ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Blaška GANTAR
ANALIZA FENOLNIH SNOVI V OREHOVEM LIKERJU
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij
Ljubljana, 2007
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Blaška GANTAR
ANALIZA FENOLNIH SNOVI V OREHOVEM LIKERJU
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij
ANALYSIS OF PHENOLIC COMPOUNDS IN WALNUT LIQUEUR
GRADUATION THESIS University studies
Ljubljana, 2007
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija agronomije. Opravljeno je bilo na Katedri za sadjarstvo Oddelka za agronomijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Rastlinski material za analizo smo nabrali na Raziskovalnem polju za lupinasto sadje Maribor.
Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Francija Štamparja in za somentorja doc. dr. Roberta Veberiča.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: akad . prof. dr. Ivan KREFT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: prof. dr. Franci ŠTAMPAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Robert VEBERIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: prof. dr. Dominik VODNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum zagovora:
Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete.
Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.
Gantar Blaška
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Dn
DK UDK 663.833:634.51:543.645:547.56(043.2)
KG sadjarstvo/oreh/Juglans regia/orehov liker/Franquette/Elit/fenolne snovi KK AGRIS Q04
AV GANTAR, Blaška
SA ŠTAMPAR, Franci (mentor)/VEBERIČ, Robert (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
LI 2007
IN ANALIZA FENOLNIH SNOVI V OREHOVEM LIKERJU TD Diplomsko delo (univerzitetni študij)
OP XIII, 40, [5] str., 1 pregl., 29 sl., 4 pril., 36 vir.
IJ sl
JI sl/en
AI V tradicionalno pripravljenem orehovem likerju smo s pomočjo HPLC (tekočinske kromatografije visoke ločljivosti) z PDA detektorjem analizirali 13 različnih fenolnih spojin: juglon, 1,4-naftokinon, kavino kislino, galno kislino, elagno kislino, klorogensko kislino, (+)-katehin, p-kumarno kislino, protokatehulno kislino, sinapinsko kislino, vanilno kislino, siringinsko kislino in aldehid siringinske kisline.
Orehov liker smo pripravili v dveh različnih terminih (30. 6. 2005 in 7. 7. 2005) iz zelenih, nezrelih plodov orehov sort 'Elit' in 'Franquette'. Fenolne snovi smo iz plodov oreha ekstrahirali z 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Med vsemi analiziranimi fenolnimi snovmi, je bilo največ galne kisline, medtem ko je bila vsebnost ostalih fenolnih snovi nekajkrat nižja. Pomemben delež skupnih analiziranih fenolov predstavljajo tudi siringinska kislina, elagna kislina in (+)-katehin. Juglon je dosegel najnižjo vrednost med vsemi analiziranimi fenolnimi snovmi. Vsebnost fenolnih snovi je bila višja pri sorti 'Franquette', kot pri sorti 'Elit', razen za juglon in vanilno kislino. Plodovi obrani v prvem terminu so se izkazali za boljši vir fenolnih snovi, zato so bolj primerni za proizvodnjo orehovega likerja. V drugem terminu vzorčenja je bila višja vsebnost elagne kisline in aldehida siringinske kisline pri obeh sortah, juglona pri sorti 'Franquette' in siringinske kisline pri sorti 'Elit', vsebnost vseh ostalih fenolnih snovi pa je bila višja v prvem terminu vzorčenja. V orehovem likerju iz 40 % etanola je bilo največ galne kisline, siringinske kisline, vanilne kisline, (+)-katehina, klorogenske kisline in juglona, vsebnost ostalih fenolnih snovi je bila višja v likerju iz višjih koncentracij etanola. Vsebnost skupnih fenolov je bila najvišja v orehovem likerju pripravljenem iz 40 % etanola. Tradicionalno pripravljen orehov liker je bogat vir fenolnih snovi.
KEY WORDS DOCUMENTATION
DN Dn
DC UDK 663.833:634.51:543.645:547.56(043.2)
CX fruit growing/walnut/Juglans regia/walnut liqueur/Franquette/Elit/phenolic compounds/
CC AGRIS Q04
AU GANTAR, Blaška
AA ŠTAMPAR, Franci (supervisor)/VEBERIČ, Robert (co-supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy PY 2007
TI ANALYSIS OF PHENOLIC COMPOUNDS IN WALNUT LIQUEUR DT Graduation Thesis (University studies)
NO XIII, 40, [5] p., 1 tab., 29 fig., 4 ann., 36 ref.
LA sl
AL sl/en
AB The phenolic composition of traditionary prepared walnut liqueur was investigated using HPLC (high performance liquid cromatography) with a PDA detector. 13 phenolic compounds were identified: juglon, 1,4-naphthoquinone, caffeic acid, gallic acid, ellagic acid, chlorogenic acid, (+)-catechin, p-coumaric acid, protocatechuic acid, sinapic acid, vanillic acid, syringic acid and syringaldehide.
The analysed walnut liqueur was made from green, unriped fruits of walnut cultivars 'Elit' and 'Franquette', on two sampling dates (30. 6. 2005 and 7. 7. 2005). The extractions of phenolic compounds were made with 40 %, 60 % and 96 % ethanol.
The content of gallic acid was the highest among investigated phenolics, meanwhile the contents of other phenolics were few times lower. Syringic acid, ellagic acid and (+)-catechin represent an importent part among all analysed phenolics. Juglone showed very low values compered to other analysed phenolics. The contents of phenolic compounds were higher in cultivar 'Franquette' then in cultivar 'Elit', except for juglone and vanillic acid. On the second sampling date the contents of ellagic acid and syringaldehide in both cultivars, the content of juglone in cultivar 'Franquette' and content of syringic acid in cultivar 'Elit', were higher then on first sampling date. The contents of other analysed phenolics were higher on first sampling date. In walnut liqueur made with 40 % ethanol the contents of gallic acid, syringic acid, vanillic acid, (+)-catechin, chlorogenic acid and juglone were higher than in liqueur made with higher percent of ethanol. The concentration of total phenolics was higher in liqueur made with 40 % ethanol, than in extracts with higher concentrations of ethanol. Traditionary prepared walnut liqueur is rich source of phenolic compounds.
KAZALO VSEBINE
Str.
