U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOMAGISTRSKO DELO
Deja Šelih
Ljubljana, 2021
U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOMAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE KEMIJA
Nadzor kvalitete in stabilnosti izdelkov iz naravnih in sintetičnih kanabinoidov
MAGISTRSKO DELO
Deja Šelih
M
ENTOR: prof. dr. Matevž Pompe
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
magistrskega dela
Spodaj podpisana Deja Šelih sem avtorica magistrskega dela z naslovom: Nadzor kvalitete in stabilnosti izdelkov iz naravnih in sintetičnih kanabinoidov.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.
dr. Matevža Pompeta;
sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje
predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;
je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.
V Ljubljani, 14. 5. 2021 Podpis avtorice
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Kemija.
Delo je bilo opravljeno na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo UL.
Senat UL FKKT je za mentorja imenoval prof. dr. Matevža Pompeta.
Recenzenti: izr. prof. dr. Drago Kočar in prof. dr. Jurij Lah.
Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela Predsednik komisije: prof. dr. Jurij Lah
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Člana: prof. dr. Matevž Pompe
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
izr. prof. dr. Drago Kočar
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Zahvala
Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Matevžu Pompetu za strokovno pomoč. Za dobro voljo in pomoč tekom izvajanja eksperimentalnega dela se zahvaljujem zaposlenim na analizni katedri Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo, še posebej Matjažu Grčmanu.
Najlepša hvala tudi mojim domačim za spodbudo in podporo.
Nadzor kvalitete in stabilnosti izdelkov iz naravnih in sintetičnih kanabinoidov Povzetek: Konoplja je v zahodnem svetu dobila pomembnejši pomen po letu 1851, ko je bila vključena v takratno ameriško farmakopejo. V zadnjem času se na trgu pojavlja vedno več prehranskih in kozmetičnih izdelkov, ki vsebujejo kanabinoide. Predvsem je govora o terapevtskih in protibolečinskih učinkih določenih kanabinoidov, na primer CBD, CBG, CBN. Glede na evropske smernice, vsebnost psihoaktivnega ∆9-THC v končnih izdelkih ne sme presegati 0,2 % v suhi snovi rastline. Za zagotavljanje varnosti in učinkovitosti pripravkov iz konoplje je potrebna ustrezna karakterizacija izdelkov in kvantifikacija učinkovin v njih, zlasti določitev zakonsko spornega ∆9-THC.
V magistskem delu smo se ukvarjali z razvojem metod za določitev sledi ∆9-THC z različnimi kromatografskimi metodami z namenom nadzora kvalitete in stabilnosti izdelkov iz naravnih in sintetičnih kanabinoidov. Razvili in validirali smo kromatografsko metodo za določitev sledi ∆9-THC s HPLC-UV/VIS. Z namenom razvoja bolj občutljive metode smo nato na sistemu LC-MS/MS optimizirali parametre masnega spektrometra in razvili ter delno validirali metodo. Z omenjenima metodama so bili rezultati določitve ∆9-THC v vzorcu CBD primerljivi. Preizkusili smo tudi uporabo GC-FID, vendar se ta za določitev zelo nizkih koncentracij ∆9-THC ni izkazal kot ustrezen.
Ključne besede: določitev sledi ∆9-THC, HPLC-UV/VIS, LC-MS/MS, GC-FID Quality and stability control of natural and synthetic cannabinoid products
Abstract: In the Western world, cannabis gained more importance after 1851, when it was included in the American Pharmacopoeia. Recently, more and more food and cosmetic products containing cannabinoids are appearing on the market. In particular, there is talk of therapeutic and analgesic effects of certain cannabinoids, such as CBD, CBG, CBN. According to European guidelines, the content of psychoactive ∆9-THC in the final products should not exceed 0,2 % in the dry matter of the plant. To ensure the safety and efficacy of cannabis preparations, it is necessary to properly characterize the products and quantify the active substances in them, in particular to determine the legally controversial ∆9-THC.
In the master's thesis, we developed methods for determination of ∆9-THC in traces by various chromatographic methods for quality and stability control of natural and synthetic cannabinoid products. Using HPLC-UV/VIS, a chromatographic method to determine traces of ∆9-THC was developed and validated. In order to develop more sensitive method, we optimized the parameters of the mass spectrometer on the LC-MS/MS system and developed and partially validated the method. The results of the determination of
∆9-THC in CBD sample by the mentioned methods were comparable. The use of GC-FID was also tested, but it was not suitable for determining such low ∆9-THC levels.
Keywords: determination of ∆9-THC, HPLC-UV/VIS, LC-MS/MS, GC-FID
Kazalo
1 Uvod ... 1
1.1 Kanabinoidi ... 1
1.2 Konoplja ... 3
1.2.1 Predstavitev rastline ... 3
1.2.2 Biosinteza fitokanabinoidov ... 3
1.2.3 Spekter uporabe ... 4
1.3 Regulacijski vidiki uporabe kanabinoidov ... 5
1.4 Analizne metode za določanje kanabinoidov ... 6
1.4.1 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti... 7
1.4.2 Tekočinska kromatografija s tandemsko masno spektrometrijo ... 9
1.4.3 Plinska kromatografija ... 10
1.4.4 Primerjava tekočinske in plinske kromatografije ... 12
2 Namen dela ... 13
3 Eksperimentalni del ... 15
3.1 HPLC-UV/VIS ... 15
3.1.1 Uporabljeni reagenti in topila ... 15
3.1.2 Uporabljeni referenčni materiali in vzorci... 15
3.1.3 Laboratorijski inventar ... 16
3.1.4 Instrumentalna oprema ... 16
3.1.5 Priprava raztopin za razvoj metode ... 16
3.1.6 Priprava raztopin za validacijo metode ... 17
3.1.7 Razvita metoda in kromatografski pogoji ... 20
3.1.8 Opis validacije metode ... 20
3.2 LC-MS/MS ... 22
3.2.1 Uporabljeni reagenti in topila ... 22
3.2.2 Uporabljen referenčni materiali in vzorci ... 22
3.2.3 Laboratorijski inventar ... 22
3.2.4 Instrumentalna oprema ... 23
3.2.5 Priprava raztopin za optimizacijo metode ... 23
3.2.6 Priprava raztopin za delno validacijo metode... 24
3.2.7 Razvita metoda in kromatografski (HPLC) ter MS pogoji ... 25
3.2.8 Opis delne validacije metode ... 26
3.3 GC-FID ... 27
3.3.1 Uporabljeni reagenti in topila ... 27
3.3.2 Uporabljeni referenčni materiali in vzorci... 27
3.3.3 Laboratorijski inventar ... 27
3.3.4 Instrumentalna oprema ... 28
3.3.5 Priprava raztopin... 28
3.3.6 Kromatografski pogoji ... 28
4 Rezultati in razprava ... 31
4.1 HPLC-UV/VIS ... 31
4.1.1 Razvoj kromatografske metode ... 31
4.1.2 Validacija metode ... 48
4.2 LC-MS/MS ... 55
4.2.1 Optimizacija metode ... 55
4.2.2 Delna validacija metode ... 58
4.3 GC-FID ... 61
4.3.1 Razvoj kromatografske metode ... 61
5 Sklepi ... 67
6 Literatura ... 69
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
ACN acetonitril
CBC kanabikromen
CBC-A kanabikromenska kislina
CBD kanabidiol
CBD-A kanabidiolna kislina
CBG kanabigerol
CBG-A kanabigerolna kislina
CBN kanabinol
ESI ionizacija z razprševanjem v električnem polju (angl. electrospray ionisation)
FID plamensko-ionizacijski detektor (angl. flame ionisation detector) FTIR spektroskopija s Fourerovo transformirano infra-rdečo svetlobo
(angl. Fourier-transform infrared spectroscopy) GC-FID plinska kromatografija s FID detektorjem (angl. gas
chromatography with FID detector)
GC-VUV plinska kromatografija z detektorjem ultravijolične svetlobe pod vakuumom (angl. gas chromatography–vacuum ultraviolet spectroscopy)
HPLC-UV/VIS tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z UV/VIS
detektorjem (angl. high-performance liquid chromatography with UV/VIS detector)
LC-MS/MS tekočinska kromatografija s tandemsko masno spektrometrijo (angl. liquid chromatography with tandem mass spectrometry) MALDI ionizacija v matriksu z lasersko desorpcijo (angl. matrix-assisted
laser desorption/ionization)
MeOH metanol
MF mobilna faza
N število teoretičnih podov (angl. number of plates)
NMR spektroskopija z jedrsko magnetno resonanco (angl. nuclear magnetic resonance)
RS raztopina standarda
RSD relativni standardni odmik (angl. relative standard deviation)
RV raztopina vzorca
S/N razmerje signal/šum (angl. signal to noise ratio) T faktor simetrije (angl. tailing factor)
TLC tankoplastna tekočinska kromatografija (angl. thin-layer chromatography)
UV/VIS ultravijolična/vidna svetloba (angl. ultraviolent-visible light)
∆𝟖-THC delta-8-tetrahidrokanabinol
∆𝟗-THC delta-9-tetrahidrokanabinol
∆𝟗-THC-A delta-9-tetrahidrokanabinolna kislina
1
1 Uvod
Konoplja (Cannabis sativa L.) sodi med prve rastline, ki jih je gojil človek. Domovina konoplje je območje severozahodne Himalaje, ki sega do Aralskega jezera in Kaspijskega morja. Kitajci so iz konopljinih vlaken izdelovali papir in oblačila že v tretjem tisočletju pred našim štetjem. Za medicinske namene so v glavnem uporabljali semena, ki praktično ne vsebujejo delta-9-tetrahidrokanabinola (∆9-THC), glavne aktivne spojine v rastlini, vsebujejo pa esencialne maščobne kisline in proteine. Zaradi zdravilnih, halucinogenih in narkotičnih učinkov so konopljo imenovali rastlina veselja. Konopljo so v medicinske namene uporabljale civilizacije v Aziji in na Bližnjem vzhodu ter tudi Grki in Rimljani.
