VPLIV NO IN HgCl2

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA BIOLOGIJO

Barbara SOBOTIČ

VPLIV NO IN HgCl

₂

NA TRANSPORT VODE IN OBLIKO HUMANEGA ERITROCITA

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij

Ljubljana, 2007

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA BIOLOGIJO

Barbara SOBOTIČ

VPLIV NO IN HgCl

₂

NA TRANSPORT VODE IN OBLIKO HUMANEGA ERITROCITA

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij

INFLUENCE OF NO AND HgCl

₂

ON WATER TRANSPORT AND SHAPE OF HUMAN ERYTHROCYTE

GRADUATION THESIS University studies

Ljubljana, 2007

(3)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. II

Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2007

Z diplomskim delom, ki je bilo opravljeno v laboratoriju za magnetno resonanco Odseka za fiziko trdne snovi na Institutu »Joţef Stefan« v Ljubljani, zaključujem univerzitetni študij biologije na Oddelku za biologijo, Biotehniške Fakultete, Univerze v Ljubljani.

Študijska komisija je za mentorja imenovala prof.dr. Gojmira Lahajnarja in za somentorja prof.dr. Slavka Pečarja.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: doc. dr. Gregor Zupančič

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Gojmir Lahajnar

Institut »Joţef Stefan« v Ljubljani, Odsek za fiziko trdne snovi Član: prof. dr. Slavko Pečar

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo Član: prof. dr. Peter Maček

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjiţnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.

Datum zagovora: 5. 9. 2007

Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Barbara Sobotič

(4)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dn

DK UDK 577.2:612.014:546.3(043.2)=863

KG eritrociti/človeški eritrociti/volumske spremembe/oblika eritrocitov/transport vode/

/Hg/NO/NMR/

AV SOBOTIČ,Barbara

SA LAHAJNAR, Gojmir (mentor)/PEČAR, Slavko (somentor)/MAČEK, Peter (recenzent)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo LI 2007

IN VPLIV NO IN HgCl2 NA TRANSPORT VODE IN OBLIKO HUMANEGA ERITROCITA

TD Diplomsko delo (univerzitetni študij) OP XVI, 110 str., 17 pregl., 47 sl., 185 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Ion teţke kovine Hg²⁺povzroča krčenje človeških eritrocitov. Proste tiolne (-SH) skupine, ki se nahajajo v številnih membranskih kanalčkih, so znano vezavno mesto teh –SH reaktivnih ionov. Moţna razlaga krčenja je aktivacija K⁺-selektivnega Gárdosevega kanalčka zaradi vezave iona na njegovo –SH skupino, kar povzroči iztok znotrajceličnega K⁺, ki ga spremlja osmotsko volumsko krčenje eritrocita. Hg²⁺

povzroči prehod eritrocitov iz nativne bikonkavne v ehinocitno obliko in sproţi brstenje membrane pri majhnem deleţu eritrocitov. Natrijev nitroprusid (NNP) kot donor NO v reakciji s prostimi -SH skupinami ne povzroča volumskih sprememb ali sprememb oblike eritrocita. Najverjetneje povzroči prehodno zmanjšanje difuzijske vodne permeabilnosti membrane eritrocita, ki pa jo z dano metodo nismo uspeli zanesljivo dokazati. Za študij transporta vode skozi membrano eritrocita smo uporabili pulzno metodo protonske jedrske magnetne resonance (¹H-NMR) merjenja relaksacijske funkcije M(t) transverzalne (T2) magnetizacije protonov vode, ki se izmenjuje med diamagnetnim znotrajceličnim prostorom in paramagnetno označeno (10 mM Mn²⁺) zunajcelično raztopino v vzorcih 20 % hematokrita. Izbrana NMR metoda omogoča zasledovanje časovne konstante τexch difuzijske izmenjave znotrajcelične vode in volumskega razmerja Vin/Vout znotrajcelične in zunajcelične vode eritrocitnega vzorca ter določitev ravnovesne difuzijske vodne permeabilnosti (Pd) eritrocitne membrane. Hg²⁺ je povzročil sočasno zmanjševanje τexch in Vin/Vout, kar kaţe na inducirano zmanjšanje celičnega volumna. Na sproščanje NO iz NNP sklepamo zaradi hitrega prehodnega skrajšanja T2,a protonov znotrajcelične vode zaradi paramagnetnega vpliva NO. NO je povzročil podaljšanje τexch ob konstantnem razmerju Vin/Vout, iz česar sklepamo na zmanjšanje Pd.Za študij volumskih in oblikovnih sprememb eritrocitov smo kot neodvisno metodo uporabili tudi svetlobni mikroskop.

