KVANTIFIKCIJA KVASOVK IN PLESNI V ŽIVILU Z

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Marija KOSMAČ

KVANTIFIKCIJA KVASOVK IN PLESNI V ŽIVILU Z METODO Sim Plate

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Marija KOSMAČ

KVANTIFIKACIJA KVASOVK IN PLESNI V ŽIVILU Z METODO SimPlate

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana

QUANTIFICATION OF YEASTS AND MOLDS IN FOOD WITH SimPlate METHOD

B. SC. THESIS

Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition

Ljubljana, 2021

(3)

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Živilstvo in prehrana.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za živilstvo je za mentorico diplomskega dela imenovala prof. dr. Barbko Jeršek in za recenzentko prof. dr. Tatjano Košmerl.

Mentorica: prof. dr. Barbka JERŠEK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Recenzentka: prof. dr. Tatjana KOŠMERL

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik:

Mentorica:

Recenzentka:

Datum zagovora:

Marija Kosmač

(4)

Kosmač M. Kvantifikacija kvasovk in plesni v živilu z metodo SimPlate. III

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1

DK UDK 579.67.083:582.28(043)=163.6

KG živilska mikrobiologija, mikrobiološke preiskave, kvasovke, plesni, kvantifikacija, gojišča, SimPlate

AV KOSMAČ, Marija

SA JERŠEK, Barbka (mentorica), KOŠMERL, Tatjana (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021

IN KVANTIFIKACIJA KVASOVK IN PLESNI V ŽIVILU Z METODO SimPlate

TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana) OP IX, 21 str., 3 pregl., 7 sl., 1 pril., 23 vir.

IJ sl JI sl/en

AI V diplomskem delu smo proučevali primerljivost alternativne metode za določanje kvasovk in plesni (SimPlate Y&M CI) s klasično metodo za kvantifikacijo kvasovk in plesni na gojišču DRBC (gojišče z barvilom dikloran rdeče in bengal ter kloramfenikolom). Alternativna metoda, ki je od klasične hitrejša ter enostavnejša, bi lahko na področju živilstva zelo pripomogla k pravočasnemu odkrivanju kvarljivcev živil. Mikrobiološko preiskavo smo izvedli z naravno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca ter umetno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca, ki smo mu dodali kvasovke vrste Saccharomyces cerevisiae v koncentraciji 10⁸ CFU/ml. Po podaljšani inkubaciji (8 dni) alternativna in klasična metoda kvantifikacije kvasovk in plesni v živilu nista dali primerljivih rezultatov. Možen in najbolj verjeten vzrok so bile spremembe dehidriranega gojišča SimPlate. Nadaljnje raziskave z metodo SimPlate Y&M CI za določanje kvasovk in plesni v živilu bi vključevale izvedbo mikrobioloških preiskav z več različnimi živili (npr. surova živila, izdelki; tekoča poltrdna in trdna živila) in z različnimi mikroorganizmi (npr. različne vrste kvasovk, plesni, mešane kulture, ki bi bile naravno prisotne in dodane v majhnem ter velikem številu) in več ponovitvami.

(5)

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1

DC UDC 579.67.083:582.28(043)=163.6

CX food microbiology, microbiological tests, yeasts, molds, quantification, agars, SimPlate

AU KOSMAČ, Marija

AA JERŠEK, Barbka (supervisor), KOŠMERL, Tatjana (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology

PY 2021

TI QUANTIFICATION OF YEASTS AND MOLDS IN FOOD WITH SimPlate METHOD

DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition) NO IX, 21 p., 3 tab., 7 fig., 1 ann., 23 ref.

LA sl AL sl/en

AB The aim of thesis was to determine the comparability of an alternative method for the quantification of yeasts and molds (SimPlate Y&M CI) with the traditional method for quantification of yeasts and molds on DRBC agar (dichloran rose-bengal chloramphenicol agar). SimPlate Y&M CI as an alternative method is faster and simpler than the traditional method and therefore could contribute significantly to faster detection of spoilage yeasts and molds in food. Microbiological tests were performed on a naturally contaminated sample of Zgornjesavinjski želodec and an artificially contaminated sample of Zgornjesavinjski želodec to which Saccharomyces cerevisiae was added at a concentration of 10⁸ CFU/ml. After a prolonged incubation of 7 days, the alternative and traditional methods did not give comparable results. The possible and most probable cause for the results obtained is changes in the dehydrated SimPlate medium. Further investigation of the SimPlate Y&M CI method for the quantification of yeasts and molds in foods should include microbiological tests on several different foods (e.g. raw foods, food products, liquid, semi-solid and solid foods) and with different microorganisms (different yeasts, different molds or mixed cultures naturally present and added at lower and higher concentrations) and several replicates.

(6)

Kosmač M. Kvantifikacija kvasovk in plesni v živilu z metodo SimPlate. V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VI KAZALO SLIK ... VII KAZALO PRILOG ... VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... IX

1 UVOD ... 1

1.1 CILJI IN HIPOTEZE ... 1

1.1.1 Cilji ... 1

1.1.2 Hipoteze ... 1

2 PREGLED OBJAV ... 2

2.1 KVASOVKE IN PLESNI KOT KVARLJIVCI ŽIVIL ... 2

2.2 KVANTIFIKACIJA KVASOVK IN PLESNI V ŽIVILIH... 3

2.2.1 Metoda štetja kolonij na trdem gojišču ... 3

2.2.2 Metoda SimPlate ... 4

2.3 VALIDACIJA ALTERNATIVNE MIKROBIOLOŠKE METODE ... 7

3 MATERIAL IN METODE ... 9

3.1 MATERIAL ... 9

3.1.1 Kultura kvasovk ... 9

3.1.2 Mikrobiološka gojišča in raztopine ... 9

3.1.3 Vzorec zgornjesavinjskega želodca ... 9

3.1.4 Laboratorijska oprema ... 9

3.2 METODE ... 10

3.2.1 Zasnova poskusa ... 10

3.2.2 Priprava matičnih raztopin in razredčitev ... 11

3.2.3 Določitev števila kvasovk in plesni z metodo štetja kolonij na gojišču DRBC 11 3.2.4 Določitev števila kvasovk in plesni z metodo SimPlate Y&M CI ... 11

4 REZULTATI ... 15

5 RAZPRAVA ... 17

6 SKLEP ... 18

7 POVZETEK ... 19

8 VIRI ... 20 ZAHVALA

PRILOGE

(7)

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Primerjava izvedbe metode SimPlate in klasične mikrobiološke metode (ASML Scientific, 2017) ... 4 Preglednica 2: Laboratorijska oprema ... 9 Preglednica 3: Število kvasovk v naravno in umetno kontaminiranem vzorcu

zgornjesavinjskega želodca ... 16

(8)

Kosmač M. Kvantifikacija kvasovk in plesni v živilu z metodo SimPlate. VII

KAZALO SLIK

Slika 1: Izvedba metode SimPlate za mikrobiološko preiskavo vzorca (ASML Scientific, 2017) ... 5 Slika 2: Shema eksperimentalnega dela ... 10 Slika 3: Sestavine metode SimPlate Y&M CI ... 12 Slika 4: Priprava raztopine za rehidracijo gojišča SimPlate in rehidracija gojišča SimPlate Y&M CI ... 12 Slika 5: Postopek mikrobiološke preiskave zgornjesavinjskega želodca z metodo SimPlate ... 13 Slika 6: Gojišča DRBC po sedemdnevni inkubaciji z (1) naravno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca in s (2) kvasovkami vrste S. cerevisiae kontaminiranim

vzorcem zgornjesavinjskega želodca... 15 Slika 7: Plošče SimPlate po sedemdnevni inkubaciji z (1) naravno kontaminiranim

vzorcem zgornjesavinjskega želodca in s (2) kvasovkami vrste S. cerevisiae

kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca ... 16

(9)