V medicino zahodnega sveta je vstopila v sredini 19. stoletja in dosegla vrhunec konec stoletja z uporabo tinktur in ekstraktov. K izrinjanju navadne konoplje je prispeval zlasti halucinogen ∆9-THC, ena od več kot 100 kanabinoidnih snovi, ki nastajajo v ženskih cvetovih in listih konoplje. Prelomno je bilo leto 1937, ko je v ZDA začel veljati zakon o obdavčenju marihuane. Leta 1942 so konopljo odstranili iz ameriške farmakopeje, kar je v praksi pomenilo konec njene uporabe v medicini tudi drugje po svetu. Kljub vsemu je identifikacija kemijskih struktur spojin, prisotnih v konoplji, in zmožnost pridobivanja čistih sestavin znova sprožila porast zanimanja uporabe te rastline v znanstvene namene.
Leta 1963 je izraelski kemik Raphael Mechoulan s sodelavci ugotovil strukturo kanabidiola (CBD), leto pozneje pa izoliral psihoaktivni tetrahidrokanabinol (THC). V devetdesetih letih je sledilo revolucionarno odkritje endokanabinoidnega sistema, ki ga človek deli z vretenčarji. Bolj dosledna in pogosta uporaba konoplje in kanabinoidov se je pričela, odkar so učinki in varnost uživanja ter zdravljenja z derivati konoplje znanstveno potrjeni [1, 2, 3].
1.1 Kanabinoidi
Kanabinoidi so heterogena skupina spojin, katerih skupna značilnost je, da se vežejo na kanabinoidne receptorje. Spadajo med terpenofenole in se uvrščajo med lipide, kar pomeni, da so topni v maščobah. Glede na njihov izvor jih delimo v tri skupine:
endokanabinoidi: nastajajo v določenih okoliščinah v telesih vretenčarjev, tudi človeka,
fitokanabinoidi: nahajajo se v rastlinah, na primer v konoplji, ameriškem slamniku, vinski rutici,
sintetični kanabinoidi: nastanejo v laboratorijih s kemijskimi reakcijami.
Endokanabinoidi so človeku lastni kanabinoidi in so del endokanabinoidnega sistema, prisotnega v živalih in ljudeh. Delujejo preko vezave na podtipa kanabinoidnih receptorjev CB1 in CB2, ki sta sklopljena s proteinom G. Endokanabinoidi v širšem smislu delujejo kot nevromodulatorji in imunomodulatorji, vpleteni so v naslednje fiziološke procese: nastajanje bolečine, kognitivni procesi, tvorjenje spomina, motorična aktivnost,
2
endokrine funkcije, uravnavanje apetita, nadzor temperature in srčnega utripa, slabost in bruhanje, očesni tlak, vnetje, imunski sistem (prepoznavanje antigenov). Naše telo jih proizvaja v živčnih celicah in so znotrajcelični lipidni prenašalci signalov med bližnjimi celicami, npr. nevronoma v sinapsi. Čisto vsaka celica našega telesa ima kanabinoidne receptorje, zaznava koncentracijo kanabinoidov v svoji okolici in se na te spremembe odziva. V nekaterih delih možganov so kanabinoidni receptorji zelo gosto nameščeni, kar pomeni, da so naši možgani sposobni dobro zaznavati spremembe v koncentraciji kanabinoidov. Najbolje raziskana endokanabinoida sta N-arahidonoiletanolamin (AEA ali anandamid) in 2-arahidonoilglicerol (2-AG), katerih struktura je prikazana na Sliki 1 [4, 5, 6].
Slika 1: Dva najbolje raziskana endokanabinoida: (a) anandamid, odkrit leta 1992 in (b) 2-arahidonoilglicerol, odkrit leta 1995 [7]
Fitokanabinoidi so rastlinski kanabinoidi iz 21 ali 22 ogljikovih atomov, ki jih rastline proizvajajo kot sekundarne presnovne produkte in so po kemijski strukturi tako podobni endokanabinoidom, da se v našem telesu vežejo na iste receptorje. Kanabinoidi so prisotni v več različnih rastlinskih vrstah, največ jih je v konoplji. Ta vsebuje preko 140 različnih kanabinoidov in skupno preko 1060 biološko aktivnih sestavin. Najbolj znana, proučena in v medicini uporabljena kanabinoida sta THC in CBD, čeprav izjemne potenciale nakazujejo tudi drugi kanabinoidi (kanabinol - CBN, kanabigerol - CBG, kanabikromen - CBC). Čedalje več raziskav potrjuje to, kar praksa kaže že dlje časa, in sicer, da najbolje delujejo izvlečki iz celotne rastline, v katerih je prisoten celotni spekter kanabinoidov, terpenov in drugih biološko aktivnih in neaktivnih sestavin, kar so poimenovali »entourage« efekt.
Sintetični kanabinoidi so čiste kemijske spojine, ki so pripravljene v laboratorijih in so prisotne v veliki večini farmacevtskih pripravkov. Izkušnje v zvezi z uporabo sintetičnih kanabinoidov kažejo, da so v primerjavi z naravnimi oblikami kanabinoidov bistveno manj učinkoviti. Njihovi vplivi na zdravje so lahko hudi in vključujejo tahikardijo, dihalne motnje in epileptične napade. Najpogostejši sintetični kanabinoidi so WIN-55,212-2, JHW-133 in (R)-metanandamid [5, 8].
3
1.2 Konoplja
1.2.1 Predstavitev rastline
Konoplja (Cannabis sativa L.) obsega 3 podvrste, ki se razlikujejo predvsem po vsebnosti fitokanabinoidov: Cannabis sativa (navadna ali industrijska konoplja), Cannabis indica (indijska konoplja) in Cannabis ruderalis. Je dvodomna rastlina, zaradi česar ločimo moške in ženske rastline (Slika 2). Moške rastline proizvajajo pelod v prašnikih, ženske pa na svojih cvetovih izražajo trihome, ki so bogati s smolo in rastlini služijo kot pomoč pri lovljenju peloda. Ko ženski cvet ujame pelod, se začne razvoj semen. Smolo proizvajajo žlezni trihomi - epidermalne izbokline, ki prekrivajo liste in stebla rastlin. Kot obrambni mehanizem izločajo ali shranjujejo sekundarne presnovke, zato so vir velikega števila terpenov in kanabinoidov.
Slika 2: Cannabis sativa L. (A) socvetje moške rastline in (B) rodna ženska rastlina [9]
Najbolj preiskana kanabinoida CBD in THC nastajata v žleznih trihomih na ženski rastlini kot kislini – tetrahidrokanabinolna (THCA) in kanabidiolna kislina (CBDA). Izhajata iz istega prekurzorja kanabigerolne kisline (CBGA). V majhnih količinah se fitokanabinoidi nahajajo tudi v semenih, koreninah in cvetnem prahu. Na splošno je koncentracija teh spojin odvisna od dela rastline oz. vrste tkiva, starosti in sorte rastline, rastnih pogojev (prehrana, vlaga, količina svetlobe), časa žetve in pogojev skladiščenja [2, 4, 10].
1.2.2 Biosinteza fitokanabinoidov
Začetna substrata v biosintezi fitokanabinoidov sta geranil pirofosfat (GPP) in olivinska kislina (OLA). Encim geranil difosfat: olivtolat geraniltransferaza (GOT) katalizira
4
alkilacijo OLA z GPP, ki proizvaja CBGA, predhodnico več kanabinoidov. Tri oksidociklaze s svojim delovanjem pretvorijo CBGA v ustrezne kisline kanabinoidov.
Sintaza tetrahidrokanabinolne kisline proizvaja THCA, sintaza kanabidiolne kisline proizvaja CBDA, sintaza kanabikromenske kisline pa CBCA. Kisline so v naslednjem koraku podvržene spontani dekarboksilaciji, katere hitrost je odvisna od različnih faktorjev. Največji vpliv ima temperatura, višja temperatura pomeni hitrejši proces dekarboksilacije, ki privede do sinteze nevtralnih kanabinoidov THC, CBD, CBG in CBC. Reakcija dekarboksilacije se dogaja tudi pri sobni temperaturi, vendar precej počasneje. Biosintezna pot nastanka kanabinoidov iz CBGA v rastlini je prikazana na Sliki 3 [5, 11].
