ang.

TEtraMEthyleneDiamine)

YPD gojišče s kvasnim ekstraktom, peptonom in glukozo (ang. Yeast exctract-Peptone-Dextrose medium)

zeo zeocin

(14)

Popošek L. L. Izolacija … erilizina B in pleurotolizina B, pripravljenih v kvasovki Pichia pastoris. 1

Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije, 2021

1 UVOD

Proteini z domeno, ki napada membrano/perforin – MACPF (ang. membrane attack complex/perforin) so velika družina proteinov, ki jo najdemo v vseh skupinah bioloških klasifikacij, proteine iz družine egerolizinov pa najdemo predvsem med bakterijami in glivami (Butala in sod., 2017; Lukoyanova in sod., 2015). Egerolizini so proteini, ki se vežejo na membrano celice, s tem pa omogočijo vezavo MACPF proteinov, ki naredijo transmembransko poro v tarčno celico in jo tako lizirajo (Ota in sod., 2013; Shibata in sod., 2010; Tomita in sod., 2004). Glivi iz rodu ostrigarjev (Pleurotus), Pleurotus ostreatus (bukov ostrigar) in Pleurotus eryngii (kraljevi ostrigar) vsebujeta proteine iz družine egerolizino ter proteine z domeno MACPF. Bukov ostrigar proizvaja egerolizine ostreolizin A (OlyA), ostreolizin A6 (OlyA6) in pleurotolizin A (PlyA), ter protein z domeno MACPF, pleurotolizin B (PlyB) (Bernheimer in Avigard., 1979; Ota in sod., 2013; Tomita in sod., 2014). Kraljevi ostrigar proizvaja egerolizin erilizin A (EryA) in pleurotolizin A2 (PlyA2), ter protein z domeno MACPF, erilizin B (EryB) (Shibata in sod., 2010; Bhat in sod., 2013).

Biofizikalne raziskave so pokazale specifično vezavo egerolizinov OlyA, OlyA6, PlyA in PlyA2 na membranske domene, ki so obogatene s ceramid fosfatidiletanolaminom (CPE) in holesterolom. Poleg tega pa se s sicer manjšo afiniteto vežejo tudi na kombinacijo sfingomielina (SM) in holesterola (Hol) v umetnih in naravnih membranskih sistemih (Bhat in sod., 2015; Ota in sod., 2013; Panevska in sod., 2019a). Za proteina EryB in PlyB so ugotovili, da v različnih kombinacijah z egerolizini v membranah z ustrezno lipidno sestavo tvorijo transmembranske pore (Ota in sod., 2013; Panevska in sod., 2019a; Shibata in sod., 2010; Skočaj in sod., 2014).

Pleurotolizin B in EryB se trenutno pripravljata kot rekombinantna proteina v bakteriji E.

coli, a je njun donos izjemno nizek, saj se pridobivata v obliki inkluzijskih telesc in ju je posledično potrebno renaturirati. Erilizin B in PlyB smo zato poskušali izraziti v kvasovki Pichia pastoris (Komagatella paffi), kjer smo pričakovali izražanje proteinov v topni obliki, s čimer bi pridobili večje količine proteinov za nadaljnje raziskave.

1.1 NAMEN DELA

V magistrski nalogi smo želeli pripraviti in izolirati rekombinantna proteina EryB in PlyB v kvasovki P. pastors ter jima opredeliti njune biofizikalne lastnosti. Njuno aktivnost smo preverili s pomočjo hemolitičnega testa na govejih eritrocitih v kombinaciji z egerolizinom OlyA6 ali EryA.

(15)

1.2 DELOVNI HIPOTEZI

H1: Rekombinantna proteina EryB in PlyB bomo pridobili kot topna proteina, ki po izražanju v kvasovki P. pastoris ne bosta tvorila inkluzijskih telesc.

H2: Pridobljena rekombinantna proteina bosta v kombinaciji z egerolizinoma OlyA6 ali EryA tvorila porotvorne komplekse.

(16)

2 PREGLED OBJAV

2.1 POROTVORNI GLIVNI PROTEINI

Porotvorne proteine imenujemo tudi citolizini in jih v vodni raztopini najdemo v monomerni obliki. Pri tvorbi pore se monomeri povežejo v oligomere (preporni oligomeri) na membrani tarče, sprememba v njihovi konformaciji pa omogoči nastanek transmembranske pore. Med porotvornimi proteini, ki jih proizvajajo glive, poznamo eno- in dvo-komponentne citolizine (Alouf in sod., 2001; Shibata in sod., 2010). Pri prvi skupini je za tvorbo transmembranske pore potreben samo en protein. Take proteine lahko najdemo v različnih gobah, kot je npr.

citolizin iz glive Flamumulina velutipe, ki proizvaja flamutoksin, ki vpliva na tesne stike in citolizin iz glive Rhodphyllus rhodopolius, ki je kardiotoksičen (Lin in sod., 1975; Shibata in sod., 2010). Pri dvo-komponentnih citolizinih pa sta potrebni dve proteinski komponenti.

Ena izmed komponent se veže na samo membrano tarčne celice, druga pa omogoča lizo celice. Tak primer sta citolitična kompleka PlyA/PlyB iz bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) in EryA/EryB iz kraljevega ostrigarja (Pleurotus eryngii) (Shibata in sod., 2010;

Tomita in sod., 2004).

2.2 SUPERDRUŽINA PROTEINOV Z DOMENO MACPF

Proteini iz družine MACPF so del velike naddružine porotvornih proteinov, vključuje pa tudi komponento komplementa, komplement-9 in sesalske porotvorne proteine, ki delujejo kot orožja pridobljene imunosti in celičnega imunskega odziva. Proteini te skupine so molekule, ki sodelujejo tako pri napadu, kot pri obrambi same celice (Tschopp in sod., 1986;

Hadders in sod., 2007). Veliko proteinov z domeno MACPF najdemo tudi med po Gramu pozitivnimi in Gramu negativnimi bakterijami, pri čemer je večina teh še vedno slabo raziskanih (Slade in sod., 2008).