(5)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. IV

KEY WORD DOCUMENTATION

DN Dn

DC UDK 577.2:612.014:546.3(043.2)=863

CX erythrocytes/human erythrocytes/volume changes/erythrocyte shape/water transport/ /Hg/NO/NMR/

AU SOBOTIČ,Barbara

AA LAHAJNAR, Gojmir (supervisor)/PEČAR, Slavko (co-advisor)/MAČEK, Peter (reviewer)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology PY 2007

TI VPLIV NO IN HgCl2 NA TRANSPORT VODE IN OBLIKO HUMANEGA ERITROCITA

DT Graduation Thesis (University studies) NO XVI, 110 p., 17 tab., 47 fig., 185 ref.

LA sl AL sl/en

AB The heavy metal ion Hg²⁺ induces shrinkage of human erythrocytes. These thiol-reactive ions can bind to free thiol (-SH) group, which is located on numerous membrane channels. The activation of K⁺-selective Gárdos channel by binding of Hg²⁺ on its –SH group, which leads to leakage of intracellular K⁺

and osmotic volume shrinkage, is a possible explanation for the observed cell volume decrease. Hg²⁺ causes erythrocyte transition from native biconcave to echynocyte shape and triggers membrane microvesiculation in a small portion of erythrocytes. Sodium nitroprusside (SNP) as an NO donor in the reaction with free –SH groups does not alter erythrocyte shape or volume. It most probably causes a transient decrease of the erythrocyte membrane diffusional water permeability, which we could not prove with certainty using our present method. The induced erythrocyte volume and membrane water permeability changes were deduced from variations in the measured proton nuclear magnetic resonance (¹H-NMR) transverse (T2) relaxation functions M(t) of water exchanging between the diamagnetic intracellular and paramagnetic (10 mM Mn²⁺) extracellular compartments of the 20 % hematocrit samples. This pulse NMR technique allows the determination of the time constant τexch of exchange of the intracellular water and thus of the diffusional water permeability (Pd) of the erythrocyte membrane, as well as the volume ratio Vin/Vout of intracellular and extracellular water of the erythrocyte sample. Hg²⁺ caused a simultaneous decrease of τexch and Vin/Vout, which indicates a decrease of cell volume. The release of NO from SNP is deduced from the fast transient shortening of T2,a of the intracellular water protons. NO caused lengthening of τexch at constant Vin/Vout ratio, from which a decrease in Pd was deduced. In addition, a light microscope was used as an independent method to study volume and shape changes of human erythrocytes.

(6)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III

KEY WORD DOCUMENTATION IV

KAZALO VSEBINE V

KAZALO PREGLEDNIC IX

KAZALO SLIK X

KAZALO PRILOG XIII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XIV

1 UVOD 1

1.1 NAMEN DELA IN HIPOTEZE 3

2 PREGLED OBJAV 5

2.1 SPLOŠNE LASTNOSTI ERITROCITOV 5

2.2 OBLIKA ERITROCITA 6

2.2.1 Sprememba bikonkavne oblike eritrocitov 7

2.2.1.1 Model sklopljenega lipidnega dvosloja 7

2.2.1.2 Brstenje (mikrovezikulacija) eritrocitov 9

2.3 VZDRŢEVANJE VOLUMNA ERITROCITOV 10

2.3.1 Membranski transport ionov v eritrocitih 10

2.3.1.1 Membranske črpalke 12

2.3.1.2 Prenašalci ionov skozi membrano eritrocita 12

2.3.1.2.1 Anionski izmenjevalec AE1 13

2.3.1.3 Ostali kanalčki 14

2.3.1.3.1 Gárdosev kanalček 14

2.3.1.3.2 Vodni kanalček AQP-1 15

2.3.1.3.3 Neselektivni kationski kanalčki (NSC) 16

2.4 APOPTOZA ERITROCITOV 17

2.4.1 Znotrajcelična koncentracija Ca²⁺ in asimetrija sestave lipidnega

dvosloja 18

2.4.2 Aktivacija ciklooksigenaze, nastanek prostaglandina E2 in aktivacija

neselektivnih kationskih kanalčkov 18

2.4.3 Tvorba trombocite aktivirajočega faktorja in stimulacija

sfingomielinaze 18

2.5 DELOVANJE Hg²⁺ in DUŠIKOVEGA OKSIDA (NO) 19

2.5.1 Hg²⁺ 19

2.5.1.1 Vpliv na obliko eritrocitov 20

2.5.1.2 Inhibicija encimov, kanalčkov in spremembe v citoskeletu 20

(7)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. VI

2.5.1.2.1 Blokada AQP-1 21

2.5.1.3 Aktivacija Gárdosevega kanalčka s Hg²⁺ in vloga v sproţitvi eriptoze 22 2.5.1.4 Nastanek reaktivnih oblik kisika in oksidacija membranskih lipidov 22