Slika 3: Biosintezna pot nastanka kanabinoidov v Cannabis sativa L. (Δ = segrevanje, ox = oksidacija; is = izomerizacija) [12]
1.2.3 Spekter uporabe
Konoplja je dragocen naravni vir, saj nas oskrbuje z bogatim repertoarjem fitokemikalij, kot imenujemo kemijske spojine, ki jih pridobivamo iz rastlin, njihovih plodov in iz vlaken. Konopljina vlakna se uporabljajo v tekstilni industriji, kot surovina za biokompozitne izdelke ali kot nadomestek sintetičnih polimerov. So najmočnejša poznana rastlinska vlakna, zato je njihova trdnost cenjena tudi pri izdelavi jermenov za motorje, gasilskih cevi, v gradbeništvu za ustvarjanje betonu podobnega materiala. Zlasti avtomobilska industrija jih uporablja za proizvodnjo biodizla in bioplastike, ki je po masi
5
močnejši in lažji material od polipropilenske plastike. Konopljina vlakna imajo tudi antibakterijske lastnosti in se uporabljajo za izdelavo antibakterijskih sredstev in kirurških pripomočkov. Pozitivne so tudi njene kmetijske značilnosti, saj je odporna proti suši in škodljivcem in ima dobro razvit koreninski sistem, ki preprečuje erozijo tal in nizko potrebo po gnojilih.
V farmakologiji kanabinoide uporabljamo kot snovi s potencialnim terapevtskim učinkom in celo kot zdravila. V nekaterih evropskih državah lahko avtorizirana zdravila vključujejo THC v kapsulah, izvleček konoplje kot pršilo za usta in posušene cvetove konoplje za uparjanje ali pripravo napitkov. Po strokovnih smernicah kanabinoidi niso zdravilo prve izbire, ampak se lahko uporabljajo kot dopolnilo k uveljavljenim zdravilom.
CBD ima antikonvulzivne, protivnetne, antipsihotične in antioksidativne lastnosti. THC pozitivno vpliva na povečanje apetita, zmanjšuje bolečino, vpliva na spastičnost, deluje nevroprotektivno in ima protivnetne učinke. Danes v raziskave vse bolj vključujejo tudi CBC in CBG. CBC ima protivnetne in proapoptozne učinke ter deluje protiglivno. CBG so dokazali šibko protibakterijsko, antioksidativno in protivnetno delovanje in vitro ter protitumorno delovanje na mišjih modelih. Konoplja pozitivno deluje tudi na nekatere dermatološke bolezni, saj je kožni endokanabinoidni sistem vključen v proces regulacije proliferacije in diferenciacije celic ter vnetnih procesov [3, 13, 14].
1.3 Regulacijski vidiki uporabe kanabinoidov
Slovenija sodi med države proizvajalke konoplje. Med prepovedanimi drogami je konoplja na prvem mestu po številu zasegov in po količini zasežene droge. Vrste konoplje, ki so gojene za različne namene, se močno razlikujejo v vsebnosti kanabinoidov. Industrijska konoplja se uporablja v kmetijske in industrijske namene ter ima zelo nizko vsebnost THC in visoko vsebnost CBD. V večini evropskih držav je zgornja meja za THC zakonsko omejena na 0,2 % (v Švici 0,3 %). Nasprotno se medicinska konoplja, katere uporaba je v nekaterih državah dovoljena v medicini, goji z namenom zdravljenja in ima nizko vsebnost CBD, visoko vsebnost THC in mora ustrezati predpisanim farmacevtskim standardom. Za gojenje je potrebna licenca, celoten proces pridelave, priprave in uporabe je strogo nadzorovan. Konoplja za rekreativno uporabo se goji s ciljem čim višje vsebnosti THC, vendar je uradno njeno gojenje pri nas prepovedano [2, 3].
Pri nas je konopljo kaznivo gojiti in prodajati, posredovati ali omogočati njeno uporabo, tudi posest manjše količine za enkratno uporabo se obravnava kot prekršek. Izjema je industrijska konoplja, za katero je v državah Evropske unije dovoljena koncentracija THC pod 0,2 % v suhi snovi in iz katere izdelujejo moko, olje, kozmetične in prehranske pripravke, vrvi, blago itd. Prodajalec mora predložiti dokaze o učinkovitosti in varnosti izdelka. Konoplja, razen industrijske, ostaja prepovedana droga, po novem pa je drugače z registriranimi zdravili na osnovi kanabinoidov. Od leta 2014 dalje je v Sloveniji s spremembo Uredbe o razvrstitvi prepovedanih drog omogočena uporaba zdravil na osnovi kanabinoidov, ki jih zdravniki predpišejo na recept za zdravljenje tistih bolezni,
6
pri katerih so ta zdravila dokazano učinkovita. Na seznamu prepovedanih drog so tudi pripravki iz konoplje, ki jim s skupnim imenom pravimo kanabis (hašiš, hašiševo olje, marihuana) [15].
Produkti s kanabinoidi so našli svoje mesto tudi v živilski in kozmetični industriji. Za pripravo živil z industrijsko konopljo veljajo zahteve Pravilnika o gojenju in uporabi vrst industrijske konoplje, v katerih vsebnost tetrahidrokanabinola ne presega 0,2 % v suhi snovi rastline. Glede vsebnosti kanabinoidov v končnem živilskem izdelku je bilo s strani Nacionalnega inštituta za javno zdravje predlagano spremljanje surovin vsaj s smernimi vrednostmi, kot jih predlaga Evropsko združenje za industrijsko konopljo. Kadar se industrijsko konopljo oz. dele rastline upraši in/ali stisne ter trži kot prehransko dopolnilo, je dolžnost proizvajalca, da na enak način kot pri običajnih živilih, spremlja surovine glede vsebnosti kanabinoidov ter varnost izdelka dodatno zagotavlja s postavitvijo primernega priporočenega dnevnega odmerka na etiketi produkta [16, 17].
1.4 Analizne metode za določanje kanabinoidov
Izvajanje nadzora kakovosti v izdelkih iz konoplje in zagotavljanje odsotnosti neustreznih količin psihotropnih ali nevarnih spojin je z vidika regulacije širše uporabe (prodaje) konopljinih izdelkov obvezna in za človekovo zdravje zelo pomembna. Za kemijsko analizo kanabinoidov v živilskih in kozmetičnih izdelkih, rastlinskih ter bioloških vzorcih so razvite številne analitske metode [11, 18].
Najpogosteje uporabljeni metodi za določevanje kanabinoidov sta plinska kromatografija (GC) in tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC). Kromatografija je separacijska metoda, ki vključuje različne metode separacije, identifikacije ter določevanja sorodnih in kompleksnih spojin na različnih področjih znanosti. Tekočinska kromatografija je največkrat sklopljena z ultravijoličnim detektorjem (HPLC-UV), detektorjem z nizom diod (HPLC-DAD) ali masnim spektrometrom (LC-MS), plinska kromatografija pa s plamensko-ionizacijskim detektorjem (GC-FID) ali masnim spektrometrom (GC-MS). Namen kromatografije je ločba posameznih komponent vzorca, ki jih s ciljem kvalitativne in kvantitativne določitve zaznamo z ustreznim detektorjem. Posamezne komponente vzorca se ločijo na podlagi različnih porazdelitev med stacionarno fazo in mobilno fazo. Glede na način izvedbe ločimo planarno in kolonsko kromatografijo, glede na vrsto uporabljene mobilne faze pa ločimo plinsko kromatografijo (GC), superkritično tekočinsko kromatografijo (SFC) in tekočinsko kromatografijo (LC). V literaturi so kot alternativne metode za določevanje kanabinoidov navedene še ionizacija v matriksu z lasersko desorpcijo (MALDI), tankoplastna tekočinska kromatografija (TLC), spektroskopija s Fourerovo transformirano infra-rdečo svetlobo (FTIR), spektroskopija z jedrsko magnetno resonanco (NMR) in plinska kromatografija z detektorjem ultravijolične svetlobe pod vakuumom (GC-VUV) [11, 18, 19].
7
1.4.1 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti
Glede na mehanizem separacije molekul vzorca pri tekočinski kromatografiji ločimo porazdelitveno, ionsko-izmenjevalno, velikostno-izključitveno in adsorpcijsko kromatografijo. Zadnjo delimo še na normalno-fazno in reverzno-fazno kromatografijo.
Najpogosteje uporabljena je reverzno fazna kromatografija, kjer je stacionarna faza nepolarna, eluent pa je polarno topilo. Separacijski mehanizem temelji na porazdeljevanju molekul analita med stacionarno in mobilno fazo. V primerih reverzno fazne kromatografije se kot mobilna faza najpogosteje uporablja mešanica polarnih organskih topil, npr. acetonitrila, metanola, vode in pogosto kislin ali pufrov. Tekom analize se prve eluirajo najbolj polarne sestavine, medtem ko nepolarne sestavine tvorijo močnejše interakcije s stacionarno fazo. Pri normalno fazni kromatografiji je elucijsko zaporedje je ravno obratno, najprej se eluirajo bolj nepolarne spojine.
