Magistrska naloga

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

AJDA HERLEC

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVIT MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE

LJUBLJANA, 2021

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

AJDA HERLEC

ANALIZA LITERATURNIH PODATKOV FIZIOLOŠKIH VREDNOSTI AKTIVNOSTI PREBAVNIH LIPAZ IN

OPTIMIZACIJA METODE LIPOLIZE IN VITRO S POSTOPKOM MENJAVE MEDIJEV

ANALYSIS OF LITERATURE DATA ON DIGESTIVE LIPASE ACTIVITY PHYSIOLOGICAL VALUES AND OPTIMIZATION OF IN VITRO LIPOLYSIS METHOD

USING MEDIUM EXCHANGE PROCESS

ENOVIT MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE

LJUBLJANA, 2021

Nalogo sem opravljala na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani pod mentorstvom prof. dr. Marije Bogataj, mag. farm. in somentorstvom asist. Katarine Rede, mag. farm.

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem mentorici prof. dr. Mariji Bogataj, mag. farm. in somentorici asist.

Katarini Rede, mag. farm. za vso pomoč, strokovne nasvete, usmerjanje in temeljit pregled magistrske naloge.

Prav posebna zahvala gre mojim staršem in družini, ki so mi stali ob strani in me podpirali skozi celoten študij. Hvala tudi Rebeki, Urši, Barbi in Tamari za vse ustvarjene spomine.

Hvala pa tudi obema Federicama za skupaj preživet čas v Tübingenu.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom mentorice prof. dr.

Marije Bogataj, mag. farm. in somentorice asist. Katarine Rede, mag. farm.

Ajda Herlec Komisija za zagovor:

Predsednik komisije: prof. dr. Aleš Obreza, mag. farm.

Članica komisije: dr. Irena Prodan Žitnik, mag. farm.

I

VSEBINA

KAZALO SLIK ... III KAZALO PREGLEDNIC ... IV POVZETEK ... VII ABSTRACT ... IX SEZNAM OKRAJŠAV ... XI

1. UVOD... 1

1.1. PREBAVNELIPAZE ... 2

1.1.1 Želodčna lipaza ... 3

1.1.2 Pankreasna lipaza ... 5

1.1.3 Pankreasni lipazi podoben protein 2 ... 6

1.1.4 Karboksil ester hidrolaza ... 6

1.1.5 Pankreasna fosfolipaza A2 ... 7

1.2 METODEZADOLOČANJEAKTIVNOSTILIPAZ ... 7

1.2.1 Volumetrične metode ... 8

1.2.2 Spektrofotometrične metode ... 9

1.2.2.1 Spektrometrija v vidnem spektru (VIS spektrofotometrija) ... 9

1.1.1.1 IR spektrofotometrija ... 10

1.1.1.2 Fluorimetrija ... 10

1.2.3 Metode z uporabo radioaktivnih izotopov ... 10

1.2.4 Imunokemijske metode... 10

1.2.5 Konduktometrične metode ... 11

1.2.6 Kromatografske metode ... 11

1.2.7 Metode, ki temeljijo na biosenzorjih ... 11

2. NAMEN DELA ... 12

3. MATERIALI IN METODE ... 13

3.1. PROGRAMSKAOPREMA,MATERIALIINNAPRAVE ... 13

3.1.1. Programska oprema ... 13

3.1.2. Materiali ... 13

3.1.3. Naprave ... 14

3.2. METODEANALIZELITERATURNIHPODATKOV ... 14

3.2.1. Iskalni niz ... 14

3.2.2. Izbor ustreznih člankov ... 15

3.2.3. Analiza podatkov iz člankov ... 16

3.3. METODELABORATORIJSKEGADELA ... 17

3.3.1. Priprava medijev ... 17

3.3.1.1. Priprava maleatnih pufrov ... 17

3.3.1.2. Priprava prebavnih medijev ... 18

3.3.1.2.1. Prvotni postopek priprave prebavnega medija ... 18

3.3.1.2.2. Optimiziran postopek priprave prebavnega medija ... 18

3.3.1.2.3. Priprava prebavnega medija za metodo in vitro lipolize s postopkom menjave medija 19 3.3.1.3. Priprava 1 M 4-bromofenilboronske kisline (BBBA) ... 20

3.3.1.4. Priprava ocetne kisline za analizo HPLC ... 20

3.3.1.5. Priprava 0,1 % ocetne kisline za redčenje vzorcev ... 20

3.3.2. Priprava samo-mikroemulgirajočega sistema (SMES) ... 20

3.3.2.1. Priprava SMES-a brez učinkovine ... 20

3.3.2.2. Priprava SMES-a z 1 % dipiridamolom ... 20

3.3.3. Merjenje pH mešanice 0,01 M HCl in maleatnega pufra ... 21

3.3.3.1. Merjenje pH mešanice 0,01 M HCl in maleatnih pufrov ... 21

3.3.3.2. Merjenje pH mešanice 0,01 M HCl in maleatnih pufrov z dodanim SMESom ... 21

II

3.3.4. Merjenje pH mešanice 0,01 M HCl in prebavnega medija ... 21

3.3.4.1. Merjenje pH mešanice 0,01 M HCl in prebavnega medija ... 21

3.3.4.2. Raztapljanje natrijevega deoksiholata in fosfatidilholina v zmesi 0,01 M HCl in maleatnega pufra ... 22

3.3.4.3. Optimizacija priprave prebavnega medija ... 22

3.3.5. Določanje aktivnosti pankreatina ... 23

3.3.5.1. Priprava pankreatina za določanje aktivnosti ... 23

3.3.5.2. Določanje aktivnosti pankreatina na titratorju ... 23

3.3.6. In vitro lipoliza s postopkom menjave medija... 23

3.3.6.1. Priprava pankreatina za metodo in vitro lipolize s postopkom menjave medija ... 23

3.3.6.2. Poskus in vitro lipolize s postopkom menjave medija ... 24

3.3.6.3. Vzorčenje med poskusom in vitro lipolize s postopkom menjave medija ... 26

3.3.6.4. Priprava vzorcev za analizo s HPLC ... 26

3.3.7. Določanje deleža sproščenega dipiridamola s HPLC ... 27

3.3.7.1. Analiza HPLC ... 27

3.3.7.2. Priprava umeritvene premice ... 27

3.3.7.3. Delež sproščenega dipiridamola ... 28

3.3.8. Poskus brez lipaze ... 29

4. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 30

4.1. REZULTATIINRAZPRAVAANALIZELITERATURNEGAPREGLEDA ... 30

4.1.1. Ustrezni članki... 30

4.1.2. Analiza literature ... 30

4.1.2.1. Analiza člankov glede na leto objave članka ... 30

4.1.2.2. Analiza člankov glede na vrsto študije ... 31

4.1.2.3. Analiza člankov glede na vsebujoče podatke o aktivnosti želodčne in pankreasne lipaze 32 4.1.2.4. Analiza člankov glede na metodo določanja aktivnosti lipaz ... 33

4.1.2.5. Analiza člankov glede na enoto aktivnosti lipaz ... 34

4.1.2.6. Analiza člankov glede na starost prostovoljcev ... 35

4.1.2.7. Analiza člankov glede na zaužit obrok v študijah ... 36

4.1.2.8. Analiza podatkov o aktivnosti želodčne lipaze ... 36

4.1.2.8.1. Primerjava aktivnosti želodčne lipaze na tešče, določene s substratoma tributirinom in trioleinom ... 36

4.1.2.8.2. Primerjava aktivnosti želodčne lipaze glede na pH medija, uporabljenega pri določanju aktivnost ... 38

4.1.2.8.3. Aktivnost želodčne lipaze po obroku ... 40

4.1.2.9. Analiza podatkov o aktivnosti pankreasne lipaze ... 41

4.1.2.9.1. Primerjava aktivnosti pankreasne lipaze glede na uporabljene substrate ... 41

4.1.2.9.2. Primerjava aktivnosti pankreasne lipaze glede na mesto odvzema vzorcev ... 42

4.1.2.9.3. Aktivnost pankreasne lipaze po obroku ... 43

4.2. REZULTATIINRAZPRAVALABORATORIJSKEGADELA ... 44

4.2.1. Iskanje ustrezne sestave mešanice 0,01 M HCl in maleatnih pufrov ... 44

4.2.2. Merjenje pH mešanici 0,01 M HCl in maleatnega pufra z dodatkom SMES-a ... 46

4.2.3. Merjenje pH mešanice 0,01 M HCl in prebavnega medija ... 47

4.2.3.1. Merjenje pH mešanice 0,01 M HCl in prebavnega medija pripravljenega po prvotnem postopku 47 4.2.3.2. Raztapljanje natrijevega deoksiholata in fosfatidilholina v zmesi 0,01 M HCl in maleatnega pufra ... 49