2.5.2 Dušikov oksid (NO) 22

2.5.2.1 Sinteza NO v telesu 23

2.5.2.2 Pretvorbe NO v telesu 23

2.5.2.2.1 Reakcije s kisikom 23

2.5.2.2.2 Reakcije s tioli 24

2.5.2.2.3 Reakcije s kovinskimi kompleksi 24

2.5.2.3 Biološka vloga v telesu 24

2.5.2.3.1 Relaksacija gladkih mišic 25

2.5.2.3.2 Spreminjanje dostopnosti NO z eritrociti 26

2.5.2.3.2.1 Reakcija NO s hemoglobinom 26

2.5.2.3.2.2 Zmanjšan privzem NO skozi eritrocitno membrano 28

2.5.2.3.3 Prenašalci NO in vivo 29

2.5.2.3.4 Vpliv NO na makroskopske lastnosti eritrocitov: agregabilnost, deformabilnost,

spremembe oblike in volumna 30

2.5.2.4 Natrijev nitroprusid 31

2.5.2.5 Nastanek reaktivnih oblik kisika in oksidacija membranskih lipidov 33

3 MATERIAL IN METODE DELA 34

3.1 MATERIAL 34

3.1.1 Priprava pufrov in drugih raztopin 34

3.1.2 Priprava eritrocitov 35

3.1.3 Priprava vzorcev 36

3.1.3.1 Vzorci za NMR meritve 36

3.1.3.1.1 Vzorci z 20 % hematokritom 36

3.1.3.1.2 Vzorec s 100 % hematokritom 36

3.1.3.1.3 Vzorec izoosmotskega pufra za eritrocite (B) ter vzorci z raztopinami NNP, KFC,

N-acetilcisteina in MnCl2 36

3.1.3.2 Vzorci za mikroskopiranje 37

3.1.3.2.1 Vzorci z 0.5 % hematokritom z MnCl2 in NNP ali HgCl2 37

3.1.3.2.2 Vzorci z 0.5 % hematokritom in NNP ali HgCl2 37

3.1.3.2.3 Vzorci z 0.5 % hematokritom z MnCl2 37

3.1.3.2.4 Vzorci z 0.5 % hematokritom v izoosmotskem pufru za eritrocite 38

3.2 METODE 38

3.2.1 Metoda pulzne jedrske magnetne resonance (NMR) 38 3.2.1.1 Študij hitrosti ravnovesne difuzijske izmenjave vode skozi eritrocitno

membrano z merjenjem transverzalne protonske NMR relaksacijske

funkcije 39

3.2.1.1.1 Difuzijska vodna permeabilnost eritrocitne membrane in τexch 42

3.2.1.2 Tehnična izvedba NMR poskusa 45

(8)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. VII

3.2.2 Mikroskopiranje 47

3.2.2.1 Tehnična izvedba mikroskopiranja 47

4 REZULTATI 49

4.1 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV 51

4.2 ANALIZA VPLIVA HgCl2 IN NNP NA τexch IN Vin/Vout Z NMR METODO 52 4.2.1 Meritve transverzalnega relaksacijskega časa protonov vode (T2) 52 4.2.1.1 Meritve T2 v diamagnetnem vzorcu s 100 % hematokritom 52 4.2.1.2 Meritve T2 v paramagnetnem vzorcu 10 mM raztopine MnCl2 53 4.2.2 Prikaz kontrolnih velikosti parametrov τexch in Vin/Vout 53 4.2.3 Slikovni prikaz vpliva HgCl2 na človeške eritrocite 55 4.2.4 Slikovni prikaz vpliva NNP na človeške eritrocite. 56

4.2.4.1 1mM NNP 56

4.2.4.2 0.5 mM NNP 58

4.2.4.3 0.25 mM NNP 60

4.2.4.4 0.1 mM NNP 62

4.2.4.5 0.05 mM NNP 64

4.2.4.6 0.025 mM NNP 65

4.2.5 Paramagnetne lastnosti NNP reakcijskih produktov 67 4.3 ANALIZA VPLIVA HgCl2 IN NNP NA VOLUMEN IN OBLIKO

ČLOVEŠKIH ERITROCITOV S SVETLOBNIM MIKROSKOPOM 68

4.3.1 1.3.1 Spremembe volumna človeških eritrocitov zaradi vpliva HgCl2 in

NNP 68

4.3.2 1.3.2. Spremembe oblike človeških eritrocitov zaradi vpliva HgCl2 in

NNP 69

4.3.2.1 Spremembe oblike človeških eritrocitov zaradi vpliva HgCl2 69 4.3.2.2 Spremembe oblike človeških eritrocitov zaradi vpliva NNP 73 4.3.2.3 Spremembe oblike človeških eritrocitov v paramagnetno označenih NMR

