UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Polona JAMNIK
INDUCIRANE MUTACIJE ZA SPREMINJANJE LASTNOSTI KMETIJSKIH RASTLIN
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij – 1. stopnja
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Polona JAMNIK
INDUCIRANE MUTACIJE ZA SPREMINJANJE LASTNOSTI KMETIJSKIH RASTLIN
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij – 1. stopnja
INDUCED MUTATIONS AS A TOOL FOR CHANGING THE PROPERTIES OF AGRICULTURAL PLANTS
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Kmetijstvo – agronomija. Delo je bilo opravljeno na Katedri za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin.
Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr.
Jerneja Jakšeta.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Dominik VODNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: prof. dr. Jernej JAKŠE
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: izr. prof. dr. Jana MUROVEC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum zagovora:
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 602.6:582.5/.9:581.154:631.528.6:633(043.2) KG inducirane mutacije, izboljšane lastnosti, kmetijske rastline AV JAMNIK, Polona
SA JAKŠE, Jernej (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Univerzitetni študijski program prve stopnje Kmetijstvo – agronomija
LI 2021
IN INDUCIRANE MUTACIJE ZA SPREMINJANJE LASTNOSTI KMETIJSKIH RASTLIN
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 20 str., 2 pregl., 2 sl., 37 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Inducirane mutacije so trajne spremembe genetskega materiala, ki se prenašajo od staršev na potomce. Te vključujejo spremembe zaporedja ali števila nukleotidov, števila genov ali kromosomov. Glede na nastanek jih lahko izzovemo s kemijskimi, fizikalnimi ali biološkimi mutagenimi dejavniki. Z raziskovanjem so se razvijale tudi metode, s katerimi lahko načrtno izzovemo različne tipe mutacij. Te metode temeljijo na izbiri želene lastnosti, ki bi določeni kmetijski rastlini prinesla izboljšavo in tako omogočila večji in kakovostnejši pridelek ter boljše odzive glede na biotske in abiotske dejavnike.
Mutagena sredstva povečajo variabilnost, ki se nanaša na ciljno lastnost določenega organizma. Postopek same mutageneze je zelo natančno optimiziran in povzroča največje število pozitivnih oziroma želenih mutacij, kar dosežemo z optimalno dozo mutagena in pa postopkom selekcije. Namen diplomske naloge je na osnovi objavljenih raziskav predstaviti postopek mutageneze in različnih lastnosti, ki so doprinesle k izboljšanju kmetijskih rastlin. Osredotočili se bomo na različne metode in rastline, ki so se uporabljale v teh postopkih in kakšne so njihove prednosti.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 602.6:582.5/.9:581.154:631.528.6:633(043.2)
CX induced mutations, improved properties, agricultural plants AU JAMNIK, Polona
AA JAKŠE, Jernej (supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Academic Study Programme in Agriculture - Agronomy
PY 2021
TI INDUCED MUTATIONS AS A TOOL FOR CHANGING THE PROPERTIES OF AGRICULTURAL PLANTS
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 20 p., 2 tab., 2 fig., 37 ref.
LA sl AL sl/en
AB Induced mutations are permanent changes in the sequence or number of nucleotides, the number of genes or chromosomes, passed from parents to offspring. Depending on their origin, they can be caused by chemical, physical or biological mutagenic factors.
Research has also developed methods by which we can challenge different types of mutations. These methods are based on the selection of the desired trait that would bring an improved trait to a particular crop plant and provide higher and better crop quality and thriving according to biotic and abiotic factors. Mutagenic agents increase the variability with respect to the target trait of a particular organism. The process of mutagenesis itself is very precisely optimized and causes the largest number of positive or desired mutations, which is achieved with the optimal dose of mutagen and with a selection process. The aim of the thesis is to present the process of mutagenesis and various traits that have contributed to the improvement of crops using published research. We will focus on the different methods and on plants that have been involved in these processes and what benefits they have.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... VI KAZALO SLIK ... VI KAZALO TABEL ... VI
1 UVOD ... 1
1.1 NAMEN IN POVOD DELA ... 1
2 VRSTE MUTACIJ ... 2
2.1 GENSKE MUTACIJE ... 2
2.2 KROMOSOMSKE MUTACIJE ... 3
2.3 GENOMSKE MUTACIJE ... 3
3 ZNAČILNOSTI INDUCIRANIH MUTACIJ ... 3
3.1 KEMIJSKE MUTAGENE SNOVI ... 4
3.2 FIZIKALNE MUTAGENE SNOVI ... 5
3.2.1 Obsevanje z gama žarki ... 5
4 POSTOPKI MUTAGENEZE ZA SPREMINJANJE LASTNOSTI ... 5
4.1 IZBIRA RASTLINSKEGA MATERIALA ... 6
4.2 SELEKCIJA ŽELENE LASTNOSTI ... 7
4.2.1 In vitro selekcija ... 7
4.2.1.1 Selekcija tolerance na slana tla ... 7
4.3 IZBIRA MUTAGENE SNOVI ... 8
4.3.1 Optimalni odmerki za uspešno mutagenezo ... 8
5 LASTNOSTI, KI SO BILE INDUCIRANE ZA IZBOLJŠANE POLJŠČINE .... 9
5.1 EKONOMSKI VPLIV NOVIH SORT ... 9
5.2 VODILNI MUTANTI VISOKE VREDNOSTI ... 10
5.2.1 Riž ... 10
5.2.2 Paradižnik ... 11
5.2.3 Bombaž ... 12
5.2.4 Sončnice ... 13
5.2.5 Sezam ... 14
6 DRŽAVE, KJER SO BILE USTVARJENE NOVE SORTE ... 15
6.1 SLOVENSKE POŽLAHTNJENE SORTE KMETIJSKIH RASTLIN ... 16
7 ZAKLJUČEK ... 17
8 VIRI ... 17 ZAHVALA
VI
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1 : Uporaba induciranih mutacij za odpornost na biotski stres v gojenju rastlin
(prirejeno po Priyadarshan, 2019) 9
Preglednica 2 : Slovenske sorte, ki so vpisane v skupno sortno listo poljščin in zelenjadnic
(prirejeno po Rozman, 2005) 16
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1 : Tranzicija in transverzija (prirejeno po Priyadarshan, 2019) 2 Slika 2: število novih kultivarjev po državah (Priyadarshan, 2019) 15
1 1 UVOD
Mutacija je trajna dedna sprememba, ki se pojavi v genetskem zapisu organizma. Poznamo več oblik mutacij, in sicer genske, kromosomske in genomske. Inducirane mutacije se od spontanih razlikujejo le v hitrosti nastanka. Povzročimo jih lahko z različnimi kemičnimi, fizikalnimi in biološkimi sredstvi. Natančneje, takšne mutacije vzpodbudimo npr. s sevanjem (gama in X- žarki, ultravijolično sevanje), z virusi in kemikalijami.
Mutirani aleli so vir nove genetske raznolikosti za spreminjanje lastnosti kmetijskih rastlin. Pri tem je ključnega pomena detekcija, izbiranje in izoliranje želenega novega alela. Ta proces je sestavljen iz pregleda, kjer žlahtnitelj izbira lastnosti, kot so zgodnejše cvetenje, odpornost na bolezni in škodljivce ali spreminjanje kakovosti hrane. Temu sledi potrditev oziroma izbira željenih mutantov. Mutacije, ki so ključne za izboljšanje poljščine, običajno vključujejo spremembe enega nukleotida in tako vplivajo na sintezo beljakovin (Jankowicz-Cieslak in sod., 2017).
Mutacije in samo razmnoževanje temelji na odbiri najboljših osebkov, kjer s samoopraševanjem poskrbimo, da dobimo želeno lastnost v homozigotni obliki. Nato sledi selekcija, ko pa mutirana linija kaže obetavno lastnost, je naslednji korak množenje semen za poljski preizkus ali pa vključevanje mutantne linije v žlahtniteljski program. Pri tem poskusu se testirajo in medsebojno primerjajo mutirana linija in matična sorta. Države, kjer so ustvarili največ novih sort z mutacijskim žlahtnjenjem, so Nizozemska, Japonska in ZDA. Največji delež rastlin pridobljenih z mutacijskim žlahtnjenjem predstavljajo osebki, ki so bili obsevani z gama žarki. Vodilno mesto zavzemajo žita, sledijo pa jim okrasne rastline in stročnice. Med žiti je na prvem mestu riž, kjer poznamo več kot 800 mutiranih sort, sledijo ječmen, pšenica, koruza, trda pšenica, oves, proso in druge (Priyadarshan, 2019).