KAZALO PRILOG

Priloga A: Pretvorbena preglednica za metodo SimPlate (Merck, Dermstaadt, Nemčija)

(10)

Kosmač M. Kvantifikacija kvasovk in plesni v živilu z metodo SimPlate. IX

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI aw vodna aktivnost (ang. water activity)

AFNOR Francoski inštitut za standardizacijo (ang. France Standardization Association, France)

AOAC Združenje uradnih analitskih kemikov (ang. Association of Official Analytical Chemists)

BAM bakteriološki analitski priročnik (ang. bacteriological analytical manual)

CFU kolonijska enota (ang. colony forming unit)

DG-18 gojišče z dikloranom in glicerolom (ang. dichloran-glycerol agar) DRBC gojišče z barvilom dikloran rdeče in bengal ter kloramfenikolom

(ang. dichloran rose-bengal chloramphenicol agar)

FDA Uprava za hrano in zdravila (ang. Food and Drug Administration) ISO Mednarodna organizacija za standardizacijo (ang. International

Organization for Standardization)

MAP pakiranje v modificiarni atmosferi (ang. modified atmosphere packaging)

MEA gojišče z ekstraktom ječmenovega sladu (ang. malt extract agar) MLG laboratorijski mikrobiološki priročnik (ang. microbiology laboratory

guidebook)

MO mikroorganizmi (ang. microorganisms)

OGY gojišče oksitetraciklin glukoza kvasni ekstrakt (ang. oxytetracyclin glucose yeast agar)

PDA gojišče krompjev dekstrozni agar (ang. potato dextrose agar) RSD relativni standardni odklon (ang. relative standard deviation)

SimPlate Y&M CI gojišče SimPlate za kvantifikacijo kvasovk in plesni (ang. SimPlate Yeast and Mould Color Inidicator)

TPC skupno število mikroorganizmov (ang. total plate count)

USDA Ministrstvo za kmetijstvo ZDA (ang. United States Department of Agriculture)

(11)

1 UVOD

Kvar živila je vsaka sprememba živila, zaradi katere se spremeni njegova značilna sestava.

To so lahko negativne spremembe senzoričnih lastnosti (npr. barva, okus, vonj, tekstura) ali razgradnja hranil do te mere, da dejanska vsebnost več ne dosega kriterijev kakovosti.

(Anwer in sod., 2017). Kvasovke in plesni so mikroorganizmi, ki se zelo dobro prilagajajo različnim razmeram, zato lahko v živilih pomenijo vzrok za njihov kvar. Razvoj kvantitativnih mikrobioloških metod za določanje kvasovk in plesni je pomemben ne le zaradi kvara, ampak tudi zaradi nekaterih oportunistično patogenih kvasovk in toksigenih plesni, saj lahko le tako pravočasno izvedemo umik oziroma odpoklic živila (Snyder in Worobo, 2018). Mikrobiološki kvar botruje četrtini odpadne hrane po svetu (Blackburn in Colworth, 2006).

Kvar živil velikokrat nastopi še pred vizualnimi spremembami, zato so se vzporedno s klasičnimi mikrobiološkimi metodami za kvantifikacijo mikroorganizmov v živilih začele razvijati alternativne metode (Doyle, 2007). Ker so klasične mikrobiološke metode časovno ter delovno zamudne in lahko zahtevajo visoko kvalificirano osebje (Rico-Munoz in sod., 2019), se razvijajo alternativne mikrobiološke metode, ki naj bi bile hitrejše in enostavnejše ob enaki občutljivosti in natančnosti, kot so klasične metode (Nemati in sod, 2016).

Z metodo SimPlate Y&M CI določimo prisotnost ter število kvasovk in plesni v živilu na podlagi encimskih reakcij. Zaradi delovanja encimov, ki jih sprostijo kvasovke in plesni, pride do razgradnje substratov v gojišču, kar vodi do spremembe barve (Ferrati in sod, 2005).

Ker je čas inkubacije pri metodi SimPlate Y&M CI krajši kot pri klasičnih gojiščih, je izvedba preiskave hitrejša. Zasnova plošče SimPlate preprečuje razraščanje kolonij plesni, zato je od klasičnih metod tudi veliko bolj zanesljiva (Feldsine in sod., 2003).

1.1 CILJI IN HIPOTEZE 1.1.1 Cilji

Cilj diplomske naloge je bil v živilu vzporedno kvantificirati kvasovke in plesni s klasično metodo štetja kolonij na trdnem gojišču in z alternativno metodo SimPlate Y&M CI ter primerjati čas, zahtevnost, natančnost in točnost obeh metod.

1.1.2 Hipoteze

Predvidevamo, da bodo rezultati kvantifikacije obeh, klasične in alternativne mikrobiološke metode SimPlate Y&M CI, sovpadali. Metoda SimPlate Y&M CI se bo izkazala kot zanesljiva in možna alternativa klasični metodi kvantifikacije kvasovk in plesni, izvedba alternativne metode bo ob tem hitrejša, enostavnejša in natančnejša kot metoda štetja kolonij na gojišču DRBC.

(12)

Kosmač M. Kvantifikacija kvasovk in plesni v živilu z metodo SimPlate. 2

2 PREGLED OBJAV

2.1 KVASOVKE IN PLESNI KOT KVARLJIVCI ŽIVIL

Mikroorganizme v živilu predstavljajo kvasovke, plesni in bakterije. Ker je generacijski čas slednjih krajši, se v živilu načeloma namnožijo veliko hitreje, vendar so za okoljske dejavnike, za razliko od gliv, bolj občutljive in so lahko prisotne v manjšem številu. Takšne razmere predstavlja predvsem bolj kislo okolje in okolje z nižjo vodno aktivnostjo (aw).

Približno četrtino vseh poznanih vrst kvasovk lahko izoliramo iz hrane. Tiste, ki povzročijo negativne spremembe živil, označimo kot kvarljivce (Lourieiro in Malfeito-Ferreira, 2003).

Mikrobiološki kvar živil botruje k četrtini odpadne hrane po celem svetu, kar predstavlja velike ekonomske izzive živilski industriji (Blackburn in Colworth, 2006; Snyder in sod., 2019). Med najpogostejšimi krivci za mikrobiološki kvar živil sodijo plesni. Pri tem je pomembno, da lahko aktivnost kvasovk zaradi razgrajevanja kislin in posledično višanja vrednosti pH živila pripomore k bolj optimalnemu okolju za aktivnost nekaterih bakterij.

Večina gliv je kemoorganotrofov, kar pomeni, da potrebna hranila pridobivajo iz organskih snovi. Kvaru specifičnega živila v večini botruje ena skupina najbolj kompetitivnih mikroorganizmov. Dobro poznavanje povezave posameznih gliv s kvarom specifičnih živil pomeni pravočasno preventivno ukrepanje, kar bi dolgoročno vodilo tudi v manj odpadne hrane. Živilska industrija proti glivam nastopi z npr. majhno koncentracijo kisika v embalaži, a se določeni mikroorganizmi lahko prilagodijo tudi na tak stresni dejavnik. Spreminjanje pH in aw pri zaviranju rasti kvasovk v živilu načeloma ne igrata tako velike vloge, kot jo npr.

pri bakterijah, saj lahko glive rastejo oz. njihove spore preživijo v širokem območju pH in aw. Dokazana prisotnost mikroorganizmov v živilu še ne pomeni, da v živilu zagotovo nastopajo kot kvarljivci. Med najpogostejše kvarljivce izmed gliv so uvrščene plesni rodu Penicillium, ki lahko kvarijo tako sveža kot procesirana živila, prilagajajo se tudi na visoke temperature. Kvasovke so bolj občutljive, se pa veliko bolje prilagodijo na kisla okolja.

Rastejo v toplotno neobdelanih ali pasteriziranih živilih. Pogost razlog mikrobiološkega kvara živila zaradi kvasovk in plesni predstavlja nezadostna toplotna obdelava živila in previsoka vrednost pH (Snyder in sod., 2019).