vzorcih 75

4.3.2.4 Spremembe oblike človeških eritrocitov zaradi pridruţenih vplivov pri

proučevanju vpliva HgCl2 in NNP pri mikroskopiranju 76

5 RAZPRAVA IN SKLEPI 80

5.1 RAZPRAVA 80

5.1.1 Uporaba pulzne metode NMR protonov vode 80

5.1.2 Uporaba mikroskopiranja 81

5.1.3 Vpliv Hg²⁺ na človeške eritrocite 81

5.1.4 Vpliv NO na človeške eritrocite 86

5.2 SKLEPI 90

6 POVZETEK 93

(9)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. VIII

7 VIRI 95

7.1 DRUGI VIRI 110

ZAHVALA

PRILOGE

(10)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. IX

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1. Vzorci z 20 % hematokritom za merjenje z NMR. 46 Preglednica 2. Vzorec s 100 % hematokritom za merjenje z NMR. 46 Preglednica 3. Vzorci za preučevanje paramagnetnih efektov NNP in njegovih

produktov za merjenje z NMR.

46

Preglednica 4. Vzorec z 10 mM MnCl₂ za merjenje z NMR. 46

Preglednica 5. Pregled vzorcev za mikroskopiranje. 48

Preglednica 6. Izmerjene velikosti T₂ na 100 % hematokritu. 53 Preglednica 7. Izmerjeni velikosti T₂raztopine 10mM MnCl₂. 53 Preglednica 8. Analiza vpliva NNP na časovno spreminjanje izmerjenega

transverzalnega relaksacijskega časa T'_2,a protonov znotajcelične vode v vzorcih 20 % hematokrita.

66

Preglednica 9. Vpliv NNP na paramagnetnost vzorca. 67

Preglednica 10. Vpliv NNP na paramagnetnost vzorca v prisotnosti –SH skupin N-acetilcisteina, v hipoosmotskem pufru za eritrocite.

67

Preglednica 11. Časovno spreminjanje premera eritrocita zaradi vpliva HgCl₂. 68 Preglednica 12. Časovno spreminjanje premera eritrocita zaradi vpliva NNP. 68 Preglednica 13. Časovno spreminjanje števila oblikovno spremenjenih eritrocitov in

deleţa eritrocitnih duhkov zaradi vpliva HgCl2.

69

Preglednica 14. Časovno spreminjanje števila brstečih eritrocitov zaradi vpliva HgCl2. 69 Preglednica 15. Časovno spreminjanje deleţa oblikovno spremenjenih eritrocitov in

deleţa eritrocitnih duhkov zaradi vpliva NNP.

73 Preglednica 16. Časovno spreminjanje deleţa oblikovno spremenjenih eritrocitov in

deleţa eritrocitnih duhkov zaradi vpliva sestavin izoosmotskega pufra za eritrocite (A).

76

Preglednica 17. Časovno spreminjanje deleţa oblikovno spremenjenih eritrocitov in deleţa eritrocitnih duhkov zaradi vpliva MnCl₂.

77

(11)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. X

KAZALO SLIK

Slika 1. Mikrografija človeških eritrocitov s prepoznavno bikonkavno obliko (http://biology.uwsp.edu/faculty/SSepsenw).

5

Slika 2. Topografska lokalizacija membranskih proteinov človeškega eritrocita in njihove povezave (De Rosa in sod., 2007).

6

Slika 3. Različne oblike eritrocitov (Svetina in sod., 2004). 8 Slika 4. A: Mikrografija eritrocitov, inkubiranih v mediju s pH≈11(Iglič in

sod.,1998). B,C,D: Mikrografija eritrocitov, inkubiranih v mediju s pH ≈ 5 (Bobrowska-Hägerstrand in sod., 1998).

10

Slika 5. Shema nekaterih transportnih poti v membrani humanega eritrocita.

(Bernhardt in Weiss, 2003; Maher in Kuchel, 2003).

11

Slika 6. Shematski povzetek prevodnostnega mehanizma kanalčka AQP-1 in

spreminjanja premera skozi poro kanalčka (de Groot in sod., 2007). 16 Slika 7. Povzetek signalnih poti in dogajanja pri eriptozi (Lang in sod., 2005). 19 Slika 8. Shematski prikaz bakterijskega kanalčka AqpZ (Savage in Stroud,

2007).

22

Slika 9. Shematski prikaz pretvorb NNP v oksičnih in anoksičnih pogojih v prisotnosti tiolov (Wang in Ting, 2005).

32

Slika 10. Shematski prikaz pretvorbe NNP v sesalskem tkivu (Wang in Ting, 2005).

32

Slika 11. Shematski prikaz pretvorbe NNP (Grossi in D'Angelo, 2005). 33 Slika 12. Primer protonske NMR transverzalne relaksacijske funkcije M(t) vode

v vzorcu paramagnetno označene suspenzije govejih eritrocitov (Lahajnar, 1992).

42

Slika 13. Prikaz merilnega signala NMR spektrometra za vzorce z različnimi raztopinami.

50

Slika 14. Prikaz merilnega signala NMR spektrometra za vzorce z ≈ 100 % hematokritom.