1.1 NAMEN IN POVOD DELA
Za to delo sem se odločila, ker me na področju kmetijstva zanima genetika in postopki, kako se pridobivajo nove in boljše sorte, saj se skozi čas trendi in povpraševanje spreminjajo. V nalogi se bom osredotočila na vrste mutacij, kakšne inducirane mutacije poznamo in kako poteka mutacijsko žlahtnjenje. Predstavila bom različne postopke in primere rastlin, ki so bile požlahtnjene s tem inovativnim postopkom.
2 2 VRSTE MUTACIJ
Najpomembnejša značilnost genov oz. genetskega materiala je zmožnost identične reprodukcije iz generacije v generacijo. Vendar pa do evolucije življenja ne bi prišlo, če ne bi v tem postopku obstajala možnost nastanka sprememb v genetskem materialu. Dokazi kažejo, da imajo vsa živa bitja na našem planetu skupnega prednika, zato je moralo v času priti do opaznih sprememb genskih informacij. Takšnim spremembam pravimo mutacije (Vogel in Motulsky, 1986).
Mutacije povzročajo fizične spremembe dednega materiala in ker je deoksiribonukleinska kislina (DNA) sestavljena iz dolgega zaporedja baznih parov, obstaja veliko možnih načinov, kako se lahko ta spremeni. Mutacije lahko na splošno delimo na genske (intragene), ki se pojavijo znotraj gena v zaporedju DNA, kromosomske (medgene), kjer so pogosti pojavi inverzija, translokacija, duplikacija in delecija, poznamo pa tudi genomske mutacije, ki vodijo do sprememb števila kromosomov (pojav poliploidije, haploidije in anevploidije) in posledično pride do spremembe celotnega genomskega seta kromosomov.
2.1 GENSKE MUTACIJE
Genske mutacije nastanejo zaradi sprememb v zgradbi gena. Nukleotidi, ki ta gen sestavljajo, se lahko zamenjajo, kakšen lahko izpade ali pa se vrine v verigo nukleotidov. Mutacije na molekularni ravni se zgodijo z zamenjavo ene baze z drugo, kjer pride do napačne povezave med purinskimi in pirimidinskimi bazami. Točkovnim mutacijam, ki spremenijo en purin v drugega (adenin v gvanin) ali en pirimidin v drugega (citozin v timin), pravimo tranzicije, do transverzij pa pride, kadar se purin pretvori v pirimidin (Slika 1). To so najpreprostejše spremembe, ki pa lahko povzročijo fenotipsko vidne mutacije. Druga pogosta napaka je dodatek ali pa izbris nukleotidnega baznega para. Takšne mutacije lahko spremenijo sporočilo gena, poleg tega pa so tudi bolj vidne (Priyadarshan, 2019).
Slika 1 : Tranzicija in transverzija (prirejeno po Priyadarshan, 2019)
Tranzicija (A-T v G-C v tem primeru)
Transverzija (C-G v G-C v tem primeru)
3 2.2 KROMOSOMSKE MUTACIJE
Pri kromosomskih mutacijah pride do različnih situacij, in sicer do vstavljanja dodatnih več baznih parov (insercija) ali pa se izbriše sekvenca določenih genov (delecija), kjer se nukleotidi prerazporedijo v popolnoma nov nabor kodonov. To vodi do posledic pri sintezi beljakovin, kjer so aminokislinska zaporedja drugačna. Poznane so tudi mutacije, pri katerih se deli kromosoma podvojijo in premestitve (translokacije), kjer se del kromosoma prenese v nehomologni kromosom. Te so posledica napak med mejotsko delitvijo celic. Njihovi učinki so odvisni od tega, kako pozicijski efekt mutacije vpliva na delovanje genov. Nakopičenje takšnih odstopanj so bila temelj za evolucijo živih bitij (Mba, 2013).
2.3 GENOMSKE MUTACIJE
Genom je celotna dedna zasnova celice in s tem celotnega organizma. Odvisno od vrste oziroma položaja organizma ga lahko tvori ena sama ali več molekul DNA različnih velikosti, ki so nosilke dedne informacije. Genomi najpreprostejših organizmov vsebujejo po nekaj tisoč različnih genov, pri višjih organizmih pa je njihovo število bistveno večje. V projektu Human Genome Project so leta 2003 raziskali, da človeški genom vsebuje 20.500 genov (Pertea in Salzberg, 2010).
Pri genomskih mutacijah pride do spremembe v številu kromosomov, s tem pa se spremeni tudi struktura genoma. Spremembe v številu kromosomov povzročajo anevploidnost, monoploidnost ali poliploidnost. Pri anevploidnosti pride do izgube oziroma dodatka enega ali več kromosomov k običajnemu številu kromosomov. Kromosomi se lahko izgubijo oziroma dodajajo zaradi kakšne od opisanih kromosomskih sprememb, ki moti normalen potek mitoze oziroma mejoze. Ena najbolj poznanih humanih bolezni je trisomija enaindvajsetega kromosoma, tako imenovani Downov sindrom. Monoploidnost pomeni izgubo celotnega kompleta kromosomov, ne samo enega ali nekaj kromosomov posameznih kromosomskih parov; celica diploidnega organizma tako postane monoploidna. Poliploidnost pa pomeni, da ima celica oziroma organizem enega ali več dodanih celotnih garnitur kromosomov.
Monoploidnost in poliploidnost, ki sta genomski mutaciji, sta usodni za večino živalskih organizmov, pomembni pa sta bili tudi pri razvoju rastlinskih vrst (Komel, 1998).
3 ZNAČILNOSTI INDUCIRANIH MUTACIJ
Genetsko izboljšanje kmetijskih rastlin je ključnega pomena za reševanje pritiska na svetovno preskrbo s hrano (Ronald, 2011). Razpoložljivost dednih variacij je predpogoj za izboljšanje pridelka. Kjer te variacije naravno ne obstajajo, so lahko ustvarjene z naključnimi ali pa s ciljnimi metodami (Greene in sod., 2003). Katero vrsto inducirane mutacije izbrati, pogosto temelji na zabeleženih preteklih uspehih, razpoložljivosti mutagenih snovi, stroškov in opremi.
4
Največ mutiranih sort, ki so tudi registrirane, je bilo proizvedenih z ionizirajočim sevanjem, zlasti z gama žarki (Jankowicz-Cieslak in sod., 2017).
Inducirane mutacije se uporabljajo za ustvarjanje novih alelov, ki jih nato vključujejo za razvoj vrhunskih oziroma izboljšanih sort (Ahloowalia in Maluszynski, 2001). Sredstva, ki spodbujajo dedne spremembe, delimo na fizikalne in kemične mutagene. Posevki so lahko različno tretirani z mutagenimi snovmi. Pri rastlinah, ki se razmnožujejo s semeni, so z mutagenimi snovmi najbolj pogosto obdelana botanična semena, obdelane pa so lahko tudi vegetativno razmnožene rastline, kjer so obdelani na primer stebelni potaknjenci, vejice, brsti in gomolji (Mba, 2013).
Inducirana mutageneza je zdaj ena najpomembnejših tehnologij za razvoj novih sort, saj je v komercialnem gojenju vedno večje povpraševanje po njih. Te mutacije so ustvarjene s klasičnimi in in vitro tehnikami, na katere vplivajo radioobčutljivost, izbor materiala, izpostavljenost mutagenim snovem, obsevanju in druge (Datta, 2020).
Lastnosti, s katerimi želimo izboljšati kmetijske rastline, so zgodnost, odpornost na bolezni, višja donosnost in večji pridelek in tudi boljša kakovost (Maluszynski in sod., 1995). Mutagena sredstva povečajo variabilnost, ki se nanaša na ciljno lastnost določenega organizma. Postopek mutageneze je zelo natančno optimiziran na način, da povzroča kar največje število pozitivnih oziroma želenih mutacij, kar dosežemo z optimalno dozo mutagena in pa postopkom selekcije, kjer ima ključno vlogo uspešnost identifikacije mutiranih alelov (Blažič, 2014).