Kvasovke in plesni vodijo v nastanek neprijetnih vonjav, spremembe barve in teksture izdelka. Nekatere plesni lahko tvorijo mikotoksine. Kontaminacija živila lahko nastopi med pridelavo, predelavo, kot tudi pri potrošniku. Preventivno jo lahko preprečimo z ustrezno higieno, da ne pride do navzkrižne kontaminacije, dodatkom aditivov v živila, aseptičnimi razmerami pakiranja, in pakiranjem živil v modificirani atmosferi (MAP). Glive pogostokrat kvarijo predvsem sadje in zelenjavo, žita ter meso in mesne izdelke (Garnier in sod., 2017).

Svetovna populacija se s časom veča, skladno z njo bo večja tudi potreba po hrani, zato je zmanjšanje količine odpadne hrane zelo pomembno. Zaradi kvara živil, ki ga povzročijo

(13)

kvasovke in plesni, v enem letu propade 125 milijonov ton poljščin; še pred pobiranjem propade več kot 20 odstotkov pridelka (Davies in sod., 2021). Neposredno, preko krme, kvasovke in plesni vplivajo tudi na manjši pridelek mleka. Pomembni kvarljivci sadja so tudi plesni rodu Aspergillus. V boju s škodljivimi glivami so pogostokrat uporabljeni konzervansi, pri čemer problem predstavlja razvoj odpornosti gliv proti protimikrobnim snovem (Davies in sod., 2021).

2.2 KVANTIFIKACIJA KVASOVK IN PLESNI V ŽIVILIH

Ločimo klasične, izboljšane, tj. avtomatizirane klasične in alternativne metode mikrobiološke preiskave živil. Bistvo klasične mikrobiološke metode je kultivacija mikroorganizmov na ali v ustreznem gojišču, pri čemer kulturo pred izvedbo nadaljnjih testov na gojišču izoliramo in namnožimo. Za tako izvedbo preiskave potrebujemo čas, v katerem se mikroorganizmi namnožijo do ustrezne koncentracije (nujna je inkubacija gojišč), pri kvasovkah in plesnih to običajno pomeni tri do sedem dni. Ker so klasične mikrobiološke metode dolgotrajne, so podvržene stalnemu razvoju, ki vodi v avtomatizacijo metod in razvoj alternativnih metod. Primer avtomatizacije pri kvantitativnih metodah predstavlja avtomatsko štetje zraslih kolonij, primer alternativne metode so kromogena gojišča (Jeršek, 2002).

2.2.1 Metoda štetja kolonij na trdem gojišču

Mikrobiološka gojišča so osnova za raziskovanje mikroorganizmov, saj nam omogočajo njihovo kultivacijo in proučevanje. Ob tem je posameznim mikroorganizmom treba prilagoditi številne dejavnike, kot so npr. hranila v gojišču, pH in aw, ter temperatura. To so parametri, s katerimi čim bolj posnemamo naravna okolja mikroorganizmov. Hranilna sestava gojišča je za organizme potrebna z vidika makrohranil, mikrohranil in rastnih faktorjev. Gojišča za kvasovke in plesni morajo vsebovati več ogljikovih hidratov in dušika, optimalni pH gojišča je med 5 in 6; temperaturni razpon, v katerem rastejo, je vse od 15 do 37 °C (Basu in sod., 2015). Klasične metode zahtevajo 3- do 7-dnevno inkubacijo, pri štetju kolonij na gojiščih pa lahko pride do napak zaradi razraščanja kolonij (Feldsine in sod., 2003).

Štetje kolonij na trdem gojišču je metoda, pri kateri je gojišče v petrijevki in nanj nanesemo vzorec ali pa vzorec vmešamo v raztopljeno in na 45 °C ohlajeno gojišče. Po inkubaciji pregledamo in preštejemo zrasle kolonije. Le-te so načeloma lepo vidne, lahko pa se pojavi problem razraščanja nekaterih mikroorganizmov (Kumar in sod., 2018). Števne plošče za kvasovke in plesni so vsa, na katerih zraste med 15 in 150 kolonij. Štetje kolonij na ploščah nam v razmerah, ki jih vzpostavimo in so podobne naravnemu okolju mikroorganizmov, omogoči kvantifikacijo kvasovk in plesni v živilu. Dobljeno število ne predstavlja

(14)

dejanskega števila kvasovk in plesni v preiskovanem živilu, ampak zgolj potencial njihovega razmnoževanja ob vzpostavljenih razmerah (Jeršek, 2017).

Kvantifikacija mikroorganizmov v živilu je pomembna za zagotavljanje kakovosti svežih in predelanih živil. Kvantifikacija kvasovk in plesni v živilu z metodo štetja kolonij na trdem gojišču zahteva selektivnost gojišč, ki zavirajo rast bakterij in uporabo dodatkov, ki zavrejo pretirano razraščanje plesni. V ta namen so gojiščem pogostokrat dodani antibiotiki ali njegove alternative, kot je npr. barvilo dikloran rdeče in bengal. Med splošno poznana gojišča za kvantifikacijo kvasovk in plesni v živilu sodijo gojišče z barviloma dikloran rdeče in bengalom ter kloramfenikolom (DRBC), gojišče dikloran glicerol (DG-18), gojišče krompirjev dekstrozni agar (PDA) (Copetti in sod., 2009).

2.2.2 Metoda SimPlate

Klasične metode za kvantifikacijo kvasovk in plesni so časovno dolgotrajne in pogosto zahtevajo visoko kvalificirano osebje, zato se razvijajo in vpeljujejo hitrejše in enostavnejše alternativne metode, med katere sodi tudi metoda SimPlate (Ferrati in sod., 2005). Časovna primerjava kvantifikacije različnih mikroorganizmov z metodo SimPlate in kvantifikacije mikroorganizmov s klasičnimi mikrobiološkimi metodami je predstavljena v preglednici 1.

Preglednica 1: Primerjava izvedbe metode SimPlate in klasične mikrobiološke metode (ASML Scientific, 2017)

Legenda: TPC: skupno število mikroorganizmov

Za izvedbo mikrobiološke preiskave z metodo SimPlate so komercialno dobavljivi kompleti, ki vsebujejo plošče SimPlate, ustrezna gojišča in dodatke. Gojišče je vnaprej pripravljeno, sterilno in dobavljivo v dehidrirani obliki. Metodo izvedemo s tremi enostavnimi koraki, ki so predstavljeni na sliki 1. Rehidrirano gojišče in vzorec nanesemo na ploščo SimPlate, razporedimo preko razdelkov in odcedimo odvečno gojišče v gobico na plošči ter inkubiramo. Pozitivni razdelki po inkubaciji so vsi tisti, na katerih se s prostim očesom vidi barvna sprememba. Te razdelke preštejemo in rezultat, to je število pozitivnih razdelkov, pretvorimo po priloženi preglednici (Priloga A) (ASML Scientific, 2017).

Mikroorganizmi Čas mikrobiološke preiskave (dan)

SimPlate Klasična metoda

Kvasovke in plesni 3 5

Koliformne bakterije/E. coli 1 5

Enterobakterije 1 3

Campylobacter 2 4

TPC 1 2

(15)

Slika 1: Izvedba metode SimPlate za mikrobiološko preiskavo vzorca (ASML Scientific, 2017)

Gojišče za mikrobiološko preiskavo z metodo SimPlate izberemo glede na vrsto mikrobiološke preiskave (Merck KGaA, 2021):

• SimPlate Campylobacter CI (barvni indikator, ang. color indicator): za bakterije rodu Campylobacter;

• SimPlate Yeast&Mold: za kvasovke in plesni;

• SimPlate Enterboacteriaceae CI: za enterobakterije;

• SimPlate Total Plate Count: za skupno število mikroorganizmov;

• SimPlate Yeast&Mold CI: za kvasovke in plesni;

• SimPlate Total Coliform&E.coli CI: za koliformne bakterije in bakterije vrste E. coli.