50

Slika 15. Prikaz merilnega signala NMR spektrometra za vzorce z 20 % hematokritom, ki so zunajcelično paramagnetno označeni z 10 mM raztopino MnCl₂.

51

Slika 16. Časovna so-odvisnost kontrolnih parametrov τ_exch(A) in V_in/V_out (B) v paramagnetno označenem vzorcu z 20 % hematokritom več krvodajalcev v času od 23.2. do 30. 5. 2007.

54

(12)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. XI

Slika 17. Vpliv 1 mM HgCl2 na časovno konstanto τexch difuzijske vodne izmenjave znotrajcelične vode v zunajcelično paramagnetno označenem vzorcu z 20 % hematokritom.

55

Slika 18. Vpliv 1 mM HgCl₂ na razmerje med znotraj- in zunajceličnim volumnom vode V_in/V_out v zunajcelično paramagnetno označenem vzorcu z 20 % hematokritom.

55

Slika 19. Vpliv 1 mM NNP na izmerjen transverzalni relaksacijski čas protonov znotrajcelične vode (T'_2,a).

56

Slika 20. Vpliv 1 mM NNP na razmerje med znotraj- in zunajceličnim volumnom vode V_in/V_out v suspenziji eritrocitov.

57

Slika 21. Vpliv 0.5 mM NNP na izmerjen transverzalni relaksacijski čas protonov znotrajcelične vode (T'_2,a).

58

Slika 22. Vpliv 0.5 mM NNP na razmerje med znotraj- in zunajceličnim volumnom vode V_in/V_out v suspenziji eritrocitov.

59

60

61

62

63

Slika 27. Vpliv 0.05 mM NNP na izmerjen transverzalni relaksacijski čas protonov znotrajcelične vode (T'2,a).

64

Slika 28. Vpliv 0.05 mM NNP na razmerje med znotraj- in zunajceličnim volumnom vode Vin/Vout v suspenziji eritrocitov.

64 Slika 29. Vpliv 0.025 mM NNP na izmerjen transverzalni relaksacijski čas

protonov znotrajcelične vode (T'_2,a).

65

Slika 31. Mikrografija 0.5 % hematokrita v izoosmotski raztopini NaCl, po 20 minutah (kontrola).

70

Slika 32. Mikrografija 0.5 % hematokrita v izoosmotski raztopini NaCl, po 60 minutah (kontrola).

70

Slika 33. Mikrografija 0.5 % hematokrita z 25 μM HgCl₂ po 20 minutah. 71

(13)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. XII

Slika 34. Mikrografija 0.5 % hematokrita z 25 μM HgCl₂ po 60 minutah. 71 Slika 35. Mikrografija 0.5 % hematokrita z 25 μM HgCl₂ po 60 minutah. 72 Slika 36. Mikrografija 0.5 % hematokrita z 0.1 mM HgCl₂ po 45 minutah. 72 Slika 37. Mikrografija 0.5 % hematokrita z 0.1 m M HgCl₂ po 45 minutah. 73 Slika 38. Mikrografija 0.5 % hematokrita z 0.25 μM NNP po 20 minutah. 74 Slika 39. Mikrografija 0.5 % hematokrita z 0.25 μM NNP po 60 minutah. 74 Slika 40. Mikrografija NMR vzorca kontrole, redčenega na 0.5 % hematokrit z

izoosmotskim pufrom za eritrocite (A), po 20 minutah.

75

Slika 41. Mikrografija NMR vzorca z dodanim 1mM HgCl₂, redčenega na 0.5 % hematokrit z izoosmotskim pufrom za eritrocite (A), po 20 minutah.

75

Slika 42. Mikrografija NMR vzorca z 1mM NNP, redčenega na 0.5 % hematokrit z izoosmotskim pufrom za eritrocite (A), po 20 minutah.

76

Slika 43. Mikrografija 0.5 % hematokrita z 0.25 mM MnCl2, po 20 minutah. 77 Slika 44. Mikrografija 0.5 % hematokrita v v izoosmotski raztopini NaCl takoj

po pripravi.

78

Slika 45. Mikrografija 0.5 % hematokrita v izoosmotski raztopini NaCl po 10

minutah osvetljevanja. 78

Slika 46. Mikrografija 0.5 % hematokrita v izoosmotski raztopini NaCl takoj po pripravi.

79

Slika 47. Mikrografija 0.5 % hematokrita v izoosmotskem pufru za eritrocite (A) takoj po pripravi.

79

(14)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. XIII

KAZALO PRILOG

PRILOGA 1. Teoretične osnove NMR

PRILOGA 2. Velikosti ∆τ_exch, ∆V_in/V_out , ∆V_eritrocit in ∆pA za zunajcelično paramagnetno označene vzorce z 20 % hematokritom in 1 mM HgCl₂.