Komponente HPLC sistema
Glavne komponente HPLC sistema so: razervoar z mobilno fazo, črpalni sistem, injektor, kolona z detektorjem in računalnik - zapis signala (Slika 4).
Slika 4: Shema tekočinskega kromatografa visoke ločljivosti Rezervoar z mobilno fazo
Sestava mobilne faze je pri HPLC bistvenega pomena za separacijo. Organska topila za mobilne faze morajo biti ustrezne čistosti, mobilna faza mora biti pred uporabo razplinjena, saj lahko v sistemu zaradi raztopljenih plinov iz ozračja nastanejo mehurčki, ki povzročajo velik šum v detektorju. Če se sestava mobilne faze tekom celotnega časa analize vzorca ne spreminja, gre za izokratsko ločbo. Nasprotno je pri gradientni ločbi v uporabi kombinacija dveh ali več topil, ki se razlikujejo v polarnosti in katerih razmerje se linearno ali v več korakih programirano spreminja. Gradientna elucija navadno izboljša
črpalka
mobilni fazi
siringa
injektor
predkolona
separacijska kolona
detektor
podatki
8
učinkovitost ločbe, s spremembo sestave oz. polarnosti mobilne faze lahko med analizo dosežemo krajše čase zadrževanja močneje vezanih komponent na koloni in s tem bistveno skrajšamo čas analize.
Črpalni sistem
Črpalni sistem (rezervoar z mobilno fazo, gradientni mešalec in črpalke) je odgovoren za potisk analita, raztopljenega v mobilni fazi, skozi celoten sistem. Zaradi polnitve kolone so upori zelo visoki, kljub temu pa mora črpalka delovati tako, da ohranja pretok mobilne faze ponovljiv, stabilen in brez nihanj. Zagotavljati mora možnost širokega območja pretokov mobilne faze in odpornost proti koroziji zaradi uporabe različnih topil. Črpalke so najpogosteje narejene iz dveh zaporednih batov, ki delujeta v nasprotni smeri. Za njima je mešalna komora, ki omogoča izokratsko in gradientno elucijo.
Injektor
Natančen volumen vzorca je s pomočjo injektorja vbrizgan na kolono. Najboljši način injiciranja v pretoku mobilne faze predstavlja injektor z dozirno zanko, ki omogoča točno in avtomatsko doziranje izbranega volumna vzorca. Na tak način je dosežena ponovljivost injiciranja. Avtomatski vzorčevalnik je navadno termostatiran in zaščiten pred svetlobo.
Kolona
Kromatografske kolone so ravne cevke, navadno izdelane iz nerjavnega jekla in v dolžino merijo 5 - 25 cm. V uporabi so kolone z različnimi premeri in stacionarnimi fazami z različno velikostjo delcev. Stacionarne faze iz silike so med najbolj pogostimi polnilnimi materiali za HPLC kolone. Delci silike so polarni, porozni, inertni in sferični ter zato idealni kot polnilni material. Površina delcev silike je prekrita s silanolnimi skupinami (-SiOH), ki so lahko z ustrezno kemijsko reakcijo enostavno modificirani. Najpogosteje s kemijsko vezanimi alkilnimi skupinami -C8 (n-oktil) oz. –C18 (n-oktadecil). Retencija oz. zadrževanje analita na stacionarni fazi je pretežno odvisna od hidrofobnih interakcij (van der Waalsovih in disperzijskih sil) med nepolarnim delom stacionarne faze in nepolarnim delom molekule analita. Vrstni red elucije pri reverzno fazni kromatografiji je odvisen od polarnosti analitov. Retencijski časi naraščajo z naraščujočo hidrofobnostjo analitov. Prvi se eluirajo najbolj polarni analiti, saj tvorijo najmanj hidrofobnih interakcij s stacionarno fazo. Navadno se retencija povečuje tudi z uporabo faz, ki so modificirane z daljšo alkilno verigo (C18 > C8 > C4). Za zaščito kolone se med injektorjem in kolono včasih uporablja predkolono s podobno stacionarno fazo kot jo vsebuje kolona. Na ta način se prepreči kontaminacija kolone in podaljša se njena življenjska doba.
Detektor
Detektor je del sistema, ki zazna posamezne komponente vzorca, ki po ločitvi pridejo iz kolone. Detektor mora biti časovno stabilen, občutljiv in zmožen zaznave vseh spojin, ki se ločijo na koloni. Najpogosteje uporabljani detektorji pri HPLC temeljijo na detekciji optičnih lastnostih analitov (absorpcija, fluorescenca, lomni količnik). Največkrat gre za
9
uporabo UV-VIS spektrofotometra kot detektorja in detektorja z nizom diod (DAD), ki omogoča snemanje celotnega spektra vzorca. Del substituiranega fenolnega obroča molekule kanabinoida, kromofor, absorbira UV svetlobo, ki jo detektor detektira. Alkilna veriga ali ciklizacija nefenolnega dela molekule ne vpliva na absorpcijo UV svetlobe [20, 21].
1.4.2 Tekočinska kromatografija s tandemsko masno spektrometrijo
LC-MS/MS omogoča večjo občutljivost, selektivnost in specifičnost kot HPLC. Trojni kvadrupol (QqQ) je pri analizi kanabinoidov najpogosteje uporabljen analizator, ki omogoča točno identifikacijo mas tako prekurzorskega kot produktnega iona. Vzorec, raztopljen v mobilni fazi, prečrpamo skozi fino kapilaro, katere konica je pri atmosferskem tlaku in ima visok potencial. Visok potencial ustvari elektrostatični brizg nabitih kapljic vzorca. Formirajo se nabiti ioni. Vzorec gre skozi šobo, kjer je pretok dušika, ki piha nasproti toka vzorca. Postopek se imenuje ionizacija z razprševanjem v električnem polju (ESI). Dušik povzroči izhlapevanje, razbitje klastrov in izpiha matrico stran od masnega analizatorja. V prvem kvadrupolu (Q1) izberemo ion [M + H]+ z določeno maso oz. razmerje masa/naboj (m/z) iona, ki je predmet naše analize. S pomočjo trkovne napetosti so izbrani ioni pospešeni v trkovno celico. V drugem kvadrupolu (Q2) se dogaja fragmentacija, inducirana zaradi kolizije molekulskih ionov. V tretjem kvadrupolu (Q3) poteka detekcija vseh ionov, ki zapustijo trkovno celico. Izbrane ione v prvem analizatorju imenujemo prekurzorski, ione, nastale v trkovni celici pa produktni ioni (Slika 5). V kvadrupolnem masnem analizatorju so za separacijo ionov na podlagi razmerja m/z uporabljena električna polja. Kvadrupol je sestavljen iz štirih paralelnih palic ali polov, okoli katerih potujejo ioni. Kvadrupoli imajo določen naboj in spreminjajočo se napetost. Odvisno od proizvedenega električnega polja, pridejo na detektor le ioni z določeno vrednostjo m/z, ostali so izločeni. S spreminjanjem dolžine in frekvence električnega polja opazimo različne ione, ki ustvarijo masni spekter.
Kvadrupolni analizator je popolnoma računalniško voden, zato so rezultati ponovljivi in robustni [20, 22, 23].
Slika 5: Shema trojnega kvadrupola in prikaz razbitja izbranega prekurzorskega iona
Kvadrupol 1 (Q1)
Kolizijska celica
Kvadrupol 2 (Q2) Kvadrupol 3 (Q3)
10 1.4.3 Plinska kromatografija
Plinska kromatografija je primerna za separacijo in kvantitativno določitev termično stabilnih, hlapnih in nepolarnih spojin. Poznana sta dva tipa plinske kromatografije.
Plinsko-trdna kromatografija, kjer je mobilna faza plin, stacionarna faza je trdna, nanjo se lahko analiti adsorbirajo in je pomembna za analizo plinov iz zraka. Bolj uporabljana pa je plinsko-tekočinska kromatografija, ki jo običajno imenujemo kar plinska kromatografija (GC). Separacija poteka na osnovi porazdelitve komponent v vzorcu med plinasto mobilno fazo in tekočo stacionarno fazo (nanos tekočine na trdnem nosilcu) in je uporabna za analizo organskih vzorcev. Za spojine, ki so termično nestabilne (mnoge polarne spojine) ali pa se na koloni ne ločijo zadovoljivo, lahko pripravimo bolj hlapne in obstojne derivate. Poznamo več reagentov, ki hitro in kvantitativno pretvorijo polarne skupine -OH, -COOH, -NH2 v ustrezne derivate.
Komponente plinskega kromatografa
Plinski kromatograf sestavljajo izvor nosilnega plina (jeklenka), regulatorja pritiska in pretoka plina, sistem za injiciranje vzorca, kolona, detektor, integrator in rekorder (Slika 6). Nosilni plin je usmerjen skozi injektor proti koloni. Njegov pretok in pritisk sta regulirana z ustreznima regulatorjema. Vzorec v plinastem agregatnem stanju je s posebnim sistemom injiciranja uveden v injektor in na kolono. Analiti se v nadaljevanju ločujejo na koloni, ki se nahaja v temperaturno kontrolirani pečici. Navadno se za bolj učinkovito separacijo uporablja temperaturni gradient. Separirane analite na koncu zazna detektor, celoten sistem pa je povezan z računalnikom, zato lahko preprosto spremljamo in ovrednotimo rezultate.