Glede na lastnosti preiskovanega živila lahko dodamo v rehidrirano SimPlate gojišče še različne dodatke (Merck KGaA, 2021):

• Dodatek A prepreči penjenje;

• Dodatek D je namenjen zmanjšanemu razraščanju plesni;

• Dodatek M koristi intenzivnejšemu obarvanju razdelkov;

• Dodatek V je pomemben za boljšo fluorescenco;

• Dodatek R prepreči razraščanje plesni ob preiskovanju bakterij.

Princip klasične gojitvene metode je kultivacija mikroorganizmov iz vzorca živila na ali v gojišču, ki je v petrijevki kot trdno gojišče ali v epruveti kot tekoče gojišče. Po inkubaciji na trdnem gojišču zrastejo kolonije oz. se spremeni motnost tekočega gojišča. Metoda SimPlate je alternativna metoda, katere princip je sprememba barve gojišča zaradi mikrobne razgradnje enega ali več kromogenih substratov v gojišču (Jasson in sod., 2010).

Z metodo SimPlate Y&M CI (ang. SimPlate Yeast and Mold Color Inidicator) kvantificiramo kvasovke in plesni v živilu. Princip kvantifikacije je razgradnja substratov v gojišču s strani prisotnih kvasovk in plesni, ki se odrazi kot barvna sprememba (Ferrati in sod., 2005). S to metodo dobimo rezultate že po 56 urah, gojišče med inkubacijo ostane v tekočem agregatnem stanju. Zaradi strukture plošče SimPlate ne pride do razraščanja kolonij plesni, zato je kvantifikacija lažja kot na klasičnem gojišču. Alternativna metoda je od klasičnih bolj občutljiva, saj do opaznih sprememb pride že pri manjšem številu kvasovk in

(16)

plesni v primerjavi s klasično metodo štetja kolonij na gojišču. Delovanje kvasovk in plesni je pri metodi SimPlate Y&M CI prepoznano kot katerakoli barvna sprememba razdelka (tj.

pozitivni razdelki) ali gobice, rezultat pa je potrebno pretvoriti z uporabo preglednice za rezultate metode SimPlate (Priloga A) (Feldsine in sod., 2003).

Raziskave so že v preteklosti pokazale, da je metoda SimPlate za določanje aerobnih mezofilnih mikroorganizmov, koliformnih bakterij in bakterij vrste E. coli zanesljiva za veliko živil, vendar za kvantifikacijo kvasovk in plesni v živilu ostaja dokaj neraziskana (Taniwaki in sod., 2001). Taniwaki in sod. (2001) so z raziskavo ugotovili, da metoda SimPlate YM (ang. SimPlate Yeast and Mold, proizvajalec BioControl Systems, Inc., Belleuve, Wash) za kvantifikacijo kvasovk in plesni v živilu slabo korelira s klasičnimi, splošno poznanimi gojišči DRBC, DG18 in PDA z antibiotiki. Kvantificirali so število kvasovk in plesni v 14 različnih živilih (koruzni zdrob, pšenična moka, tapiokina moka, cel obrok, kruh, arašidi, mocarela, nariban parmezan, sirovi zvitki, pomarančni sok, ananasova pulpa, ananasova torta, gobe v konzervi) v 10 ponovitvah za posamezno živilo. Inkubacija plošč SimPlate YM po 48 urah ni pokazala vidnih sprememb, zato so jo podaljšali še za 24 ur. Inkubacija klasičnih gojišč je bila petdnevna. Rezultati analize so pokazali večja odstopanja metode SimPlate YM v primerjavi s klasičnimi gojišči. Koeficienti korelacije metode SimPlate in kvantifikacija MO na gojiščih DRBC, DG18, PDA in Petrifilm so bili med 0,62 in 0,68. Na plošči SimPlate je bil zaznan problem razraščanja plesni, kar je otežilo štetje kolonij. Po ugotovitvah Taniwakija in sod. (2001) metoda SimPlate Y&M ni ustrezna metoda za kvantifikacijo kvasovk in plesni, saj rezultati ne sovpadajo z rezultati, pridobljenimi s klasičnimi mikrobiološkimi gojišči. Na večini živil je alternativna metoda podala premajhno število kvasovk in plesni. Taniwaki in sod. (2001) tudi navajajo, da po navodilih proizvajalca Biocontrol Systems, Inc. metoda ni primerna za sveže sadje in zelenjavo, kar omeji spekter možne mikrobiološke preiskave živil.

Feldsine in sod. so v letu 2003 z metodo SimPlate Y&M CI analizirali šest različnih skupin živil. Metodo SimPlate so primerjali s klasično metodo po BAM ter standardih ISO.

Analizirali so naravno kontaminirane vzorce zmrznjenega sadja (maline, jagode in borovnice), sire (mocarela, čedar, plesnivi sir), oreške (lešnik, oreh, ameriški oreh) in umetno kontaminirane vzorce s tremi različnimi koncentracijami kvasovk vrst Candida albicans, Torulaspora delbrueckii in plesnimi vrste Aspergillus clavatus v naslednjih živilih:

zmrznjena hrenovka v koruznem testu, žitni kosmiči ter mešanica za peko peciva.

Posamezne razredčitve vzorcev živil z aw≤0,95 (mešanica za peko peciva, žitni kosmiči in zmrznjene hrenovke v koruzni moki) so v treh ponovitvah inkubirali na gojišču DG18.

Posamezno razredčitev preostalih živil z aw>0,95 so inkubirali na gojišču DRBC v treh ponovitvah. Vse plošče so pet do sedem dni inkubirali pri 25 °C. Metodo SimPlate so izvedli po navodilih proizvajalca, pri čemer je bil na sredino plošče nanesen vzorec v količini 1 ml.

Plošče SimPlate so 56 ur inkubirali pri 25 °C in po inkubaciji prešteli razdelke, na katerih je prišlo do barvne spremembe. Podatke so statistično primerjali z relativnim standardnim

(17)

odklonom (RSD) in povprečjem logaritemskih vrednosti števila kvasovk in plesni (log CFU/g). Med-laboratorijska študija je s primerjavo metod ugotovila, da sta metodi SimPlate za kvantifikacijo kvasovk in plesni in metoda štetja kolonij na klasičnem gojišču DG18 ter DRBC primerljivi. Izmed 18 analiziranih živil je bila statistična razlika med SimPlate in BAM dokazana na vzorcu ameriških orehov in orehov. Povprečje zraslih kolonij na SimPlate je bilo večje in možna razlaga v odstopanju je v izbiri gojišča za kvantifikacijo kvasovk in plesni, ker naj bi bilo trdno gojišče optimalno, medtem ko metoda SimPlate Y&M predvideva tekoče gojišče. Izmed 18 analiziranih živil je statistično razliko med metodama SimPlate in ISO pokazalo sedem analiziranih živil (Feldsine in sod., 2003).

2.3 VALIDACIJA ALTERNATIVNE MIKROBIOLOŠKE METODE

Klasične mikrobiološke metode so pogostokrat zamudne, zato se uvajajo nove, predvsem hitrejše metode, ki predstavljajo alternativo tako kvantitativnim kot kvalitativnim klasičnim metodam. Izbor metode je pred samo izvedbo preiskave odvisen od številnih dejavnikov, kot sta npr. hitrost in natančnost metode, že izvedene študije in objave, strošek metode, kaj alternativna metoda ponudi v primerjavi s klasično. Z alternativno metodo moramo doseči primerljive rezultate kot pri klasični metodi (Sandle, 2016). Ker morajo biti rezultati, pridobljeni z alternativnimi metodami, zanesljivi, morajo biti alternativne metode validirane.

S postopkom validacije overimo specifičnost, občutljivost, linearnost in mejo kvantifikacije oz. zaznavanja (Jasson in sod., 2010).