3.1 KEMIJSKE MUTAGENE SNOVI
Prednost kemijskih mutagenih snovi je, da jih je mogoče uporabljati brez posebej za to namenjenih laboratorijskih naprav. Kljub temu pa je njihova ključna slabost, da pri tej vrsti mutageneze lahko nastajajo večje nezaželene spremembe. Pri delu je potrebna velika pozornost in varnost, saj so kemijske mutagene snovi rakotvorne. Med najbolj znane in največkrat uporabljene snovi spadajo etil metansulfonat (EMS), 1-metil-1nitrosourea in 1-etil-1- nitrosourea. Najučinkovitejši so agensi alkiliranja, ki delujejo na DNA tako, da alkilirajo fosfatne skupine in purinske ter pirimidinske baze. Druga skupina je skupina osnovnih analogov, med katere spadata 5-bromo-uracil in maleinski hidrazin. Jasna in velika prednost je pri točkovnih mutacijah, ki jih ustvarjajo kemijski mutageni. Ker so kemijske snovi zelo reaktivne, je priporočljivo uporabiti sveže serije kemikalij, na samo učinkovitost mutageneze pa vplivajo tudi koncentracija, temperatura in čas tretiranja. Med omenjenimi snovmi, se lahko uporabljajo tudi razni antibiotiki (aktinomicin D, mitomicin C, sreptonigrin), dušikova kislina, ki citozin nadomesti z uracilom, ta pa se lahko poveže z adeninom, kar skozi replikacijske cikle vodi do tranzicij (Priyadarshan, 2019).
5 3.2 FIZIKALNE MUTAGENE SNOVI
Fizikalne mutagene snovi oziroma ionizirajoča sevanja so bila v zadnjih 80. letih uporabljena za razvoj več kot 70 % mutiranih sort (Priyadarshan, 2019). To so deli elektromagnetnega spektra, ki odbijejo atome iz njihovih orbital, ti pa potem postanejo ioni, od tukaj tudi izraz ionizirajoče sevanje. Za inducirane mutacije se uporabljajo kozmični, gama- in X-žarki. Tudi utravijolična svetloba, čeprav neionizirajoča, je sposobna doseči določeno stopnjo prodornosti v tkiva, zato je bila prav tako uporabljena pri indukciji mutacij. Ultravijolična svetloba ima namreč sposobnost, da reagira z DNA in drugimi biološkimi molekulami, saj te absorbirajo njene valovne dolžine. Poleg ionizirajočih sevanj pa so uporabljeni tudi drugi visoko energijski ionizirajoči delci alfa in beta ter nevtroni. Mutagenost teh sredstev izvira iz kombinacije njihovih sposobnosti, da proizvajajo ione, ki posledično povzročajo škodo na živih organizmih;
povzročena škoda se izraža skozi odstopanja na ravni DNA, kjer pride do raznih prekinitev kemijskih vezi v molekulah DNA, brisanja ali dodajanja nukleotidov, do velikih kromosomskih prelomov in prerazporeditev (Mba, 2013).
3.2.1 Obsevanje z gama žarki
Obsevanje je ionski proces, kjer se ne sprošča toplota in se uporablja kot funkcionalno modifikacijsko sredstvo pri raziskavah polimerov. Visokoenergijska raven elektromagnetnega spektra je sposobna odbiti elektrone iz jedrskih orbital atomov (Priyadarshan, 2019). V primerjavi z drugimi fizikalnimi metodami, kot so mikrovalovna, ultravijolična, tlačna in hidrodinamična obdelava, je ionizirajoča energija priročnejša, ker hitreje prodira skozi polisaharide (Abu in sod., 2005). Pri obsevanju rastlin s to obliko žarkov nastanejo spremembe v dednem zapisu ali pa v drugih celičnih komponentah, kjer pride do funkcionalnih sprememb beljakovin, encimov in presnovne aktivnosti (Zaka in sod., 2004). Pri obsevanju z UV svetlobo je bilo ugotovljeno, da ta škodljivo vpliva na zarodek repičnega semena, vendar pa je bila regeneracija nespremenjena, medtem ko je obsevanje z gama žarki povzročilo zmanjšano frekvenco zarodkov in rastlin (Szarejko in Forster, 2007).
4 POSTOPKI MUTAGENEZE ZA SPREMINJANJE LASTNOSTI
Eden najpomembnejših prebojev v zgodovini genetike je bilo odkritje eksperimentalne mutageneze v začetku 20. stoletja, kar je kasneje povzročilo gojenje rastlin s spremenjenimi lastnostmi. Z nepredstavljivim razvojem rastlinske molekularne genetike in funkcionalne genomike v zadnjem desetletju so se razvile tudi napredne tehnologije, ki temeljijo na edinstvenih aplikacijah pri odkrivanju genov in razvoju novih lastnosti pridelka (Babu in Prasanna, 2014).
Raziskave mutageneze so napredovale z metodami za odkrivanje genskih variacij, selekcijo mutantnih fenotipov, ciljno usmerjenimi induciranimi lokalnimi lezijami v genomih (metoda
6
TILLING), ponovnim sekvenciranjem, dodajanjem genov in modifikacijami mutacij in anevploidijo. Izzvane mutacije tako zajemajo različne genske modifikacije, ki vključujejo polimorfizme enega nukleotida, majhne insercije in delecije, kromosomske preureditve, pogosto pa pride tudi do podvojitve oziroma replikacije genov. Sestavni deli take raziskave pri rastlinah zajemajo razvoj induciranih mutantov za nadaljnje preučevanje morfološke, biokemične in fiziološke lastnosti ter preučevanje njihove genetske stabilnosti in ostalih agronomskih lastnosti. V tem primeru bo potrebna ustanovitev novih rastlinskih mutantov, ki so bili ustvarjeni s pomočjo kemijske ali fizikalne mutageneze, saj je te potrebno vzdrževati (Penna in Jain, 2017).
Vsaka strategija mutageneze zahteva več zaporednih korakov. Učinkovitost induciranih mutacij je odvisna od selekcije uporabnih mutiranih osebkov v drugi (M2) in tretji (M3) generaciji. Pri prvem koraku je potrebno zmanjšati možne različice med mutagenih semen in osebke, ki predstavljajo prvo generacijo (M1) razmnoženih rastlin, kar omogoča natančno oceno in analizo. Določitev ciljne velikosti populacije v prvi generaciji mutantov je predpogoj za potencialni uspeh katerega koli žlahtniteljskega programa. Osebki prve generacije (M1) so heterozigotni. To je posledica tega, ker je med postopkom mutacije prizadet samo en alel. Poleg tega je v tej generaciji mogoče prepoznati samo dominantne mutacije, kar pa ne velja za identifikacijo izražanja recesivnih mutacij, ki so opazne samo v homozigotnem stanju. V tem primeru se mora žlahtnitelj poslužiti ločevalnih tehnik. Uporabljajo se homozigotni osebki z dominantnimi oziroma recesivnimi aleli, potrebna pa je tudi previdnost, da ne bi prišlo do navzkrižnega opraševanja, saj bi to lahko povzročilo nastanek sprememb, ki bi jih težko razlikovali od učinka mutacije. Fizična ali mehanična selekcija s presejalnimi stroji se uporablja za učinkovito določanje oblike, velikosti, teže, gostote semen in podobno. Najučinkovitejša metoda za prepoznavanje mutiranih fenotipov pa je vizualni pregled, ki se uporablja pri izbiri rastline, glede na višino, prilagajanje zemlji, določanje rastne dobe, odpornosti na bolezni, spremembe barv, zgodnje zrelosti, prilagajanje podnebju itd. V zadnjem času se porabljajo tudi visokozmogljive fenotipske analize z zajemanjem in obdelavo slik. Ko se zdi, da je mutirana linija obetavna, je naslednji korak množenje semen za obsežna terenska preskušanja.
Preizkušajo se mutirana linija, matična sorta in druge varietete. Namen poljskega poskusa je ugotoviti, ali mutant obeta, da bo postal komercialna sorta, ki je boljša od matične sorte.
Testirati je treba tudi različne dejavnike izboljšane sorte, kot so rastne razmere, struktura in komponente pridelka v različnih okoljih z različno razpoložljivostjo vode, gostoto rastlin, rok setve … (Oladosu in sod., 2016).
4.1 IZBIRA RASTLINSKEGA MATERIALA
Verjetnost, da bo tehnika inducirane mutacije privedla do uporabnega materiala za selekcijo, je zelo odvisna od začetne izbire rastlinskega materiala in ravnanja z njim skozi celoten postopek selekcije. Pomemben dejavnik pri določanju izida mutageneze je izvor naključnih meristemov, ki povzročajo regenerirane rastline. Znanstveniki so predlagali mutageno obdelavo haploidnih
7
celic, kjer se tako omogoči izražanje recesivnih mutacij, čemur sledi podvajanje kromosomov za regeneracijo fertilnih rastlin. Mutageneza zahteva nizek somatski, a močan genetski učinek.