4.2.3.3. Optimizacija priprave prebavnega medija ... 50

4.2.3.4. Merjenje pH mešanice 0,01 M HCl in prebavnega medija pripravljenega po optimiziranem postopku ... 52

4.2.4. Določanje aktivnosti pankreatina ... 52

4.2.4.1. Določanje aktivnosti pankreatina ... 52

4.2.4.2. Meritve pH pred in po dodatku tributirina ... 54

4.2.5. In vitro lipoliza s postopkom menjave medija... 55

III

4.2.5.1. Poskus brez lipaze ... 55

4.2.5.2. Primerjava dodane količine NaOH in spreminjanje pH pri optimizaciji metode in vitro lipolize s postopkom menjave medija z aktivnostmi 250, 600 in 1000 TBU/mL ... 56

4.2.5.3. Primerjava deležev sproščenega dipiridamola med aktivnostmi 250, 600 in 1000 TBU/mL 59 4.2.5.3.1. Delež sproščenega dipiridamola v celokupnih vzorcih ... 61

4.2.5.3.2. Delež sproščenega dipiridamola v vzorcih vodne faze ... 63

5. SKLEP ... 65

6. LITERATURA ... 67

7. PRILOGA ... XI

KAZALO SLIK

Slika 2: Prikaz poteka razgradnje trigliceridov, fosfolipidov, galaktopilidov in holesterolnih estrov z navedenimi lipazami, ki katalizirajo njihovo razgrajujejo. ŽL – želodčna lipaza, PL – pankreasna lipaza, CEH – karboksil ester hidrolaza, PLPP2 – pankreasni lipazi podoben protein 2, FLA2 – fosfolipaza A2 in prikazom triglicerida in fosfatidilholina z označenimi pozicijami ... 3

Slika 3: Umeritvena premica za določevanje koncentracij dipiridamola, pripravljena v mobilni fazi ... 27

Slika 4: Prikaz števila ustreznih člankov s podatki o aktivnosti želodčne in pankreasne lipaze v 10- letnih obdobjih ... 31

Slika 5: Razvrstitev člankov glede na vrsto študije ... 32

Slika 6: Razdelitev člankov glede na vsebujoče podatke o aktivnosti želodčne in pankreasne lipaze ... 33

Slika 7: Razdelitev člankov glede na uporabljeno metodo za določaje aktivnosti lipaz ... 34

Slika 8: Razdelitev člankov glede na starost prostovoljcev, udeleženih v študijah ... 35

Slika 9: Razdelitev študij stanja po obroku glede na zaužit obrok v študijah ... 36

Slika 10: Aktivnost želodčne lipaze na tešče, moder stolpec – aktivnost so določali z uporabo substrata tributirina, oranžen stolpec – aktivnost so določali z uporabo substrata trioleina. ... 38

IV

Slika 11: Aktivnost želodčne lipaze na tešče, modri stolpci – aktivnost so določali v mediju s pH 5,4, oranžni stolpci – aktivnost so določali v mediju s pH 5,5, zelena stolpca – aktivnost so določali v mediju s pH 6,0. ... 39 Slika 12: Aktivnost želodčne lipaze na tešče – direktna titracija s pretitracijo ... 39 Slika 13: Aktivnost želodčne lipaze na tešče in 60 oz. 240 min po onroku ... 40

Slika 14: Aktivnosti pankreasne lipaze na tešče – oranžen stolpec: določanje aktivnosti pankreasne lipaze z ELISA testom, zelen stolpec: določanje aktivnosti pankreasne lipaze s fluorimetrijo, modri stolpci: določanje aktivnosti pankreasne lipaze z direktno titracijo. ... 41

Slika 15: Aktivnost pankreasne lipaze na tešče, modri stolpci – odvzem vzorcev blizu velike dvanajstnikove papile, oranžna stolpca – odvzem blizu Treitzovega ligamenta, razlika v številu prostovoljcev, prost. – prostovoljcev, sek-cer. – dodatek sekretina in cerulina. ... 42

Slika 16: Aktivnost pankreasne lipaze na tešče in 60, 90 ter 120 min po obroku, prost. – prostovoljcev, posam. – podatki za posameznika ... 44 Slika 17: Volumen dodanega NaOH v odvisnosti od časa pri določanju aktivnosti pankreatina. ... 53

Slika 18: Prikaz razgradnje tributirina ob prisotnosti pankreasne lipaze in nastanek proste maščobne kisline ... 54

Slika 19: Spreminjanje pH v odvisnosti od časa pri in vitro lipolizi SMES-a s postopkom menjave medija pri aktivnosti pankreatina 1000 TBU/mL ... 58

Slika 20: Povprečni volumni dodanega NaOH, normirani na 500 mg SMES, za aktivnosti 250, 600 in 1000 TBU/mL (n=3) ... 59

Slika 21: Delež sproščenega dipiridamola v celokupnih vzorcih, odvzetih med in vitro lipolizo SMES-a z aktivnostmi pankreatina 250, 600 in 1000 TBU/mL, kjer čas 0 pomeni, da v reakcijski posodi še ni bilo dodanega pankreatina, SMES pa je že bil dispergiran v 0,01 M HCl ... 63

Slika 22: Delež sproščenega dipiridamola v vodni fazi, odvzetih med in vitro lipolizo SMES-a z aktivnostmi pankreatina 250, 600 in 1000 TBU/mL, kjer čas 0 pomeni, da v reakcijski posodi še ni bilo dodanega pankreatina, SMES pa je že bil dispergiran v 0,01 M HCl ... 64

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica I: Primerjava lastnosti želodčne in pankreasne lipaze ... 5 Preglednica II: Pregled substratov, principa določevanja aktivnosti lipaz in prednosti (P) ter slabosti (S) metod, ki se uporabljajo za določanje aktivnosti lipaz. ... 7

V

Preglednica III: Besede, ki smo jih uporabili za oblikovanje iskalnih nizov in ki ustrezajo postavljenim kriterijem ... 15

Preglednica IV: Koncentracije in preračunane mase komponent za pripravo 200 mL 50 mM, 100 mM in 200 mM maleatega pufra ... 17 Preglednica V: Sestava prebavnih medijev z navedenimi izhodnimi koncentracijami in volumni pripravljenih maleatnih pufrov ter koncentraciamii in masami fosfatidilholina (FH) in natrijevega deoksiholata (NDH) za pripravo 10, 80, 100, 20, 40, 50 in 15 mL prebavnega medija. Neosenčen del – priprava prebavnega medija po prvotnem oz. optimiziranem postopku priprave medija.

Oranžni del – priprava večje količine prebavnega medija pripravljenega po prvotnem postopku.

Zeleni del – optimizacija prebavnega medija. Sivo osenčen del – priprava prebavnega medija za metodo in vitro lipolize s postopkom menjave medija. ... 19 Preglednica VI: Deleži komponent v SMES-u... 20

Preglednica VII: Masa pankreatina, ki ustreza aktivnostim 250, 600 in 1000 TBU/mL, za pripravo 6 mL raztopine pankreatina za metodo in vitro lipolize s postopkom menjave medija ... 24 Preglednica VIII: Parametri za določanje aktivnosti pankreatina (a) in metodo in vitro lipolize s postopkom menjave medija (b) ... 25 Preglednica IX: Rezultati pH meritev mešanice 0,01 M HCl in maleatnih pufrov z navedenimi volumni 0,01 M HCl in volumni, koncentracije in pH maletnih pufrov ter končni volumen;

povprečja, SD – standardni odklon in RSD – relativni standardni odklon. ... 45

Preglednica X: Rezultati pH meritev dodatka SMES-a k 0,01 M HCl in maleatnega pufra z navedenimi volumni 0,01 M HCl in volumni, koncentracijami in pH maleatnih pufrov; povprečja, SD in RSD. ... 47 Preglednica XI: Rezultati pH meritev mešanice 0,01 M HCl in prebavnega medija pripravljenega po prvotnem postopku. V preglednici so navedeni tudi volumni 0,01 M HCl in prebavnega medija, koncentracije ter pH maleatnih pufrov, ki smo jih uporabili za pripravo prebavnega medija pripravljenega po prvotnem postopku, in opažanja pri pripravi prebavnega medija. ... 48

Preglednica XII: Rezultati pH meritev mešanice 0,01 M HCl in prebavnega medija pripravljenega po prvotnem postopku, kjer smo pripravili večje količine prebavnega medija. V preglednici so navedeni tudi volumni 0,01 M HCl in prebavnega medija, koncentracije ter pH maleatnih pufrov, ki smo jih uporabili za pripravo prebavnega medija pripravljenega po prvotnem postopku, in opažanja pri pripravi prebavnega medija; povprečja, SD, RSD ... 49 Preglednica XIII: Rezultati in opažanja pri poskusu raztapljanja natrijevega deoksiholata in fosfatidilholina v zmesi 0,01 M HCl in maleatnega pufra ... 50