Kljub odsotnosti sekvenčne identičnosti je kristalna struktura proteinov MACPF razkrila homologijo v domeni z družino proteinov od holesterola (Hol) odvisni citolizini (ang., Cholesterol-Dependent Cytolysins, CDC) (Hadders in sod., 2007). Ta strukturna podobnost se navezuje na ključne elemente pri tvorbi pore. Pri obeh družinah je centralna domena proteina iz štirih močno zavitih β-ploskev, okrog katerih so prisotne tri majhne skupine α- vijačnic. Dva skupka vijačnic, t.i. transmembranske β-lasnice (ang., Transmembrane beta- Hairpin THM1 in THM2), sodelujeta pri nastanku pore, tretja α-vijačnica pa vsebuje motiv HTH (ang., Heliks-Turn-Heliks), ki ga najdemo na pregibu centralne β-ploskve, ki je na vrhu domene THM2 in, ki sodeluje pri njenem premiku iz začetne pozicije. Predstavljeni elementi skupaj tvorijo N-terminalno domeno proteinov MACPF. Vse to skupaj nakazuje na skupen razvoj družin proteinov MACPF in CDC. Po vsem tem lahko sklepamo na podoben mehanizem tvorbe transmembranske pore, zato sedaj ti dve družini uvrščamo v naddružino proteinov MACPF (Hadders in sod., 2007; Slade in sod., 2008). Med proteine z domeno MACPF prištevamo PlyB iz bukovega ostrigarja in EryB iz kraljevega ostrigarja (Shibata in sod., 2010; Tomita in sod., 2004).

(17)

2.3 EGEROLIZINI

Egerolizini so skupina proteinov, ki jih najdemo v različnih kraljestvih, pri rastlinah, žuželkah in praživalih, najbolj pogosto pa so prisotni pri bakterijah in glivah. Egerolizine, ki jih proizvajajo gobe, najdemo tako pri jedilnih gobah, kot tudi pri saprofitih, fitopatogenih in oportunistično patogenih glivah (Butala in sod., 2017).

Prva izolirana egerolizina sta bila Asp-hemolizin iz plesni Aspergillus fumigatus (Yokota in sod., 1977) in pleurotolizin (Ply) iz gobe Pleurotus ostreatus (Bernheimer in Avigad, 1979).

Egerolizini so strukturno in funkcionalno zelo raznolika skupina proteinov, ki jih razvrščamo v dve skupini. V prvo spadajo proteini, veliki med 10 - 14 kDa, v drugo pa proteini, velikosti 15 kDa (Butala in sod., 2017). Zelo nizek delež teh proteinov je dejansko biokemijsko okarakteriziran. Imajo nizko izoelektrično točko in so stabilni v zelo širokem območju pH (Butala in sod., 2017; Berne in sod., 2009; Ota in sod., 2013).

Egerolizini naj bi imeli veliko bioloških vlog. Delujejo kot virulentni faktorji patogenih gliv in bakterij ter lahko sodelujejo pri sporulaciji (Zhang in sod., 2011; Butala in sod., 2017).

Pri molju Pseudoplidos includens imajo egerolizini vlogo pri celični imunosti (Zhang in sod., 2011). Zadnji rezultati nakazujejo, da imajo egerolizini v glivah rodu Pleurotus skupaj s svojimi MACPF-partnerji vlogo pri naravni zaščiti gob pred obžiranjem s strani različnih predatorjev (Panevska in sod., 2019a).

2.3.1 Bukov ostrigar (Pleurotus ostreatus)

Bukov ostrigar (Pleurotus ostreatus) je nepatogena bazidiomicetna vrsta glive. Kot druge vrste iz rodu Pleurotus, tudi bukovega ostrigarja gojijo za potrebe prehrane ljudi in živali, uporabljajo pa jih tudi biotehnološko, in sicer za razgradnjo ligno-celuloznega materiala (Cohen in sod., 2002).

Leta 1978 so izolirali prvi citolizin iz bazidiokarpa bukovega ostrigarja, ki so ga poimenovali pleurotolizin (Bernheimer in Avigad, 1979). Takrat so pokazali, da ima hemolitično aktivnost, niso pa vedeli, da je to dvokomponentni citolizin, sestavljen iz egerolizina pleurotolizina A in proteina z domeno MACPF, pleurotolizina B. Tomita in sod. so leta 2004 odkrili, da je ta sfingomielin-specifični citolizin sestavljen iz dveh podenot in sicer pleurotolizina A (PlyA), ki je velik 15 kDa, ter pleurotolizina B (PlyB), ki je velik 59 kDa.

Zaključili so, da se PlyA specifično veže na membranske mikrodomene, obogatene s sfingomielinom (SM) in Hol (Tomita in sod., 2004).

Naslednji protein, ki so ga odkrili leta 2002, je ostreolizin A (Oly), ki je velik 15 kDa, ki prepozna in se veže na membrane, bogate s Hol (> 30 %) in SM. Ostreolizin je bil sprva okarakteriziran kot hemolitični egerolizin, a so kasneje ugotovili, da je bil nativni izolat sestavljen pretežno iz egerolizinskega proteina (pozneje poimenovanega OlyA)

(18)

kontaminiranega s proteinom PlyB (Berne in sod., 2002; Sepčić in sod., 2004; Ota in sod., 2013).

Tudi ostreolizin A6 (OlyA6) spada v družino egerolizinov iz bukovega ostrigarja in ima 78

% aminokislinsko identičnost z OlyA. Ostreolizin A6 se veže na domene bogate s SM/Hol, ne prepozna pa prostega SM. Ugotovili so, da v kombinaciji s proteinom s PlyB tvori transmembranske pore in povzroči propad celice (Beren in sod., 2005; Endapally in sod., 2019) Egerolizin OlyA6 ne prepozna samo celic, ki vsebujejo SM/Hol, ampak se lahko s 1000-krat večjo afiniteto veže na celice ali membrane, ki vsebujejo kombinacijo ceramid fosfoetanolamina (CPE) in Hol (Bhat in sod., 2015).