Po zaključenem postopku pa je treba ohraniti rast kulture, da se premagajo primarne poškodbe obsevanja in omogočiti oceno učinkovitosti postopka. Kulture se po obsevanju hitro prenesejo na sveže gojišče, da se prepreči tvorba strupenih snovi, lahko pa se jih pred obdelavo prenese v posode oziroma petrijevke, ki vsebujejo nekaj vode. Tako se poveča zaščita pred dehidracijo, hkrati pa je učinkovitejše tudi obsevanje. Po obdelavi je s kulturami mogoče manipulirati.
Poganjki se lahko odstranijo, naredijo se potaknjenci in se jih prenese v sveže razmnoževalna in/ali regeneracijska gojišča (Predieri, 2001).
4.2 SELEKCIJA ŽELENE LASTNOSTI
Selekcija vključuje metode, ki temeljijo na genotipskih podatkih celotnega genoma, pri tem pa lahko natančno izbere določeno lastnost. Cikel, ki je potreben za vzgojo določene rastline, traja 4 leta, vključno s triletnim poljskim testiranjem. Ta cikel se skrajša na 4 mesece, ki so potrebni za rast in razvoj. Tehnologije so najprej privedle do kvantitativne identifikacije lastnosti določenega lokusa, in nato do uporabe molekulskih markerjev. Te metode so bile zelo koristne za manipulacijo povezanosti alelov z markerjem, ne pa tudi za kvantitativne lastnosti, ki pa so še vedno zahtevale obsežno terensko testiranje. Metode selekcije s pomočjo markerjev predpostavljajo, da uporabnik oziroma žlahtnitelj ve, kateri aleli so ugodni in kakšni so njihovi povprečni učinki na izražanje fenotipa (Lorenz in sod., 2011).
4.2.1 In vitro selekcija
Pogost pojav, ki je posledica in vitro mutacij, je pojav genskih variacij. Te mutacije niso vedno izražene, kadar pa so, so očitne fenotipske in citološke spremembe regenerirane rastline iz kalusa. Med selekcijo v naravnih pogojih, žlahtnitelji nimajo na voljo natančnega orodja za selekcijo želene lastnosti in za doseg svojih ciljev potrebujejo več let. In vitro selekcija znatno skrajša čas, ki je potreben za odbiro želene lastnosti, ne da bi na to vplivalo zunanje okolje (Jain, 2010). Odbrane rastline se prenesejo v laboratorij, v posebne prostore, ki so namenjeni izključno razmnoževanju rastlin in vitro. Prostori morajo zagotavljati aseptične sterilne pogoje za delo, da ostanejo rastline, ki se razmnožujejo, brez stika z raznimi okužbami. Rastline, ki so bile razmnožene, so posajene v zaščiten prostor (rastlinjak, plastenjak), ki je zgrajen tako, da preprečuje dostop prenašalcem virusnih bolezni. Pred sajenjem se izvedejo ukrepi, s katerimi se zagotovi, da v substratu niso prisotni škodljivi organizmi (Vzdrževalna selekcija …, 2021).
4.2.1.1 Selekcija tolerance na slana tla
Nizka toleranca na odvečno sol v tleh ali v vodi je glavna omejitev gojenja kmetijskih rastlin.
Razvitih je bilo več metod selekcije za genotipe, odporne na sol. Toleranca visoko rastočih borovnic (Vaccinium corymbosum L.), ki so bile odbrane na gojiščih z visoko vsebnostjo NaCl,
8
je pozitivno korelirala s povečano kapaciteto celic, ki kopičijo natrijeve in kalcijeve ione.
Študija o metabolizmu celičnih linij, odpornih na sol pri citrusih, je zagotovila informacije o beljakovinah in encimih, ki sodelujejo pri prilagajanju na solni stres. Pristopi, ki temeljijo na biokemičnih, molekularnih in fizioloških študijah tkivnih kultur, so lahko zanesljivejša sredstva za razvoj rastlin, odpornih na sol. Biokemijske in molekularne analize lahko podpirajo genetske dokaze o opaženi fenotipski spremembi, vendar so terenski poskusi temeljni korak za oceno učinkovitega izboljšanja. Študije o drugih okoljskih dejavnikih so pokazale dobre korelacije med in vitro presajanjem in odzivi na terenu na znanih sortah, zaradi česar so te na voljo kot metode zgodnjega presajanja. Izbor je lahko koristen tudi pri določanju meja indukcije mutacij pred prehodom na terensko testiranje oziroma pred poljskim poskusom (Predieri, 2001).
4.3 IZBIRA MUTAGENE SNOVI
Dolgo veljavna predstava, ki verjetno vpliva na izbiro vrst mutagenih snovi, je ta, da kemijske mutagene snovi povzročajo točkovne mutacije, medtem ko fizikalne mutagene snovi povzročajo kromosomske mutacije in prerazporeditve. Trenutni empirični podatki tega sklepa ne podpirajo; bolj verjetno je sklepati iz razpoložljivih informacij, da so pogostost in vrste mutacij neposredni rezultat odmerjanja in stopnje izpostavljenosti mutageni snovi kot pa sami vrsti mutageneze. To pomeni, da bi bila podaljšana potopitev rastlinskih propagacijskih tkiv v visoko koncentracijsko raztopino natrijevega azida (NaN3) enako škodljiva ali celo smrtonosna, kakor podaljšana izpostavljenost velikim odmerkom ionizirajočega sevanja. V vseh primerih je treba pred obsežnim induciranjem mutacij vedno določiti optimalne odmerke mutagenih snovi.
Prav tako je potrebno poudariti, da so kemični mutageni toksini, ki običajno zahtevajo razstrupljanje laboratorijske posode in odstranjevanje uporabljenih reagentov. Tveganje, ki ga povzročajo fizikalne mutagene snovi, je za zdravje veliko manjše. Na koncu bo izbira mutagene snovi temeljila na okoliščinah določenega raziskovalca, kar zavzema razpoložljivost mutagenih snovi, s tem pa so povezani tudi stroški in razpoložljiva infrastruktura (Mba, 2013).
4.3.1 Optimalni odmerki za uspešno mutagenezo
Pri ustvarjanju novih mutantov je glavni cilj pridobiti primerno število mutacij za izbrano lastnost, hkrati pa povzročiti malo nenamernih motenj v genotipu kmetijske rastline. To zagotavlja, da mutant ni ogrožen zaradi prisotnosti nenamerno povzročenih škodljivih mutacij, ki bi zahtevali dodatne postopke, čas in pa vire. Splošna norma odmerka je takšna, da povzroči zmanjšanje od 30 do 50 ali od 40 do 60 odstotkov preživetja osebkov prve generacije (M1) v primerjavi z osebki, ki niso bili tretirani. Zmanjšanje stopnje kalivosti, višine osebkov, stopnje preživetja in plodnosti in mutacija klorofila pri M2 generaciji, so glavni parametri, ki so izmerjeni s testi občutljivosti za določanje optimalnih odmerkov (Mba, 2013).
9
5 LASTNOSTI, KI SO BILE INDUCIRANE ZA IZBOLJŠANE POLJŠČINE
Do zdaj je bilo s pomočjo induciranih mutacij dobljenih več kot 3220 registriranih sort po celem svetu. Številni inducirani mutanti so bili izdani neposredno kot nove sorte; drugi so bili uporabljeni kot starševski osebki, ki so botrovali k nastanku novih sort. Od 3220 sort je bila večina sort (80 %) razmnožena s pomočjo semena, kjer so izmed sejancev izbrali določenega mutanta in njegovo nadaljnje množenje opredelili kot novo varieteto oziroma sorto (Ahloowalia in sod, 2004). Poljščine predstavljajo kar 75 %, okrasne rastline pa 25 % skupnih sort. Večina sort, ki so bile izdane do leta 2007, je bilo razmnoženih s semenom – te vključujejo 1072 žit in 311 stročnic. Glavna strategija pri žlahtnjenju na podlagi mutacij je bila nadgraditi dobro prilagojene rastlinske sorte s spremembo ene ali dveh glavnih lastnosti. Med te lastnosti spadajo višina rastline, zrelost, drobljenje semen, odpornost proti boleznim, kar predstavlja večji donos pridelka in boljšo kakovost. V mnogih primerih pa je prišlo do sinergije med gojenjem pridelka, agronomskimi vložki, kolobarjenjem in uporabo. Genotip, ki je predstavljal nižjo rast, je v rižu, pšenici, ječmenu in koruzi prispeval k povečanju pridelka zrnja zaradi manjšega poleganja rastlin in večje gostote sajenja (Szarejko in Forster, 2007).