VI

Preglednica XIV: Rezultati pH meritev pri optimizaciji postopka priprave prebavnega medija. V preglednici so navedeni volumni 0,01 M HCl in prebavnega medija, koncentracije ter pH maleatnih pufrov, ki smo jih uporabili pri optimizaciji priprave prebavnega medija, in opažanja pri pripravi prebavnega medija. ... 51 Preglednica XV: Rezultati pH meritev mešanice 0,01 M HCl in prebavnega medija pripravljenega po optimiziranem postopku z opažanji; povprečje, SD in SRD ... 52

Preglednica XVI:Merjenje pH medija za merjenje aktivnosti pankreatina pred in po dodatku tributirina, 3 ponovitve meritev, navedeno povprečje, SD in RSD ... 55

Preglednica XVII: Meritve pH pri poskusu brez lipaze v različnih stopnjah postopka menjave medija, 3 ponovitve meritev, navedeno povprečje meritev, SD in RSD. ... 55

Preglednica XVIII: Delež sproščenega dipiridamola v celokupnih vzorcih in vzorcih vodne faze pri poskusu brez lipaze, 3 meritve, navedena povprečja, SD in RSD ... 56

Preglednica XIX: Vrednosti pH reakcijske zmesi pred dodatkom pankreatina, ob času 0, po 20 s od začetka poskusa in razlike med vrednostmi pH v teh časovnimi točkami za aktivnosti pankreatina 250, 600 in 1000 TBU/mL, navedena povprečja, SD in RSD ... 58 Preglednica XX: Delež sproščenega dipiridamola v celokupnih vzorcih in celotni količini za vsako ponovitev z izračunanim povprečjem, SD, RSD v posamezni časovni točki za aktivnosti 250, 600 in 1000 TBU/mL. Podan je tudi delež celotne količine dip, ki predstavlja vsoto seštevek dipiridamola v ostanku in mase dipiridamola v odvzetih vzorcih. ... 60 Preglednica XXI: Delež sproščenega dipiridamola v vzorcih vodne faze za vsako ponovitev posebej z izračunanim povprečjem, SD, RSD posamezni časovno točko za aktivnosti 250, 600 in 1000 TBU/mL ... 61 Preglednica XXII: Zbrani podatki o aktivnosti želodčne lipaze . ... XI Preglednica XXIII: Zbrani podatki o aktivnosti pankreasne lipaze ... XIII

VII

POVZETEK

Ena izmed rešitev za povečanje biološke uporabnost slabo topnih učinkovin je njihova vgradnja v lipidne dostavne sisteme. Po peroralni aplikaciji so ti podvrženi kompleksnim procesom razgradnje, ki jih klasični testi za vrednotenje sproščanja učinkovin ne zmorejo ponazoriti. Zaradi tega se razvijajo novi testi na osnovi in vitro lipolize, ki v večji meri upoštevajo pogoje, ki vplivajo na razgradnjo lipidnih dostavnih sistemov. Eden izmed pomembnih vplivov so prebavne lipaze, ki hidrolizirajo estrske vezi lipidov in jih tako spremenijo v oblike, ki se lahko absorbirajo. Namen te naloge je bil analizirati fiziološke podatke o aktivnosti prebavnih lipaz iz literature in optimizirati metodo in vitro lipolize s postopkom menjave medija.

V prvem delu naloge smo v podatkovni bazi Pubmed sistematično iskali članke s podatki o aktivnosti želodčne in pankreasne lipaze, določene pri zdravih prostovoljcih v stanjih na tešče in po obroku. Našli smo 17 ustreznih člankov, jih analizirali in pridobljene podatke grafično prikazali. Pri analizi člankov smo ugotovili, da so vrednosti aktivnosti želodčne in pankreasne lipaze zelo odvisne od parametrov določanja aktivnosti, kot sta struktura zaužitega obroka (trden ali tekoč obrok) in metoda določanja aktivnosti lipaz (izbira metode, uporabljen substrat). Aktivnosti pankreasne lipaze pa niso odvisne od mesta odvzema vzorcev v dvanajstniku.

Ideja izvedbe metode in vitro lipolize s postopkom menjave medija je, da lipidne dostavne sisteme dispergiramo v 0,01 M HCl, ki ponazarja kisle želodčne pogoje, nato pa z dodatkom prebavnega medija ponazorimo prehod vsebine želodca v tanko črevo.

Preizkusili smo več mešanic 0,01 M HCl in maleatnega pufra v različnih razmerjih z različnimi koncentracijami komponent ter pH vrednostmi maleatnega pufra. Izbrali smo mešanice, ki so imele pH 7,5 oz. 6,5. V nadaljevanju smo maleatnemu pufru dodali natrijev deoksiholat in fosfatidilholin in tako pripravili prebavni medij. Pri tem smo optimizirali postopek priprave prebavnega medija. Z razvitim postopkom menjave medija (0,01 M raztopina HCl, ki ji dodamo prebavni medij, pripravljen iz 100 mM maleatnega pufra s pH 7,8 z optimiziranim postopkom) smo uspešno nadgradili metodo in vitro lipolize.

Z metodo in vitro lipolize s postopkom menjave medija smo vrednotili vpliv aktivnosti pankreatina na sproščanje dipiridamola iz samo-mikroemulgirajočega sistema (SMES), pri

VIII

čemer smo primerjali tri aktivnosti (250, 600 in 1000 TBU/mL) pankreatina, izbrane na podlagi analize literature. Določili smo koncentracijo sproščenega dipiridamola v celokupnih vzorcih, v vzorcih vodne faze in ostanku. Iz neznanega razloga so bili rezultati v celokupnih vzorcih in celotni količini (seštevek dipiridamola v ostanku in mase dipiridamola v odvzetih vzorcih) nižji od 100 %. Iz vzorcev vodne faze pa smo opazili, da so bili deleži sproščenega dipiridamola najvišji pri najnižji aktivnosti pankreasne lipaze in najnižji pri najvišji aktivnosti, kar ni bilo v skladu z našimi pričakovanji.

KLJUČNE BESEDE: aktivnost želodčne lipaze, aktivnost pankreasne lipaze, prebavni medij, in vitro lipoliza

IX

ABSTRACT

One of the solutions to increase the bioavailability of poorly water-soluble active pharmaceutical ingredients is their incorporation into lipid-based drug delivery system.

After oral administration lipid-based drug delivery systems are digested in complex processes that cannot be simulated by conventional tests to evaluate the release of active ingredients. New tests based on in vitro lipolysis are being developed that take greater account of the conditions that affect digestion of lipid-based delivery systems. One of the important influences are digestive lipases, which hydrolyse lipid ester bonds and thus convert them into forms that are more easily absorbed. The aim of this thesis was to analyse physiological data on the activity of digestive lipases from literature and to optimize the in vitro lipolysis method using medium exchange process.

In the first part, we systematically searched the Pubmed database for articles with data on fasted and fed gastric and pancreatic lipase activity determined in healthy volunteers. We found 17 relevant articles, analysed them and graphically presented the obtained data. In the analysis of the articles, we found the values of gastric and pancreatic lipase activity are highly dependent on activity determination parameters such as structure of solid or liquid meal and lipase activity determination method (choice of method, substrate used).

However, pancreatic lipase activities do not depend on the sampling site in duodenum.

The idea of the in vitro lipolysis method using medium exchange process is to disperse lipid-based delivery systems in 0.01 M HCl, which illustrates acidic gastric conditions, and then by adding digestive medium we demonstrate the passage of gastric contents into the small intestine. We tested several mixtures of 0,01 M HCl and maleate buffer in different ratios and with different concentrations of components and pH values of maleate buffer.

We selected mixtures that had a pH of 7.5 or 6.5. Sodium deoxycholate and phosphatidylcholine were then added to the maleate buffer to prepare the digestive medium. We optimized the process of preparation of the digestive medium. The in vitro lipolysis method was successfully upgraded with a developed medium exchange process:

0.01 M HCl solution to which digestive medium prepared from 100 mM maleate buffer pH 7.8 is added with an optimized process of preparation.

The effect of pancreatic activity on the release of dipyridamole from the self- microemulsifying system (SMES) was evaluated with the in vitro lipolysis method using

X

medium exchange process, comparing three activities of pancreatin (250, 600 in 1000 TBU/mL) selected based on literature analysis. We determined the concentration of released dipyridamole in the whole samples, in the samples of aqueous phase and in the residue. For some unknown reason, the results in the whole samples and the total amount of dipyridamole (sum of dipyridamole in the residue and mass of dipyridamole in the samples taken) were lower than 100 %. From the aqueous phase samples, we observed that the proportions of dipyridamole released were highest at the lowest pancreatic lipase activity and lowest at the highest pancreatic lipase activity, which was not within our expectations.