2.3.2 Kraljevi ostrigar (Pleurotus eryngii)

Leta 2010 so Shibata in sod. izolirali in okarakterizirali nov dvokomponentni citolizin iz kraljevega ostrigarja. Ta dvokomponentni citolizin je sestavljen iz egerolizina erilizina A (EryA) in proteina, ki spada v družino porotvornih proteinov MACPF, erilizina B (EryB).

Erilizin B je 98 % identičen PlyB. Delovanje citolitičnega kompleksa EryA/EryB je zelo podobno delovanju citolitičnega kompleksa OlyA6/PlyB. Egerolizin EryA se veže na membrano tarčne celice, s tem pa omogoči vezavo EryB in lizo tarčne celice (neobjavljeni rezultati).

Erilizin A se za razliko od OlyA6 ne veže na kombinacijo SM/Hol, ampak se specifično in z visoko afiniteto veže samo na kombinacijo CPE/Hol (Bhat in sod., 2013). Sfingolipid CPE najdemo pri žuželkah in drugih nevretenčarjih, pri sesalcih pa ga zaznamo le v sledovih (Kraut, 2011; Panevska in sod., 2019b). Kombinaciji proteinov EryA/EryB in predvsem EryA/PlyB imata zelo velik potencial v kmetijski biotehnologiji, in sicer za zatiranje različnih škodljivcev (ličink različnih žuželk) (Panevska in sod., 2019a).

Iz gobjega ekstrakta kraljevega ostrigarja poznamo še en egerolizin, in sicer pleurotolizin A2 (PlyA2) (Bhat in sod., 2013), ki je velik 15 kDa. Z OlyA6 pa ima 96 % identično aminokislinsko zaporedje. Ima visoko afiniteto do domen, obogatenih s SM/Hol, kar nakazuje na dejstvo, da bi bil uporaben kot označevalec le-teh v živih sesalskih celicah (Bhat in sod., 2013). Za PlyA2 je poznana tudi vezava na sam CPE brez prisotnosti Hol. Protein PlyA2 v kombinaciji s proteinom PlyB tvori tansmembransko poro v membranah tarčnih celic in jo poslednično lizira (Bhat in sod., 2013). Panevska in sod. (2019a) so predlagali njegovo uporabo kot biopesticida, saj so ugotovili, da se PlyA2 specifično veže na membrane, ki vsebujejo kombinacijo lipidov CPE/Hol.

Če povzamemo lahko iz Preglednice 1 vidimo, da se vsi egerolizini vežejo na kombinacijo CPE/Hol. Erilizin A je edini, ki se veže le na CPE/Hol in ne prepozna SM/Hol, PlyA2 pa je edini, ki prepozna čisti CPE (brez prisotnosti Hol) (Bhat in sod., 2013; Ota in sod.,2013;

Panevska in sod., 2019a; Tomita in sod., 2004).

(19)

Preglednica 1: Egerolizini in njihovi proteinski partnerji z domeno MACPF izolirani iz gliv ter njihovi lipidni receptorji (+, vezava na lipidno tarčo; n.d., ni določeno).

Produkcijski organizem

PROTEINI Lipidna tarča egerolizina Vir

GLIVA Egerolizin MACPF SM/Hol SM CPE/Hol CPE Pleurotus

ostreatus (bukov ostrigar)

PlyA

PlyB

+ + (Tomita in sod.,

2004)

OlyA + + (Berne in sod.,

2002)

OlyA6 + + (Panevska in

sod., 2019a., Ota in sod., 2013) Pleurotus

eryngii (kraljevi

ostrigar

EryA

EryB

- + (Bhat in sod.,

2013)

PlyA2 + + + (Bhat in sod.,

2013) Aspergillus

fumigatus

Asp-HS n.d. n.d. (Yokota in sod.,

1977; Butala in sod., 2017)

2.4 NASTANEK PORE

Nastaenk pore so Lukoyanova in sod leta 2013 okarakterizirali z dvokomponentnim sistemom PlyA/PlyB. Egerolizin PlyA ima strukturo β-sendviča (Slika 1A), ki je zelo podobna strukturi proteinov iz aktinoporinske družine porotvornih toksinov. Predstavniki le- te prepoznajo lipidno tarčo (vezava na umetne ali biološke membrane, ki vsebujejo SM in Hol) z N-terminalnim delom β-sendviča, ki je odgovoren za nastanek pore. Egerolizin PlyA nima aktinoporinske N-terminalne transmembranske regije, zato sam po sebi ne more tvoriti pore (Mancheño in sod., 2003; Lukoyanova in sod., 2015).

Struktura proteina PlyB razkriva N-terminalno domeno MACPF (Slika 1B, označeno z modro/rdečo/rumeno), ki ji sledijo tri manjše β-bogate domene, združene v globularno trilistno strukturo (Slika 1B, označeno z zeleno). Domena MACPF vsebuje centralni štiri- slojni upognjen in zvit β-list značilen za naddružino proteinov MACPF (Slika 1B, označeno rdeče). Skupek vijačnic THM1 (Slika 1B, označeno z rumeno) se nahaja na notranji strani proteina poleg konkavne strani β-listov. Skupek vijačnic THM2 (Slika 1B, označeno z rumeno) je zgrajen iz ene α-vijačnice in ena β-ploskve, ki se nahaja na robu centralnega β- lista. Skupaj tvorijo β-listi in regiji THM transmembransko poro (Lukoyanova in sod., 2015).

(20)

Slika 1. Kristalna struktura komponent citolitičnega kompleksa PlyA/PlyB (Lukoyanova in sod., 2015).