5.1 EKONOMSKI VPLIV NOVIH SORT
Ekonomsko vrednost novih sort je mogoče oceniti s pomočjo več parametrov. To so večji donos, izboljšana kakovost, manjša uporaba pesticidov in fungicidov (npr. sorte odporne proti boleznim in žuželkam), manjša poraba vode (toleranca na sušo), potrošnik daje prednost kakovosti (nova barva pri okrasnih rastlinah, korenovkah, sadnih rastlinah), večja hranilna vrednost (višja vsebnost vitaminov), podaljšan rok trajanja in druge.
Preglednica 1: Uporaba induciranih mutacij za odpornost na biotski stres pri gojenih rastlinah (prirejeno po Priyadarshan, 2019)
Odpornost Poljščina
Odpornost na krompirjevo bakterijsko uvelost na paradižniku (Ralstonia
solanacearum) paradižnik
Odpornost na belo gnilobo (Sclerotinia sclerotiorum) oljna repica Odpornost na jablanovo pepelovko (Podosphaera leucotricha) in jablanov škrlup
(Venturia inaequalis) jablana
Odpornost na plesen Ascochyta in fuzarijsko uvelost čičerika
Odpornost na virus rumenega mozaika fižol mungo
Odpornost na črno stebelno gnilobo trda pšenica
Odpornost na žitno progasto rjo pšenica
Odpornost na sivo riževo pegavost, virus rumene lisavosti, bakterijsko listno
pegavost in bakterijsko listno progavost riž
Odpornost na listno pegavost glive Myrothecium in na virus rumenega mozaika soja Odpornost na bakterijsko pegavost in na virus kodravosti listov bombaža bombaž Odpornost na pritlehno trohnobo (Phytophthora nicotianae var. parasitica) sezam
Odpornost proti patogenu Striga asiatica koruza
10
Inducirane mutacije pogosto predstavljajo več prednosti, kot pa samo enostavno fenotipsko spremembo (Ahloowalia in sod., 2004). Mnoge poljščine so odporne na različne bolezni, kot so gniloba stebla pri oljni repici, pepelasto plesen in jablanov škrlup pri jablani, črno gnilobo stebla pri trdi pšenici in druge (Preglednica 1).
5.2 VODILNI MUTANTI VISOKE VREDNOSTI
Sorte, ki so bile pridobljene s pomočjo mutacij, vključujejo mnoge poljščine, kot so riž, pšenica, bombaž, sončnice, sezam, grenivke in banane. Mnoge poljščine predstavljajo velik ekonomski delež kmetijstva, med temi so sorte riža v Avstraliji, Indiji, Pakistanu, na Kitajskem in Tajskem, bombaž v Pakistanu, japonska hruška na Japonskem, grenivka in sončnica v ZDA, mnoge sorte ječmena v Evropi, trda pšenica v Italiji, okrasne rastline v Indiji, na Nizozemskem in Nemčiji ter mnoge druge. Absolutne ekonomske vrednosti mutiranega gena pa ni mogoče določiti, saj geni v celem genomu delujejo vzajemno z drugimi, kar nato predstavlja spremembo donosa in kakovosti končnega proizvoda (Ahloowalia in sod., 2004).
5.2.1 Riž
Riž predstavlja glavni vir hrane oz. ogljikovih hidratov za več kot 50 % svetovnega prebivalstva. Različne tehnike, s katerimi so povzročili mutacije, so imele pomembno vlogo pri povečanju proizvodnje riža, predvsem v Aziji. Mutirane sorte riža z izboljšanimi lastnostmi nosijo alele za zgodnjo zrelost, izboljšan donos in kakovost zrn, odpornost na bolezni in mraz ter spremenjeno višino rastlin. Od tega jih je bilo 56 % induciranih z gama žarki, nekaj pa tudi z rentgenskimi žarki in drugimi viri sevanja. V Pakistanu je bila leta 1977 iz sorte 'Basmati 370' s pomočjo inducirane mutacije izdana nova sorta 'Kashmir Basmati', ki prej dozori in je tolerantna na mraz. Kljub temu pa je sorta ohranila aromo in kuharsko kakovost starševskih osebkov, saj drugače običajno križanci med Basmati rižem in sortami, ki niso aromatične, ne ohranijo lastnosti arome starševskih linij Basmati (Ahloowalia in sod., 2004).
Žlahtnitelji se za gensko raznolikost odločajo predvsem na podlagi morfoloških značilnostih, ker je njihovo ocenjevanje relativno poceni, hitro in dokaj enostavno. Prav tako se za to ocenjevanje ne uporablja zahtevne in drage opreme, poleg tega pa jih je mogoče dokazovati tudi brez posebnih biokemijskih in molekularnih tehnik (Oll, 1990).
Mutanti riža so bili ustvarjeni z uporabo tradicionalnih mutagenih snovi, kot so ionizirajoče sevanje in s kemičnimi sredstvi, kjer so lahko opredelili, kako geni sodelujejo pri razvojnih in fizioloških lastnostih riža. Pojavile so se različne vrste mutacij, ki so segale od sprememb posameznih nukleotidov do velikih delecij ali kromosomskih prerazporeditev. Posebno vrednost imajo kemični mutageni, ki povzročajo majhne spremembe, kot so točkovne mutacije ali majhne delecije. Kemični mutageni in ionizirajoče sevanje pa ponujajo tudi druge prednosti.
Mnoge podatkovne baze mutantov so bile razvite kot rezultat prizadevanj za ustvarjanje
11
induciranih virov mutantov. Te zbirke s pomočjo genotipskih in fenotipskih informacij omogočajo raziskovalcem prepoznati mutante, ki jih zanimajo za nadaljnje študije. Nekatere izmed teh podatkovnih zbirk so IRIS, Orzyabase in Gramene (Tai, 2007).
Lokalni kmetije gojijo tradicionalne sorte riža v neugodnih razmerah, kot so suha zemljišča v hribovitih predelih, kisla in močvirnata zemlja, mnoga zemljišča so tudi večkrat poplavljena in slana. Zato je mogoče tradicionalne sorte riža, ki dobro prenašajo biotske in abiotske obremenitve, prilagoditi in ustvariti takšne z dobrim okusom glede na želje potrošnikov (Science, 2020).
5.2.2 Paradižnik
Paradižnik (Lycopersicon esculentum L.) spada v družino Solanaceae in je pomembna zelenjadnica zaradi hranilne vrednosti. Vsebuje namreč veliko vitaminov in mineralov (vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, in vitamin C). Je diploidna rastlina in v njegovem fenotipu je jasno prepoznati različne vrste mutacij. Večina teh predstavlja modifikacije oblike, velikosti, barve in višine ter števila plodov na rastlino. Starševske sorte z nenavadnimi lastnostmi so običajno pridobljene v prvem koraku z mutagenezo in kasneje izpostavljene gojitvenim poskusom, da bi tako dobili bolj stabilne in spremenjene linije rastlin. Tkivne kulture so temelj metodologij, ki vodijo do mutiranih rastlin preko uporabe različnih vrst mutagenih snovi v optimiziranih pogojih (Ishfaq in sod., 2012).
Paradižnik je najnaprednejši model za rastline, ki imajo mesnat plod (npr. grozdje in pomaranče), poleg tega pa je paradižnik ekonomsko najpomembnejša sveža in predelana zelenjava na trgu. Mutante paradižnika so zbirali več desetletij, danes pa je 978 monogenih linij opisanih in na voljo v CM Rick Tomato Genetic Resource Ceter na Kalifornijski univerzi. Te linije prihajajo iz več virov, in sicer iz spontanih, induciranih mutantov pa tudi naravnih različic in divjih sorodnikov paradižnika (Emmanuel in Levy, 2002).
Pri postopkih mutageneze paradižnika se lahko pojavljajo različne težave. Ploda paradižnika ni mogoče dolgo hraniti, zato je treba seme iz ploda odstraniti takoj po obiranju, kar pa zahteva obsežno delo v kratkem obdobju. Večina sort je visokih (1 meter pri determinantnih sortah in več kot 2 metra pri indeterminantnih sortah) z razmeroma dolgim življenjskim ciklom, saj od kalivosti semen pa do zorenja traja 90–110 dni (Emmanuel in Levy, 2002).