KEY WORDS: gastric lipase activity, pancreatic lipase activity, digestive medium, in vitro lipolysis

XI

SEZNAM OKRAJŠAV

BBBA - 4-bromofenilboronska kislina

CEH – carboxyl ester hydrolase, karboksil ester hidrolaza ELISA – encimska imunoadsorpcijska preiskava

FH – fosftidilholin FLA2 – fosfolipaza A2

FTIR – infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo HPLC – tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

IR spektroskopija – spektroskopija v infrardečem spektru NDH – natrijev deoksiholat

PL – pankreasna lipaza

PLPP1 – pankreasni lipazi podoben protein 1 PLPP2 – pankreasni lipazi podoben protein 2

Rcf - relative centrifugal force, relativna centrifugalna sila RSD – relativni standardni odklon

SD – standardni odklon

SI – International System of Units, Mednarodni sistem enot SMES – samo-mikroemulgirajoči sistem

VIS spektroskopija – spektroskopija v vidnem spektru ŽL – želodčna lipaza

1

1. UVOD

Prebavne lipaze so pomembni prebavni encimi, ki hidrolizirajo estrske vezi maščob in jih pretvorijo v bolj vodotopne molekule, ki se lahko absorbirajo v krvni obtok. Slika 1 prikazuje, kaj se dogaja z maščobami vzdolž prebavnega trakta. Razgradnja maščob se začne v želodcu, kjer se nahaja želodčna lipaza (ŽL) in se nadaljuje v dvanajstniku, kjer se želodčna vsebina združi z izločki trebušne slinavke in žolča. Glavni izločki trebušne slinavke, ki sodelujejo pri razgradnji maščob, so prebavne lipaze, glavne komponente žolča pa žolčne kisline ter fosfolipidi. Lipaze, ki se izločijo iz trebušne slinavke, so pankreasna lipaza (PL), pankreasni lipazi podoben protein 2 (PLPP2), karboksil ester hidrolaza (crboxyl ester hydrolase – CEH) in pankreasna fosfolipaza A2 (FLA2) (1). Lipaze se med seboj razlikujejo glede na vrsto maščob, ki jih razgrajujejo. Glavni predstavnik s hrano vnesenih maščob so trigliceridi (92 – 96 %), katere v največji meri razgrajujeta želodčna in pankreasna lipaza. Ostale maščobe, ki jih prebavne lipaze še razgrajujejo so fosfolipidi, galaktolipidi, holesterol in holesterolni estri ter v maščobah topni vitamini (1,2).

Slika 1: Prikaz poti maščobnih kapljic od začetka razgradnje v želodcu do mesta absorpcije razgradnjih produktov maščob v tankem črevesju z navedenimi organi, ki so pomembni za razgradnjo (zelen okvirček), lipazami (oranžen okvirček) in oblikami v katerih se nahajajo oljne kapljice in razgradnji produkti maščob (modri okvirček) (povzeto po (3)).

2

1.1. PREBAVNE LIPAZE

Lipaze spadajo v specifičen razred esteraz, ki katalizirajo hidrolizo estrskih vezi v vodi netopnih substratov. V vodi netopni substrati se v prebavnem traktu nahajajo v obliki emulzije olje v vodi in lipaze delujejo na površini kapljic emulzije. Substrati, ki se nahajajo v taki obliki, so trigliceridi in digliceridi. Trigliceride in digliceride razgrajujeta želodčna in pankreasna lipaza in preglednica I prikazuje primerjavo njunih lastnosti. Ostale lipaze razgrajujejo tudi estrske vezi drugih lipidov, ki se v prebavnem traktu nahajajo v obliki micelov, kot so fosfolipidi, galaktolipidi, holesteroli in holesterolni estri ter v maščobah topni vitamini (1). Slika 2 prikazuje procese razgradnje trigliceridov, fosfolipidov, galaktolipidov in holesterolnih estrov z navedenimi lipazami, ki katalizirajo posamezen korak razgradnje (1).

Prva stopnja razgradnje trigliceridov je nastanek diglicerida in proste maščobne kisline (slika 2 – enačba 1). Tudi digliceridi so v vodi slabo topni in se v prebavnem traktu nahajajo v obliki kapljic. V naslednjem koraku, po odcepitvi še ene proste maščobne kisline, nastanejo monogliceridi (slika 2 – enačba 2). Monogliceridi so z dvema hidroksilnima skupinama bolj polarni kot digliceridi ter trigliceridi in se lahko s pomočjo površinsko aktivnih soli žolčnih kislin in fosfolipidov organizirajo v lamelarne oblike in micele. Želodčna in pankreasna lipaza delujeta na površini kapljic emulzije olje v vodi, torej so glavni substrati teh dveh najpomembnejših lipaz trigliceridi in digliceridi, medtem ko se monogliceridi razgradijo do glicerola in zadnje proste maščobne kisline s pomočjo drugih lipaz, kot sta karboksil ester hidrolaza in pankreasni lipazi podoben protein 2 (slika 2 – enačba 3). Razgradnja monogliceridov ni ključnega pomena za uspešno absorpcijo prostih maščobnih kislin, saj se monogliceridi že lahko absorbirajo v krvni obtok (1).

Razgradnja trigliceridov:

Prikaz triglierida z

označenimi pozicijami: Enačba 1

Enačba 2

3

Enačba 3 Razgradnja fosfolipidov:

Prikaz fosfatidilholina z označenimi pozicijami:

Enačba 4

Enačba 5 Razgradnja galaktolipidov:

Enačba 6 Razgradnja holesterolnih estrov:

Enačba 7 Slika 2: Prikaz poteka razgradnje trigliceridov, fosfolipidov, galaktopilidov in holesterolnih estrov z navedenimi lipazami, ki katalizirajo njihovo razgrajujejo. ŽL – želodčna lipaza, PL – pankreasna lipaza, CEH – karboksil ester hidrolaza, PLPP2 – pankreasni lipazi podoben protein 2, FLA2 – fosfolipaza A2 in prikazom triglicerida in fosfatidilholina z označenimi pozicijami

1.1.1 Želodčna lipaza

Človeška želodčna lipaza (ŽL) je 50 kDa velik globularni protein (1,4). Skupaj s pepsinogenom se nahaja v glavnih celicah proksimalnega želodca. Na sproščanje ŽL vpliva vnos hrane preko vpliva na izločanje gastrina ali acetilholina. Dejavniki, ki vplivajo na aktivnost ŽL, so pH, velikost kapljic emulzije olje v vodi, lastnosti obroka (tekoč ali trden obrok), koncentracija dolgoverižnih prostih maščobnih kislin v želodcu in prisotnost površinsko aktivnih snovi (4).

Prvi pogoj za začetek delovanja ŽL je, da se lipidi nahajajo v obliki kapljic emulzije olje v vodi. To je pomembno, saj so lipaze v vodi topne molekule in lahko delujejo le na površini teh kapljic (5). V želodec lahko lipidi pridejo v obliki emulzije (npr. mleko) ali v trdni

4

obliki. V slednjem primeru je proces nastanka emulzije omogočen zaradi želodčne peristaltike in amfifilnih molekul, kot so produkti lipolize ter s hrano vneseni proteini in fosfolipidi (1). Poleg nastanka emulzije pa lahko v želodcu pride tudi do obratnega pojava, in sicer lahko pride do pojava koalescence (združevanja kapljic), ki se pokaže kot lipidna plast na površini vsebine želodca in je prikazana na sliki 1. Vsako povečanje kapljic emulzije olje v vodi zmanjša površino, na katero se lahko adsorbira želodčna lipaza in s tem se zmanjša obseg želodčne lipolize (4).