(A) Struktura egerolizina PlyA z označenim N- in C-terminalnim delom. (B) Struktura proteina z domeno MACPF, PlyB, s centralnim delom, ki vsebuje štiri slojni β-list (rdeče), ter tri skupke α-vijačnic THM1 in THM2 (rumeno) in HTH (črtkana črta). (C) Struktura PlyB, obrnjena za 90°.

Pri nastanku pore egerolizinskih citolitičnih kompleksov sta pomembni dve komponenti.

Egerolizinski protein (PlyA) se veže na membrano in tvori dimer v obliki črke V. Sledi vezava PlyB, Pri čemer se β-ploskev konformacijsko spremeni. Nato pride do spremembe v regiji HTH, kar vodi do spremembe v regiji THM. Spremembe privedejo do nastanka transmembranske lasnice in njene vstavitve v membrano in oblikovanje pore. (Lukoyanova in sod., 2015). Zaradi nastanka transmembranskih por, pride do povečane transmembranske električne prevodnosti in do povečanja same permeabilnosti membrane. To so dokazali na primeru dvokomponentnega sistema egerolizin/MACPF protein; OlyA/PlyB (Vrecl in sod., 2015)

Slika 2. Shematski prikaz nastanka transmembranske pore (Lukoyanova in sod., 2015).

(A) Monomerni strukturi proteinov PlyA in PlyB z označenimi posameznimi domenami, ki so pomembne za nastanek pore. (B) in (C) nakazuje na nastanek prepore in (D) nastanek pore.

(21)

2.5 CELIČNE MEMBRANE IN LIPIDNI RAFTI

Membrana celic je proteo-lipidni dvosloj, ki ščiti celico pred zunanjimi dejavniki okolja. V membranah je bilo identificiranih že preko 10.000 različnih lipidov in proteinov. Medtem, ko za proteine poznamo njihovo široko vlogo, je funkcija posameznih lipidnih zvrsti v samih membran še dokaj neznana (Lingwood in Simons, 2010). Membrane so dolgo opisovali kot homogene strukture, kjer molekule nimajo nobene omejitve v gibanju. Kasneje pa so ugotovili, da se nahajajo določene lipidne in proteinske molekule v specifičnih domenah, ki so jih poimenovali lipidni rafti. Te lipidne domene so bogate s Hol, sfingolipidi in proteini (Edidin, 2003; London, 2002).

Lipidni rafti igrajo zelo pomembno vlogo v endocitozi, eksocitozi, membranskem transportu, v interakciji gostitelj-patogen, celičnem signaliziranju, pri raku, imunskem odzivu,pri prenosu signala ter pri določenih boleznih, kot so Alzheimerjeva, Parkinsonova, kardiovaskularne bolezni in prionske bolezni (Lencer in sod., 1999; London, 2002; Michel in sod., 2007).

V sesalčjih membranah sta v lipidnih raftih večinoma zastopana SM in Hol. Holesterol je pomemben del vretenčarskih celičnih membran, kjer interagira s sfingolipidi in vpliva na njihove lastnosti (Pike, 2006). Sfingomielin, ki ima polarno fosfoholinsko glavo, je najbolj zastopan sfingolipid v zunanjem delu plazemske membrane (Ohanin in Ohanin, 2001). V okolici raftov, ki se nahajajo v tekoči urejeni fazi, so razporejeni manj urejeni glicerofosfolipidi.

Ceramid fosfoetanolamin (CPE) ima za razliko od SM fosfoetanolaminsko polarno glavo inje najbolj zastopan sfingolipid pri nevretenčarjih, določenih enoceličnih parazitih in pri nekaterih po Gramu negativnih bakterijah, v sesalčjih celicah pa le v sledovih (Ohanin in Ohanin, 2001; Kraut, 2011; Panevska in sod., 2019b).

2.6 BIOLOŠKA VLOGA EGEROLIZINOV

Egerolizini iz odprtotrosnic (Basidiomycota) imajo pomembno vlogo v razvoju produkcijskega organizma in tudi med sporulacijo. Domnevajo, da je izražanje in proizvodnja samih egerolizinov umeščena v čas tvorbe primordijev in mladih mesnatih delov gobe. Egerolizin OlyA6 najdemo v trosih bukovega ostrigarja, prav tako se sočasno izraža PlyB, kar nakazuje na neko skupno delovanje teh dveh proteinov, najverjetneje v procesu razvoja same gobe (Berne in sod., 2002; Butala in sod., 2017; Shim in sod., 2006).

Ena izmed pomembnejših vlog egerolizinov naj bi bila zaščita pred plenilci (Zhang in sod., 2011). Panevska in sod. so ugotovili, da egerolizini in njihovi proteinski partnerji z domeno MACPF verjetno sodelujejo pri obrambi gliv proti ličinkam žuželk. Tako bi lahko te dvokomponentne sisteme (OlyA/PlyB, EryA/PlyB, PlyA/PlyB) potencialno uporabili kot biopesticide (Panevska in sod., 2019a). Podobno bi lahko veljalo za divje živali, ki se prehranjujejo z gobami. Če bi pojedle preveliko količino ostrigarjev, bi le ta poškodoval

(22)

prebavni epitelij, saj bi se egerolizin v povezavi z MACPF proteinom vezal na membrano epitelnih prebavnih celice (vsebujejo namreč kombinacijo SM/Hol) in jo poškodoval.

Manjše količine egerolizinov in MACPF proteinov za sesalce niso nevarne, saj je nedavno bilo pokazano, da jih prebavni encimi učinkoviti razgradijo (neobjavljeni rezultati).

2.7 BIOTEHNOLOŠKE APLIKACIJE EGEROLIZINOV 2.7.1 Detekcija lipidnih raftov

Za egerolizina OlyA6 in PlyA2 je bilo pokazano, da se specifično vežeta na kombinacijo Hol in SM (Ota in sod., 2013; Bhat in sod., 2013). Ta dva proteina, sama po sebi nista toksična za tarčo na katero se vežeta, zato jih lahko uporabiljamo kot potencialni orodji za detekcijo lipidnih raftov v različnih celicah in tkivih sesalcev ter nevretenčarjev (Bhat in sod., 2013; Skočaj in sod., 2014).