Slika 6: Shematski prikaz plinskega kromatografa Nosilni plin
Mobilna faza oz. nosilni plin kemijsko ne interagira z molekulami vzorca ali stacionarne faze. Njegov namen je, da prenaša analite od injektorja skozi kolono v detektor. Nosilni
kolona injektor septa
siringa
merilec pretoka
detektor podatki regulator
pretoka regulator
tlaka
nosilni plin
pečica spliter
11
plin mora biti inerten, kot so npr. helij, dušik in vodik, zelo čist (najmanj 99,995 %) in neviskozen.
Sistem za injiciranje vzorca
Injiciranje vzorca v GC kolono je ključen del analize. Z uporabo mikrosiringe poteka injiciranje tekočega ali plinastega vzorca skozi silikonsko septo v del, kjer se ta pred vhodom v kolono upari. Poznamo več tipov injektorjev, eden od njih je split/splitless injektor in je uporabljen pri kapilarnih kolonah. Pri načinu split se s pomočjo spliterja razdeli volumen injiciranega vzorca, in sicer se od nastavljene količine volumna vzorca na kolono prenese le manjši del, preostanek vzorca pa gre v odpad. Pri zelo nizkih koncentracijah vzorca lahko na kolono injiciramo brez razdelitve vzorca, kar imenujemo splitless način.
Kolona
V plinski kromatografiji se uporabljajo polnjene in kapilarne kolone. Ločba analitov je odvisna od polnitve, to je nosilca ali adsorbenta s stacionarno fazo in od učinkovitosti kolone. Pri polnjenih kolonah je na stacionarno fazo nanešen nosilni material, pri kapilarnih kolonah pa je tekoča stacionarna faza (imobilizirana tekočina) nanešena na steno kolone. Kapilare imajo notranji premer med 0,1 in 0,6 mm in dolžino do 100 m, zato so zvite v obliko heliksa, da ustrezajo v prostor s pečico. Kapilarne kolone so narejene iz sintetične silike visoke čistosti, stekla ali nerjavnega jekla. Stacionarna faza je lahko kot tanka filmska plast nanešena direktno na notranjo steno (WCOT, wall-coated open tubular) ali pa je na porozen nosilec adsorbirana že v naprej (SCOT, support-coated open tubular). Med najpogosteje uporabljenimi tekočimi stacionarnimi fazami je polidimetil siloksan, ki predstavlja nepolarno fazo. Gre za od 5 % do 50 % fenil-polidimetil siloksan, kjer je del metilnih (-CH3) skupin zamenjan s fenilnimi (-C6H5), ki prispevajo k polarnosti stacionarne faze.
Zelo pomembna spremenljivka, ki mora biti za natančno delo nadzorovana, je temperatura kolone. Kolona se nahaja v termostatirani pečici, katere optimalna temperatura je odvisna od vrelišč analitov in od ločbe, ki jo želimo zagotoviti. Optimalna temperatura analize naj bi bila nastavljena na povprečno temperaturo vrelišč analitov oz.
malo nad njo. Za vzorce s spojinami s širokim razponom temperatur vrelišč je smiselno uvesti temperaturni program. Program je možno nastaviti tako, da temperatura tekom ločbe narašča konstantno ali pa stopenjsko.
Detektor
Na izhodu kromatografske kolone je nameščen detektor, s katerim zaznamo komponente, ki jih s pomočjo mobilne faze eluiramo iz kolone. Detektor daje signal, ki ga ustrezen senzor pretvori v analogni električni signal. Detektorski sistem zagotavlja zvezni zapis v obliki koncentracijskih profilov (vrhov) komponent, ki se eluirajo iz kolone. V plinski kromatografiji poznamo vrsto različnih detektorjev: plamensko-ionizacijski detektor
12
(FID), toplotno prevodni detektor, termoionski detektor, detektor na zajetje elektronov, masni spektrometer (MS).
FID detektor temelji na spremembi električne prevodnosti, ki izvira iz ionov in elektronov, nastalih pri gorenju organskih spojin v plamenu mešanice vodik/zrak. Ko iz kolone v detektor pride organska spojina, tok močno naraste in je sorazmeren z množino snovi v eluatu. Nastali tok povzroči padec napetosti na visokoomskem uporu, ta napetostni signal ojačimo in peljemo na izhodno enoto (rekorder ali integrator). FID detektor odlikuje visoka občutljivost, široko območje linearnosti in majhen šum.
Primeren je za analizo spojin, ki vsebujejo C-C ali C-H vezi. Ker ni občutljiv na prisotnost plinov H20, CO2, SO2, NOx, je primeren za analizo organskega onesnaženja v zraku [20, 21].
1.4.4 Primerjava tekočinske in plinske kromatografije
Poleg možnosti analiziranja nehlapnih in termično labilnih spojin, ima HPLC ima v primerjavi z GC določene pomembne prednosti. Pri določanju kanabinoidov je poglavitno to, da se z uporabo HPLC izognemo okoliščinam, ki jih povzroča visoka temperatura analize na GC, ki vpliva na rezultate predvsem v fazi injiciranja vzorca in tudi med samo analizo. Kanabinoidi so v rastlini prisotni v glavnem kot kisline, ki se pod vplivom povišane temperature dekarboksilirajo. Proces dekarboksilacije se zaradi visoke temperature dogaja tudi v plinskem kromatografu. Problem tega procesa se pri rezultatih odraža na dva načina: kislih in dekarboksiliranih oblik določenega kanabinoida ni mogoče ločeno določiti. Določimo lahko le vsoto obeh oblik. Velika verjetnost je, da proces dekarboksilacije v injektorju ni popoln. Težavi je mogoče uspešno rešiti z derivatizacijo kanabinoidov (nevtralnih in kislih) v vzorcu, ki poveča njihovo hlapnost in omogoča ohranitev strukture kanabinoidov tekom analize. Derivatizacija pogosto ni zaželjen korak, saj poveča verjetnost eksperimentalne napake in podaljša čas analize. S HPLC se tem težavam uspešno izognemo, saj se analize ne izvajajo pod tako visokimi temperaturami in lahko razmeroma hitro in učinkovito določimo kisle in dekarboksilirane kanabinoide.
Zaradi omenjenih dejavnikov obstajata dva glavna pristopa h kromatografski analizi kanabinoidov: neposredna analiza ustrezno razredčenega vzorca s tekočinsko kromatografijo ali predhodna derivatizacija vzorca in nadaljnja analiza s plinsko kromatografijo. Kljub omenjenim pomanjkljivostim je slednji pristop za nekatere aplikacije zaradi preproste, hitre in cenovno ugodne uporabe zelo priljubljen [18, 21, 24].
13
2 Namen dela
Industrijska konoplja je prisotna v živilih in kozmetičnih ter drugih izdelkih na slovenskem trgu. Prav tako se kanabinoidi, aktivne učinkovine v konoplji, v medicini uporabljajo za zdravljenje simptomov nekaterih bolezni. Zaradi oglaševanja in javnih polemik glede koristi in tveganj za zdravje, obstajajo glede uporabe industrijske konoplje v živilih in drugih izdelkih številne nejasnosti, tako pri potrošnikih kot proizvajalcih. Za pripravo običajnih živil z industrijsko konopljo veljajo zahteve Pravilnika o gojenju in uporabi vrst industrijske konoplje, v katerih vsebnost THC ne presega 0,2 % v suhi snovi rastline. Glede vsebnosti kanabinoidov v končnem živilskem izdelku je potrebno spremljanje surovin vsaj s smernimi vrednostmi, kot jih predlaga Evropsko združenje za industrijsko konopljo. Za nadzor kakovosti in kemijske sestave izdelkov so zato nujno potrebne ustrezne analizne metode in tehnike, s katerimi lahko kvalitativno in kvantitativno določimo prisotnost kanabinoidov v različnih vzorcih. Še posebej aktualno je določevanje vsebnosti psihoaktivnega in zakonsko spornega ∆9-THC.
Namen magistrskega dela je bil razviti metode za kvantitativno določitev sledi ∆9-THC v vzorcih naravnih (CBD, CBG) in sintetičnih oz. polsintetičnih (CBN) kanabinoidov, ki omogočajo spremljanje njihove kvalitete in stabilnosti. Aktualen je razvoj analiznih metod, s katerimi bi lahko kvantitativno določili ∆9-THC do zakonsko določene meje 0,2 % v suhi snovi. Naš cilj pa je bil razviti metode, občutljive za določitev vsaj tisočkrat nižje vsebnosti ∆9-THC (0,0002 % oz. 2 ppm). Za razvoj kromatografskih metod smo tekom eksperimentalnega dela uporabljali tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC), tekočinsko kromatografijo sklopljeno s tandemsko masnim spektrometrijo (LC-MS/MS) in plinsko kromatografijo (GC). Naprej smo želeli postaviti ustrezno metodo na HPLC, jo validirati in nato določene parametre optimizirati na masnem spektrometru. Za primerjavo smo sledi ∆9-THC v vzorcih želeli kvantitativno določati tudi z GC-FID in tako razviti dodatno možno metodo.