Želodčna lipaza v največji meri razgrajuje trigliceride in jih hidrolizira stereospecifično na poziciji sn-3 (prikaz triglicerida z navedenimi pozicijami – slika 2). Aktivnost ŽL je manjša pri digliceridih, kjer hidrolizira estersko vez na položaju sn-1 in nastane sn-2- monoglicerid. V najmanjšem obsegu ŽL hidrolizira tudi monogliceride (1,4,5). Pri primerjavi aktivnosti želodčne lipaze med dolgoverižnimi in kratkoverižnimi trigliceridi niso opazili nobene razlike v aktivnosti (4). Opazili pa so razliko v obsegu želodčne lipolize. In sicer v primeru dolgoverižnih trigliceridov po hidrolizi estrske vezi nastanejo dolgoverižne maščobne kisline (4,5). Dolgoverižne maščobne kisline se same ne morejo organizirati v micele in za to potrebujejo žolčne kisline, medtem ko so kratkoverižne maščobne kisline bolj vodotopne in se lahko že same v večjem obsegu odstranijo s površine kapljic (4). V želodcu ni prisotnih žolčnih kislin ali fosfolipidov, zato je tvorjenje lamelarnih struktur in micelov prekinjeno, kar pomeni, da se na površini kapljic emulzije ustvari plast maščobnih kislin. Plast maščobnih kislin na površini kapljic emulzije prekine delovanje ŽL, dokler vsebina želodca ne preide v dvanajstnik. Ko vsebina želodca preide v dvanajstnik, se zmeša z encimi trebušne slinavke in solmi žolčnih kislin ter fosfolipidov (slika 1). Soli žolčnih kislin in fosfolipidi s površine kapljic odstranijo monogliceride in proste maščobne kisline tako, da jih dispergirajo v micelarne oblike. Z odstranitvijo so na površini spet prisotni trigliceridi in želodčna lipaza, ki je skupaj z vsebino želodca potovala naprej v tanko črevo, lahko zopet pomaga pri razgradnji lipidov (1).

Območje delovanja človeške želodčne lipaze je med pH 2 in 7 z vrhom lipolitične aktivnosti pri pH vrednostih med 5 in 5,4 (1,4,5). Z vnosom hrane se pH vrednosti v želodcu dvignejo na pH 5 – 6 in se čez več ur spustijo do bazalne vrednosti, ki je med pH 1 in 2. Široko pH območje delovanja želodčne lipaze po eni strani omogoča dovolj dolgo in zadostno delovanje lipaze v želodcu, po drugi strani pa omogoča delovanje želodčne lipaze tudi v dvanajstniku in naprej v tankem črevesju (4).

5 1.1.2 Pankreasna lipaza

Človeška pankreasna lipaza (PL) je kvantitativno gledano glavna lipaza razgradnje trigliceridov (1). Velikost encima je 50,5 kDa in izloča se iz acinarnih celic trebušne slinavke pod vplivom prebavnih hormonov holecistkinina in sekretina, indirektno pa na izločanje vplivajo tudi produkti lipolize – proste maščobne kisline vplivajo na izločanje holecistkinina. Za razliko od drugih encimov želodčne slinavke, se PL v dvanajstnik izloči kot aktiven encim (1).

Veliko snovi v prebavnem mediju – žolčne kisline, fosfolipidi, holesterolni estri, proteini in ogljikovi hidrati vneseni s hrano – zavirajo delovanje človeške PL (1,2). Zato PL za svoje delovanje potrebuje kolipazo. Kolipaza je 10 kDa velik protein trebušne slinavke. Iz trebušne slinavke se izloči v obliki prokolipaze, ki se s pomočjo tripsina pretvori v kolipazo (1,2). Sama po sebi kolipaza nima nobene katalitične aktivnosti, ampak se v razmerju 1:1 poveže s pankreasno lipazo (1,2). Kolipaza pomaga pankreasni lipazi tako, da jo stabilizira v aktivni konformaciji in se ji pomaga zasidrati na površino kapljice emulzije (1,2). Afiniteta povezave med pankreasno lipazo in kolipazo je večja ob prisotnosti lipidov (1).

Pankreasna lipaza hidrolizira razgradnjo trigliceridov (slika 2 – enačba 1 in 2). Je regioselektiven encim in deluje na pozicijah sn-1 in sn-3 trigliceridov (prikaz triglicerida z navedenimi pozicijami – slika 2) (1,5). Končni produkt hidrolitičnega delovanja PL je sn- 2-monoglicerid (1). Zaradi možne izomerizacije sn-2-monogliceridov v sn-1-monoglicerid lahko PL sodeluje tudi v zadnjem koraku hidrolize trigliceridov, ki vodi do nastanka glicerola (5).

Optimalno območje delovanja PL se nahaja pri pH vrednostih 7 – 7,5. Pod pH 5,0 pankreasna lipaza ne izkazuje pomembne aktivnosti, pod pH 3,0 pa se ta protein denaturira (1).

Preglednica I: Primerjava lastnosti želodčne in pankreasne lipaze

ŽELODČNA LIPAZA PANKREASNA LIPAZA Optimalen pH delovanja 5,0 – 5,4 (1,4,5) 7,0 – 7,5 (1)

Delež lipolize V želodcu: 10 – 25 % (1)

Skupno: do 30 % (2) > 95 % (2)

6

Substrati Trigliceridi, digliceridi (1,4,5) Trigliceridi, digliceridi, sn-1- monogliceridi (1,5)

Delovanje na poziciji triglicerida (prikaz pozicij

triglicerida na sliki 2) sn-3 (1,4,5) sn-1, sn-3 (1,5)

Kofaktor Ne (1,4,5) Da (1,2,5)

1.1.3 Pankreasni lipazi podoben protein 2

Trebušna slinavka izloča dva pankreasni lipazi podobna proteina – pankreasni lipazi podoben protein 1 (PLPP1) in pankreasni lipazi podoben protein 2 (PLPP2). Poimenovanje teh dveh proteinov verjetno izhaja iz podatka, da se njuno aminokislinsko zaporedje v 70

% ujema z aminokislinskim zaporedjem človeške pankreasne lipaze (1,2). Kljub strukturnim podobnostim pri PLPP1 še niso ugotovili nobene encimske aktivnosti, medtem ko je PLPP2 encimsko aktiven in v primerjavi s PL razgrajuje več različnih substratov, kot so monogliceridi, fosfolipidi in galaktolipidi (1,2). Druga razlika med PLPP2 in PL je ta, da PLPP2 razgrajuje v vodi topne substrate, medtem ko PL deluje na površini kapljice emulzije olje v vodi (1). Glavna fiziološka funkcija PLPP2 je razgradnja fosfolipidov, ki jih PLPP2 razgrajuje na mestu sn-1 (slika 2 – enačba 4). Poleg sodelovanja pri razgradnji fosfolipidov, PLPP2 deluje tudi kot galaktolipaza, t. j. sodeluje pri razgradnji glavnih rastlinskih lipidov in je eden izmed glavnih encimov ki razgrajujejo monogalaktozildigliceride in digalaktozildigliceride (slika 2 – enačba 5). Dodatno so opazili tudi delovanje PLPP2 na vitaminske estre (1).

1.1.4 Karboksil ester hidrolaza

Karboksil ester hidrolaza (carboxyl ester hydrolase – CEH) je nespecifična esteraza, ki nastaja v acinarnih celicah trebušne slinavke in se izloča skupaj z ostalimi eksokrinimi encimi trebušne slinavke v lumen tankega črevesa (1,2). Poleg trebušne slinavke se CEH, pod imenom od žolčnih soli stimulirana lipaza, izloča tudi iz mlečnih žlez in je prisotna v človeškem mleku (1).

CEH deluje tako na vodotopne substrate kot na trigliceride, ki v vodi niso topni. V primerjavi z želodčno in pankreasno lipazo CEH nima tako pomembne vloge pri razgradnji trigliceridov, večjo vlogo ima pri razgradnji substratov, ki se v lumnu tankega črevesa nahajajo v obliki micelov. Ni regiospecifičen, ampak lahko katalizira odcep proste

7

maščobne kisline na katerikoli poziciji triglicerida. Ob prisotnosti žolčnih kislin je aktivnost CEH do vseh substratov, ki jih razgrajuje, od 7 do 10-krat večja v primerjavi z aktivnostjo ob odsotnosti žolčnih kislin. Substrati, ki jih CEH razgrajuje, so holesterolni estri (slika 2 – enačba 7), fosfolipidi (slika 2 – enačba 4), galaktolipidi (slika 2 – enačba 5), monogliceridi (slika 2 – enačba 3) in vitaminski estri (1).

1.1.5 Pankreasna fosfolipaza A2

Fosfolipaza A2 (FLA2) je 14 kDa velik stereospecifičen encim, ki katalizira hidrolizo fosfolipidov na mestu sn-2 (prikaz fosfatidilholina z navedenimi pozicijami – slika 2). Pri tem nastane ena prosta maščobna kislina in 1-sn-lizofosfolipid (slika 2 – enačba 5) (2).

Največ FLA2 je prisotne v pankreasnem soku, nahaja pa se tudi v gladkih mišicah žil in pljuč (1). Njena posebnost je, da ima v svoji strukturi več disulfidnih vezi, kar jo naredi stabilno pri večjem temperaturnem razponu in nižjih pH vrednostih (1,2). Kalcij igra veliko vlogo pri katalitični aktivnosti FLA2, saj ustvari interakcije med fosfatno skupino fosfolipidnega substrata z aktivnim mestom encima. Zato je pomembno, da se pri raziskovanju fosfolipaze A2 spremljajo tudi koncentracije kalcija, medtem ko pri ostalih prebavnih lipazah to ni pomembno (1).