Bhat in sod. (2013) so PlyA2 pripravili kot fluorescenčno označen protein (PlyA2-eGFP) in pokazali, da se selektivno veže na domene, bogate s SM/Hol na membranah rakavih HeLa celic. Skočaj in sod. (2014) pa so OlyA6 na C-terminalnem delu označili s fluorescentnim proteinskim označevalcem mCherry in ga uporabili za označevanje lipidnih raftov v membranah sesalskih celic.

2.7.2 Označevanje lipidov in uporaba citolitičnih kompleksov pri organizmih, ki vsebujejo CPE

Za razliko od vretenčarjev, kjer je poglavitni sfingolipid SM, imajo nevretenčarji kot poglavitni sfingolipid v svojih membranah CPE, ki pa ga pri vretenčarjih najdemo le v sledovih. Posledično bi lahko egerolizine, ki se vežejo na CPE, uporabili kot potencialne označevalce teh celic, oziroma domen, obogatenih s CPE (Bhat in sod., 2015; Panevska in sod., 2019a).

Bhat in sod. (2015) so uporabili EryA-eGFP kot označevalec organizma Tripanosoma brucei, ki predstavlja zelo velik medicinski problem. EryA, ki je sam po sebi ne toksičen, se je selektivno vezal na CPE/Hol, ne pa tudi na sesalske celice, s čimer so dokazali, da ima EryA velik potencial kot označevalec domen CPE/Hol (Bhat in sod., 2015).

2.7.3 Zatiranje škodljivcev in uporaba biopesticidov

Koruzni (Diabrotica virgifera virgifera) in koloradski hrošč (Leptinotarsa decemlineata) povzročata letno več milijonske izgube v kmetijstvu (Casagrande, 1987; Chu in sod., 2014;

Jakka in sod., 2016). Kljub različnim insekticidom za zatiranje teh škodljivec, čez čas le-ti postanejo odporni nanje, zato so začeli raziskovalci iskati nove rešitve za boj proti njim (Alyokhin in sod., 2008).

Žuželke imajo v svojih membranah kot poglavitni sfingolipid CPE, na katere se lahko egerolizini, kot so OlyA, PlyA2 in EryA , v kombinaciji s proteinskim partnerjem z domeno

(23)

MACPF (PlyB ali EryB) vežejo in povzročijo lizo in vitro žuželčjih celičnih kultur ali samih žuželk in njihovih ličink (Panevska in sod., 2019a).

CPE-vezavni egerolizini iz gob rodu Pleurotus v kombinaciji s proteinskimi partnerji z domeno MACPF so tudi selektivno toksični za ličinki koruznega in koloradskega hrošča, s čimer se nakazuje možnost za njihovo uporabo kot nove generacije biopesticidov (Panevska in sod., 2019a).

2.7.4 Zatiranje tumorskih celic

Resnik in sod. so leta 2015 na urotelijskih rakavih celicah uporabili nativni izolat Oly in ugotovili, da selektivno povzroča nekrozo celic, na zdrave celice pa ne vpliva. Vemo, da imajo rakave celice v svoji membrani večje količine holesterola (zaradi spremenjenega metabolizma). Posledično se OlyA v kombinaciji s PlyB lahko veže veliko bolj specifično na kombinacijo SM/Hol in je bolj citotoksičen za rakaste celice (Resnik in sod., 2015).

Podobno tudi rekombinantni Oly (rOlyA) zaradi vezave na lipidne rafte deluje kot inhibitor rasti tumorskih celic debelega črevesja, saj inducira apoptozo le-teh (Nimri in sod., 2017).

Čiste egerolizine ali citolitične komplekse egerolizin/MACPF bi lahko obravnavali kot nove farmacevtske proizvode za boj proti raku. Njegove prednosti so, da je topen v vodi in ima nizko molekularno maso, kar mu poveča biodostopnost v primerjavi z ostalimi učinkovinami (Nimri in sod., 2017).

2.8 KVASOVKA Pichia pastoris

Raziskovalci so leta zmotno predpostavljali, da Komagataella paffi spada v rod Pichia, zato so jo klicali Pichia pastoris. Prvič je to kvasovko leta 1919 uspešno izoliral Alexander Guilliermond iz eksudata francoskega kostanja in jo poimenoval Zygosacharomyces pastori.

Leta 1950 je v ZDA Herman Paff iz črnega hrasta izoliral nov sev in prav tako preimenoval vrsto v Pichia pastoris (Guilliermond, 1920; Phaff in sod., 1956). Leta 1995 so s sekveniranjem ribosomalne RNA vse seve P. pastoris prenesli v nov rod in jih ločili v dve vrsti, Komagataella pastoris in Komagataella paffi. Ime Pichia pastoris se uporablja v uporabni znanosti, medtem ko najdemo ime Komagataella paffi v različnih raziskavah (Kurtzman, 2005; Love in sod., 2016; Yamada in sod., 1995).

Kvasovka se lahko razmnožuje tako nespolno kot spolno. Nespolno se razmnožuje z brstenjem, kjer v procesu mitoze nastajajo brsti. Ti lahko nastajajo tako na haploidnih, kot na diploidnih celicah. Združitev dveh haploidnih celic različnega paritvenega tipa (ang., maiting type MATa in MATα) poteka pri spolnem razmnoževanju, pri čemer nastane diploidna celica, ki se v procesu mitoze deli na štiri haploidne celice. Za razliko od navadne kvasovke je P. pastoris pogosteje v haploidnem stanju, razen če se v rastnem okolju pojavi pomanjkanje hranil, kot je na primer pomanjkanje dušika (Bernauer in sod., 2021).