Validacija je proces, s katerim se z visoko stopnjo zaupanja dokaže, da metoda ob predvideni uporabi izpolnjuje vnaprej postavljene zahteve. Z eksperimentalnim preverjanjem so dokazane ponovljivost, točnost in natančnost rezultatov, pridobljenih z alternativno metodo.

Vse novo vpeljane laboratorijske metode kot tudi standardne metode v primeru njihovih izboljšav oz. modifikacij morajo biti validirane (FDA, 2019).

Validacija alternativne metode temelji na že obstoječi referenčni metodi. S statistično analizo dobljenih rezultatov obeh metod, alternativne in referenčne, lahko primerjamo ujemanje ali izboljšanje alternativne metode. Referenčne metode, s katerimi določamo mikroorganizme, so največkrat splošno poznane gojitvene metode (FDA, 2019).

Standarde določajo organi za standarde; to so Uprava za hrano in zdravila – bakteriološki analitični priročnik (FDA BAM), Ministrstvo za kmetijstvo ZDA – Mikrobiološki priročnik za laboratorij (USDA MLG) in Mednarodna organizacija za standardizacijo (ISO), pri čemer ima, razen če je poudarjeno drugače, največjo prednost pri izbiri referenčne metode FDA BAM (FDA, 2019). Certifikat validacije metode v Evropi pa izdajajo različne organizacije:

Francoski inštitut za standardizacijo (AFNOR), NordVal in MicroVal; v ZDA ga izda AOAC (Jasson in sod., 2010).

(18)

Referenčne metode so standardizirane, prepoznamo jih predvsem kot klasične gojitvene metode, ki so še dandanes v široki uporabi. So temeljito raziskane in jasno opredeljujejo potrebne razmere in postopke meritev. Zaradi njihove zamudnosti se uvajajo alternativne metode, ki zahtevajo veliko manj časa od klasičnih, zato jih poznamo tudi pod imenom

»hitre« metode. Referenčne metode nam podajajo mejnike, s katerimi določamo natančnost alternativnih metod (Jasson in sod., 2010).

Prvo stopnjo validacije predstavlja preverjanje ustreznosti metode v laboratoriju, ki je alternativno metodo uvedel, pri čemer se izvede primerjavo alternativne in referenčne metode. Drugo stopnjo validacije opravi neodvisni laboratorij. Tretja stopnja je med- laboratorijska validacija. Med-laboratorijska validacija je organizirana izvedba in ovrednotenje metode ob enakih vnaprej določenih razmerah in enakih vzorcih v sodelovanju dveh ali več neodvisnih laboratorijev; na tej stopnji določimo tudi ponovljivost metode (FDA, 2019).

Namen verifikacije je eksperimentalno dokazati, da alternativna metoda dosega določene zahteve ob predvideni uporabi. S procesom verifikacije pridemo do potrditve, da metoda lahko zazna in identificira določen analit. Ko govorimo o metodah, katerih gojišča so vnaprej pripravljena, morajo ta, tudi če so že bila validirana in primerjana s klasičnimi metodami, preiti proces verifikacije v laboratoriju, če jo le-ta uporablja prvič. Proces verifikacije mora biti izveden s klasično ter z alternativno metodo, v šestih ponovitvah analize z umetno kontaminiranim vzorcem in šestih ponovitvah analize z naravno kontaminiranim vzorcem.

Če ni nobenih lažno pozitivnih ali lažno negativnih rezultatov, potem je gojišče primerno za uporabo v laboratoriju, kjer je bila verifikacija izvedena. Mejo določljivosti se preveri s kontaminiranimi vzorci; ob tem se preveri, da metoda reagira le z analitom, saj bi drugače prišlo do lažnih rezultatov (FDA, 2019).

Ker gojitvene metode temeljijo na oceni mikroorganizmov (MO) v živilu in ne na njihovem dejanskem številu, je natančna primerjava takih metod zahtevna. Ujemanje rezultatov ni nujno popolno, mora pa alternativna metoda podati primerljive rezultate. Parametri, ki jih overimo z validacijo alternativne metode, so točnost, natančnost, ponovljivost, robustnost, linearnost, najmanjše zaznano število MO, ki ga ni nujno možno določiti, in najmanjše zaznano število MO, ki se lahko določi (Sandle, 2016).

(19)

3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL

3.1.1 Kultura kvasovk

Eksperimentalno delo smo izvedli s kvasovkami vrste Saccharomyces cerevisiae, uporabljena koncentracija prekonočne kulture je bila 10⁸– CFU/ml.

3.1.2 Mikrobiološka gojišča in raztopine

• Gojišče z barviloma dikloran in bengal rdeče ter antibiotikom (DRBC, ang.

Dichloran Rose-Bengal Chloramphenicol agar, CM1148, Hampshire, Anglija);

• SimPlate Y&M CI (ang. SimPlate Yeast and Mold Color indicator, Merck, 65009- 20, Darmstadt, Nemčija);

• dodatek A za metodo SimPlate Y&M CI (ang. Supplement A, SimPlate, Merck, 63011-200, Darmstadt, Nemčija);

• fiziološka raztopina;

• sterilna voda.

Gojišča in raztopine smo pripravili po navodilih proizvajalca.

3.1.3 Vzorec zgornjesavinjskega želodca

Pri eksperimentalnem delu smo uporabili zgornjesavinjski želodec. Do mikrobioloških preiskav hranjen v hladilniku pri 4 °C na Katedri za tehnologijo mesa in vrednotenje živil, Oddelek za živilstvo, Biotehniška fakulteta.

3.1.4 Laboratorijska oprema

Eksperimentalni del diplomske naloge je zajemal uporabo laboratorijske opreme, navedene v preglednici 2.

Preglednica 2: Laboratorijska oprema

Laboratorijska oprema Oznaka, proizvajalec in država

Tehtnica Kern EMB, Merck, Nemčija

Inkubator Semlab, Slovenija

Homogenizator oz. gnetilnik Seward Stomacher, Anglija

Namizni mešalnik Fischerbrand, Italija

Avtoklav Kambič, Slovenija

Hladilnik LTH, Slovenija

(20)

Polega laboratorijske opreme, navedene v preglednici 2, smo analizo izvedli še z naslednjim laboratorijskim priborom: deska za rezanje, petrijeve plošče fi 90 mm (Laboratehnika Golias, Slovenija), avtomatske pipete 1,0 in 10,0 ml (Gilson, Francija) ter nastavke, steklene palčke, steklene epruvete (10 ml), stojala za epruvete, vrečke s filtrom za gnetilnik, gorilnik.

3.2 METODE

3.2.1 Zasnova poskusa

Število kvasovk in plesni smo določali s klasično mikrobiološko metodo štetja kolonij na gojišču DRBC, vzporedno z alternativno metodo SimPlate Y&M CI. Po inkubaciji gojišč DRBC in plošč SimPlate smo prešteli število zraslih kolonij na gojišču DRBC oz. po navodilih proizvajalca prešteli število obarvanih razdelkov na plošči SimPlate ter določili število kvasovk in plesni v živilu. Shema je predstavljena na sliki 2.

Slika 2: Shema eksperimentalnega dela

(21)

3.2.2 Priprava matičnih raztopin in razredčitev

Pripravili smo dve matični raztopini zgornjesavinjskega želodca in v prvi določili naravno prisotne kvasovke in plesni, medtem ko smo drugo matično raztopino uporabili za umetno kontaminacijo vzorca s kvasovkami vrste S. cerevisiae in nadaljnjo določitev kvasovk in plesni:

a) Naravno kontaminirani vzorec zgornjesavinjskega želodca: Matično raztopino smo pripravili iz vzorca zgornjesavinjskega želodca in fiziološke raztopine v razmerju 1:9 (10 g vzorca in 90 ml fiziološke raztopine) ter homogenizirali v gnetilniku v vrečki za gnetilnik s filtrom. To je predstavljalo prvo razredčitev (10^-1). Filtrat homogenizirane matične raztopine smo v količini 1 ml prenesli naprej in v epruveto s fiziološko raztopino (9 ml) pripravili nadaljnje razredčitve vzorca (od 10^-2 do 10^-6).

b) Umetno kontaminirani vzorec zgornjesavinjskega želodca s kvasovkami vrste S.

cerevisiae: Matično raztopino smo pripravili kot pri a), nato pa dodali 10 ml prekonočne kulture kvasovk vrste S. cerevisiae s 10⁸ CFU/ml. Razredčitve smo pripravili enako kot pri naravno kontaminiranem vzorcu.