Ključna dokumentacijska informacija III
Key words documentation IV
Kazalo vsebine V
Kazalo preglednic VII
Kazalo slik VIII
Kazalo prilog XII
Okrajšave in simboli XIII
1 UVOD 1
1.1 VZROK ZA RAZISKAVE 1
1.2 NAMEN RAZISKAVE 1
1.3 DELOVNA HIPTEZA 1
2 PREGLED OBJAV 2
2.1 NAVADNI OREH (Juglans regia L.) 2
2.2 PLOD OREHA 2
2.3 KEMIČNA SESTAVA PLODU OREHA 2
2.4 UPORABA OREHA 3
2.5 OREHOV LIKER 3
2.6 FENOLNE SPOJINE 4
2.6.1 Razdelitev fenolnih spojin 5
2.7 VLOGA FENOLNIH SPOJIN 6
2.7.1 Fenolne spojine kot antioksidanti 6
2.7.2 Antioksidativno delovanje fenolnih spojin iz oreha in vpliv na zdravje človeka
7
3 MATERIALI IN METODE 9
3.1 RASTLINSKI MATERIAL 9
3.2 SORTE OREHOV 9
3.2.1 Sorta 'Elit' 9
3.2.2 Sorta 'Franquette' 9
3.3 KLIMATSKE IN TALNE RAZMERE NA RAZISKOVALNEM
POLJU ZA LUPINASTO SADJE MARIBOR V LETU 2005
10
3.4 METODA DELA 10
3.4.1 Vzorčenje in priprava vzorcev na kemijske analize 10 3.4.2 Analiza s pomočjo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti
(HPLC)
11
3.4.3 Statistična analiza 12
4 REZULTATI IN RAZPRAVA 13
4.1 JUGLON 13
4.2 1,4-NAFTOKINON 14
4.3 KAVINA KISLINA 16
4.4 GALNA KISLINA 17
4.5 ELAGNA KISLINA 18
4.6 KLOROGENSKA KISLINA 20
4.7 (+)-KATEHIN 21
4.8 p-KUMARNA KISLINA 23
4.9 PROTOKATEHULNA KISLINA 24
4.10 SINAPINSKA KISLINA 26
4.11 VANILNA KISLINA 27
4.12 SIRINGINSKA KISLINA 29
4.13 ALDEHID SIRINGINSKE KISLINE 30
4.14 SKUPNI ANALIZIRANI FENOLI 31
5 SKLEPI 34
6 POVZETEK 35
7 VIRI 37
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Razvrstitev fenolnih snovi 5
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Prerez plodu oreha. 3
Slika 2: Povprečna vsebnost juglona x 1000 ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
13
Slika 3: Povprečna vsebnost juglona x 1000 ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
14
Slika 4: Povprečna vsebnost 1,4-naftokinona ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
15
Slika 5: Povprečna vsebnost 1,4- naftokinona ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
15
Slika 6: Povprečna vsebnost kavine kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
16
Slika 7: Povprečna vsebnost kavine kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
17
Slika 8: Povprečna vsebnost galne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
18
Slika 9: Povprečna vsebnost galne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
18
Slika 10: Povprečna vsebnost elagne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
19
Slika 11: Povprečna vsebnost elagne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
19
Slika 12: Povprečna vsebnost klorogenske kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
20
Slika 13: Povprečna vsebnost klorogenske kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
21
Slika 14: Povprečna vsebnost (+)-katehin ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
22
Slika 15: Povprečna vsebnost (+)-katehin ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
22
Slika 16: Povprečna vsebnost p-kumarne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
23
Slika 17: Povprečna vsebnost p-kumarne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p <0,05.
24
Slika 18: Povprečna vsebnost protokatehulne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
25
Slika 19: Povprečna vsebnost protokatehulne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
25
Slika 20: Povprečna vsebnost sinapinske kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
26
Slika 21: Povprečna vsebnost sinapinske kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
26
Slika 22: Povprečna vsebnost vanilne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
28
Slika 23: Povprečna vsebnost vanilne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
28
Slika 24: Povprečna vsebnost siringinske kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
29
Slika 25: Povprečna vsebnost siringinske kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
30
Slika 26: Povprečna vsebnost aldehida siringinske kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
30
Slika 27: Povprečna vsebnost aldehida siringinske kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
31
Slika 28: Vsebnost skupnih analiziranih fenolov (mg/l) pri sorti 'Franquette' v obeh terminih obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96
% etanolom.
32
Slika 29: Vsebnost skupnih analiziranih fenolov (mg/l) pri sorti 'Elit' v obeh terminih obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom.
32
KAZALO PRILOG
PRILOGA A: Povprečna vsebnost 13 analiziranih fenolnih spojin ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' v prvem terminu (30. 6. 2005) obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom.
PRILOGA B: Povprečna vsebnost 13 analiziranih fenolnih spojin ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' v drugem terminu (7. 7. 2005) obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom.
PRILOGA C: Povprečna vsebnost 13 analiziranih fenolnih spojin ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' v prvem terminu (30. 6. 2005) obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom.
PRILOGA D: Povprečna vsebnost 13 analiziranih fenolnih spojin ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' v drugem terminu (7. 7. 2005) obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom.
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI Okrajšava Pomen
HDL high density lipoprotein; lipoproteini visoke gostote LDL low densitiy lipoprotein; lipoproteini nizke gostote
HPLC high performance liquid cromatography; tekočinska kromatografija visoke ločljivosti
PEOXI phenol antioxidant index; antioksidativni indeks fenolov
sod. sodelavci
1 UVOD
1.1 VZROK ZA RAZISKAVO
V Sloveniji navadni oreh (Juglans regia L.) predstavlja staro, tradicionalno sadno vrsto, ki jo najdemo skoraj na vsakem dvorišču. Opaziti je, da oreh v zadnjih letih pridobiva na pomenu, širi pa se tudi njegova pridelava in predelava. Predvsem je poznana uporaba plodov oreha v kulinariki, nekoliko manj poznana pa je njegova zdravilna funkcija.
Iz mladih, zelenih orehov pripravljamo zdravilno alkoholno pijačo temno rjave barve in grenkega okusa, ki jo imenujemo orehov liker. Poleg tega, da je orehov liker poznan kot zelo okusna pijača, pa je dobro poznana tudi njegova uporaba v tradicionalni ljudski medicini.
Številne raziskave v zadnjih letih so pokazale visoko vsebnost fenolnih snovi v orehu in orehovem likerju. Kljub temu, da fenolne snovi nimajo hranilne vrednosti, so pomembne za človekovo zdravje. Različne vrste hrane in pijače, pridobljene iz sadja, so bogat vir fenolnih snovi, ki kot naravni antioksidanti zmanjšujejo število prostih radikalov in s tem tveganje za nastanek številnih bolezni srca in ožilja, diabetesa, visokega krvnega tlaka, kapi in še mnogih drugih bolezni.
1.2 NAMEN RAZISKAVE
Namen raziskave je bil preučiti vpliv sorte, termina obiranja oziroma zrelosti plodov in koncentracije etanola na vsebnost fenolnih snovi v tradicionalno pripravljenem orehovem likerju. S pomočjo HPLC analize smo želeli določiti fenolne snovi v orehovem likerju, ki smo ga pripravili iz zelenih plodov oreha sort 'Franquette' in 'Elit' v dveh različnih terminih in ekstrakcijo s 40 %, 60 % in 96 % etanolom.
1.3 DELOVNA HIPOTEZA
Delovna hipoteza temelji na predpostavki, da se pri višji koncentraciji etanola v likerju izloči več fenolnih snovi ter, da se koncentracija fenolnih snovi razlikuje glede na sorto in termin obiranja.
2 PREGLED OBJAV
2.1 NAVADNI OREH (Juglans regia L.)
Navadni oreh (Juglans regia L.) pomološko uvrščamo med lupinasto sadje, botanično pa spada v družino Juglandaceae, ki ima 7 rodov z več kot 60 vrstami listnatih, enodomnih dreves, katerih skupna lastnost so pernato sestavljeni listi (Solar, 2004). V svetu je najbolj razširjen rod Juglans, znotraj tega rodu pa sta najbolj razširjena navadni oreh (Juglans regia L.) in črni oreh (Juglans nigra L.) (Ocepek, 1995). Oreh raste v Evropi, v Aziji, severni Indiji, na Kitajskem, v severni, osrednji in južni Ameriki ter Avstraliji. Za gojenje oreha so najbolj primerna zmerno hladna humidna območja s čim manjšimi temperaturnimi nihanji (Štampar in sod., 2005b). V Sloveniji oreh raste tako rekoč povsod- ob morju in v notranjosti do nadmorske višine 1000 metrov. Najbolj razširjen je v severovzhodni Sloveniji (Ocepek, 1995).