1.2 METODE ZA DOLOČANJE AKTIVNOSTI LIPAZ

Za določanje aktivnosti lipaz je na voljo več metod: volumetrične metode, spektroskopske metode (VIS spektroskopija, IR spektroskopija, fluorimetrija), metoda z uporabo radioaktivnih izotopov, encimska imunoadsorpcijska preiskava (ELISA), konduktometrične metode, kromatografske metode in uporaba biosenzorjev. Vse navedene metode za določanje aktivnosti lipaz temeljijo na reakciji lipolize a) preko vrednotenja količine nastalih produktov (prostih maščobnih kislin, glicerola) ali b) z uporabo sinteznih substratov, ki se po reakciji lipolize pretvorijo v produkte, katere je z določeno metodo možno kvantificirati. V preglednici II so zbrani podatki o uporabljenih substratih, principih določanja aktivnosti lipaz in prednostih ter slabostih posamezne metode.

Preglednica II: Pregled substratov, principa določevanja aktivnosti lipaz in prednosti (P) ter slabosti (S) metod, ki se uporabljajo za določanje aktivnosti lipaz.

METODE SUBSTRAT PRINCIP DOLOČANJA

AKTIVNOSTI LIPAZ

PREDNOSTI (P) in

SLABOSTI (S) Referenca

Volumetrične metode

Triolein, olivno olje, tributirin

Nevtralizacija nastalih prostih maščobnih kislin

- P: enostavna aparatura, enostaven proces - S: slaba občutljivost (1

(6–8)

8

mol/min), časovna neučinkovitost

VIS spektrofotometrija

- bakrove spojine - p-nitrofenolni in

naftilni estri dolgoverižnih maščobnih kislin,

tioestri - kromotropna kislina

Določanje prostih maščobnih kislin, glicerola ali uporaba

substratov, ki se po delovanju lipaz pretvorijo v

produkte, ki se jih določi spektrofotometrično

- P: možnost izvajanja metod na mikrotitrskih ploščah (določitev aktivnosti do 96 vzorcem

naenkrat)

(6)

IR

spektrofotometrija /

Uporaba absorpcijskega spektra estrov maščobnih kislin pri valovnem številu

1730 – 1750 cm^-1

/ (6,7)

Fluorimetrične metode

Estri maščobnih kislin parinarne kisline, kumarina, resorufina in

fluoresceina

Uporaba substratov, ki se po delovanju lipaze pretvorijo v

molekule s fluoroforom

- P: zelo občutljiva metoda, omogoča kontinuirano spremljanje

kinetike reakcije

(6,7)

Metode z uporabo radioaktivnih

izotopov

- z ¹⁴C, ³H ali ¹³¹I označeni trigliceridni

analogi - označevanje nastale proste maščobne kisline

z ⁶³Ni

Uporaba označenih trigliceridnih analogov in

določanje produktov ali uporaba neoznačenih substratov in označevanje nastalih prostih maščobnih

kislin

- P: zelo specifična in občutljiva metoda (nanomolarno območje)

- S: rokovanje z radioaktivnimi elementi

(6)

ELISA testi Specifična protitelesa Kvantitativno določanje lipaz v bioloških vzorcih

- P: zelo specifična metoda - S: protitelesa le za

določene vzorce

(6,7)

Konduktometrične

metode Triacetin

Sprememba prevodnosti medija po sprostitvi acetatnih

ionov

- S: meritve so zelo

odvisne od temperature (6)

Kromatografske

metode - derivat p-nitrofenola Določanje lipidov in sproščenih maščobnih kislin

- P: visoka občutljivost, primerna metoda za

kompleksne vzorce

(6,7)

Biosenzorji Encimi biokemijske reakcije

Določanje produkta lipolize (npr. glicerola) preko nadaljnjih biokemijskih

reakcij

- P: hitra, zelo občutljiva metoda, ne zahteva uporabe dragih aparatov

(6)

1.2.1 Volumetrične metode

Osnova te metode je nevtralizacijska titracija prostih maščobnih kislin (6). Gre za »pH stat« metodo, kar pomeni, da je v reakcijski posodi ves čas poskusa konstanten pH. Kot titrant se uporablja NaOH. Zaradi sproščanja maščobnih kislin, ki so posledica delovanja lipaze, se pH v posodi zniža. Znižanje pH zazna pH elektroda in doda se toliko NaOH, da se pH dvigne na nastavljeno vrednost. Preko porabe NaOH se lahko izračuna aktivnost lipaze (6,7). Zaradi enostavne aparature in procesa se ta način določanja aktivnosti danes

9

največ uporablja. Slabosti metode sta slaba občutljivost (1 mol/mL) in časovna neučinkovitost (največ 2 določitvi aktivnosti lipaz na uro) (6).

Substrati, ki se uporabljajo za določanje aktivnosti lipaze pri volumetrični metodi, so triolein, olivno olje in tributirin (6–8). Triolein je triglicerid dolgo verižnih maščobnih kislin in se nahaja tudi v olivnem olju. Slednje je cenejše, zaradi česar je v širši rabi (6).

Prednost trioleina in olivnega olja je v tem, da sta boljša predstavnika s hrano vnesenih maščob. Slabost pa je, da je potrebno v vodi netopne dolgoverižne trigliceride in njihove produkte disperigrati s pomočjo arabskega gumija ali drugega emulgatorja (6). Evropska farmakopeja za določanje aktivnosti pankreasnega prahu navaja uporabo olivnega olja in arabskega gumija kot stabilizatorja emulzije (8). Zaradi netopnosti trioleina in olivnega olja v vodi se uporablja tudi tributirin. Tributirin je predstavnik kratkoverižnih trigliceridov in sproščena butanojska kislina je topna v vodi, zato ni problematična za titrimetrično določitev (6).

1.2.2 Spektrofotometrične metode

1.2.2.1 Spektrometrija v vidnem spektru (VIS spektrofotometrija)

Pri spektrofotometriji v vidnem spektru se uporabljata dva različna načina določanja aktivnosti lipaz, in sicer lahko se določi koncentracijo lipoliznih produktov (proste maščobne kisline in glicerol) oz. z uporabo sinteznih substratov, ki se po delovanju lipaz pretvorijo v produkte, ki se jih lahko spektrofotometrično detektira.

Za določanje aktivnosti lipaz, kjer se aktivnost določa preko nastalih prostih maščobnih kislin, se kot reagent uporabljajo bakrove spojine (npr. bakrov sulfat). Nastanejo bakrovi kompleksi maščobnih kislin, ki so modro obarvani in se jih po ekstrakciji v organskih topilih lahko določi spektrofotometrično pri valovni dolžini 440 nm. S to metodo se lahko določi aktivnost lipaze v območju 0,02 – 0,4 nmol/mL, slabost pa je, da se uporabljajo toksična organska topila (6).

P-nitrofenolni in naftilni estri dolgoverižnih maščobnih kislin ter tioestri so primeri sinteznih substratov, ki se po delovanju lipaz pretvorijo v produkte, ki se jih lahko določi spektrofotometrično in se uporabljajo za določanje aktivnosti lipaz (6). Ti sintezni substrati so nespecifični za lipaze, ker je slabost metod. Prednost pa je možnost izvajanja metod na mikrotitrskih ploščah, kar pomeni, da se lahko določi aktivnosti do 96 vzorcem naenkrat (6).

10

Pri metodah spektrofotometričnega določanja aktivnosti lipaz, kjer določanje temelji na detekciji glicerola, se glicerol, ki nastaja med reakcijo lipolize, po zaporednih oksidacijah spremeni v formaldehid. Formaldehid lahko zaznamo z dodatkom kromotorpne kisline, kjer se produkt kemijske reakcije med formaldehidom in kromotropne kisline obarva vijolično. Ta način detekcije se redko uporablja, saj v večini primerov ena vrsta prebavne lipaze ne katalizira celotne hidrolize trigliceridov (od trigliceridov do glicerola). (6,7).

1.1.1.1 IR spektrofotometrija

Pri tem načinu določanja aktivnosti lipaz se uporablja infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (FTIR). Trigliceridi kot estri maščobnih kislin in nastale proste maščobne kisline se razlikujejo v molarnem absorpcijskem koeficientu, kar lahko uporabimo za kvantifikacijo lipoliznih produktov. Za določanje aktivnosti lipaz se uporablja absorpcijski spekter estrov maščobnih kislin pri valovnem številu med 1730 – 1750 cm^-1 (6,7).