Mutanti paradižnika so bili in so še vedno prisotni pri gojenju paradižnika. Poleg tega so zasebna podjetja začela uporabljati mutagenezo za odkrivanje genov paradižnika in za razvoj novih izdelkov. Med temi podjetji nekateri rastlinski oddelki uporabljajo mutagenezo s pridobitvijo neke funkcije v paradižniku. To je mutacija, ki daje beljakovini novo ali okrepljeno aktivnost, medtem ko drugi v paradižniku uporabljajo s transpozoni posredovano mutagenezo ali pa uporabljajo EMS in mutagenezo s hitrimi nevtroni. Uporaba miniaturnih linij
12
paradižnikov lahko olajša ravnanje z velikimi populacijami, ki se uporabljajo pri postopkih reverzne genetike. Kratkoročno bi lahko TILLING metoda (metoda, ki omogoča direktno identifikacijo mutacije v specifičnem genu) zagotovila hiter pristop k reverzni genetiki mutantnih populacij paradižnika. Dolgoročno pa so predvidevali, da je najlažje iskati mutante v tarčnih genih z iskanjem po podatkovnih bazah, ki prikazujejo insercijska mesta (Emmanuel in Levy, 2002).
Pridelek je najpomembnejša lastnost poljščin. Za rastline, kot je paradižnik, tvorba plodov neposredno vpliva na donos. Končna velikost plodov je odvisna od števila in prostornine celic v perikarpu, kar je določeno s stopnjo delitve in širjenja celic, tako je pridelek plodov pretežno odvisen od končnega števila celic in velikosti plodov. Z udomačenjem paradižnika se je donos paradižnika znatno povečal zaradi mutacij, povezanih z velikostjo plodov, saj so študije odkrile gene, ki vplivajo na celični cikel in število plodov (Ariizumi in sod., 2013).
5.2.3 Bombaž
Bombaž je gospodarsko pomembna rastlina, ki se goji v mnogih delih sveta in je vodilna predivnica v svetu. Imenovan je tudi belo zlato, saj ima prevladujoč položaj med vsemi poljščinami v Indiji. Za Indijce je pomembna surovina v tekstilni industriji, saj zagotavlja približno 65 % potreb industrije. Je tudi pomemben vir jedilnega olja in beljakovin, stranskih proizvodov, kot so bombažne pogače, lupine in bombažna stebla, ki so uporabna za proizvodnjo več industrijskih dobrin (IAEA, 2005). Domači bombaž ima edinstven izvor in zgodovino med gojenimi pridelki (Ritchie in sod., 2004). Bombaž se goji na suhih tleh in se redno namaka.
Kultivarji morajo premagati sušni stres, tako pa se zmanjša izguba pridelka na suhih območjih in poraba vode, ki je potrebna za namakanje. Suša je namreč velik problem, saj se tako zmanjša rast in razvoj korenin, prav tako pa so mnoge študije pokazale, da suša zavira razvoj rastline (Pace in sod., 1999).
Dva glavna problema pri gojenju bombaža sta kratko rastno obdobje in bolezen, ki jo povzročajo glive rodu Verticillium (verticilijska uvelost), zato morajo biti novejše sorte bombaža takšne, da zgodnost in odpornost na bolezen kombinirajo s produktivnostjo rastline in kakovostjo vlaken (Kechagia in sod., 1994). Med različnimi metodami, ki so bile uporabljene, so bile inducirane mutacije uporabljene kot pomembno orodje za ustvarjanje kakovostnih in količinsko pomembnih lastnosti v bombažu, zlasti različne stopnje odpornosti na biotski in abiotski stres, pridelka semen in vsebnosti olja (IAEA, 2005).
V žlahtniteljskem centru za gojenje bombaža v Indiji so vzgojili dve tetraploidni sorti MCU 5 in MCU 11 bombaža (Gossypium hirsutum L.) z dobro razvitimi, svežimi, enotnimi in jasnimi semeni. Nekateri osebki so bili obsevani z različnimi valovnimi dolžinami gama žarkov, drugi pa so bili tretirani s kemijskimi mutagenimi snovmi, kot so EMS in natrijev azid (NaN3).
13
Mutanti so kazali značilnosti, kot so zgodnejše cvetenje, večji pridelek, večje število semen in večje razvejanje (IAEA, 2005).
5.2.4 Sončnice
Sončnica (Helianthus annuus L.) spada v družino nebinovk (Asteraceae), njena ocenjena velikost genoma je 3000 Mbp in je ena izmed najpomembnejših poljščin za pridelavo olja.
Prihaja iz severne Amerike, vendar se goji po vsem svetu. Številne vrste divjih sončnic so bile uporabljene kot genski viri za izboljšanje gojenih sort v konvencionalni pridelavi. Poznavanje genoma in njegova manipulacija sta prispevala k stalnem izboljšanem donosu, kakovosti in agronomski uspešnosti te kulture v zadnjih desetletjih. Med selekcijo ciljnih lastnosti za izboljšanje kulture so bili izbrani številni aleli, ki izvirajo iz naravnih populacij sončnic (Zambelli in sod., 2015).
Inducirane mutacije so bile pogosto uporabljene v žlahtniteljskih programih, saj so zahtevale nizke stroške in manj napredne tehnološke metode, prav tako pa so prispevale k večji genetski variabilnosti. Mutageneza tako ne nadomešča konvencionalnih metod žlahtnjenja, temveč jih dopolnjuje. Omogočile so razvoj več lastnosti sodobnega genotipa sončnic, še posebej pa je bil pomemben napredek trženja sončničnega olja in pa ustvarjanje genotipov, odpornih na herbicide (Zambelli in sod., 2015).
Rastlinska olja veljajo za dragocene proizvode v svetovnem trgu, saj so povezana s posebnimi zahtevami glede kakovosti, tako za prehrano, kot tudi za druge potrebe. Sestavljajo jih triacilgliceroli, ki predstavljajo 92–98 % celotne vsebnosti in tudi fosfolipidi, galaktolipidi, monoacilgliceroli, diacilgliceroli in manjše količine prostih maščobnih kislin. Tri glavne lastnosti, kako izboljšati kakovost olja, so sestava maščobnih kislin, sestava triacilglicerola ter količina in sestava antioksidantov, ki so prisotni v olju. Sposobnost vnašanja novih maščobnih kislin v rastline temelji na razumevanju presnovnih poti za sintezo posameznih maščobnih kislin, vedno večji razpoložljivosti genov, ki kodirajo vključene biosintetske encime in zdaj že dobro uveljavljena sposobnost metabolizma za izražanje genov, ki kodira enosmerno ali večstopenjsko biosintetsko pot. Sončnica je drugi največji vir, iz katerega pridobivajo rastlinsko olje v Evropi, kjer sta s prehranskega vidika zaželena povečana vsebnost oleinske kisline (70
%) in zmanjšanje linolne kisline (20 %), zato se je gojenje sončnic osredotočilo predvsem na spremembo relativne količine maščobnih kislin, s čimer se je povečala vsebnost oleinske kisline, kar je pomenilo večjo stabilnost takih olj (Zambelli in sod., 2015).
V zadnjem desetletju je bilo odkritih več genov, ki ponujajo odpornost na herbicide in tudi nove številne tehnologije za zatiranje plevela. Pravilna uporaba teh tehnologij je omogočila izjemno zatiranje plevela pri sončnicah, vendar pa je potrebno nekatere gene in alelne interakcije preizkusiti in razviti, da bi zopet ustvarili nove pristope zatiranja. Glede na način delovanja se pogosto uporablja zaviranje encima acetohidroksi kislinske sintaze (AHAS), kar pa vodi k hitri
14
selekciji tolerantnih plevelov, ki lahko ogrozijo trajnost tehnologij. Selekcija divjih vrst sončnic in mutiranih knjižnic bo omogočila odkrivanje novih virov tolerance na herbicide, zlasti pa drugih načinov delovanja poleg zaviranja encima AHAS. Poleg tega pa je treba raziskati tudi nove interakcije med mehanizmi tolerance (Sala in sod., 2012).
5.2.5 Sezam
Sezam (Sesamum indicum L.) je pomembna oljnica, ki je odporna na sušo in vročino. Njegova semena so dober vir beljakovin, olja, vitaminov in mineralov. Povprečen pridelek semen pa je zaradi nepravilne pridelave kultivarjev nizek. Pri pridelavi namreč uporabljajo majhne količine gnojila, kultivarji so fotoperiodno občutljivi, kot sekundarni posevek pa se ga pogosto prepozno seje. Ob zrelosti se pri večini komercialnih sort kapsule odprejo in semena se razsujejo po tleh, k temu pa velikokrat pripomore veter. Da bi se povečala produktivnost te poljščine, bi morali zagotoviti pogoje namakanja, saj je tako donos sezama mogoče povečati skoraj trikrat (Diouf in sod., 2010).