2.2 PLOD OREHA
Plod oreha (Slika 1) je luščina z jedrcem in je sestavljen iz zunanje, zelene lupine in trdne, svetlo rjave, olesenele luščine ali endokarpa, v kateri se nahaja seme ali jedrce (Ocepek, 1995). Zelena lupina predstavlja zunanji ovoj ali mezokarp oreha, ki se razvije iz zunanjih sten plodnice. Kožica zelene lupine se imenuje eksokarp. Na notranji steni zelene lupine se nahaja mrežica prevodnih tkiv. Debelina zelene lupine je sortna lastnost in znaša pred zorenjem od 3 do 5 milimetrov. Orehovo seme ali jedrce se razvije iz dveh kotiledonov.
Sestavljeno je iz dveh polovic, ki sta med seboj ločeni s primarno pregrado. Jedrce predstavlja užitni del orehovega plodu (Solar, 2004). V orehu jedrce ščiti tanka, rjava kožica, ki predstavlja le 5 % celotne mase sadeža in je naravno bogata z antioksidativnimi fenolnimi spojinami, ki pomagajo zaščititi jedrce pred oksidacijo oziroma žarkostjo (Colarič in sod., 2005).
2.3 KEMIČNA SESTAVA PLODU OREHA
Orehi so visoko energijska hrana z veliko vsebnostjo maščob, sorazmerno visoko vsebnostjo beljakovin, kalija, fosforja in folata ter z veliko vlaknin in nizko vsebnostjo sladkorjev. V primerjavi z drugimi lupinarji, ki vsebujejo predvsem enkrat nenasičene maščobne kisline, so orehi edinstveni, saj so bogati z n-6 in z n-3 večkrat nenasičenimi maščobnimi kislinami. Izbrane vrednosti hranila na 100 gramov jedrc oreha so: energijska vrednost (654 kcal oziroma 2747 kJ), skupne maščobe (65,2 g), beljakovine (15,2 g), vlaknine (6,7 g), fosfor (346 mg), kalij (441 mg) in folat (98 µg). Orehi so tudi bogat vir vitamina E (2,9 g), ki deluje kot antioksidant, in drugih biološko aktivnih snovi, kot so fenolne spojine in steroli (Feldman, 2002).
Slika 1: Prerez plodu oreha (Razpet, 2002)
2.4 UPORABA OREHA
Uporaba oreha je zelo raznolika in razširjena. Zeleni orehi, lupine, jedrca, semena, lubje, les in listi se uporabljajo v lesni industriji, krovstvu, livarski in plastični industriji, v tekstilni industriji za barvanje tekstilije ter v farmacevtski in kozmetični industriji (Colarič in sod., 2005). Zelo raznovrstna pa je tudi uporaba orehov v prehrani. Orehi so pomemben vir koristnih prehrambnih maščob in potencialno bogat vir fenolnih spojin, ki prispevajo k antioksidativni zmožnosti človeške plazme (Anderson in sod., 2001). Jedrca zrelih plodov največ uporabljamo za pripravo raznih sladic, kot so tradicionalna slovenska potica, biskviti, sadne rezine, sladoledi, pa tudi za pripravo kruha, štrukljev, različnih nadevov in solat (Ocepek, 1995). Mladi, zeleni orehi so zelo cenjeni v tradicionalni ljudski medicini, saj se iz njih izdeluje orehov liker, ki se uporablja kot zdravilna, alkoholna pijača (Štampar in sod., 2006).
2.5 OREHOV LIKER
Orehov liker je lahka, alkoholna pijača keltskega izvora (Alamprese in Pompei, 2005).
Njegova uporaba v tradicionalni ljudski medicini je zelo znana in cenjena tako v Sloveniji, kot v večini ostalih evropskih držav (Štampar in sod., 2006). V Italiji orehov liker imenujejo nocino, njegova proizvodnja pa je povezana s starodavnimi vražami in legendami. Nezrele, zelene orehe, namenjene za izdelavo likerja, tradicionalno obiramo v noči na 24. junij, ko praznujemo praznik rojstva svetnika Janeza Krstnika. Ta dan sovpada s koncem poletnega sončevega obrata oziroma koncem poletnega solsticija (Alamprese in Pompei, 2005). V preteklosti so verjeli, da je noč poletnega sončnega obrata prinesla dobroto na Zemljo in med človeštvo, zato je bila uporaba določenih rastlin močno pod vplivom tega verovanja (Alamprese in sod., 2005). Alamprese in Pompei (2005) so kasneje
Olesenela luščina ali endokarp Zelena lupina ali mezokarp Kožica zelene lupine ali eksokarp
Jedrce ali seme
Rjava kožica, ki pokriva jedrce
dognali, da so zelišča in orehi nabrani v tem času močno pod vplivom sprememb v sončni elipsi in hkratnih sprememb v rastnem ciklusu rastline.
Za proizvodnjo orehovega likerja obstaja veliko število receptov in metod, še vedno pa prevladuje tradicionalen način proizvodnje. Orehe obiramo nezrele, ko je lupina še zelena, endokarp pa je že razvit, a še ni popolnoma lignificiran oziroma olesenel. Za liker je najbolje, da plodove oberemo v drugi polovici meseca junija, ker bi lahko vsako zavlačevanje z obiranjem imelo negativen vpliv na kvaliteto likerja. Cele plodove operemo, narežemo na četrtine in namakamo v etanolu od 1 do 3 mesece, skupaj z različnimi zelišči in začimbami, kot so nageljeve žbice, cimet, koriander, kavna zrna in limonina lupina, ki ustvarjajo razlike v izraženem okusu. Ko je proces namakanja končan, tekoči del ločimo od trdnega. Po filtriranju dobljeno tekočino razredčimo z dodajanjem sirupa narejenega iz sladkorja in vode, tako da je koncentracija alkohola približno 40 %.
Da pa bi dosegli pravo ravnotežje med vsebovanimi aromatičnimi snovmi v likerju, ga pustimo starati za obdobje od 3 mesecev do več let.
Orehov liker je cenjen predvsem zaradi grenkega, visoko razvitega in privlačnega okusa, zaradi zelo posebne arome, temno rjave barve in njegovih lastnosti, kot sta krepilna moč in pomoč pri težavah s prebavili. Ostale lastnosti, ki so povezane z njegovo sposobnostjo povečanja izločanja želodčnih sokov, bi lahko izvirale iz visoke vsebnosti fenolnih snovi, ki so jih našli v orehovem likerju in z njihovo antioksidativno močjo (Alamprese in sod., 2005). Od fenolnih snovi pa je odvisna tudi grenkoba in moč hrane, zato je grenak okus orehovega likerja lahko posledica vsebovanih fenolnih snovi (Jakopič in sod., 2007).
Alamprese in sod. (2005) so raziskovali antioksidativno delovanje orehovega likerja.
Izkazalo se je, da je antioksidativna aktivnost neposredno povezana z vsebnostjo skupnih fenolov, skupnih taninov in netaninskih fenolov in se tudi po več letih staranja ni spreminjala. Alamprese in Pompei (2005) poročata, da ima zrelost velik vpliv na vsebnost fenolnih snovi in hkrati antioksidativno aktivnost, ki je bila najvišja v najmanj zreli seriji orehov, medtem ko imata temperatura in dolžina namakanja le majhen vpliv na sestavo likerja.