14
15
3 Eksperimentalni del
Eksperimentalni del sem opravila na katedri za analizno kemijo na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo (FKKT) v Ljubljani. Razvoj metod in vse meritve sem izvedla na razpoložljivih instrumentih na fakulteti - tekočinskem kromatografu visoke ločljivosti z UV/VIS detektorjem (HPLC-UV/VIS), tekočinskem kromatografu sklopljenim z masnim spektrometrom (LC-MS/MS) in plinskem kromatografu s plinsko-ionizacijskim detektorjem (GC-FID). Eksperimentalno delo je zajemalo pripravo ustreznih topil, mobilnih faz, standardnih oz. referenčnih raztopin in raztopin vzorcev za potrebe razvoja ter kasnejše validacije metode.
Na tekočinskem kromatografu z UV/VIS detektorjem smo razvijali analizno metodo za določevanje nizkih koncentracij ∆9-THC in končno metodo tudi validirali. Po razvoju analizne metode na sistemu HPLC-UV/VIS, smo analizo vzorcev izvedli še na sistemu LC-MS/MS. Parametre na masnem spektrometru smo ustrezno optimizirali in z uporabo masnega spektrometra razvili bolj občutljivo metodo kot na sistemu HPLC-UV/VIS. Prav tako smo z namenom kvantifikacije ∆9-THC in razvoja metode na plinskem kromatografu s FID detektorjem izvedli eksperimente, vendar so se v primeru določevanja sledi analita s to tehniko pojavljale težave.
3.1 HPLC-UV/VIS
3.1.1 Uporabljeni reagenti in topila
Za analizo smo uporabljali vodo Milli-Q in reagente ustrezne čistosti:
o acetonitril, CH3CN (J.T.Baker, za uporabo v HPLC), o metanol, CH3OH (J.T. Baker, za uporabo v HPLC), o etanol, (CH3CH2OH) (J.T.Baker, za uporabo v HPLC),
o mravljična kislina, HCOOH (Carlo Erba, 99 %, p.a. ACS reagent), o amonijev formiat, NH4HCO2 (Fluka, p. a. ACS reagent).
3.1.2 Uporabljeni referenčni materiali in vzorci o izolat CBD
o izolat CBG o izolat CBN
o ekstrakt konopljinih vršičkov kot vir CBG-A o smola, vsebnost ∆9-THC = 63 %
o smola, vsebnost ∆9-THC = 90 % o smola ∆8-THC
16 3.1.3 Laboratorijski inventar
o laboratorijska steklovina o analitska tehtnica
o ultrazvočna kopel o mešalo
o avtomatska pipeta 100 – 1000 µL o avtomatska pipeta 20 – 200 µL o plastični nastavki za pipete o steklena in plastična kapalka o magnetno mešalo
o spatula
o viale, pokrovčki
3.1.4 Instrumentalna oprema
Tekočinski kromatograf Thermo Scientific Dionex UltiMate Scouter, sestavljen iz:
– kvarterne črpalke (LPG-3400SD), – selekcijski ventil (Rheodyne.MXIIvalve)
– avtomatskega vzorčevalnika (WPS-3000SplitLoopRS), – kolonskega termostata (TCC-3200) in
– DAD detektorja (DAD-3000) ter
tekočinski kromatograf Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 sestavljen iz:
– kvarterne črpalke (LPG-3400SD),
– avtomatskega vzorčevalnika (WPS-3000 SplitLoop), – kolonskega termostata (TCC-3000) in
– DAD detektorja (DAD-3000).
Rezultate s kromatogramov smo obdelovali na osebnem računalniku s programsko opremo Chromeleon.
3.1.5 Priprava raztopin za razvoj metode
0,1 % mravljična kislina v vodi Milli-Q za mobilno fazo A
V 1000 mL bučo smo nalili 500 mL vode Milli-Q in dodali 1,0 mL mravljične kisline. Z vodo smo dopolnili do oznake volumna na buči ter previdno premešali.
0,1 % mravljična kislina v acetonitrilu/metanolu za mobilno fazo B
V 1000 mL bučo smo nalili 500 mL vode acetonitril/metanol in dodali 1,0 mL mravljične kisline. Z ustreznim topilom smo dopolnili do oznake volumna na buči ter previdno premešali.
17
Raztopina 5 mM amonijevega formiata z 0,1 % mravljično kislino
V ustrezno čašo smo natančno natehtali približno 0,316 g amonijevega formiata, dodali magnetno mešalo in ga raztopili v približno 950 mL vode Milli-Q. Raztopino smo prelili v 1000 mL merilno bučo, dodali 1,0 mL mravljične kisline in dopolnili z vodo do oznake volumna ter premešali.
Raztopine referenčnih materialov kanabinoidov
V 5 mL merilno bučko smo natančno natehtali približno 5 mg posameznega referenčnega materiala. Dodali smo približno ¾ volumna merilne bučke topila etanola in raztapljali v ultrazvočni kopeli približno 5 minut oz. dokler se ni vse raztopilo. Raztopino smo temperirali na sobno temperaturo, dopolnili s topilom do oznake volumna in premešali (γ = 1 mg/mL). Posamezne raztopine smo nato s topilom ustrezno redčili do γ = 0,1 mg/mL.
Raztopina vzorca CBD
V 5 mL merilno bučko smo natančno natehtali približno 1000 mg izolata CBD. Dodali smo približno ¾ volumna merilne bučke topila etanola in raztapljali v ultrazvočni kopeli približno 10 minut oz. dokler se ves vzorec ni raztopil. Raztopino smo temperirali na sobno temperaturo, dopolnili s topilom do oznake volumna in premešali (γ = 200 mg/mL).
Glede na potrebe tekom razvoja smo pripravili raztopine vzorcev različnih koncentracij referenčnih materialov in vzorcev tako, da smo ustrezno prilagodili natehte in volumne.
Postopki priprave raztopin so opisani tekom razvoja (v poglavju 4.1.1).
3.1.6 Priprava raztopin za validacijo metode MF A: 0,1 % mravljična kislina v Milli-Q
V 1000 mL bučo smo nalili 500 mL vode Milli-Q in dodali 1,0 mL mravljične kisline. Z vodo smo dopolnili bučo do oznake volumna in previdno premešali.
MF B: 0,1 % mravljična kislina v MeOH
V 1000 mL bučo smo nalili 500 mL MeOH in dodali 1,0 mL mravljične kisline. Z MeOH smo dopolnili bučo do oznake volumna in previdno premešali.
Raztopina standarda 1 ∆9-THC (RS1)
V 5 mL merilno bučko smo natančno natehtali približno 6,6 mg smole z vsebnostjo
∆9-THC = 63 %. Dodali smo približno ¾ volumna merilne bučke etanola in raztapljali v ultrazvočni kopeli približno 5 minut oz. dokler se smola ni raztopila. Raztopino smo temperirali na sobno temperaturo, dopolnili s topilom do oznake volumna in premešali (γ = 0,83 mg/mL).
18 Raztopina standarda ∆9-THC (RS)
V 5 mL bučko smo natančno dodali 301 µL RS1, dopolnili z etanolom do oznake in premešali (γ = 0,05 mg/mL).
Raztopine standarda za umeritveno krivuljo (preverjanje linearnosti)
Za preveritev linearnosti metode smo pripravili umeritveno krivuljo iz šestih raztopin standarda tako, da smo v 5 mL bučke natančno dodali ustrezen volumen RS. Raztopine smo nato dopolnili z etanolom do oznake volumna in premešali. Faktorji redčenja in pipetirani volumni raztopine standarda ∆9-THC (γ = 0,05 mg/mL) so podani v Tabeli 1.
Tabela 1: Priprava raztopin za preveritev linearnosti Oznaka
raztopine
γ ∆𝟗-THC [µg/mL]
Faktor redčenja
V bučke
[mL] V RS [µL]
1 0,5 100 5 50
2 1,0 50 5 100
3 1,5 33,33 5 150
4 2,0 25 5 200
5 2,5 20 5 250
6 3,0 16,67 5 300
Raztopine za umeritveno krivuljo s standardnimi dodatki (preverjanje točnosti)
Za preveritev točnosti metode smo umeritvno krivuljo pripravili iz šestih raztopin vzorca, ki smo jim dodali standardni dodatek. V 5 mL bučke smo natančno dodali ustrezen volumen raztopine RS ∆9-THC (γ = 0,05 mg/mL). Faktorji redčenja in pipetirani volumni RS so podani v Tabeli 2. Raztopine smo nato z v naprej pripravljeno raztopino vzorca dopolnili do oznake volumna bučke in premešali.