Pri gojenju sezama se pojavijo številni dejavniki stresa, vključno s slanostjo, sušo, poplavo in mrazom. Sezam se namreč goji na sušnih in polsuhih tleh, kjer je njegova produktivnost omejena s sušo in slanostjo. Komercialna proizvodnja in razširjenost je omejena z nizkim pridelkom, škodljivci, boleznimi in neenotno zrelostjo kapsul. Glavni žlahtniteljski cilji so izboljšanje zadrževanja semen v kapsuli med in po zrelosti, večji pridelek semen, odpornost na škodljivce in bolezni, znižanje stopnje proizvodnje grenkih semen in prilagoditev rastline na različne strese (Islam in sod., 2016).
Pri tej poljščini so trajnostno razvili nekatere lastnosti, kot je rezistenca na biotski stres. Biotski stres, kamor uvrščamo bolezni in škodljivce, negativno vpliva na pridelek, kar se kaže v nepredvidenih izgubah produktivnosti rastline in posledično tudi pridelka. Te izgube so pomembnejše tam, kjer primanjkuje odpornih ali tolerantnih sort. Razvoj odpornih kultivarjev na biotski stres tako poveča pridelek sezama, prav tako pa pomaga obvladovati biotske obremenitve. Kultivarji, ki dobro prenašajo sušo in učinkovitejše uporabijo vodo, so koristni, saj se sezam običajno goji na obrobnih območjih, kjer se soočajo z vodnim stresom. Gojenje poljščine bi lahko potekalo v širšem spektru agroekoloških pogojev, ki temeljijo na kombiniranju odpornosti in tolerance na posameznem območju. Na nacionalni in mednarodni ravni je treba zagotoviti dobro razvit program za testiranje in razširjanje sort, ki izhajajo iz takšnih prizadevanj. V zadnjem času pa so v Koreji, Keniji, Indiji in Izraelu ustanovili genske banke za učinkovito upravljanje in spodbujanje razvoja genskih virov sezama (Islam in sod., 2016).
15
6 DRŽAVE, KJER SO BILE USTVARJENE NOVE SORTE
Azija je med celinami na prvem mestu po izdanih sortah mutantov. Kitajska je na prvem mestu pri razvoju novih sort z inducirano mutagenezo, prav tako pa je precej pred drugimi državami tudi po številu ustvarjenih novih sort (Slika 2). Pridelki žit mutagenih sort odtehtajo največji odstotek, ki predstavlja kar 48 % novih sort. Japonska je država, kjer so obstoj 242 novih sort zagotovili z obsevanjem, kemično mutagenezo in s somaklonalnimi variacijami. Indija je med letoma 1950 in 2009 razvila približno 329 mutiranih sort riža, pšenice, ječmena, prosa, arašidov, soje, čičerike, fižola, sladkornega trsa, krizantem, tobaka in dalij (Priyadarshan, 2019).
Slika 2: Število novih kultivarjev po državah (prirejeno po Priyadarshan, 2019)
Zaradi široke uporabe visoko rodnih sort je Vietnam postal drugi največji izvoznik riža. Na leto izvozi 4,3 milijona ton, trenutno mutirane sorte pa prispevajo 15 % k letni proizvodnji riža.
Tolikšna proizvodnja riža je privedla do zmanjšanja lakote in revščine. Poleg večjega pridelka pa so bile pridobljene tudi sorte z večjo vsebnostjo beljakovin, amilaze in arome. Velik pomen pa predstavlja toleranca na slanost, mraz in sušo (Priyadarshan, 2019).
Tudi evropske države so bile dejavne v programih vzgoje s pomočjo mutacij. V Bolgariji je bilo s pomočjo inducirane mutageneze sproščenih 76 novih sort, kjer koruza predstavlja kar 26 novih sort. 'Kneja 509' je hibrid koruze, ki zavzema 50 % rastnih površin. V drugih evropskih državah je razvoj nizko rastočih in visoko rodnih kultivarjev ječmena 'Golden Promise' in 'Diamant' močno vplival na pivovarsko industrijo. Ti so bili uporabljeni tudi kot starševski rastlini za številne vodilne sorte ječmena po Evropi, Severni Ameriki in Aziji. 'Golden Promise' je sorta, ki je bila izdana leta 1965 na takratnem Češkoslovaškem. Razvita je bila tako, da so
Kitajska Japonska
Indija Rusija Nizozemska Nemčija ZDA Bolgarija Vietnam Pakistan Bangladeš Kanada Francija Italija Koreja UK Poljska Indonezija Švedska Ostale
16
sorto 'Maythorpe' obsevali z gama žarki. Priljubljena je na Irskem, Škotskem in v Veliki Britaniji, kjer se uporablja predvsem za pivovarstvo. Sorta 'Diamant' ima za 12 % večji pridelek, je 15 cm nižje rasti in zavzema 43 % površine ječmena (Priyadarshan, 2019).
6.1 SLOVENSKE POŽLAHTNJENE SORTE KMETIJSKIH RASTLIN
V tem poglavju omenjam tudi sorte, ki so rezultat tudi klasičnega žlahtnjenja in ne samo postopkov mutacijskega žlahtnjenja. Prva požlahtnjena sorta, ki je bila vpisana v sortno listo po koncu 2. svetovne vojne, je bila ozimna rž 'Tetraploidna okta', ki je imela 4n garnituro kromosomov in katere avtor je bil prof. dr. Jože Spanring. Pri pšenici sta v Sloveniji dve požlahtnjeni sorti, in sicer 'Marinka' in 'Reska', pri ajdi pa so 4 sorte in sicer 'Siva', 'Darja', 'Darina' in 'Rana 60'. Pri žitih je v Sloveniji relativno malo domačih sort. Pri krompirju je kar 17 slovenskih sort, vendar pa jih 10 ni več v zadnji sortni listi. Še vedno pa se v sortni listi nahajajo sorte 'Kresnik', 'Pšata', 'Cita' in 'Bistra' (Preglednica 2).
Preglednica 2 : Slovenske sorte, ki so vpisane v skupno sortno listo poljščin in zelenjadnic (Rozman, 2005) Vrsta
Species
Sorta Cultivar
Vpis v sortno listo Year of registration
Prijavitelj Applicannt's
name
Koruza Zea mays L. 'Lj-180' * 1996 BF
Krompir
Solanum tuberosum L.
'Cvetnik' 1964 KIS
'Vesna' 1970 KIS
'Jana' 1973 KIS
'Kresnik' 1989 KIS
'Pšata' 2004 KIS
'Bistra 2004 KIS
Mnogocvetna ljulka
Lolium multiflorum Lam. subsp. non alter
'Laška' *, + 2001 CRKP Jable
Lucerna
Medicago sativa L.
'Soča' 2003 SEM
'Krima' 2003 SEM
Šalotka
Allium ascalonicum L.
'Pohorka' 1996 SEM
'Kozjanka' 2000 SEM
Čebula Allium cepa L.
'Tera' 1996 SEM
Radič Cichorium intybus L. (partim) 'Vervit' * 1996 SEM
Glavnata solata Lactuca sativa L.
'Leda' * 1996 SEM
'Marija' 1998 Oswald d.o.o.
Nizki fižol
Phaseolus vulgaris L.
'Stanko' 1998 Oswald d.o.o.
'Filip' 1998 Oswald d.o.o.
Paradižnik
Lycopersicon lycopersicum (L.)
'Val' * 1999 SEM
Strniščna repa
Brassica rapa var. rapa
'Kranjska podolgovata' * 1995 SEM
* - zavarovane po ZSMKR; protected under the ASPMA,
+ - ni vpisana v Evropsko sortno listo; not registered in EC common catalogue.
17
Po 1 sorto imamo pri soji, topinamburju in krmni ogrščici, pri hmelju, ki pa se v Sloveniji že tradicionalno žlahtni, je vzgojenih kar 11 slovenskih sort. To so sorte 'Ahil', 'Apolon', 'Cekin', 'Celeia' in druge, nekatere sorte serije C so triploidne in pridobljene z mutacijskimi postopki.
Po letu 1991 je bilo v Sloveniji požlahtnjenih veliko vrtnin, kot so fižol, glavnata solata, motovilec, paradižnik, zelje. Vinska trta v Sloveniji vsebuje kar 26 vpisanih slovenskih sort. S selekcijo trte se ukvarjajo na Kmetijskem inštitutu Slovenije, kjer so bile sorte vzgojene s pomočjo klonske selekcije iz starih sort, kar pa je ena glavnih žlahtniteljskih metod vinske trte (Rozman, 2005).
7 ZAKLJUČEK
Za spreminjanje genetskega potenciala kmetijskih rastlin so uporabili različne načine in metode. Ena izmed možnosti so inducirane mutacije, ki jih sprožajo mutageni dejavniki, ki so lahko kemijski, fizikalni ali biološki. Pri izbiri metode moramo upoštevati selekcijsko metodo, ki temelji na oceni genotipa in fenotipa rastline, kjer se lahko natančno izbere želena lastnost.