2.5 FENOLNE SPOJINE
Fenolne spojine (imenujemo jih tudi fenolne snovi, rastlinski fenoli, polifenoli ali polifenolne spojine) so zelo raznolika skupina sekundarnih metabolitov (Robards in sod., 1999). Mednje prištevamo vse tiste spojine, ki imajo najmanj en aromatski obroč in najmanj eno ali več hidroksi (–OH) skupin direktno vezanih na aromatski obroč. V naravi običajno najdemo spojine z več hidroksi skupinami (Abram in Simčič, 1997).
V rastlinah nastajajo fenolne spojine po dveh glavnih biogenetskih poteh. Glavnina fenolnih spojin nastane po poti šikiminske kisline iz fenilalanina ali njegovega prekurzorja šikiminske kisline. Flavonoidi (C6-C3-C6) pa nastajajo kot produkt iz poti šikiminske in malonske kisline (Strack, 1997; Abram in Simčič, 1997).
2.5.1 Razdelitev fenolnih spojin
Ker v literaturi vlada precejšna zmeda na področju poimenovanja fenolnih spojin, se uporablja predvsem razdelitev po številu C-atomov v molekuli (Preglednica 1), (Goodwin in Mercer, 1983).
Preglednica 1: Razvrstitev fenolnih spojin (Goodwin in Mercer, 1983)
Fenolne kisline najdemo skoraj povsod v rastlinah (Abram in Simčič, 1997). Delimo jih v tri skupine: hidroksibenzojske kisline, hidroksicimetne kisline in kumarine. V prvo skupino spadajo hidroksibenzojske kisline, ki so derivati benzojske kisline z osnovno formulo C6-C1. V to skupino spadajo spojine, kot so: p-hidroksibenzojska kislina, vanilna kislina, galna kislina, elagna kislina, siringinska kislina in protokatehulna kislina (Macheix in sod., 1990). Hidroksicimetne kisline so druga skupina fenolnih kislin s splošno formulo C6-C3. Glavni predstavniki te skupine so p-kumarna kislina in kavina kislina ter njuna metilirana derivata: ferulna kislina in sinapinska kislina ter klorogenska kislina (Macheix in sod.,
Število C atomov Osnovni skelet Skupina
6 C6 Fenoli
7 C6C1 Fenolne kisline
8 C6C2 Fenilocetne kisline
9 C6C3 Hidroksicimetne kisline
Fenilpropeni Kumarini Izokumarini Kromoni
10 C6C4 Naftokinoni
13 C6C1C6 Ksantoni
14 C6C2C6 Stilbeni
Antrakinoni
15 C6C3C6 Flavonoidi
18 (C6C3)2 Lignani
Neolignani
30 (C6C3C6)2 Biflavonoidi
n (C6C3)n Lignini
(C6)n Melanini
(C6C3C6)n Kondenzirani tanini
1990; Abram in Simčič, 1997). Tretjo skupino fenolnih kislin predstavljajo kumarini s splošno formulo C6-C3 (Macheix in sod., 1990).
Naftokinoni so fenolne snovi s splošno formulo C6-C4 (Robards in sod., 1999). Med naftokinoni največ zanimanja vzbuja juglon zaradi svoje kemične reaktivnosti. Poleg juglona med naftokinone spada tudi 1,4-naftokinon (Štampar in sod., 2006; Jakopič in sod., 2007).
Flavonoidi predstavljajo najbolj razširjeno in raznoliko skupino fenolnih spojin (Robards in sod., 1999). Osnovno spojino, flavan oziroma 2-fenilbenzopiran, sestavljajo strukture, ki jih označimo s C6-C3-C6. Med flavonoide spadajo spojine, ki se razlikujejo po oksidacijski stopnji heterocikličnega C3 obroča, kot tudi po različnih substituentah na obročih A, B in C. Flavonoide ločimo na flavone (luteonin, apigenin), flavonole (kvarcetin, kampferol, miricetin), katehine (katehin, epikatehin), flavanone (hesperatin, naringenin), dihidroflavonole, flavan-3,4-diole, antocianidine (pelargonidin, cianidin, malvidin), izoflavone (genistein, daidzein), neoflavone, kalkone (arbutin), dihidrokalkone in avrone (Abram, 2000; Abram in Simčič, 1997; Vrhovšek, 2001).
2.6 VLOGA FENOLNIH SPOJIN
Fenolne spojine imajo mnogo funkcij (Gordon, 2003). V naravi so pomembne za zaščito rastlin pred rastlinojedci, delujejo kot kemične signalne spojine pri cvetenju, oplojevanju in rastlinski simbiozi. Prispevajo tudi k odpornosti rastlin proti mehanskim stresom, ki so posledica prisotnih insektov ali mehanskih poškodb, infekcij z glivami, bakterijami in virusi (Abram in Simčič, 1997). Fenolne snovi pa so zelo pomembne tudi v človeški prehrani, zaradi svojih antioksidativnih, antimikrobnih, antimutagenih in protivnetnih lastnostih ter zato, ker ščitijo pred nastankom rakavih in trombotičnih obolenj (Štampar in sod., 2005a). Prispevajo tudi k okusu, vonju in barvi živil in pijač (Abram in Simčič, 1997). Pomembni so predvsem kot antioksidanti, ki delujejo kot lovilci prostih radikalov, kot kelatorji kovinskih ionov in reducenti (Gordon, 2003).
2.6.1 Fenolne spojine kot antioksidanti
Kljub temu, da fenoli nimajo znane prehrambne funkcije, so zelo pomembni za človekovo zdravje (Jakopič in sod., 2007).
Prosti radikali so atomi, molekule in ioni z vsaj enim elektronom brez para. So visoko reaktivne molekule, ki poškodujejo celične strukture, vključno z nukleinskimi kislinami in geni (Korošec, 2000). Antioksidanti so spojine, ki so v snovi prisotne v majhnih koncentracijah in preprečujejo ali zmanjšujejo oksidacijo snovi. Fiziološka vloga antioksidantov je zaščita celic pred poškodbami, ki so posledice kemičnih reakcij, pri
katerih se sproščajo prosti radikali (Young in Woodside, 2001). Prosti radikali in antioksidanti so v telesu v stalnem ravnotežju, če pa se to ravnotežje podre, se pojavi oksidativni stres. Antioksidanti ga preprečujejo z lovljenjem prostih radikalov, s keliranjem kovinskih ionov in z odstranjevanjem ali popravilom oksidativno poškodovanih molekul (Korošec, 2000).
Polifenolne spojine lahko delujejo tudi kot naravni antioksidanti. Antioksidativne učinke imajo predvsem flavonoidi, derivati cimetne kisline in kumarini. Znano je, da imajo na antioksidacijsko sposobnost velik vpliv položaj in razporeditev –OH skupin. Dobri antioksidanti so predvsem flavonoidi, za katere menijo, da preprečujejo peroksidacijo lipidov (Abram in Simčič, 1997).
2.6.2 Antioksidativno delovanje fenolnih spojin iz oreha in vpliv na zdravje človeka Mnoge raziskave so potrdile pozitivne učinke antioksidativnega delovanja fenolnih snovi iz oreha in ostalih lupinarjev na zdravje človeka.
Plodovi oreha in njegovi proizvodi, kot je orehov liker, so bogat vir fenolnih spojin in se uporabljajo v ljudski medicini širom po svetu (Prasad, 2003).