PRILOGA 3. Prikaz izmerjenega T'_2,a na vzorcu z 20 % hematokritom in 0.25 mM NNP.

PRILOGA 4. Prikaz izmerjenega T'_2,a na vzorcu z 20 % hematokritom in 0.1 mM NNP.

(15)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. XIV

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

Å Ångström; 1 Å = 10^-10 m = 0.1 nm AE1 anionski izmenjevalec-1

PKB proteinska kinaza B

Ala alanin

Arg arginin

ar/R restrikcijska regija v pori akvaporina-1 z aromatsko aminokislino in argininom

Asn asparagin

AQP-1 vodni kanalček-1 (akvaporin-1) ATP adenozin trifosfat

ΔA razlika med površinama zunanjega in notranjega sloja membrane eritrocita ΔA0 razlika med sproščenima površinama zunanjega in notranjega sloja

membrane eritrocita

ΔpA izračunan hipotetični upad difuzijske vodne permeabilnosti βCys93

BH4

cistein 93 v beta podenoti hemoglobina (6R)-5,6,7,8-tetrahidrobiopterin

cGMP ciklični gvanozin monofosfat cNOS konstitutivna NO sintaza GTP gvanozin trifosfat

CPMG Carr-Purcell-Meiboom-Gill

Cys cistein

deoksiHb deoksihemoglobin

DIDS diizotiocianostilben sulfonska kislina DNK deoksiribonukleinska kislina

EDRF od endotelija odvisni vazodilatacijski dejavnik (ang. endothelial-derived relaxing factor)

EDTA etilendiamintetraacetat eNOS endotelijska ˙NO sintaza FAD flavindinukleotid

FID upad signala proste precesije (ang. Free Induction Decay)

GSH glutation

Hb hemoglobin

Hb-Fe-NO nitrozil hemoglobin Hb-SNO S-nitrozohemoglobin

His histidin

KCC K⁺-Cl^- kotransporter iNOS inducibilna ˙NO sintaza

kD kilodalton, 1000 daltonov; dalton je definiran kot masa nevezanega atoma vodika ²H v osnovnem stanju; D ≈ 1.66 × 10⁻²⁴g

(16)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. XV

KFC

L kalijev fericianid (K3[Fe(CN)6]) liter

M molarnost, mol/L

M(t) relaksacijska funkcija transverzalne (T2) magnetizacije protonov vode metHb methemoglobin

MHz megahertz, 10⁶ Hz

mL mililiter

mM milimolarnost, mmol/L

mol enota za količino snovi (1 mol je količina elementa ali spojine, ki ustreza relativni atomski ali molekulski masi, izraţeni v gramih)

mOsm miliosmolarnost; mosmol/L NADPH adenindinukleotid fosfat NKCC Na⁺-K⁺-2Cl^- kotransporter nM nanomolarnost, nmol/L nm nanometer

NMR jedrska magnetna resonanca (ang. nuclear magnetic resonance) NNP natrijev nitroprusid, Na2[Fe(CN)5NO].2H20

NO radikal dušikovega oksida (˙NO) NOS ˙NO sintaza

nNOS nevronska ˙NO sintaza

NPA motiv treh aminokislin, asparagina, prolina in alanina, v pori akvaporina-1 NSC neselektivni kationski kanalčki

obr./min obrati na minuto oksiHb oksihemoglobin

Pa deleţ celokupnega protonskega NMR signala znotrajcelične vode (okolje a)

Pb deleţ celokupnega protonskega NMR signala zunajcelične vode (okolje b) P'a/P'b navidezno razmerje med deleţem celokupnega protonskega NMR signala

znotrajcelične vode (okolje a) in deleţem celokupnega protonskega NMR signala zunajcelične vode (okolje b)

PAF trombocite aktivirajoči faktor (ang. platelet activation factor) pCMB parakloromerkuribenzoid

pCMBS parakloromerkuribenzen sulfonat

Pd difuzijska vodna permeabilnost oz. koeficient difuzijske vodne permeabilnosti

PE fosfatidiletanolamin PGE2 prostaglandin E2

pH negativni desetiški logaritem efektivne koncentracije H⁺ Phe fenilalanin

PLA2 fosfolipaza A2

(17)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. XVI

Pro prolin

PS fosfatidilserin

rad radian; enota za merjenje kota (1 rad = 57,4 °)

rf radiofrekvenčni

ROS reaktivne oblike kisika (ang. reactive oxygen species) RPV regulativno povečanje celičnega volumna

RZV regulativno zmanjšanje celičnega volumna s površina eritrocita

SH tiolna oz. sulfhidrilna skupina SNP ang. sodium nitroprusside SOD superoksidna dismutaza

T2 časovna konstanta: spin-spinski ali transverzalni relaksacijski čas

T2,a časovna konstanta: spin-spinski ali transverzalni relaksacijski čas protonov znotrajcelične vode v NMR vzorcu