Za pripravo raztopine vzorca smo uporabili dvakrat prekristaliziran izolat CBD. V 50 mL merilno bučko smo natančno natehtali približno 10 g vzorca. Dodali smo približno ¾ volumna merilne bučke etanola in raztapljali v ultrazvočni kopeli 10 minut oz. dokler se ves vzorec ni raztopil. Raztopino smo temperirali na sobno temperaturo, dopolnili s topilom do oznake volumna in premešali (γ = 200 mg/mL).
19 Tabela 2: Priprava raztopin za preveritev točnosti
Oznaka raztopine
Dodatek ∆𝟗-THC γ [µg/mL]
V bučke [mL]
Dodatek RS
[µL] Faktor redčenja
1 0,5 5 50 100
2 1,0 5 100 50
3 1,5 5 150 33,33
4 2,0 5 200 25
5 2,5 5 250 20
6 3,0 5 300 16,67
Raztopine za preverjanje ponovljivosti priprave vzorca
V 5 mL merilne bučke smo natančno natehtali približno 750 mg vzorca. Uporabili smo dvakrat prekristaliziran izolat CBD. Dodali smo približno ¾ volumna merilne bučke etanola in raztapljali v ultrazvočni kopeli približno 10 minut oz. dokler se ves vzorec ni raztopil. Raztopine smo temperirali na sobno temperaturo, dopolnili s topilom do oznake volumna in premešali. Po opisanem postopku smo pripravili šest paralelk, točni podatki nateht vzorca in koncentracije so zbrani v Tabeli 3.
Tabela 3: Priprava raztopin vzorca za preveritev ponovljivosti priprave
Paralelka Masa vzorca [mg] V bučke [mL] γ vzorca [mg/mL]
1 758,088 5 151,618
2 752,708 5 150,542
3 753,130 5 150,626
4 749,740 5 149,948
5 752,412 5 150,482
6 749,792 5 149,958
20 3.1.7 Razvita metoda in kromatografski pogoji
Razvili smo kromatografsko metodo za določitev sledi ∆9-THC, ki smo jo v nadaljevanju tudi validirali. Kromatografski pogoji in gradientna ločba (Tabela 4) so sledeči:
Tabela 4: Gradientna ločba razvite metode t (min) MF A
(%)
MF B (%)
Pretok (mL/min)
0 35 65 1,5
1 35 65 1,5
5,5 35 85 1,5
6 35 85 1,0
14 35 85 1,0
15 35 65 1,5 uravnoteženje
kromatografskega sistema
18 35 65 1,5
MF A: 0,1 % mravljična kislina v Milli-Q MF B: 0,1 % mravljična kislina v MeOH Kolona: Raptor ARC-18
Injiciranje: 15 L + spiranje igle z EtOH na način kot ga omogoča aparatura T kolone: 30 °C
T vzorca: 25 °C
Detekcija: UV, valovna dolžina 208 nm 3.1.8 Opis validacije metode
Z validacijo analizne metode smo preverili linearnost metode, ponovljivost injiciranja, ponovljivost priprave vzorca, točnost in robustnost metode. Določili smo območje določitve, mejo zaznave (LOD) in mejo določitve (LOQ). Validacijo smo izvajali na koloni Raptor ARC-18, 2,7 µm, 150 x 4,6 mm, SN: 19052874, Lot: 190901RW, kataloška št: 9314A65 in na tekočinskem kromatografu Ultimate Scouter. Uporabljen je bil gradient, ki ga prikazuje Tabela 4, kromatografski pogoji pa so zapisani v nadaljevanju:
MF A: 0,1 % mravljična kislina v Milli-Q MF B: 0,1 % mravljična kislina v MeOH Detekcija: UV, valovna dolžina 208 nm
Injiciranje: 15 L + spiranje igle z EtOH na način kot ga omogoča aparatura T kolone: 30 °C
T vzorca: 25 °C
21 Preverjanje linearnosti metode
Linearnost smo preverjali v območju koncentracij ∆9-THC med 0,5 µg/mL in 3,0 µg/mL.
Na tem območju smo izdelali umeritveno krivuljo s šestimi točkami z enakomernimi koncentracijskimi razmiki. Za umeritveno krivuljo smo pripravili šest raztopin tako, da smo v 5 mL bučke dodali ustrezen volumen RS. Celoten postopek priprave raztopin je opisan v poglavju 3. 1. 6. Raztopine smo injicirali v kromatografski sistem in kot odzive dobili površine vrhov ∆9-THC.
Preverjanje ponovljivosti injiciranja
Za preverjanje ponovljivosti injiciranja smo šestkrat injicirali raztopino standarda
∆9-THC s γ = 1,5 µg/mL (7 ppm glede na koncentracijo RV, ki znaša 200 mg/mL).
Preverjanje ponovljivosti priprave vzorca
Za preverjanje ponovljivosti priprave vzorca smo pripravili šest paralelk vzorca CBD po 3. prektristalizaciji. Postopek priprave je opisan v poglavju 3. 1. 6. Vsako raztopino smo enkrat injicirali in kot odzive dobili površine vrhov ∆9-THC. Preveritev smo izvedli pod pogoji: ista metoda, isti izvajalec, uporaba iste opreme in v kratkem časovnem obdobju.
Preverjanje točnosti metode
Točnost metode smo preverili tako, da smo pripravili umeritveno krivuljo s standardnimi dodatki. Raztopini vzorca smo dodajali različne dodatke standarda v območju koncentracij ∆9-THC med 0,5 µg/mL in 3,0 µg/mL. Podrobnejši opis priprave raztopin je zapisan v poglavju 3. 1. 6. Raztopine smo injicirali v kromatografski sistem in kot odzive dobili ploščine vrhov ∆9-THC.
Preverjanje robustnosti metode
Robustnost smo preverjali na raztopini vzorca in raztopini standarda. Preverili smo sledeče vplive:
sprememba temperature termostatiranja kolone: ± 5 °C,
sprememba % mravljične kisline v MF A, ± 0,1 enote,
zamik gradienta za 1,0 min.
Pri spremembi temperature termostatiranja kolone smo temperaturo kolone nastavili na ± 5 °C od temperature, določene v metodi, torej na 25 °C in 35 °C. Preverili smo ločbo pri spremenjeni sestavi vodne mobilne faze - koncentracijo mravljične kisline v mobilni fazi smo spremenili za ± 0,1 enote. Pripravili smo MF A z 0,09 % (900 µL mravljične kisline v 1000 mL Milli-Q) oz. 0,11 % (1100 µL mravljične kisline v 1000 mL Milli-Q) mravljične kisline. Preverili smo tudi vpliv zamika gradienta za 1,0 min. Spremenjena gradientna metoda je zapisana v Tabeli 5:
22
Tabela 5: Gradientna ločba razvite metode z zamikom gradienta za 1,0 min
t (min) MF A (%) MF B (%) Pretok (mL/min)
0 35 65 1,5
2 35 65 1,5
6,5 35 85 1,5
7 35 85 1,0
15 35 85 1,0
16 35 65 1,5 uravnoteženje
kromatografskega sistema
18 35 65 1,5
Pri normalnih in spremenjenih pogojih smo injicirali raztopini vzorca in standarda ter spremljali ali pri spremembi posameznih pogojev pride do signifikantnih sprememb kromatografskih parametrov vrha ∆9-THC.
3.2 LC-MS/MS
3.2.1 Uporabljeni reagenti in topila
Za analizo smo uporabljali ultračisto vodo (Milli-Q) in reagente ustrezne čistosti:
o metanol, CH3OH (J.T. Baker, for use in HPLC), o etanol, CH3CH2OH (J.T.Baker, za uporabo v HPLC),
o mravljična kislina, HCOOH (Carlo Erba, 99 %, p.a. ACS reagent).
3.2.2 Uporabljen referenčni materiali in vzorci o smola, vsebnost ∆9-THC = 90 %
o izolat CBD o izolat CBG o izolat CBN
3.2.3 Laboratorijski inventar o laboratorijska steklovina o analitska tehtnica
o ultrazvočna kopel
o avtomatska pipeta 100 – 1000 µL o avtomatska pipeta 20 – 200 µL o plastični nastavki za pipete o steklena in plastična kapalka
23 o spatula
o viale, pokrovčki
3.2.4 Instrumentalna oprema
Tekočinski kromatograf Thermo Scientific sklopljen z masnim spektrometrom Thermo Scientific TSQ Quantis. Rezultate s kromatogramov smo obdelovali na osebnem računalniku s programsko opremo Thermo Scientific Xcalibur.
3.2.5 Priprava raztopin za optimizacijo metode MF A: 0,1 % mravljična kislina v Milli-Q
V 1000 mL bučo smo nalili 500 mL vode Milli-Q in dodali 1,0 mL mravljične kisline. Z vodo smo dopolnili do oznake volumna na buči in previdno premešali.
MF B: 0,1 % mravljična kislina v MeOH
V 1000 mL bučo smo nalili 500 mL MeOH in dodali 1,0 mL mravljične kisline. Z MeOH smo dopolnili do oznake volumna na buči in previdno premešali.
Raztopina standarda 2 (RS2)
V 5 mL merilno bučko smo natančno natehtali približno 5 mg smole (vsebnost
∆9-THC = 90 %). Dodali smo približno ¾ volumna merilne bučke topila - etanola in raztapljali v ultrazvočni kopeli približno 5 minut oz. dokler se smola ni raztopila.