Kornsteiner in sod. (2006) so v svoji raziskavi analizirali vsebnost tokoferolov, karotenoidov in skupnih fenolov v desetih različnih vrstah lupinarjev. Poročali so, da lupinarji služijo kot dober vir fenolnih spojin z visokim antioksidativnim potencialom.
Najnižjo povprečno vsebnost galne kisline so izmerili v pinijah, in sicer 32 mg/100 g pinij.
Najvišjo povprečno vsebnost galne kisline pa so izmerili v jedrcu oreha, in sicer 1625 mg/100 g jedrc. Ugotovili so, da največ skupnih fenolov in skupnih tokoferolov vsebujejo orehi, pistacije in pekani. Navajajo, da antioksidanti iz sadja in zelenjave, kot so tokoferoli in polifenoli, igrajo pomembno vlogo pri zaščiti pred rakavimi obolenji, vnetnimi aktivnostimi in srčno-žilnimi obolenji. Poleg tokoferolov in polifenolov, lupinarji vsebujejo še mnoga druga hranila in spojine, ki imajo potencial za zmanjšanje tveganja za nastanek srčno-žilnih obolenj. Glede na antioksidativni potencial so lupinarji odličen vir tokoferolov in fenolnih snovi.
Kris-Etherton in sod. (1999) so v svoji raziskavi navedli, da imajo lupinarji ugodno maščobno-kislinsko in hranilno sestavo, saj vsebujejo veliko bioaktivnih komponent, ki ugodno vplivajo proti nastanku srčno-žilnih obolenj. Predvsem elagna kislina in flavonoidi imajo ugoden vpliv na zniževanje LDL (low density lipoprotein ali lipoproteini nizke gostote) holesterola.
Tudi Anderson in sod. (2001) so odkrili, da rastlinska hrana, ki vsebuje veliko fenolnih spojin, kljub temu, da vsebuje veliko maščobnih kislin, vpliva na zmanjšano pojavnost
smrtnosti zaradi srčno-žilnih obolenj, deluje proti nastanku rakavih obolenj ter ščitijo LDL holesterol proti oksidativnimi spremembami in s tem pred aterosklerozo. Navedli so, da ima uživanje orehov ugoden vpliv na lipidni profil limfne tekočine s tem, da zmanjšuje skupni holesterol in LDL holesterol ter triacilgliceride in povečuje HDL (high density lipoprotein ali lipoproteini visoke gostote) holesterol in apolipoprotein A1. Fenolne snovi iz oreha učinkovito zavirajo oksidacijo LDL holesterola.
Gunduc in El (2003) sta določila vsebnost fenolnih snovi v 25 različnih vrstah običajno zaužite hrane v Turčiji. V in vitro razmerah so vzgojili oksidiran LDL holesterol, nato pa so izmerili vpliv fenolnih snovi na zaviranje oksidacije LDL holesterola. Turška kava (2389 mg/l) in jedrca oreha (7052 mg/kg) so imeli najvišjo vsebnost skupnih fenolov, hkrati pa so imeli jedrca oreha in rdeče vino najvišjo PEOXI (phenol antioxidant index ali antioksidativni indeks fenolov) vrednost.
Halvorsen in sod. (2002) so preučevali učinke rastlinsko osnovane diete na zaviranje razvoja nekaterih kroničnih bolezni. Poročali so, da ima oreh največjo vsebnosti antioksidantov med analiziranimi plodovi in semeni (>20 mmol/100 g), medtem ko je med vsemi analiziranimi rastlinami največ antioksidantov vseboval šipek (~ 40 mmol/100 g).
Juglon je znan po svojem antimikrobnem učinku, zmanjšuje pa tudi pojavnost tumorjev malega črevesja pri podganah (Sugie in sod., 1998 cit. po Štampar in sod., 2006).
Lee in sod. (2004) so poročali, da (+)-katehin zavira oksidacijo LDL holesterola in ščiti limfne celice pred citotoksičnimi učinki oksidiranega LDL holesterola. Poročali pa so tudi, da p-kumarna kislina zavira oksidacijo LDL holesterola.
Feldman (2002) je v svoji raziskavi iskal znanstvene dokaze o, za zdravje koristni, zvezi med orehi in koronarnimi boleznimi. Ugotovili so, da orehi, kot del za srce zdrave diete, znižujejo vsebnost holesterola v krvi pri ljudeh in živalih, kar je predvsem posledica ugodne maščobno-kislinske sestave. Oreh vsebuje tudi veliko zdravju koristnih komponent, kot je nizko razmerje lizin: arginin in visoke vsebnosti vitamina E, arginina, folata, vlaknin, taninov in fenolnih snovi.
3 MATERIALI IN METODE 3.1 RASTLINSKI MATERIAL
Kot rastlinski material, ki smo ga uporabili za analizo fenolnih snovi v orehovem likerju, smo uporabili mlade, zelene, nezrele orehe sort 'Elit' in 'Franquette', katerih luščina še ni lignificirala. Rastlinski material smo nabrali v dveh terminih - 30. 6. 2005 (1. termin) in 7. 7. 2005 (2. termin), v kolekcijskem nasadu Biotehniške fakultete, na Raziskovalnem polju za lupinarje v Mariboru.
3.2 SORTE OREHOV 3.2.1 Sorta 'Elit'
Sorta 'Elit' je selekcija Biotehniške fakultete Ljubljana, izpostava Maribor, avtorice Tatjane Hlišč. Nastala je iz semena neke francoske sorte. Drevo je bujno, razmeroma razvejano, v mladosti precej pokončno. Primerna je za gojenje v vrtovih in nasadih tudi na nevinogradniških legah.
Masa plodu je približno 10 gramov, je srednje velik in jajčaste oblike. Luščina je nekoliko debelejša, hrapava, svetlo rjave barve in dobro zaprta. Svetlo rumena jedrca, ki so dobrega okusa, se zlahka izluščijo. Dobit jedrc je 46 %. Jedrca imajo 67 % maščobe in 15 % beljakovin (Ocepek, 1995).
Povprečen čas brstenja, izmerjen za obdobje od 1991-2001, je 30. aprila, čas polnega cvetenja ženskih cvetov je 13. maja in čas zrelosti plodov je 23. septembra (Jakopič in sod., 2007).
3.2.2 Sorta 'Franquette'
Francoska sorta 'Franquette' izvira iz okolice Grenobla in je ena najbolj razširjenih sort oreha na svetu. Drevo je počasne rasti in ne preveč bujno. Odžene in cveti pozno, skoraj sočasno z sorto 'Elit', zato na pozebe ni občutljiva (Ocepek, 1995). Zori v drugi dekadi oktobra. Rodi redno in dobro (Solar, 2004).
Plod je podolgovat, koničast, debel, z maso od 9,5 do 12 gramov. Ima srednje tanko, čvrsto, brazdasto, svetlo rjavo in dobro zaprto luščino. Se zlahka lušči. Jedrca so svetlo rumena in zelo dobre kakovosti. Dobit jedrc je okoli 48 % (Ocepek, 1995).
Povprečen čas brstenja, izmerjen za obdobje od 1991-2001, je 2. maja, čas polnega cvetenja ženskih cvetov je 21. maja in čas zrelosti plodov je 1. oktobra (Jakopič in sod., 2007).