(24)

2.8.1 Pot uporabe metanola

Pichia pastoris (Komagataella paffi) je metilotrofna kvasovka in obligatni aerob, sposobna rasti na metanolu kot na edinem viru ogljika. Metabolizem metanola lahko v kvasovki poteka tako v peroksisomih kot v citosolu. V prvem koraku se z encimom alkohol oksidazo (AOX) metanol oksidira do formaldehida in peroksida. Peroksid v prisotnosti katalaze razpade do vode in kisika, del formaldehida pa se prenese v citoplazmo, kjer pride do pretvorbe do ogljikovega dioksida, pri čemer se sprosti energija v obliki NADH. Ostali del formaldehida se pretvori v gliceralaldehid-2-fosfat in dihidroksiaceton, ki potem vstopita v pentoza fosfatno pot metabolizma glukoze (Slika 3) (Hartner in Glieder, 2006; Krainer in sod., 2012).

Slika 3. Uporaba metanola kot vira ogljika v P. pastoris (Juturu in Wu, 2018).

AOX: alkoholna oksidaza, Cat: katalaza, DAK: dihidroksiaceton kinaza, DAS: dihidroksiaceton sintaza, FBA:

fruktoza-1,6-bifosfat aldoza, FBP: fruktoz-1,6-bifosfataza, FLD: formaldehid dehidrogenaza, FDH: format dehidrogenaza.

2.8.2 Pichia pastoris kot ekspresijski sistem

Po letu 1970 se je pričel razvoj rekombinantne DNA tehnologije. Raziskovalci so ugotovili, da lahko mikroorganizmi proizvedejo proteine, ki izvirajo iz drugih organizmov. Prvi uporabljeni sistemi za proizvodnjo proteinov so bili prokarionti, vendar so se med proizvodnjo evkariontskih proteinov v prokariontih pojavili problemi, kot je pomanjkanje njihove stabilnosti in biološke aktivnosti. Znotrajcelični prostor v kvasovkah je primerno okolje za pravilno zvijanje evkariontskih proteinov. Evkariontski ekspresijski sistemi omogočajo posttranslacijske modifikacije, kot sta glikozilacija in tvorba disulfidnih

(25)

mostičkov. Kljub temu, da je evkariontski sistem kompleksnejši od prokariontskega, pa je njegova genetska manipulacija preprostejša (Cregg in sod., 1987).

Saccharomyces cerevisiae (bolj znan kot pekovska, pivska ali preprosto navadna kvasovka) je bila prva uporabljena kvasovka za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Kljub temu ni najbolj primeren organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov, saj prihaja velikokrat do izgube plazmida v produkciji, do hiperglikozilacije tarčnega proteina in zmanjšane produkcije le-tega. Kot njeno zamenjavo se velikokrat uporabljajo metilotrofne kvasovke in ena od teh je tudi P. Pastoris (Romanos in sod., 1992; Türkanoğlu Özçelik in sod., 2019).

Pichia pastoris je postala zelo uporabna kot gostiteljski organizem v farmacevtski in živilski industriji, zato je dobila ime biotehnološka kvasovka (ang., biotech yeast). Hitro raste na poceni surovinah kot so metanol, glukoza, glicerol ali etanol. V primerjavi s S. cerevisiae ima P. pastoris boljšo termo- in osmotoleranco. Sposobna je veliko posttranslacijskih modifikacij, kot so proteolitsko procesiranje, tvorba disulfidnih mostičkov in glikozilacija.

Ob vsem tem ima zelo učinkovit aparat za iznos proteinov iz celice (s tem je čiščenje proteinov enostavno) in zmožnost izražanja rekombinantnih proteinov pod močnimi inducibilnimi ali konstitutivnimi promotorji. Ker spada med metilotrofne kvasovke, so na njej lahko raziskovali pot uporabe metanola, kar niso mogli prej na nobenem drugem organizmu. Te lastnosti dajejo P. pastoris zelo veliko vrednost kot modelnemu organizmu (Cregg in sod., 2000). Poleg tega P. pastoris ni fermentativna kvasovka, kar pomeni da gre lahko ves vir ogljika v biomaso, kar vodi v visoke celične gostote v aerobnih pogojih (Hagenson, 1991; Macauley-Patrick in sod., 2005; Türkanoğlu Özçelik in sod., 2019).

Kot drugi organizmi ima tudi P. pastoris nekaj pomanjkljivosti. Za uspešno transformacijo potrebuje velike količine plazmidne DNA (več µg), število transformant je glede na količino plazmidne DNA mnogo manjše v primerjavi z E. coli. Produkcija proteinov je v večini regulirana samo z dvema promotorjema, in sicer PGAP ali PAOX1. Ena izmed pomanjkljivosti P. pastoris je tudi, da ima majhno število selekcijskih markerjev (geni his4, arg4 in Sh ble).

Problem so tudi pogoste okužbe s saprofitskimi bakterijami in glivami. Tudi sama P. pastoris proizvaja proteaze, ki lahko hidrolizirajo sam protein in vplivajo na končen izplen, kar je tudi razlog za razvoj novih sevov, ki v svojem genomu nimajo zapisov za proteaze (Preglednica 2) (Karbalaei in sod., 2020; Stewart, 2015).

(26)

Preglednica 2: Primerjava ekspresijskih sistemov bakterije in kvasovke.