3.2.3 Določitev števila kvasovk in plesni z metodo štetja kolonij na gojišču DRBC Z metodo štetja kolonij na gojišču DRBC smo 0,1 ml vsake razredčitve razmazali s stekleno palčko po površini trdnega gojišča DRBC (v dveh paralelkah)^. Inkubacija je potekala pri 25

°C, rezultate smo preverili po 48 h, 72 h in po 7 dneh.

Po inkubaciji smo prešteli kolonije na tistih gojiščih, kjer je zraslo števno število kolonij (od 15 do 150 kolonij) in z enačbo (1) izračunali število MO v vzorcu živila.

𝑁 =^𝑛^𝑝

𝑅 … (1)

Legenda:

N … število mikroorganizmov v vzorcu živila (CFU/g);

𝑛_𝑝 … povprečno število kolonij;

R … razredčitev vzorca, pri kateri smo prešteli kolonije.

3.2.4 Določitev števila kvasovk in plesni z metodo SimPlate Y&M CI

Gojišče SimPlate Y&M CI za kvantifikacijo kvasovk in plesni je bilo zapakirano v plastičnih epruvetah, ločeno za vsako ploščo. Plošče so bile zapakirane posebej. Gojišče in dodatek A smo hranili enajst mesecev v hladilniku pri 4 ^oC. Gojišče je bilo pred rehidracijo rahlo sprijeto v skupke, v nekaterih epruvetah se je oprijelo na pokrovčke. Sestavine za izvedbo metode SimPlateY&M CI so prikazane na sliki 3.

(22)

Slika 3: Sestavine metode SimPlate Y&M CI

Legenda: A - plošča SimPlate, B - rehidrirano gojišče SimPlate Y&M CI, C - dodatek A, D - plošča SimPlate po nanosu gojišča in vzorca

Rehidracija gojišča SimPlate Y&M CI:

Najprej smo pripravili raztopino za rehidracijo gojišča tako, da smo zmešali sterilno vodo in dodatek A (1 ml dodatka A v 99 ml sterilne vode). Ker smo raztopino pripravili za vsa dehidrirana gojišča hkrati, smo v 198 ml sterilne vode dodali 2 ml dodatka A (slika 4).

Gojišče SimPlate Y&M CI v plastični epruveti smo rehidrirali z 9,9 ml raztopine za rehidracijo (slika 4).

Slika 4: Priprava raztopine za rehidracijo gojišča SimPlate in rehidracija gojišča SimPlate Y&M CI

Dodatek vzorca živila v rehidrirano gojišče:

V rehidrirano gojišče smo nato dodali 0,1 ml vzorca zgornjesavinjskega želodca tako, da smo dodali 0,1 ml matične raztopine in enako nadaljevali z vsemi pripravljenimi razredčitvami. Vsebino epruvete smo premešali na namiznem mešalniku. Skupni volumen vsebine vsake plastične epruvete z rehidriranim gojiščem in vzorcem živila je znašal 10 ml.

Po navodilih proizvajalca bi morali ta postopek izvesti drugače, in sicer naj bi najprej na ploščo SimPlate (slika 3, oznaka A) nanesli matično raztopino (ali razredčitev) in šele nato gojišče SimPlate Y&M CI. Ustrezno razredčitev vzorca smo v našem primeru na oz. v gojišče vnesli že pred razlitjem na ploščo, ker je bilo mešanje gojišča in vzorca lažje izvedljivo v plastični epruveti.

(23)

Nanos rehidriranega gojišča z vzorcem živila na ploščo SimPlate:

Pokrov plošče SimPlate smo odprli ob gorilniku, nanesli rehidrirano gojišče z vzorcem in ploščo takoj zaprli. Z nežnimi krožnimi gibi smo poskrbeli, da se je celotna tekočina porazdelila v vse razdelke plošče, preostanek smo z rahlim nagibom v smeri proti gobici odlili v gobico na obodu plošče. Celoten potek mikrobiološke preiskave zgornjesavinjskega želodca je predstavljen na sliki 5.

Slika 5: Postopek mikrobiološke preiskave zgornjesavinjskega želodca z metodo SimPlate

Legenda: MR1: matična raztopina 1, MR2: matična raztopina 2, FR: fiziološka raztopina, Aa: vrečka za gnetilnik z naravno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca, Ab: vrečka za gnetilnik z umetno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca z dodano kulturo kvasovk vrste S cerevisiae, c:

rehidrirano gojišče SimPlate Y&M CI , d: plošča SimPlate.

(24)

Postopek: V vreči za gnetilnik smo pripravili dve matični raztopini (eno z naravno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca in eno z umetno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca z dodano kulturo kvasovk vrste S. cerevisiae). To je predstavljalo prvo razredčitev 10^-1, iz katere smo pripravili nadaljnje razredčitve do 10^-5. 0,1 ml vsake razredčitve smo nato prenesli v rehidrirano gojišče SimPlate Y&M CI. Celotno vsebino plastične epruvete z gojiščem SimPlate Y&M CI z vzorcem smo nato nanesli na dve paralelki plošče SimPlate. Plošče smo inkubirali 48 h, 72 h in 7 dni.

Plošče SimPlate smo inkubirali pri 25 ºC, rezultate pa preverili po dveh, treh in sedmih dneh.

Ob prisotnih kvasovkah in plesnih bi do barvnih sprememb moralo priti v času med 56 ur in 3 dnevi. Skozi celotno inkubacijo je gojišče ostalo v tekočem agregatnem stanju.

Kvantifikacijo pri metodi SimPlate Y&M CI izvedemo na podlagi barvne spremembe, ki lahko pomeni barvno spremembo vsaj enega izmed razdelkov ali gobice, ki je absorbirala odvečno gojišče. Razdelke, na katerih se spremeni barva, vključno z obarvano gobico, je potrebno preko pretvorbene preglednice (Priloga A), ki jo priloži proizvajalec, pretvoriti v število mikroorganizmov na plošči. Za vrednost CFU/g oz. CFU/ml živila je to število potrebno pomnožiti še s faktorjem razredčitve, pri kateri(h) smo zabeležili pozitiven rezultat.

Rezultati pri metodi SimPlate Y&M CI:

• Ni obarvanih razdelkov. Do spremembe barve pride v gobici, v katero smo odcedili odvečno gojišče. To pomeni, da je populacija na plošči enaka 1.

• Ni obarvanih razdelkov, do barvnih sprememb gobice z odvečnim gojiščem ne pride.

To pomeni, da je populacija na plošči manjša od 1 (ASML Scientific, 2017).

Ob prisotnosti kvasovk ali plesni se razdelki obarvajo v rdečo, belo, oranžno barvo.

(25)

4 REZULTATI

Po dvodnevni inkubaciji so bile na gojiščih DRBC z umetno in naravno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca lepo vidne rožnato obarvane kolonije kvasovk vrste S.

cerevisiae. Na gojišču SimPlate Y&M CI ni prišlo do sprememb po dvodnevni inkubaciji.

Rezultate smo zato ponovno preverili po naknadnih 24 urah in še po sedmih dneh inkubacije.

Po sedmih dneh inkubacije so na gojišču DRBC z umetno kontaminiranim vzorcem s kvasovkami vrste S. cerevisiae lepo vidne ovalne in rožnato obarvane kolonije (slika 6).