3.3 KLIMATSKE IN TALNE RAZMERE NA RAZISKOVALNEM POLJU ZA LUPINASTO SADJE MARIBOR V LETU 2005
Raziskovalno polje za lupinarje se nahaja v Mariboru, ki leži na nadmorski višini 274 m (15° 39' 12" zemljepisne dolžine in 46° 33' 39" zemljepisne širine). V tem nasadu se nahaja bogata kolekcija različnih vrst lupinarjev, poteka pa tudi vzdrževanje in razmnoževanje matičnih rastlin leske in oreha.
V aprilu 2005 je bila v Mariboru povprečna mesečna temperatura 11 oC, povprečna količina padavin pa 100 mm. Vse dni v mesecu je bila temperatura nad 0 oC. V maju je bila povprečna temperatura 16,2 oC, povprečna količina padavin pa 76 mm. Junij je bil za 1,7 oC toplejši od dolgoletnega povprečja. Povprečna mesečna temperatura je bila 19,6 oC, povprečna količina padavin pa 89 mm. V juliju pa je bila nad povprečjem količina padavin, in sicer 201 mm, povprečna mesečna temperatura pa je bila 20,7 oC (Agencija RS…, 2005).
3.4 METODA DELA
3.4.1 Vzorčenje in priprava vzorcev na kemijske analize
Zelene plodove oreha sort 'Elit' in 'Franquette' smo, na Raziskovalnem polju za lupinarje v Mariboru, obrali v dveh terminih: 30. junija 2005 (1. termin) in 7. julija 2005 (2. termin), ko luščina še ni lignificirala. Iz nabranih orehov smo na Katedri za sadjarstvo (Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani) po tradicionalnem receptu pripravili orehov liker.
Orehe smo narezali na tanke koščke. Za vsak vzorec posebej smo zatehtali 600 gramov sesekljanih orehov, jih dali v steklen kozarec in zalili z 1 litrom etanola različnih koncentracij (96 %, 60 % ali 40 % etanola). Kozarce smo nato neprodušno zaprli in jih postavili za 3 tedne na sonce. Vzorce smo vsak dan premešali, da se je iz orehov izločilo čimveč snovi. Isti postopek smo ponovili tudi za drugo vzorčenje čez en teden.
Po treh tednih smo vzorce precedili skozi hidrofilno gazo, da smo ločili trdni in tekoči del.
Orehov liker smo razredčili z metanolom v razmerju 1 : 4, tako da smo 0,3 ml vzorca orehovega likerja skozi poliamidni filter Chromafil AO-45/25 (Machery- Nagel) prefiltrirali v viale in ga razredčili z 1,2 ml metanola. Iz vsakega kozarca smo naredili 2 vzorca, tako da smo skupaj dobili 48 vzorcev, v katerih so nato na Katedri za sadjarstvo, s
pomočjo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC), analizirali vsebnost posameznih fenolnih snovi.
3.4.2 Analiza s pomočjo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC)
Analiza, s pomočjo tekočinske kromatografije visoke ločljivost HPLC, je bila opravljena na Katedri za sadjarstvo (Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani).
Kromatografska analiza temelji na ločevanju posameznih komponent vzorca, ki jih nato zaznamo z ustreznim detektorjem. Posamezne komponente raziskovanega vzorca se ločijo med seboj na podlagi njihovih različnih fizikalnih in kemijskih interakcij z mobilno in stacionarno fazo (Žorž, 1991). Pri HPLC molekule vzorca na poti skozi kolono prehajajo med mobilno fazo, ki je tekočina majhne viskoznosti in stacionarno fazo, ki je trdna snov.
Mobilna faza potuje skozi stacionarno fazo v določeni smeri. Kromatografski proces, ki pri tem nastaja, je rezultat ponavljajoče se sorpcije in desorpcije s stacionarno fazo, ki poteka med potovanjem komponent vzdolž kolone. Do separacije pride zaradi razlik v porazdelitvenih konstantah posameznih komponent vzorca, ki so posledica termodinamskih lastnosti topljencev. Topljenci, ki imajo večjo afiniteto do mobilne faze, pridejo hitreje iz kolone kot topljenci, ki se zadržujejo v stacionarni fazi. Eluirajo se v vrstnem redu po velikosti porazdelitvenih koeficientov glede na stacionarno fazo.
Porazdelitev je posledica velikosti porazdelitvenih sil med molekulami topljenca in molekulami obeh faz. Močnejše kot so sile med molekulami topljenca in molekulami v stacionarni fazi, počasneje se topljenec eluira (Šircelj, 2001).
Izbira stacionarne in mobilne faze je pri HPLC bistvenega pomena. Sestavo oziroma polarnost mobilne faze lahko med separacijo tudi programirano spreminjamo - ta način imenujemo gradientno izpiranje. Z razvojem črpalk za visoke tlake in konstantne pretoke brez pulziranja, tehnologije kolon in različnih detektorjev, je postala HPLC nepogrešljiva metoda za separacijo in določevanje večine organskih (in anorganskih) spojin. Odlikujejo jo hitrost, občutljivost, ločljivost, majhna množina vzorca in večkratna uporaba kolone.
Uporabna je v zelo širokem masnem območju (Pečavar, 1998).
Za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti smo uporabili tekočinski kromatograf Surveyor, proizvajalca Thermo Finnigan (San Jose, ZDA), s kvarterno črpalko, s PDA detektorjem (photodiode array detector), ki zaznava spekter valovnih dolžin v območju od 220-380 nm. Uporabili so analitsko kolono Chromsep HPLC Colum SS (250x4,6 mm, Hypersil 5 ODS) s predkolono Chromsep guard colum SS (10x3 mm) (Chrompack, Nizozemska). HPLC sistem je povezan z kromatografsko delovno postajo ChromQuestTM
4.0. Razmere kromatografije smo povzeli po metodi, ki so jo opisali Schieber in sod.
(2001). Volumen injeciranega vzorca je bil 20 µl, pretok mobilne faze pa 1 ml/min.
Temperatura kolone je bila 25 °C. Ločevanje fenolnih spojin je potekalo z mešanjem dveh mobilnih faz: topilo A je bila 2 % ocetna kislina v bidestilirani vodi, topilo B pa je bila 0,5 % ocetna kislina v bidestilirani vodi z acetonitrilom v razmerju 1 : 1 (v/v). Razmerje med mobilnima fazama A in B se je v tem času gradientno spreminjalo: iz začetnih 90 % topila A je njegova vsebnost po 50 minutah padla na 45 %, po 60 minutah je bila 0 % in nato po 65 minutah narasla zopet na 90 %. Analiza posameznega vzorca je trajala 65 minut. Med vsako analizo pa je bila izvedena izenačitev razmer kromatografije z 90 % topila A za 15 minut.
Detekcija fenolnih spojin je potekala pri valovni dolžini 280 nm. Posamezne fenolne spojine so kvalitativno določili s primerjavo po retencijskem času, absorbcijskem maksimumu v UV spektru in dodatku standardne raztopine vzorcu pri standardnih raztopinah in spojinah v vzorcih. Koncentracijo posamezne fenolne spojine pa so izračunali na osnovi primerjave površine vrhov na kromatografu standardne raztopine in vzorca.
3.4.3 Statistična analiza
Zbrane podatke smo najprej tabelarično uredili v programu Microsoft Office Excel 2003, nato pa rezultate statistično obdelali z enosmerno analizo variance (ANOVA) s pomočjo programa Statgraphics Plus for Windows 4.0. Statistično značilne razlike v vsebnosti fenolnih snovi pri različnih koncentracijah alkohola smo ugotavljali z pomočjo Duncanovega preizkusa mnogoterih primerjav z upoštevanim 5 % tveganjem.