Ekspresijski sistem Prednosti Slabosti

Bakterija (E. coli) Enoceličnost

Kratek generacijski čas Enostavno gojenje

Enostavno urejanje genoma Sekveniran genom

Nizka cena

Inkluzijska telesa Težave pri izražanju evkariontskih proteinov

Kvasovka (P. pastoris) Enoceličnost

Kratek generacijski čas Enostavno gojenje Nizka cena Nepatogenost

Sekretorno izražanje proteinov Posttranslacijske modifikacije Tvorba disulfidnih mostičkov Glikozilacija

Velika količina plazmidne DNA Proteaze

Prevelika količina metanola ovira rast

Okužbe

2.8.3 Promotorji

V proizvodnji rekombinantnih proteinov je ključna tudi izbira pravega promotorja. V večini so v uporabi inducibilni ali konstitutivni promotorji. Prednost inducibilnega promotorja je ta, da sta akumulacija biomase in proizvodnja proteina ločena v različnih časovnih fazah, kar nam daje prednost pri proizvodnji toksičnih proteinov (J. M. Cregg in sod., 1993;

Macauley-Patrick in sod., 2005). Pomembno je tudi dejstvo, da lahko pred izražanjem rekombinantnega proteina sprožimo ekspresijo pomožnih proteinov, kot so npr. šaperoni (ti pomagajo pri zvijanju proteinov). Konstitutivno izraženi proteini pa so lahko v določenih primerih toksični za gostiteljski organizem, je pa z njimi enostavno delati (Ahmad in sod., 2014).

Inducibilni promotorji

Najbolj uporaben promotor za izražanje rekombinantnih proteinov v P. pastoris je promotor encima alkoholne oksidaze, P^AOX1, ki je močan in natančno reguliran promotor encima AOX1, ki sodeluje v procesu oksidacije metanola do formaldehida. Kvasovka P. pastoris potrebuje AOX1 za rast na mediju, ki vsebuje metanol. Prisotnost glukoze, etanola, glicerola in acetata pa je potrebna za represijo tega promotorja (Tschopp in sod., 1987; Türkanoğlu Özçelik in sod., 2019).

Ker je metanol zelo vnetljiva in zdravju škodljiva molekula, je nezaželen v obsežnih fermentacijah. Poznamo še veliko drugih promotorjev, ki jih lahko brez dodatka metanola dokaj uspešno uporabljamo za pripravo rekombinantnih proteinov. Ti inducibilni promotorji so alkoholna dehidrogenaza, glicerol kinaza in enolaza (Preglednica 3) (Ahmad in sod., 2014).

(27)

Konstitutivni promotorji

Gliceralaldehid-3-fosftat dehidrogenaza (GAP) je encim, ki je udeležen v glikolizi in se konstitutivno izraža v okolju z glukozo, glicerolom, metanolom in z veliko biomase (Ahmad in sod., 2014; Türkanoğlu Özçelik in sod., 2019).

Poznamo še veliko drugih konstitutivnih promotorjev, kot je promotor GCW14, ki je mnogo močnejši v primerjavi s promotorjem GAP. V primerjavi s promotorjem GAP proizvede promotor GCW14 petkrat več proteina, kljub temu pa se v industriji kot konstitutivno izražen promotor še vedno najbolj uporablja promotor GAP (Preglednica 3) (Ahmad in sod., 2014).

Preglednica 3: Najpogosteje uporabljeni promotorji P. pastoris.

Inducibilni promotorji

Ime gena Genski produkt Induktor Stopnja

izražanja

Vir

AOX1 Alkohol oksidaza I Metanol Močna (Tschopp in sod.,

1987)

ADH3 Alkoholna

dehidrogenaza

Etanol Močna (Karaoglan in

sod., 2016)

DAS Dihidroksiaceton

fosfat

Metanol Močna (Tschopp in sod.,

1987)

FLD1 Formaldehid

dehidrogenaza

Metanol/Metilamin Močna (Shen in sod., 1998)

PEX8 Protein

peroksisomskega matriksa

Metanol/Oleat Šibka (Cereghino in

Cregg, 2000)

ENO1 Enolaza Glicerol Močan (James M. Cregg

in sod., 2000)

GU1 Glicerol kinaza Glicerol Močan (James M. Cregg

in sod., 2000) Konstitutivni promotorji

GAP Gliceralaldehid-3-

fosfat

dehidrogenaza

Močan (Waterham in

sod., 1997) TEF1 Translacijski

elongacijski faktor- 1 alfa

Močan (Stadlmayr in

sod., 2010)

2.8.4 Sevi

V biotehnologiji obstaja veliko različnih sevov P. pastoris s širokim naborom genotipov za proizvodnjo rekombinantnih proteinov (Preglednica 4). Odločitev za uporabo specifičnega seva je odvisna od proteina, ki ga želimo izražati (Batt, 2014).

(28)

Preglednica 4: Gostiteljski sevi P. pastoris (prirejeno po Batt, 2014).

Ime seva Genotip Fenotip

Y-11430 divji sev

GS115 his4 Mut⁺ His^-

KM71 aox1Δ::SARG4 his4 arg4 Mut^S His^-

SMD1168 pep4Δhis4 Mut^- His^- okvarjene proteaze

SMD1165 prb1 his4 Mut⁺ His^- okvarjene proteaze

SMD1163 pep4 prb1 his4 Mut⁺ His^- okvarjene proteaze

2.8.5 Ekspresijski vektorji in selekcijski označevalci

Vsi ekspresijski vektorji so oblikovani kot prenosljivi vektorji (ang., shuttle vectors) za uporabo v bakterijah in kvasovkah, npr. E. coli oz. P. pastoris. Vsebovati mora mesto ori (ang., origin of replication) za obstoj plazmida in njegovo podvojevanje v E. coli ter selekcijski označevalec, ki je uporaben v enem ali v obeh organizmih. Med promotorjem in terminatorjem najdemo mesto za kloniranje, kamor vnesemo zapis za rekombinantni protein. Zelo pomemben je signalni protein za sekrecijo tarčnega proteina, kot je npr. PHO1 (kisla fosfataza) iz P. pastoris ali α-MF (alfa paritveni faktor) iz S. cerevisiae (Ellis in sod., 1985; Koutz in sod, 1989).

2.8.6 Zeocin

Zeocin spada med bleomicin/fleomicin družino antibiotikov, izoliranih iz bakterij iz rodu Streptomyces. Antibiotiki te družini so širokospektralni antibiotiki, ki delujejo tudi proti tumorsko (Invitrogen, 2010).