Z laboratorijskimi in nato praktičnimi poizkusi smo danes sposobni ustvariti nove sorte rastlin, ki vsebujejo lastnosti, ki so izboljšane in pritegnejo tako pridelovalca kot potrošnika. Velika prednost je tudi to, da smo zmožni pridelati večjo količino hrane, saj te rastline zagotavljajo tudi višji pridelek, prav tako pa jih je zmožno gojiti na različnih marginalnih območjih, saj so odporne ali tolerantne na biotske in abiotske dejavnike.
Poleg razvoja različnih metod, kako bi izboljšali kmetijske rastline, se je potrebno zavedati, da je potrebno izbrati lastnosti, ki so zares primerne in bi lahko prispevale k boljšem življenju in počutju ljudi, kljub temu pa ne bi smele vplivati na onesnaževanja okolja, saj je okolica naravni vir, ki je ključen za pridelavo hrane.
8 VIRI
Abu J.O., Muller K., Duodu K.G., Minnaar A. 2005. Functional properties of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) flours and pastes as affected by γ-irradiation. Food Chemistry, 93, 1: 103-111
Ahloowalia B.S., Maluszynski M. 2001. Induced mutations - A new paradigm in plant breeding. Euphytica, 118, 2: 167-173
Ahloowalia B.S., Maluszynski M., Nichterlein K. 2004. Global impact of mutation-derived varieties. Euphytica, 135: 187-204
Ariizumi T., Shinozaki Y., Ezura H. 2013. Genes that influence yield in tomato. Breeding Science, 63, 1: 3-13
Babu R., Prasanna B.M. 2014. Molecular breeding for quality protein maize (QPM). V:
Genomics of plant genetic resources. Dordrecht, Springer: 489-505
18
Blažič M., Čadež N., Jamnik P., Paš M., Petković H. 2014. Biotehnologija mikroorganizmov:
delovno gradivo za vaje. Ljubljana, BF, Študij biotehnologija: 44 str.
Datta S.K. 2020. Induced mutations: technological advancement for development of new ornamental varieties. Nucleus, 63: 119-129
Diouf M., Boureima S., Diop T., Çaǧirgan M.I. 2010. Gamma rays-induced mutant spectrum and frequency in sesame. Turkish Journal of Field Crops, 15, 1: 99-105
Emmanuel E., Levy A.A. 2002. Tomato mutants as tools for functional genomics. Current Opinion in Plant Biology, 5, 2: 112-117
Greene E.A., Codomo C.A., Taylor N.E., Henikoff J.G., Till B.J., Reynolds S.H., Enns L.C., Burtner C., Johnson J.E., Odden A.R., Comai L., Henikoff S. 2003. Spectrum of
chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.
Genetics, 164, 2: 731-740
International Atomic Energy Agency. 2005. Mutation Breeding Newsletter and Reviews No.1. Seibersdorf, IAEA: 24 str. https://www-
pub.iaea.org/MTCD/Publications/PDF/Newsletters/MB-NL&R-01.pdf (13.7.2021) Ishfaq M., Nasir I.A., Mahmood N., Saleem M. 2012. In vitro induction of mutation in tomato
(Lycopersicon esculentum L.) cv. Roma by using chemical mutagens. Pakistan Journal of Botany, 44, 1: 311-314
Islam F., Gill R.A., Ali B., Muhammad A. F., Ling X., Ullah N., Weijun Z. 2016. Sesame. V:
Breeding oilseed crops for sustainable production. Elesevier: 135-147
Jain S.M. 2010. Mutagenesis in crop improvement under the climate change. Romanian Biotechnological Letters, 15, 2: 88-106
Jankowicz-Cieslak J., Mba C., Till B. J. 2017. Mutagenesis for Crop Breeding and Functional Genomics. V: Biotechnologies for Plant Mutant Breeding. Springer: 3-18
Kechagia U.E., Xanthopoulos F.P., Sarropoulou M. 1994. Development of improved cotton cultivars by induced mutations. V: International atomic energy agency (IAEA). Vienna, IAEA: 159-162
Komel R. 1998. Genetske bolezni in genska preiskava. Proteus, 8, 60: 344-356
Lorenz A.J., Chao S., Asoro F.G., Heffner E.L., Hayashi T., Iwata H., Smith K.P., Sorrells M.E., Jannink J.L. 2011. Genomic Selection in Plant Breeding. Knowledge and Prospects. Advances in Agronomy, 110: 77-123
Maluszynski M., Ahloowalia B.S., Sigurbjörnsson B. 1995. Application of in vivo and in vitro mutation techniques for crop improvement. Euphytica, 85, 1-3: 303-315
Mba C. 2013. Induced Mutations Unleash the Potentials of Plant Genetic Resources for Food and Agriculture. Agronomy, 3, 1: 200-231
Oladosu Y., Rafii M.Y., Abdullah N., Hussin G., Ramli A., Rahim H.A., Miah G., Usman M.
2016. Principle and application of plant mutagenesis in crop improvement.
Biotechnology and Biotechnological Equipment, 30, 1: 1-16
Oll Y. 1990. Plant mutation breeding for crop improvement vol.1. Proceedings of a symposium, jointly organized by IAEA and FAO: 569 str.
19
Pace P.F., Cralle H.T., El-Halawany S.H.M., Cothren J.T., Senseman S.A. 1999. Drought- induced changes in shoot and root growth of young cotton plants. Journal of Cotton Science, 3, 4: 183-187
Penna S., Jain S.M. 2017. Mutant Resources and Mutagenomics in crop plants. Emirates Journal of Food and Agriculture, 29, 9: 651-657
Pertea M., Salzberg S. L. 2010. Between a chicken and a grape: estimating the number of human genes. Genome Biology, 11: 206, doi: 10.1186/gb-2010-11-5-206: 7 str.
Predieri S. 2001. Mutation induction and tissue culture in improving fruits. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 64: 185-210
Priyadarshan P.M. 2019. Induced mutations and polyploidy breeding. V: Plant breeding:
Classical to modern. Singapore, Springer: 329-370
Ritchie G.L., Bednarz C.W., Jost P.H., Brown S.M. 2004. Cotton growth and development.
Cooperative Extension, the University of Georgia. Bulletin 1252: 14 str.
http://www.ugacotton.com/vault/file/UGA-Ext.-Pub.-Cotton-Growth-Development- 2004.pdf (13.7.2021)
Ronald P. 2011. Review Plant Genetics, Sustainable Agriculture and Global Food Security.
Genetics, 188, 1: 11-20
Rozman L., Huremagić Z., Meglič V. 2005. Pregled požlahtnjenih slovenskih sort kmetijskih rastlin. Acta agriculturae Slovenica, 85, 2: 385-396
Sala C.A., Bulos M., Altieri E., Ramos M.L. 2012. Genetics and breeding of herbicide tolerance in sunflower. Helia, 35, 57: 57-70
Szarejko I., Forster B.P. 2007. Doubled haploidy and induced mutation. Euphytica, 158, 359- 370
Tai T.H. 2007. Induced mutations in rice (Oryza sativa L.). Israel Journal of Plant Sciences, 55, 2: 137-145
Vogel F., Motulsky A.G. 1986. Mutation. V: Human genetics. Berlin, Heidelberg, Springer:
334-432
Vzdrževalna selekcija inštitutskih sort krompirja. Kmetijski inštitut Slovenije.
https://arhiv.kis.si/pls/kis/!kis.web?m=159&j=SI (12. 7. 2021)
Zaka R., Chenal C., Misset M.T. 2004. Effects of low doses of short-term gamma irradiation on growth and development through two generations of Pisum sativum. Science of the Total Environment, 320, 2–3: 121-129
Zambelli A., León A., Garcés R. 2015. Mutagenesis in sunflower. V: Sunflower: chemistry, production, processing, and utilization. Elsevier: 27-52
20 ZAHVALA
Posebna zahvala gre mentorju, red. prof. dr. Jerneju Jakšetu, za čas, nasvete in pomoč pri sestavljanju diplomske naloge.
Zahvala gre tudi družini, še posebej se zahvaljujem mami in očetu, ki sta mi študij omogočila, me vso pot skozi bodrila in verjela vame. Brez vaju bi bila ta pot veliko težja.
Zahvaljujem se tudi sestri Tjaši, fantu Gašperju, prijateljem in vsakemu posebej za spodbudne besede.
Hvala Mateji Lupšina za pomoč pri oblikovanju in lektoriranju diplomskega dela.
Hvala.