4 REZULTATI IN RAZPRAVA
V orehovem likerju, pripravljenem iz zelenih plodov orehov sort 'Elit' in 'Franquette', smo analizirali 13 fenolnih spojin: juglon, 1,4-naftokinon, kavino kislino, galno kislino, elagno kislino, klorogensko kislino, (+)-katehin, p-kumarno kislino, protokatehulno kislino, sinapinsko kislino, vanilno kislino, siringinsko kislino in aldehid siringinske kisline.
Rezultate analize vsebnosti fenolov v orehovem likerju, ki smo jih statistično obdelali, predstavljamo v grafični obliki. Vsebnost posamezne fenolne spojine je predstavljena v mg/l orehovega likerja.
4.1 JUGLON
Juglon je dobro znana fenolna spojina, ki je v precejšnih količinah prisotna v zelenih delih oreha (Solar in sod., 2006; Štampar in sod., 2006). Vsebnost v jedrcih oreha je nekoliko nižja, vendar je še vedno med tremi prevladujočimi fenolnimi spojinami v jedrcu in rjavi kožici, ki pokriva jedrce (Colarič, 2005).
0 5 10 15 20 25 30 35 40
40 60 96
Koncentracija alkohola (%)
Juglon x 1000 (mg/l) 'Franquette' - 30. 6. 2005
'Franquette' - 7. 7. 2005
b b
a
Slika 2: Povprečna vsebnost juglona x 1000 ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
Naša raziskava je pokazala, da je vsebnost juglona pri sorti 'Franquette' višja v 2. terminu (Slika 2), pri sorti 'Elit' pa v 1. terminu (Slika 3). Pri sorti 'Franquette' se je v 1. terminu vsebnost juglona statistično razlikovala le pri ekstrakciji s 96 % etanolom, kjer je bila nižja kot pri ekstrakcijah s 40 % in 60 % etanolom. Pri sorti 'Elit' pa so se v 1. terminu statistično značilne razlike v vsebnosti juglona pokazale pri ekstrakcijah z vsemi tremi koncentracijami alkohola, in sicer je najvišja vrednost juglona bila izmerjena pri ekstrakciji s 40 % etanolom (0,042 ± 0,003 mg/l), nekoliko nižja vrednost pri ekstrakciji s 60 %
(0,028 ± 0,005 mg/l) etanolom in najnižja vrednost pri ekstrakciji s 96 % etanolom (0,011
± 0,0005 mg/l). V drugem terminu raziskave niso pokazale statistično značilnih razlik med vsebnostjo juglona pri nobeni sorti. Vsebnost juglona v orehovem likerju je zelo nizka, saj najvišjo vsebnost doseže pri sorti 'Elit' v 1. terminu pri ekstrakciji s 40 % etanolom.
Ugotovili smo tudi, da je raven juglona skoraj enaka v likerju narejenem iz sorte 'Elit', kot iz sorte 'Franquette'.
Štampar in sod. (2006) so v svoji raziskavi navedli, da vsebnost juglona v zeleni lupini oreha v juniju, pri sorti 'Elit', lahko doseže več kot 1400 mg/100 g suhe mase, pri sorti 'Franquette' pa lahko preseže tudi 2200 mg/100 g suhe mase. Ugotovili so tudi, da je vsebnost juglona veliko manjša v likerju, kot v zeleni lupini oreha, saj je bila vsebnost juglona v likerju, ki so ga v letu 2003 pripravili iz sorte 'Elit' in z 40 % etanolom, le 0,2 mg/100 ml.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
40 60 96
Koncentracija alkohola (%)
Juglon x 1000 (mg/l) 'Elit' - 30. 6. 2005
'Elit' - 7. 7. 2005 c
b
a
Slika 3: Povprečna vsebnost juglona x 1000 ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
4.2 1,4-NAFTOKINON
1,4-naftokinon skupaj z juglonom spada v skupino naftokinonov, ki so poleg flavonoidov ena glavnih skupin fenolnih spojin v orehu (Solar in sod., 2006). V nezrelih plodovih navadnega oreha (Juglans regia L.) so Binder in sod. (1989) odkrili 8 hlapnih vrst 1,4- naftokinonov. Solar in sod. (2006) navajajo, da naftokinoni predstavljajo največji delež izmed 8 raziskovanih fenolnih snovi v enoletnih poganjkih oreha, vendar je bil delež 1,4- naftokinona kljub temu majhen. V raziskavi fenolnih spojin v zeleni lupini oreha, ki so jo izvedli Štampar in sod. (2006), 1,4-naftokinon ni bil zaznan, njegovo prisotnost pa so v isti raziskavi potrdili v orehovem likerju, ki so ga po tradicionalnem receptu pripravili iz zelenih, nezrelih orehov sorte 'Elit'.
0 1 2 3 4 5 6
40 60 96
Koncentracija alkohola (%)
1,4-naftokinon (mg/l) 'Franquette' - 30. 6. 2005
'Franquette' - 7. 7. 2005
a a
b
a
b
c
Slika 4: Povprečna vsebnost 1,4-naftokinona ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
0 1 2 3 4
40 60 96
Koncentracija alkohola (%)
1,4-naftokinon (mg/l) 'Elit' - 30. 6. 2005
'Elit' - 7. 7. 2005
a a
b
a ab b
Slika 5: Povprečna vsebnost 1,4- naftokinona ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
Vsebnost 1,4-naftokinona v naši raziskavi je tako pri sorti 'Franquette' (Slike 4), kot pri sorti 'Elit' (Slika 5), dosegla najvišje vrednosti v prvem terminu pri ekstrakciji s 96 % etanolom. Najvišjo vsebnost smo določili pri sorti 'Franquette', kjer je vrednost dosegla 4,13 ± 0,46 mg/l likerja in se je statistično značilno razlikovala od vrednosti pri ekstrakciji s 40 % in 60 % etanolom. Tudi pri sorti 'Elit' smo najvišjo vrednost izmerili pri ekstrakciji s 96 % etanolom (1,93 ± 0,06 mg/l), ki se je statistično značilno razlikovala od vsebnosti pri ekstrakciji s 40 % in 60 % etanolom.Vsebnost 1,4-naftokinona je v drugem terminu manjša kot v prvem pri obeh sortah in pri vseh koncentracijah etanola. Najnižjo vsebnost 1,4-naftokinona smo določili v drugem terminu v likerju iz sorte 'Franquette' in 40 %
etanola in sicer 0,8 ± 0,06 mg/l likerja. Vrednosti 1,4-naftokinona pri sorti 'Franquette' so se v drugem terminu statistično značilno razlikovale pri ekstrakcijah z vsemi koncentracijami etanola, in sicer je bila najnižja vrednost izmerjena pri ekstrakciji s 40 % etanolom (0,8 ± 0,06 mg/l) najvišja pa pri ekstrakciji s 96 % etanolom (2,64 ± 0,16 mg/l).
Pri sorti 'Elit' so se v drugem terminu statistično značilne razlike pokazale le za vrednosti pri ekstrakciji s 40 % (1,57 ± 0,05 mg/l) in 96 % etanolom (1,93 ± 0,06 mg/l).