1.1.1.2 Fluorimetrija

Fluorimetrične metode temeljijo na uporabi substratov, ki se po delovanju lipaz pretvorijo v molekule s fluoroforom. Primeri teh substratov so estri maščobnih kislin parinarne kisline, kumarina, pirenskih substratov, resorufina in fluoresceina (6). Prednost fluorimetrije je, da je zelo občutljiva analizna metoda in omogoča kontinuirano spremljanje kinetike reakcije lipolize (7).

1.2.3 Metode z uporabo radioaktivnih izotopov

Pri metodah z uporabo radioaktivnih izotopov obstajata 2 načina določanja aktivnosti lipaz, in sicer z radioaktivnimi elementi se lahko označi trigliceridne analoge, ki se jih lahko označi z ¹⁴C, ³H in ¹³¹I, ali pa sproščene proste maščobne kisline, ki se jih označi z radioaktivnim elementom ⁶³Ni (6). Metode z uporabo radioaktivnih izotopov so zelo specifični in občutljivi način določanja aktivnosti lipaz. Slabosti metod sta rokovanje z radioaktivnimi elementi in dolgotrajnost postopka (6,7).

1.2.4 Imunokemijske metode

Encimska imunoadsorpcijska preiskava (ELISA) je zelo občutljiva in specifična metoda.

ELISA testi se največkrat uporabljajo v klinični diagnostiki in so razviti za uporabo krvnih

11

(serumskih in plazemskih) vzorcev, tkivnih vzorcev in vzorcev iz dvanajstnika. Zaradi specifičnosti protiteles se metoda lahko uporabi le za izbrane biološke vzorce. (6)

1.2.5 Konduktometrične metode

Konduktometrične metode temeljijo na spremembi prevodnosti medija. Prevodnost medija se spremeni na račun nastanka naboja, ki je posledica nastanka prostih maščobnih kislin pri lipolizi, kar lahko zaznamo s konduktometrom. Kot substrat se uporablja triacetin, ki je triglicerid kratkoverižnih maščobnih kislin. Prednost triacetina v primerjavi z drugimi trigliceridi je njegova vodotopnost in večja sprememba v prevodnosti medija sproščenih acetatnih ionov. Slabost te metode je v tem, da triacetin ni specifičen substrat lipaz in da so meritve prevodnosti medija zelo odvisne od temperature medija (6).

1.2.6 Kromatografske metode

Kromatografske metode, ki se lahko uporabljajo za določanje aktivnosti lipaz so tankoplastna kromatografija, plinska kromatografija in tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) (6). Princip teh metod je, da se najprej izvede reakcijo lipolize, nato pa se s kromatografskimi tehnikami zazna in kvantificira lipide in lipolizne produkte (proste maščobne kisline) (7). Primer metode je, da se kot substrat uporabi palmitinski in lavrinski ester p-nitrofenola, ki se ga inkubira skupaj z lipazo, čemur sledi kvantifikacija nitrofenola na reverznofaznem HPLC (7). Prednost teh metod je v visoka občutljivost in primernost za kompleksne vzorce (6).

1.2.7 Metode, ki temeljijo na biosenzorjih

Biosenzorji so naprave, ki z uporabo specifične biokemijske reakcije zaznajo določeno snov. To je novejša tehnologija in prednosti uporabe biosenzorjev so v tem, da se rezultate pridobi hitro, so zelo občutljivi in ne zahteva dragih aparatov (6).

Primer amperometričnega biosenzorja, s katerim se lahko določa aktivnost lipaz temelji na biokemijski pretvorbi glicerola, ki je produkt delovanja lipaze. Glicerol se z encimom gliceroldehidrogenazo pretvori do dihidroksiacetona in NADH. NADH oksidaza pa nato pretvori NADH do NAD⁺ in H2O2. Signal, ki ga zazna ampermeter je električni tok, ki nastane pri oksidaciji H2O2 in je premo sorazmeren količini nastalega glicerola, ta pa je neposredno odvisna od aktivnosti lipaze (6).

12

2. NAMEN DELA

Z vgradnjo učinkovin v lipidne dostavne sisteme lahko povečamo biološko uporabnost v vodi slabo topnih učinkovin. Za uspešno vrednotenje lipidnih dostavnih sistemov je potrebno razviti in vitro metodo, ki bo v čim večjem obsegu vključevala kompleksne fiziološke pogoje in procese, ki se odvijajo pri razgradnji lipidov. Namen te magistrske naloge je prispevati k razvoju biorelevantne metode in vitro lipolize z analizo podatkov o aktivnosti prebavnih lipaz iz literature in optimizacijo metode in vitro lipolize s postopkom menjave medijev, ki bolje ponazarja prehod vsebine želodca naprej v tanko črevo.

Podatke o aktivnosti prebavnih lipaz bomo iskali v podatkovni bazi Pubmed, kjer bomo iskali članke o aktivnosti želodčne in pankreasne lipaze, določene pri zdravih prostovoljcih v stanjih na tešče in po obroku. Poleg aktivnosti želodčne in pankreasne lipaze nas bodo zanimali še podatki o starosti prostovoljcev, zaužitem obroku, mestu odvzema vzorca in metodi določanja aktivnosti lipaze. Zbrane podatke bomo ustrezno grafično prikazali in jih ovrednotili.

Pri optimizaciji metode in vitro lipolize s postopkom menjave medija bomo razvili postopek menjave medija. Za ponazarjanje kislih pogojev v želodcu bomo uporabili 0,01 M HCl, kjer bomo dispergirali SMES, nato pa bomo z dodatkom prebavnega medija dvignili pH in ponazorili prehod vsebine želodca naprej v tanko črevo. Prebavni medij bo sestavljen iz maleatnega pufra, natrijevega deoksiholata in fosfatidilholina. Z merjenjem pH bomo najprej določili razmerje med 0,01 M HCl in maleatnim pufrom, nato pa še razmerje med 0,01 M HCl in prebavnim medijem, ki ga bomo nato upoštevali pri izvedbi metode in vitro lipolize s postopkom menjave medija.

V zadnjem delu bomo z metodo in vitro lipolize, optimizirano s postopkom menjave medija, vrednotili sproščanje dipiridamola iz SMES-a. In vitro lipolizo bomo izvedli pri treh različnih aktivnostih pankreatina, ki jih bomo izbrali v skladu s podatki iz pregleda literature. Ugotavljali bomo, kako aktivnost vpliva na sproščanje dipiridamola iz SMES-a.

Koncentracijo sproščenega dipiridamola bomo določili v celokupnih vzorcih in vzorcih vodne faze s pomočjo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC).

13

3. MATERIALI IN METODE

3.1. PROGRAMSKA OPREMA, MATERIALI IN NAPRAVE

3.1.1. Programska oprema

- Engauge Digitizer, program za izpis grafičnih podatkov iz slik - Microsoft Excel

- LabX titration, program za izvedbo titracije - Pubmed, podatkovna baza

3.1.2. Materiali

- 4-bromofenilboronska kislina, Sigma-Aldrich, ZDA - Acetonitril, Honeywell, ZDA

- Bidestilirana voda, Fakulteta za farmacijo, Slovenija - Capmul MCM®, Abitec, ZDA

- Capmul PG-8 R, Abitec, ZDA

- Dipiridamol ≥98 %, Sigma-Aldrich, ZDA - Fosfatidilholin, Sigma-Aldrich, ZDA

- Kalcijev klorid dihidrat, p.a., MERCK, Nemčija - Kolliphor RH 40, BASF, Nemčija

- Klorovodikova kislina, Titrisol® za pripravo 1 M HCl, MERCK, Nemčija - Labrasol ALF, Gattefossé, Francija

- Metanol za HPLC, Ultra Gradient HPLC Grade, J.T. Baker, ZDA - Natrijev deoksiholat, Sigma-Aldrich, ZDA

- Natrijev hidroksid, Titrisol® za pripravo 1 M NaOH, MERCK, Nemčija - Natrijev klorid, p.a., MERCK, Nemčija

- Ocetna kislina 100%, MERCK, Nemčija

- Pankreatin (prašičjega izvora), Sigma-Aldrich, ZDA - Prečiščena voda, Fakulteta za farmacijo, Slovenija - Propilenglikol, Sigma-Aldrich, ZDA

- Pufrska raztopina pH 2,00 (20 °C), MERCK, Nemčija - Pufrska raztopina pH 4,00 (20 °C), MERCK, Nemčija - Pufrska raztopina pH 7,00 (20 °C), MERCK, Nemčija - Pufrska raztopina pH 9,00 (20 °C), MERCK, Nemčija

14 - Tributirin > 99%, Sigma-Aldrich, ZDA - Trizma® maleat, Sigma-Aldrich, ZDA 3.1.3. Naprave