Slika 6: Gojišča DRBC po sedemdnevni inkubaciji z (1) naravno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca in s (2) kvasovkami vrste S. cerevisiae kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca

Legenda: a: paralelki z razredčitvijo vzorca 10^-2, b z razredčitvijo vzorca 10^-3, c z razredčitvijo vzorca 10^-4, d z razredčitvijo vzorca 10^-5, e z razredčitvijo vzorca 10^-6.

Ob prisotnosti kvasovk in plesni se gojišču SimPlate Y&M CI spremeni barva gojišča v okviru 56 ur do 3 dni. Plošče SimPlate smo preverili po dveh, treh in sedmih dneh inkubacije.

Do barvnih sprememb na gojišču SimPlate ni prišlo. Obarval se ni noben razdelek na nobeni plošči, opaznih sprememb na gobici, ki je vpila gojišče, ni bilo (slika 7).

(26)

Slika 7: Plošče SimPlate po sedemdnevni inkubaciji z (1) naravno kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca in s (2) kvasovkami vrste S. cerevisiae kontaminiranim vzorcem zgornjesavinjskega želodca

Legenda: a sta paralelki z razredčitvijo vzorca 10^-2, b z razredčitvijo vzorca 10^-3, c z razredčitvijo vzorca 10^-4, d z razredčitvijo vzorca 10^-5, e z razredčitvijo vzorca 10^-6.

V vzorcu naravno kontaminiranega zgornjesavinjskega želodca smo s klasično metodo štetja kolonij na gojišču DRBC določili število kvasovk <1,3 x 10³ CFU/g vzorca, v umetno kontaminiranem vzorcu pa število kvasovk 1,1 x 10⁹ CFU/g vzorca, medtem ko smo z metodo SimPlate Y&M CI v obeh vzorcih določili število kvasovk ˂1x10² CFU/g vzorca (preglednica 3).

Preglednica 3: Število kvasovk v naravno in umetno kontaminiranem vzorcu zgornjesavinjskega želodca

Metoda oz. gojišče Število kvasovk (CFU/g)

Naravno kontaminiran vzorec Umetno kontaminiran vzorec

DRBC <1,3 x 10³ 1,1 x 10⁹

SimPlate Y&M CI <1 x 10² <1 x 10²

(27)

5 RAZPRAVA

Rezultati so pokazali, da alternativna metoda SimPlate Y&M CI za kvantifikacijo kvasovk in plesni ni primerljiva s klasično metodo štetja kolonij na gojišču DRBC, ker je v rezultatih prišlo do odstopanj. Na gojišču DRBC so kolonije kvasovk zrasle po dveh dneh, na gojišču SimPlate Y&M CI kvasovke niso zrasle tudi po sedmih dneh, tako pri naravno kot tudi pri umetno kontaminiranem vzorcu zgornjesavinjskega želodca.

Metodo štetja kolonij na gojišču DRBC in metodo SimPlate Y&M CI smo izvedli aseptično in slednjo po navodilih proizvajalca, inkubacija pri 25 °C je bila sedemdnevna. Možna razlaga za odstopanja je v gojišču SimPlate Y&M CI, saj smo s strani proizvajalca prejeli pojasnilo, da če je gojišče pred rehidracijo v grudicah ali celo lepljivo, lahko to pomeni, da je bilo gojišče SimPlate Y&M CI izpostavljeno previsoki zračni vlažnosti in v takem primeru rezultati ne bodo pravilni (Merck, 2021). Gojišče SimPlate Y&M smo skoraj eno leto hranili v hladilniku na Oddelku za živilstvo Biotehniške fakultete in ga uporabili še pred iztekom roka uporabe. Shranjevanje gojišča SimPlate Y&M po navodilih proizvajalca je za dehidrirano gojišče: shranjujemo v temi pri 2 -30 ºC in za že rehidrirano gojišče: shranjujemo v temi pri 15-20 ºC ter uporabimo v 12 urah. Gojišča SimPlate Y&M smo prejeli v začetku leta 2020 in jih hranili v temi pri sobni temperaturi do aprila 2021. Gojišče po izgledu ni bilo spremenjeno, čeprav smo opazili manjše grudice, prav tako še ni potekel rok uporabe (rok uporabe je bil do junija 2021). V tem času (od začetka leta 2020 do aprila 2021) je bilo delo v laboratoriju večkrat prekinjeno (skupno za približno 6 mesecev), in predvidevamo, da je medtem morda prišlo do sprememb(e) gojišča, ki je bila vzrok za neskladnost rezultatov na gojišču SimPlate v primerjavi z gojiščem DRBC.

Do podobnih ugotovitev so že v letu 2001 prišli Taniwaki in sod. (2001), ko so ob primerjavi metode štetja kolonij na gojišču DRBC in SimPlate Y&M CI ugotovili značilna odstopanja med rezultati obeh metod. Metoda SimPlate Y&M CI naj bi bila primerna za živila in izdelke, vendar ne za surovo sadje in zelenjavo ter moko zaradi možne endogene aktivnosti (Taniwaki in sod., 2001).

Z izvedenim eksperimentalnim delom in dobljenimi rezultati ne moremo ovrednotiti metode SimPlate Y&M CI, saj bi eksperimentalno delo morali izvesti ponovno in vključiti več različnih živil, več različnih mikroorganizmov in več ponovitev.

(28)

6 SKLEP

Na podlagi pridobljenih rezultatov vzporednih mikrobioloških preiskav za kvantifikacijo kvasovk in plesni v naravno in umetno kontaminiranem vzorcu zgornjesavinjskega želodca s klasično metodo štetja kolonij na gojišču DRBC in z alternativno metodo SimPlate CI slednje ne moremo ovrednotiti, saj je bilo izvedenih premalo vzporednih mikrobioloških preiskav. Hipotez ne moremo ne potrditi in ne zavrniti.

(29)

7 POVZETEK

Kvasovke in plesni povzročajo kvar živil, posledica katerega je povečana količina odpadne hrane. Ker kvar živila zaradi prisotnih mikroorganizmov nastopi že preden je opazen, so v živilstvu zelo pomembne metode kvantifikacije kvasovk in plesni.

Klasične mikrobiološke metode so zamudne in pogosto zahtevajo visoko izobražene analitike, zato se razvijajo nove alternativne metode, ki so hitrejše in enostavnejše ob enaki občutljivosti, specifičnosti, ponovljivosti in natančnosti. Ena od njih je alternativna metoda SimPlate. Gojišče SimPlate Y&M CI na podlagi barvne spremembe omogoča kvantifikacijo kvasovk in plesni v živilu. Na podlagi obarvanih razdelkov plošče s štetjem le-teh ter pretvorbo rezultatov s priloženo preglednico (priloga A) lahko na hiter ter enostaven način kvantificiramo kvasovke in plesni.

V naši raziskavi smo proučevali primerljivost metode SimPlate Y&M CI za kvantifikacijo kvasovk in plesni v zgornjesavinjskem želodcu. Kot referenčno metodo smo uporabili klasično mikrobiološko metodo kvantifikacije kvasovk in plesni na gojišču DRBC.

Alternativna metoda SimPlate je v naravno in umetno kontaminiranem (dodane kvasovke vrste Saccharomyces cerevisiae) vzorcu zgornjesavinjskega želodca v dveh paralelkah ni podala primerljivih rezultatov glede na klasično metodo štetja kolonij na gojišču DRBC.

Glede na dobljene rezultate, metode SimPlate in metode štetja kolonij na gojišču DRBC ne moremo primerjati. Izvesti bi morali dodatne mikrobiološke preiskave različnih vzorcev živil v vsaj treh ponovitvah z naravno in umetno kontaminacijo vzorcev.

(30)

8 VIRI

Anwer S. S., Ali G. A., Hamadamin C. Z., Jaafar H. Y. 2017. Isolation and identification of fungi from fast food restaurants in Langa Bazar. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology, 2, 4: 1517–1522.