4.3 KAVINA KISLINA
Kavina kislina spada med hidroksicimetne kisline. Njeno vsebnost v jedru in rjavi kožici, ki pokriva jedro oreha, so raziskovali Colarič in sod. (2005) in ugotovili, da je vsebnost kavine kisline v jedru 0,24 mg/100 g jedrc in v rjavi kožici 4,86 mg/100 g, kar je zelo blizu vsebnosti, ki so jo Štampar in sod. (2006) izmerili v zelenih lupinah oreha in je znašala od 1 do 1,87 mg/100 g suhe mase.
0 0,5 1 1,5 2 2,5
40 60 96
Koncentracija alkohola (%)
Kavina kislina (mg/l) 'Franquette' - 30. 6. 2005
'Franquette' - 7. 7. 2005 a
ab b
Slika 6: Povprečna vsebnost kavine kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
Vsebnost kavine kisline v orehovem likerju se med različnimi termini in ekstrakcijami z različnimi koncentracijami etanola ni bistveno razlikovala. Najvišja vsebnost kavine kisline je bila pri sorti 'Franquette' (Slika 6) v prvem terminu in 60 % koncentraciji etanola (1,86 ± 0,08 mg/l) in se je statistično značilno razlikovala od vsebnosti pri ekstrakciji s 96 % etanolom (1,38 ± 0,09 mg/l). V drugem terminu pri sorti 'Franquette' ni bilo statistično značilnih razlik med vsebnostmi kavine kisline pri posamezni koncentraciji etanola, smo pa v tem terminu izmerili najmanjše vsebnosti kavine kisline (~ 1,30 mg/l).
Pri sorti 'Elit' (Slika 7) so bile vsebnosti nekoliko nižje, od sorte 'Franquette', v prvem terminu in nekoliko višje v drugem terminu. V prvem terminu so se statistično značilne razlike pokazale med ekstrakcijama s 40 % (1,69 ± 0,15 mg/l) in 96 % etanolom (1,33 ±
0,05 mg/l). V drugem terminu se je statistično značilna razlika v vsebnosti kavine kisline pokazala le pri ekstrakciji s 60 % etanolom (1,71 ± 0,03 mg/l), kjer je bila vsebnost višja kot pri ekstrakciji s 40 % (1,51 ± 0,03 mg/l) in 96 % etanolom (1,53 ± 0,05 mg/l).
0 0,5 1 1,5 2 2,5
40 60 96
Koncentracija alkohola (%)
Kavina kislina (mg/l) 'Elit' - 30. 6. 2005
'Elit' - 7. 7. 2005 b
ab a a
b
a
Slika 7: Povprečna vsebnost kavine kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
4.4 GALNA KISLINA
Glavna fenolna spojina, analizirana v orehovem likerju, je bila galna kislina, ki spada med hidroksibenzojske kisline. Najvišjo vsebnost smo izmerili pri sorti 'Franquette' (Slika 8) v prvem terminu pri uporabi 40 % etanola, in sicer 216,77 ± 4,34 mg/l, in je lahko tudi več kot 10x večja od vsebnosti ostalih fenolnih spojin v orehovem likerju. Nekoliko nižjo vsebnost smo izmerili v drugem terminu pri isti sorti, najnižjo pa pri sorti 'Elit' (Slika 9) v obeh terminih pri ekstrakciji s 96 % etanolom - v prvem terminu je bila vsebnost 56,47 ± 1,49 mg/l, v drugem terminu pa 55,16 ± 2,75 mg/l. Pri obeh sortah in v obeh terminih so bile razlike med vsebnostmi galne kisline, pri ekstrakcijah z različnimi koncentracijami alkohola, statistično značilne, in sicer najvišje vsebnosti so bile pri obeh sortah in v obeh terminih izmerjene pri ekstrakciji s 40 % etanolom, nekoliko nižje pri ekstrakciji s 60 % etanolom in najnižje pri ekstrakciji s 96 % etanolom.
Podobne rezultate so v svoji raziskavo dobili tudi Štampar in sod. (2006), ki so poročali, da je glavna fenolna spojina v orehovem likerju iz sorte 'Elit' galna kislina, le da je vsebnost le-te bila v njihovi raziskavi nižja (manj kot 7 mg/100 ml), kot so jo pokazali naši rezultati.
Pri raziskavi vsebnosti galne kisline v zeleni lupini oreha so ugotovili višjo vsebnost v juniju (28,3 ± 4,65 mg/100 g suhe mase) kot v juliju (13,8 ± 1,54 mg/100 g suhe mase).
0 50 100 150 200 250
40 60 96
Koncentracija alkohola (%)
Galna kislina (mg/l) 'Franquette' - 30. 6. 2005
'Franquette' - 7. 7. 2005 a
c b c
b
a
Slika 8: Povprečna vsebnost galne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
0 20 40 60 80 100 120 140
40 60 96
Koncentracija alkohola (%)
Galna kislina (mg/l) 'Elit' - 30. 6. 2005
'Elit' - 7. 7. 2005 c
b
a b
a c
Slika 9: Povprečna vsebnost galne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
4.5 ELAGNA KISLINA
Colarič in sod. (2005) so elagno kislino, ki spada med hidroksibenzojske kisline, analizirali v jedrcu oreha in kožici, ki pokriva jedrce, in ugotovili, da je poleg siringinske kisline in juglona ena od glavnih fenolnih spojin v orehu. Njeno vsebnost v enoletnih poganjkih so raziskali Solar in sod. (2006) in ugotovili, da vsebnosti elagne kisline izmerjene v juniju in juliju, rahlo presegajo vsebnosti v maju, najnižjo vsebnost pa dosežejo v avgustu. Štampar in sod. (2006) poročajo, da je bilo v zelenih lupinah oreha največ elagne kisline izmerjene konec maja, ko je bila vsebnost 98,3 ± 5,56 mg/100 g suhe mase, nato pa je vsebnost
padala vse do konca julija, ko je bila vsebnost 3,90 ± 0,84 mg/100 g suhe mase. V orehovem likerju iz sorte 'Elit' so elagno kislino določili kot eno glavnih fenolnih spojin, njene vsebnosti pa so bile podobne, kot smo jih dobili v naših raziskavah.
0 5 10 15 20 25 30 35
40 60 96
Koncentracija alkohola (%) Elagna kislina (mg/l)
'Franquette' - 30. 6. 2005 'Franquette' - 7. 7. 2005 a
ab
b
Slika 10: Povprečna vsebnost elagne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Franquette' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
40 60 96
Koncentracija alkohola (%)
Elagna kislina (mg/l) 'Elit' - 30. 6. 2005
'Elit' - 7. 7. 2005 a
b
b
Slika 11: Povprečna vsebnost elagne kisline ± standardna napaka v mg/l likerja pri sorti 'Elit' glede na oba termina obiranja zelenih plodov in ekstrakciji s 40 %, 60 % in 96 % etanolom. Različne črke (a, b, c) označujejo statistično značilne razlike med različnimi koncentracijami etanola pri p<0,05.
Tudi naša raziskava je pokazala, da je elagna kislina ena od glavnih fenolnih spojin v orehovem likerju, čeprav je njena vsebnost veliko nižja od galne kisline. Najvišje vsebnosti elagne kisline smo izmerili v obeh terminih pri sorti 'Franquette' (Slika 10), najnižje pa v obeh terminih pri sorti 'Elit' (Slika 11). Najvišja vsebnost elagne kisline (27,9 ± 4,19 mg/l)