T2,b časovna konstanta: spin-spinski ali transverzalni relaksacijski čas protonov zunajcelične vode v NMR vzorcu

T'2,a izmerjena časovna konstanta: spin-spinski ali transverzalni relaksacijski čas protonov znotrajcelične vode v NMR vzorcu

tGC topna guanilat ciklaza

TNF tumorje nekrotizirajoči faktor (ang. tumor necrosis factor) TRIS HCl tris (hidroksimetil) aminometan (2–amino–2-(hidroksimetil)-1,3-

propandiol) z dodatkom kisline HCl v volumen znotrajcelične vode eritrocita v/v volumsko razmerje

Vin/Vout razmerje znotrajcelične in zunajcelične vode eritrocitnega vzorca

μL mikroliter

τexch časovna konstanta difuzijske izmenjave znotrajcelične vode skozi membrano eritrocita

(18)

Sobotič B. Vpliv NO in HgCl2 na transport vode in obliko humanega eritrocita. 1

1 UVOD

Uravnavanje celičnega volumna je osnovna funkcija, ki so jo celice razvile in ohranile v teku evolucije. Vsakršna sprememba v znotrajcelični ali zunajcelični osmolarnosti vpliva na celični volumen zaradi hitrega osmotsko induciranega prehajanja vode skozi celično membrano.

Celice so zato razvile mehanizme, s katerimi lahko prilagajajo znotrajcelično osmolarnost in tako vzdrţujejo konstantni celični volumen. V procesu uravnavanja znotrajceličnega volumna so najpomembnejši ioni, saj le-ti ob nenadni spremembi zunajcelične osmolarnosti prispevajo kar dve tretjini aktivnosti, bodisi z izstopom iz celice ali vstopom vanjo. V normalnih eritrocitih sesalcev, na primer, okrog 70 % znotrajceličnega volumna zavzema voda; vsakršna sprememba celičnega volumna je torej povezana s prehajanjem vode skozi celično membrano (Lang in sod., 1998).

Za razumevanje procesa uravnavanja celičnega volumna in transporta vode je pomembno poznavanje transportnih poti v celični membrani. Največje število študij membranskih transportnih poti je bilo izvedenih na membrani eritrocita. Eritrociti so visoko specializirane celice, ki so zaradi svoje relativno preproste strukture in lahke dostopnosti med najbolje raziskanimi celicami. V fizioloških pogojih (pH 7.4, ~ 330 mOsm) imajo človeški eritrociti obliko bikonkavnega diska. Odvisno od lastnosti okolice in svojega metabolizma pa lahko zavzamejo različne oblike in velikosti. Zaradi vsega naštetega je eritrocit modelna celica za številne tovrstne raziskave.

Plazmatske membrane vseh celic so do neke mere prepustne za vodo kot rezultat počasne difuzije individualnih molekul skozi lipidni dvosloj. Na koncu petdesetih let prejšnjega stoletja so naleteli na zelo zanimiv fenomen pri preučevanju vodne permeabilnosti membran človeških eritrocitov. Odkrili so, da je neravnovesni difuzijski (osmotski) transport vode skozi membrane eritrocitov v anizoosmotskih pogojih do šestkrat večji kot ravnovesni difuzijski transport vode v izoosmotskih pogojih, slednji pa je bil dvakrat večji kot ravnovesni difuzijski transport vode skozi umetni lipidni dvosloj (Paganeli in Solomon, 1957; Sidel in Solomon, 1957; Moura in sod., 1984).

Rešitev te uganke se je ponudila, kot je v znanosti pogosto, naključno, ko je skupina Agreja in sod. leta 1988 izolirala do takrat še neznan 28 kD velik protein, ki so ga poimenovali CHIP28 (channel-like-integral-protein 28) (Preston in sod., 1993). Kasneje se je izkazalo, da je ta najdba odgovor na vprašanje o poteh transporta vode preko membrane. Šlo je namreč za prvi izolirani specializirani vodni kanalček – akvaporin 1 ali

(19)

AQP-1, ki je odgovoren za izključni in obojesmerni transport molekul vode preko membrane.

Difuzija ne ustvarja neto toka preko membrane in je proces ravnovesnega izoosmotskega okolja. Polovica ravnovesne difuzijske vodne permeabilnosti membran eritrocitov gre na račun AQP-1, drugo polovico pa prispeva prehod vode preko lipidnega dvosloja (Macey in Farmer, 1970). S tem lahko razloţimo dvakrat večjo ravnovesno difuzijsko permeabilnost membrane eritrocitov v primerjavi z umetnimi lipidnimi membranami.