Basu S., Bose C., Ojha N., Das N., Das J., Pal M., Khurana S. 2015. Evolution of bacterial and fungal growth media. Bioinformation, 11, 4: 182–184.

Blackburn de W. C., Colworth U. 2006. Introduction. V: Food spoilage microorganisms.

Blackburn de W. C. (ur.). Cambridge, Woodhead publishing limited: xvii-xxiii.

ASML Scientific. 2017. SimPlate ^®flyer. Chatswood, Australasian Medical & Scientific Ltd: 2 str.

https://www.amsl.com.au/downloads/files/PR_100_133_Simplate_Flyer.pdf (16. julij 2021)

Copetti V. M., Santurio M. J., Cavalheiro S. A., Alves H. S., Ferreiro L. 2009. Comparison of different culture media for mycological evaluation of commercial pet food. Acta Veerinariae, 37, 4: 329–335.

Davies R. C., Wohlgemuth F., Young T., Violet J., Dickinson M., Sanders J., Valliers C., Avery V. S. 2021. Evolving challenges and strategies for fungal control in the food supply chain. Fungal Biology Reviews, 36: 15–26.

Doyle E. M. 2007. Microbial food spoilage – losses of control strategies. FRI Briefings.

Madison, Food Research Institute, University of Wisconsin: 16 str.

https://fri.wisc.edu/files/Briefs_File/2017-

0718_0857_FRI_Brief_Microbial_Food_Spoilage_7_07.pdf (16. marec 2021)

Feldsine T. P., Lienau H. A., Leung C. S., Mui A. L. 2003. Enumeration of total yeasts and molds in foods by the SimPlate Yeast and Mold-Color Indicator method and conventional culture methods: collaborative study. Journal of AOAC International, 86, 2: 296-313.

Ferrati A. R., Tavolaro P., Destro M. T., Landgraf M., Franco B. D. G. M. 2005. A comparison of ready-to-use systems for evaluating the microbiological quality of acidic fruit juices using non-pasteurized orange juice as an experimental model. International Microbiology, 8, 1: 49–53.

FDA. 2019. Guidelines for the validation of analytical methods for the detection of microbial pathogens in foods and feeds, 3^rd ed. Silver Spring, Food and Drug Administration: 54 str.

https://www.fda.gov/media/83812/download (6. julij 2021)

Garnier L., Valence F., Mounier J. 2017. Diversity and control of spoilage fungi in dairy products: an update. Microorganisms, 5, 3: 42, doi:10.3390/microorganisms5030042:

33 str.

Jasson V., Jacxsens L., Luning P., Rajkovic A., Uyttendaele M. 2010. Alternative microbial methods: an overview and selection criteria. Food Microbiology, 27: 710–730.

(31)

Jeršek B. 2002. Metodologija odkrivanja mikrobiološke kontaminacije živil. V:

Mikrobiologija in biotehnologija v proizvodnji varnih živil. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Biotehniška fakulteta: 100–108.

Jeršek B. 2017. Navodila in delovni zvezek za laboratorijske vaje pri predmetu Mikrobiološka preiskava živil. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo:

3–3.

Kumar A., Murthy N. L., Jeyakumari A. 2018. Plating techniques in isolation of microorganisms. V: Training manual on ''microbiological examination of seafood pathogens with special preference V. mimicus & V. valnificus. Murthy N. L., Kumar A., Jeyakumari A., Nilavan E. (ur.). Mumbai, Indian Council of Agricultural Research: 16–

20.

Lourieiro V., Malfeito-Ferreira M. 2003. Yeasts in spoilage. V: Encyclopedia of food sciences and nutrition. Vol 9. 2^nd ed. Caballero B., Trugo L., Finglas M. P. (ur.).

Amsterdam, Academic Press: 5530–5537.

Merck KGaA. 2021. SimPlate^®. Dermsadt, Merck KGaA: 1 str.

https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/search/simplate?focus=products&page=1&perP age=30&sort=relevance&term=simplate&type=product (25. julij 2021)

Nemati M., Hamidi A., Dizaj S. M., Javaherzadeh V., Lotfipour F. 2016. An overview on novel microbial determination methods in pharmaceutical and food quality control.

Advanced Pharmaceutical Bulletin, 6, 3: 301–308.

Rico-Munoz E., Samson R. A., Houbraken J. 2019. Mould spoilage of foods and beverages:using the right methodology. Food Microbiology, 81: 51–62.

Sandle T. 2016. Key criteria fort he selection of rapid and alternative microbiological methods. American Pharmaceutical Review, 19, 3: 46–48.

Snyder B. A., Worobo W. R. 2018. Fungal spoilage in food processing. Journal of Food Protection, 81, 6: 1035–1040.

Snyder B. A., Churey J. J., Worobo W. R. 2019. Association of fungal genera from spoiled processed foods with physochemical food properties and processing conditions. Food Microbiology, 83: 211–218.

Taniwaki M. H., Da Silva N., Bahne A. A., Tamnaka B. T. 2001. Comparison of culture media simplate and petrifilm for enumeration of yeasts and molds in food. Journal of Food Protection 64, 10: 1592–1596.

(32)

Kosmač M. Kvantifikacija kvasovk in plesni v živilu z metodo SimPlate.

ZAHVALA

Veliko zahvalo namenjam mentorici, prof. dr. Barbki Jeršek. Iskrena hvala za veliko mero spodbude, ki sem jo potrebovala, za vse nasvete, konstruktivne komentarje, za strokovno vodenje ter pomoč in sodelovanje pri pripravi diplomskega dela. Zahvaljujem se recenzentki, prof. dr. Tatjani Košmerl, za strokovni pregled diplomske naloge. Iskreno se zahvaljujem tudi podjetju Sanolabor, d. d., Ljubljana, ki je zagotovilo potrebne surovine za izvedbo metode SimPlate.

Posebno zahvalo namenjam svoji družini ter partnerju, ki so mi stali ob strani med pisanjem diplome in tudi v težkih trenutkih skozi celotni študij. Vsake ovire so premagane lažje s podporo najbližjih, z njihovim zaupanjem in veliko mero ljubezni. Hvala tudi bližjim sodelavcem, ki so mi stali ob strani in prevzeli moje izmene, ko sem proste dneve za pisanje diplome oz. opravljanje dela v laboratoriju nujno potrebovala.

V malenkostih se kaže človekova veličina. Pomeni mi veliko, brez vas ne bi šlo. Iskrena hvala!

(33)

PRILOGE

Priloga A: Pretvorbena preglednica za metodo SimPlate (Merck, Dermstaadt, Nemčija) Št. pozitivnih razdelkov =

populacija na plošči

Št. pozitivnih razdelkov = populacija na plošči

1 = 2 31 = 76 61 = 216

2 = 4 32 = 80 62 = 224

3 = 6 33 = 84 63 = 232

4 = 8 34 = 86 64 =240

5 = 10 35 = 90 65 = 248

6 = 12 36 = 94 66 = 256

7 = 14 37 = 96 67 = 266

8 = 16 38 = 100 68 = 276

9 = 18 39 = 104 69 = 288

10 = 22 40 = 108 70 =298

11 = 24 41 = 112 71 = 312

12 = 26 42 = 116 72 = 324

13 = 28 43 = 120 73 = 338

14 = 30 44 = 124 74 = 354

15 = 32 45 = 128 75 = 372

16 = 36 46 = 132 76 = 392

17 = 38 47 = 136 77 = 414

18 = 40 48 = 142 78 = 440

19 = 42 49 = 146 79 = 470

20 = 46 50 = 150 80 = 508

21 = 48 51 = 156 81 = 556

22 = 50 52 = 160 82 =624

23 = 54 53 = 166 83 = 738

24 = 56 54 = 172 84 ≥ 738

25 = 58 55 = 178

26 = 62 56 = 184

27 = 64 57 = 190

28 = 68 58 = 196

29 = 70 59 = 202

30 = 74 60 = 208