- Analitska tehtnica, AG245, Mettler Toledo, Švica - Analitska tehtnica, XS205, Mettler Toledo, Švica - Centrifuga, Centric 400R, Tehtnica, Slovenija

- Centrifuga, Microcentrifuge 5415R, Eppendorf, Nemčija

- Grelno magnetno mešalo, RCT basic saftey control, IKA-WERKE, Nemčija - Grelno magnetno mešalo, Rotamix 550 MMH, Tehtnica, Slovenija

- HPLC, Aglient 1100 Series, Aglient Technologies Nemčija

- Kolona za HPLC, Kinetex C18 2,10 x 50 mm, 2,6 m, Phenomenex, ZDA - Kombinirana steklena elektroda za titrator, DGi111-SC, Mettler Toledo, Švica - Lab dancer, IKA, Nemčija

- Mešalo za titrator, Compact Stirrer, Mettler Toledo, Švica - Ostali pripomočki (steklene čaše, bučke, kapalke, žličke) - pH meter, FiveEasy Plus, Mettler Toledo, Švica

- Polavtomatska pipeta 1 – 10 mL, Eppendorf, Nemčija - Polavtomatska pipeta 100 –1000 µL, Eppendorf, Nemčija - Polavtomatska pipeta 2 – 20 µL, Eppendorf, Nemčija - Polavtomatska pipeta 20 – 200 µL, Eppendorf, Nemčija - Precizna tehtnica, Exacta 300 EB, Slovenija

- Termostat, Ministat 125-cc-NR, Huber, Švica - Titrator, , T70 Titrator, Mettler Toledo Švica - Vortex, Vibromix 10, Tehtnica, Slovenija

3.2. METODE ANALIZE LITERATURNIH PODATKOV

3.2.1. Iskalni niz

Članke smo sistematično iskali v podatkovni bazi PubMed. V preglednici III so navedene besede, ki smo jih uporabili za oblikovanje iskalnih nizov in kriteriji za izbiro primernih člankov. Iskali smo članke, ki so navajali fiziološke podatke za aktivnosti prebavnih lipaz na tešče in po obroku za zdrave, odrasle osebe. Dodatno so nas zanimali tudi podatki o fiziološkem delovanju prebavnih lipaz ob prisotnosti določenih komponent oziroma

15

parametrov, ki potencialno lahko vplivajo na delovanje lipaz (soli žolčnih kislin, fosfolipidi, viskoznost, lipidi).

Iskalne nize smo oblikovali tako, da smo kombinirali besede iz preglednice III in jih med seboj povezali z AND. V primerih, kjer smo z določenim iskalnim nizom dobili preveliko število člankov, smo iskalnemu nizu dodali NOT liver in tako izključili članke, ki so navajali podatke za jetrne lipaze.

Preglednica III: Besede, ki smo jih uporabili za oblikovanje iskalnih nizov in ki ustrezajo postavljenim kriterijem

Kriterij Besede uporabljene v iskalnem nizu

Prebavna lipaza digestive lipase, pancreatic lipase, lipase

Podatki za ljudi human

Aktivnost encima activity

Podatki na tešče fasted

Podatki po obroku fed

Podatki v prebavnem traktu gastrointestinal tract, duodenum, human intestinal fluid, human gastric fluid Podatki o dodatnih komponent/parametrov v

prebavnem traktu characterization, lipolysis, lipid digestion Podatki kontrolnih skupinah v člankih z

raziskavami bolezenskih stanj (debelost, kronični pankreatitis, alkoholizem)

exocrine pancreatic insufficiency

3.2.2. Izbor ustreznih člankov

Prebrali smo povzetke vseh pridobljenih člankov določenega iskalnega niza. Na podlagi povzetkov in naslovov smo se odločili, ali je članek primeren ali ne. Ustrezni so bili raziskovalni in pregledni članki, ki so navajali fiziološke podatke za aktivnosti prebavnih lipaz na tešče in po obroku za zdrave, odrasle osebe. Pri preglednih člankih smo pregledali reference, navedene ob iskanih podatkih, in poiskali ustrezne raziskovalne članke ter v njih poiskali želene podatke. Pri raziskovalnih člankih, kjer so navajali podatke o aktivnostih prebavnih lipaz pri različnih bolezenskih stanjih, so bili za nas ustrezni podatki o aktivnostih prebavnih lipaz kontrolnih skupin.

16 Razlogi za izločitev člankov so bili naslednji:

- članki so opisovali postopke čiščenja, izražanja in pridobivanja lipaz (živalskih in humanih) v različnih biotehnoloških sistemih (Pichia Pastoris, Eschericia Coli, insekti, kvasovke, idr.),

- članki so navajali podatke za aktivnosti lipaz v primeru bolezenskih stanj, kot so bile sladkorna bolezen tipa 2, prisotnost H. Pylori, debelost, kronični pankreatitis, alkoholizem, cistična fibroza, in ni bilo navedenih podatkov za morebitne kontrolne skupine,

- članki so navajali podatke za aktivnosti lipaz živalskega izvor (prašičja, goveja, zajčja, pasja, mišja, kokošja, idr.),

- članki so navajali podatke samo za dojenčke in otroke,

- članki so navajali podatke za aktivnosti jetrne lipaze, lipoprotein lipaze, liposomalne lipaze, endotelijske lipaze,

- članki so bili pregledni članki bolezni pankreasa in so opisovali diagnostiko bolezni in terapijo bolezni.

3.2.3. Analiza podatkov iz člankov

Najprej smo izbrane članke podrobno prebrali in v njih poiskali in izpisali iskane podatke.

Poleg aktivnosti lipaze na tešče in po obroku smo izpisali tudi število preiskovanih oseb, starost in spol preiskovanih oseb, sestavo in strukturo zaužitega obroka, mesto odvzema vzorca, metodo za določanje aktivnosti lipaz in pogoje metode (uporabljen substrat, pH in temperatura, sestava medija, podatek o morebitni izvedbi povratne titracije, če ja, pri katerem pH) in druge fiziološke parametre, če so bili navedeni. V primerih, kjer so bili podatki za aktivnosti lipaz podani le grafično, smo jih izpisali s pomočjo programa Engauge Digitizer.

Izpisane podatke smo uredili. Najprej smo razdelili podatke na želodčno in pankreasno lipazo, nato smo podatke znotraj skupine podatkov želodčne oziroma pankreasne lipaze razdelili na podatke na tešče in po obroku. Tako smo dobili 4 skupine – podatke za želodčno lipazo na tešče in po obroku ter podatke za pankreasno lipazo na tešče in po obroku. Znotraj teh skupin smo podatke o aktivnosti želodčne in pankreasne lipaze grafično prikazali. To pomeni, da smo na primer v enem grafu prikazali vse podatke za aktivnosti želodčne lipaze na tešče, kjer so za določanje aktivnosti uporabili substrat

17

tributirin. Ostale grafe smo naredili na enak način. Podatki o aktivnosti želodčne in pankreasne lipaze so bili razen v enem članku, kjer so bili navedeni podatki o aktivnosti pankreasne lipaze za posameznike, podani kot povprečja. Da smo aktivnosti lipaz lahko grafično prikazali, smo vse vrednosti aktivnosti lipaz pretvorili v U/mL ali IU/mL (enoti sta enaki, razlikuje se le zapis) po spodnjem principu:

Enačba 8

Enačba 9

3.3. METODE LABORATORIJSKEGA DELA

3.3.1. Priprava medijev

3.3.1.1. Priprava maleatnih pufrov

Pripravili smo tri maleatne pufre, ki so se razlikovali po koncentraciji – 50 mM, 100 mM in 200 mM. Maleatni pufri so vsebovali tris-maleat, natrijev klorid in kalcijev klorid dihidrat. Preračunane mase in koncentracije komponent za posamezen pufer so navedene v preglednici IV.

Preglednica IV: Koncentracije in preračunane mase komponent za pripravo 200 mL 50 mM, 100 mM in 200 mM maleatega pufra

Koncentrcija tris-maleata (mM)

Masa tris maleata (g)

Koncentracija natrijevega klorida (mM)

Masa natrijevega klorida (g)

Koncentracija kalcijevega klorida dihidrata (mM)

Masa kalcijevega klorida dihidrata (g)

50 2,3721 150 1,7532 5 0,1470

100 4,7442 300 3,5064 10 0,2940

200 9,4884 600 7,0128 20 0,5880

- Priprava 50 mM maleatnega pufra

V 200 mL bučko smo natehtali tris-maleat, natrijev klorid in kalcijev klorid dihidrat (preračunane mase komponent so navedene v preglednici IV) ter jih raztopili v nekaj