Protein, ki posreduje rezistenco proti zeocinu, je produkt gena Sh ble (Streptoalloteichus hindustanus belomicinski gen). Je 13,7 kDa velik protein, ki se veže na DNA in s tem prepreči vezavo zeocina na vijačnico (Invitrogen, 2010).

2.8.7 Ekspresijski plazmidni vektor pGAPZαA

Ekspresijski plazmidni vektor pGAPZAα A je velik 3,1 kb in je oblikovan za konstitutivno izražanje rekombinantnih proteinov. Vektor omogoča kloniranje želenega gena in selekcijo transformant z rezistenco na antibiotik zeocin. Vektor vsebuje promotor GAP za konstitutivno izražanje ob prisotnosti glukoze, poliklonsko mesto, transkripcijski terminator AOX1 za učinkovito terminacijo transkripcije mRNA, ori mesto za začetek podvajanja v E.

coli in gen za odpornost proti zeocinu za selekcijo v E. coli in P. pastoris. Sekrecijski signal α-faktor je pomemben za iznos rekombinantnega proteina iz celic (Slika 4) (Invitrogen, 2010).

(29)

Slika 4: Plazmidna mapa vektorja pGAPZα A (Invitrogen, 2010).

Promotor GAP omogoča konstitutivno izražanje genov; poliklonsko mesto omogoča vstavitev gena v pGAPZAα A; α-faktor omogoča iznos proteina iz celice; AOX1 transkripcijski terminator omogoča učinkovito terminacijo transkripcije in stabilizacijo mRNA; pUC ori omogoča vzdrževanje velikega števila kopij vektorja v E. coli; gen za rezistenco proti zeocinu omogoča selekcijo transformant v E. coli in P. pastoris.

2.8.8 Integracija vektorja pGAPZαA z vnesenim fragmentom v genom kvasovke Pichia pastoris

Linearna DNA lahko generira stabilne transformante P. pastoris s homologno rekombinacijo. Takšni vključki kažejo veliko stabilnost v odsotnosti selekcijskega markerja.

Dogodki, kjer se v genom vnese več kopij naše DNA, se zgodi 1 na 10 dogodkov enojne vstavitve DNA (Invitrogen, 2010).

Vstavitev konstrukta poteče na lokusu promotorja GAP (Slika 5). Poteče na samo enem mestu in sicer ima vektor pGAPZαA v svojem zaporedju del regije promotorja GAP, ki je homologen delu na lokusu promotorja GAP v genomu kvasovke P. pastoris. Rezultat tega je, da se lahko ob vstavitvi v genom vnese ena ali več kopij samega konstrukta višje ali nižje od lokusa GAP (Invitrogen, 2010).

(30)

Slika 5: Slika homologne rekombinacije (Invitrogen, 2010).

Slika prikazuje rezultat vstavitve rekombinantnega plazmida z delom 5' promotorja GAP, ki ga najdemo pred fragmentom na vektorju, na 5' del promotorja GAP v genomu kvasovke P. pastoris. Ti dogodki se lahko zgodijo tako z linearnim, kot krožnim plazmidom ali ponovno zlepljenim plazmidom, vendar se zadnja dva dogodka zgodita z zelo malo verjetnostjo.

Slika 6 prikazuje večkratne vstavitve insertov na enem lokusu v celici, ki se lahko zgodijo spontano, vendar z zelo nizko, a zaznavno frekvenco. Zaradi zelo nizke frekvence pojavnosti, je potrebno pregledati veliko število kolonij in ugotoviti ali ima genom posamezne celice, na lokusu promotorja GAP več zaporednih vstavitev konstrukta.

Slika 6: Integracija več zaporednih konstruktov v genom kvasovke Pichia pastoris (Invitrogen, 2010).

genom P.pastoris

Ekspresijska kaseta

Ekspresijska kaseta 1

2 vstavitev konstrukta

Ekspresijska kaseta 2

3 vstavitev konstrukta

(31)

2.8.9 Sekretorno izražanje rekombinantnih proteinov

Pri izražanju rekombinantnih proteinov v kvasovki je zelo pomembno ali se bo rekombinantni protein izražal znotrajcelično ali pa bo preko sekretornega signalnega peptida preusmerjen v zunajcelično okolje (Daly in Hearn, 2005). Če se tarčni protein v svojem naravnem okolju ne izloča iz celic, je potem lahko iznos proteina v heterolognem ekspresijskem sistemu neugoden in problematičen. Posledice tega so lahko spremenjen protein z napačno glikozilacijo in pomanjkanje nekaterih post-translacijskih modifikacij, ki so ključne za njegovo aktivnost (Rees in sod., 1999). Sekretorno izražanje je kompleksen večstopenjski proces, v katerega je vključenih veliko dejavnikov. Njegova pot do zunajceličnega okolja se začne z nastankom pravilne sekundarne strukture in disulfidnih vezi v endoplazemskem retikulumu. Veliko proteinov, še posebej pa ti, ki se naravno izločajo iz celice, vsebujejo pro-regijo, katera je potrebna za pravilno zvijanje tarčnega proteina. Pro- regija se kasneje proteolitično odstrani v Golgijevem aparatu. Iz Golgijevega aparata se proteini, zapakirani v posebnih veziklih, z eksocitozo izločijo v rastni medij (Slika 7) (Daly in Hearn, 2005; Holst in sod., 1996; Romanos in sod., 1992).

Slika 7: Shematski prikaz sekretorne poti izločanja proteinov iz kvasovke P. pastoris (Delic in sod., 2013).

Po sintezi proteinov so ti preneseni iz jedra v lumen endoplazemskega retikuluma (ER), kjer pride do zvijanja in glikozilacije. Pri pravilnem zvijanju proteinov so prisotni šaperoni, nepravilno zviti proteini pa se razgradijo v preoteosomu. Iz ER se prenesejo v Golgijev aparat in do celične membrane, kjer se z eksocitozo izločijo v izvencelični prostor.

JEDRO PROTEASOM

ZUNANJOST

CITOSOL