Raztopino smo temperirali na sobno temperaturo, dopolnili s topilom do oznake volumna in premešali (γ = 0,9 mg/mL).
Raztopina standarda 1 (RS1)
V 5 ml merilno bučko smo natančno dodali 1,0 mL RS2, dopolnili z etanolom do oznake volumna bučke in premešali (γ = 0,18 mg/mL).
Raztopina standarda (RS)
V 50 ml merilno bučko smo natančno dodali 1,0 mL RS1, dopolnili z etanolom do oznake volumna bučke in premešali (γ = 3,6 µg/mL).
Raztopina vzorca CBD, dvakrat prekristaliziran
V 5 mL merilno bučko smo natančno natehtali približno 200 mg vzorca. Dodali smo približno ¾ volumna merilne bučke topila - etanola in raztapljali v ultrazvočni kopeli približno 10 minut oz. dokler se ves vzorec ni raztopil. Raztopino smo temperirali na sobno temperaturo, dopolnili s topilom do oznake volumna in premešali (γ = 40 mg/mL).
24 Raztopina vzorca CBD, trikrat prekristaliziran
V 5 mL merilno bučko smo natančno natehtali približno 500 mg vzorca. Dodali smo približno ¾ volumna merilne bučke topila - etanola in raztapljali v ultrazvočni kopeli približno 10 minut oz. dokler se ves vzorec ni raztopil. Raztopino smo temperirali na sobno temperaturo, dopolnili s topilom do oznake volumna in premešali (γ = 100 mg/mL).
Raztopini vzorcev CBG oz. CBN
V 5 mL merilno bučko smo natančno natehtali približno 50 mg izolata CBG oz. CBN.
Dodali smo približno ¾ volumna merilne bučke topila etanola in raztapljali v ultrazvočni kopeli približno 10 minut oz. dokler se ves vzorec ni raztopil. Raztopino smo temperirali na sobno temperaturo, dopolnili s topilom do oznake volumna in premešali (γ = 10 mg/mL).
3.2.6 Priprava raztopin za delno validacijo metode Raztopine za preveritev linearnosti
Za preverjanje linearnosti smo z redčenjem raztopine standarda ∆9-THC (γ = 3,6 µg/mL) pripravili pet raztopin v koncentracijskem območju med 0,06 µg/mL in 0,14 µg/mL.
Raztopine smo pripravili v 10 mL bučkah. Izračunane redčitve raztopine standarda in volumni raztopine standarda, ki smo jih dodali za pripravo umeritvene krivulje so prikazani v Tabeli 6.
Tabela 6: Podatki priprave raztopin za preveritev linearnosti
γ ∆𝟗-THC [µg/ml] Faktor redčenja V bučke [mL] V RS [µL]
0,06 63,6 10 157,2
0,08 47,7 10 209,6
0,10 38,2 10 262,1
0,12 31,8 10 314,5
0,14 27,3 10 366,9
Priprava raztopin za preveritev točnosti
Točnost metode smo preverili tako, da smo pripravili raztopine vzorcev CBD po 2. in po 3. prekristalizaciji brez dodatka standarda in z dodatkom standarda (RS, γ = 3,6 µg/mL).
Vzorca brez dodatka standarda smo pripravili po postopku, opisanem v poglavju 3.2.5.
Vzorcema z dodatkom standarda pa smo dodali približno takšni koncentraciji ∆9-THC, kot sta jo vzorca že sama vsebovala. Podatki za pripravo raztopin so zbrani v Tabeli 7.
25
Tabela 7: Podatki priprave raztopin za preveritev točnosti
Oznaka vzorca Masa vzorca [mg]
V bučke [mL]
γ vzorca [mg/mL]
Dodana konc.
standarda [µg/mL]
CBD po 2. prekrist. 204,6 5 40,28 /
CBD po 2. prekrist. +
dodatek standarda 202,8 5 40,10 0,1099
CBD po 3. prekrist. 508,0 5 101,6 /
CBD po 3. prekrist. +
dodatek standarda 505,1 5 101,02 0,0699
3.2.7 Razvita metoda in kromatografski (HPLC) ter MS pogoji
Na tekočinskem kromatografu s tandemskim masnim spektrometrom smo optimizirali metodo za določitev ∆9-THC. Gradientna ločba je zapisana v Tabeli 4, kromatografski pogoji na tekočinskem kromatografu in pogoji na masnem spektrometru pa so podani v nadaljevanju.
Pogoji na HPLC:
MF A: 0,1 % mravljična kislina v Milli-Q MF B: 0,1 % mravljična kislina v MeOH
Kolona: Raptor ARC-18, 2,7 µm, 150 x 4,6 mm, serijska št.: 19052874, Lot: 190901RW Injiciranje: 3 L + spiranje igle z EtOH na način kot ga omogoča aparatura
T kolone: 30 °C T vzorca: 25 °
Detekcija: UV, valovna dolžina 208 nm
Instrument: tekočinski kromatograf Thermo Scientific sklopljen s tandemskim masnim spektrometrom Thermo Scientific Quantis TQS
Pogoji na MS:
Napetost kapilare: 3000 V Sheath gas: ~ 8,55 L/min Auxiliary gas: ~ 13,85 L/min Sweep gas: ~ 1,5 L/min
Ion transfer tube temperature: 350 ºC
26 Vaporizer temperature: 400 ºC
Napetost pri nastavitvi kolizijske energije: 22 V 3.2.8 Opis delne validacije metode
V sklopu delne validacije optimizirane metode smo preverili linearnost metode, ponovljivost injiciranja in točnost metode. Izvajali smo jo pri sledečih kromatografskih (HPLC) in MS pogojih. Uporabljen je bil gradient končne razvite metode, podan v Tabeli 4.
Kromatografski pogoji (HPLC):
MF A: 0,1 % mravljična kislina v Milli-Q MF B: 0,1 % mravljična kislina v MeOH
Kolona: Raptor ARC-18, 2,7 µm, 150 x 4,6 mm, serijska št.: 19052874, Lot: 190901RW Injiciranje: 3 L + spiranje igle z EtOH na način kot ga omogoča aparatura
T kolone: 30 °C
T vzorčevalnika: 25 °C
Detekcija: UV, valovna dolžina 208 nm Pogoji na masnem spektrometru:
Napetost kapilare: 3000 V Sheath gas: ~ 8,55 L/min Auxiliary gas: ~ 13,85 L/min Sweep gas: ~ 1,5 L/min
Ion transfer tube temperature: 350 ºC Vaporizer temperature: 400 ºC
Napetost pri nastavitvi kolizijske energije: 22 V Preverjanje linearnosti metode
Linearnost smo preverili v območju koncentracij ∆9-THC med 0,06 µg/mL in 0,14 µg/mL. Izdelali smo umeritveno krivuljo s petimi točkami z enakomernimi koncentracijskimi razmiki. Po postopku, opisanem v poglavju 3.2.5, smo pripravili raztopino standarda ∆9-THC s γ = 3,6 µg/mL, ki smo jo uporabili za nadaljnje redčenje in pripravo raztopin. Raztopine smo pripravili tako, da smo v 10 mL bučke dodali ustrezen volumen RS. Celoten postopek priprave raztopin za umeritveno krivuljo je opisan v poglavju 3.1.6. Injicirali smo jih v kromatografski sistem in kot odzive dobili površine vrhov ∆9-THC. Iz dobljenih podatkov smo ovrednotili linearnost umeritvene krivulje.
27 Preverjanje ponovljivosti injiciranja
Za preverjanje ponovljivosti injiciranja smo v kromatografski sistem šestkrat injicirali raztopino standarda ∆9-THC s γ = 0,1 µg/mL.
Preverjanje točnosti metode
Za preverjanje točnosti metode smo pripravili raztopine vzorcev CBD po 2. in po 3.
prekristalizaciji brez in s standardnim dodatkom. Vzorce smo pripravili po postopku, opisanem v poglavju 3.2.6. Raztopine smo injicirali in iz umeritvene premice iz dobljenih odzivov - ploščin izračunali koncentracijo ∆9-THC. Tako določene koncentracije smo primerjali s teoretično dodanimi koncentracijami vzorca.
3.3 GC-FID
3.3.1 Uporabljeni reagenti in topila
Za analizo smo uporabljali reagente ustrezne čistosti:
o heksan, C6H14 (J.T. Baker, for use in HPLC), o metanol, CH3OH (J.T. Baker, for use in HPLC), o etanol, CH3CH2OH (J.T. Baker, for use in HPLC).
3.3.2 Uporabljeni referenčni materiali in vzorci o izolat CBD
o izolat CBG o izolat CBN
o smola, vsebnost ∆9-THC = 90 % o smola ∆8-THC
o izolat CBD
3.3.3 Laboratorijski inventar o laboratorijska steklovina o analitska tehtnica
o ultrazvočna kopel
o avtomatska pipeta 100 – 1000 µL o avtomatska pipeta 10 – 100 µL o plastični nastavki za pipete o steklena in plastična kapalka o spatula
o viale, pokrovčki