V primeru transmembranskega osmotskega neravnovesja voda skozi membrane prehaja z osmozo. Za neto tok skozi membrano eritrocitov je odgovorno gibanje molekul vode skozi akvaporine. Tako je neravnovesna difuzijska (osmotska) permeabilnost membrane eritrocitov šestkrat večja od njihove ravnovesne difuzijske permeabilnosti. Njihova neravnovesna difuzijska permeabilnost pa je desetkrat večja od neravnovesne difuzijske permeabilnostji umetnih lipidnih dvoslojev, kjer ni neto toka skozi membrano, saj sta ravnovesna in neravnovesna difuzijska permeabilnost sta enaki.

Po odkritju prvega akvaporina so začeli iskati njegove blokatorje. Ker ima v oţini kanalčka izpostavljeno –SH skupino cisteina 189, se kot kandidati ponujajo –SH reaktivni reagenti. Ţivosrebrovi organski spojini p-kloromerkuribenzoat (pCMB) in p- kloromerkuribenzen sulfonat (pCMBS) sta do danes edina znana učinkovita blokatorja AQP-1 posredovanega vodnega transporta v človeških eritrocitih (Browning in Wilkins, 2003).

Druga –SH reagenta sta na primer ion Hg²⁺ in radikal ˙NO (dalje NO). Če se morda zdi, da je o prvem ţe mnogo znanega, je pa NO pravi »grdi raček« majhnih signalnih molekul, ki mu do devetdesetih let prejšnjega stoletja niso pripisovali nobene vloge v človeškem telesu. Danes vemo, da je kratkoţiva signalna molekula, ki sodeluje v številnih fizioloških procesih. Lahko reagira s kisikom, superoksidom in drugimi radikali, kot tudi s tioli in kovinskimi kompleksi, najpomembnejši med njimi so hemski obroči (Lancaster, 2000).

Ob spremenitvi v »belega laboda« pa se mu odpira ne le vloga v kardiovaskularnem sistemu, kjer je bil prvič opisan, ampak tudi v ţivčnem, gastrointestinalnem in urogenitalnem sistemu.

Podobno kot je bila uganka o akvaporinih dolgo časa nerešena, tudi NO čaka na svojo razrešitev. NO je bil v človeškem telesu prvič prepoznan kot EDRF (od endotelija odvisni vazodilatacijski dejavnik, ang. endothelial-derived relaxing factor), ki ga izloča endotelij ţil in povzroči relaksacijo gladkih mišic in s tem padec krvnega tlaka. Za njegovo odkritje je bila leta 1998 podeljena tudi Nobelova nagrada za medicino. Zaradi njegove kratke ţivljenjske dobe v krvoţilju (izredno hitro reagira s hemoglobinom v eritrocitih) še vedno

(20)

ostaja nejasno, kako NO prispe do gladkih mišic, kateri prenašalci NO aktivnosti so v to vpleteni in kako so med seboj povezani.

Natrijev nitroprusid (NNP) je NO donor, ki je bil v uporabi kot vazodilatator ţe dolgo časa pred spoznanjem o vlogi NO v telesu. Kljub novim odkritjem mehanizem njegovega delovanja še vedno ni natanko pojasnjen in čaka nova srečna naključja.

Za zasledovanje vpliva Hg²⁺ (v obliki HgCl2) in NO (iz NNP) na transport vode in obliko humanega eritrocita je na voljo večje število metod. Mi smo se odločili, da bomo za študij transporta vode preko membrane eritrocitov uporabili merjenje transverzalne protonske magnetizacije s pulzno metodo jedrske magnetne resonance (NMR) protonov znotrajcelične vode. Metoda omogoča neinvazivno zasledovanje spremembe časovne konstante difuzijske izmenjave znotrajcelične vode, kot tudi zasledovanje volumskih sprememb eritrocitov preko merjenja spremembe razmerja med znotraj- in zunajcelično mnoţino vode. Kot pomoč pri interpretaciji rezultatov smo si pomagali z opazovanjem eritrocitov pod svetlobnim mikroskopom, kar nam je omogočilo tudi zasledovanje vpliva Hg²⁺ in NO na obliko človeških eritrocitov.

1.1 NAMEN DELA IN HIPOTEZE

Delovna hipoteza diplomske naloge, zasnovana na podlagi znanih izsledkov iz strokovne literature o delovanju iona Hg²⁺ in radikala NO na transport vode in obliko človeškega eritrocita, je naslednja:

 Z neposredno aktivacijo od Ca²⁺ odvisnega K⁺-kanalčka (Gárdosevega kanalčka) lahko Hg²⁺ povzroči povečan iztok znotrajceličnih ionov K⁺ in s tem osmotsko inducirano volumsko krčenje eritrocita.

 Hg²⁺z vezavo na Cys189 akvaporina AQP-1 v oţini pore lahko blokira kanalček.

 Reakcija Hg²⁺ s sulfhidrilnimi (-SH) skupinami citoskeleta, ki povzroči prečne povezave tipa -S-Hg-S- in hkratna inkorporacija Hg²⁺v zunanji del lipidnega dvosloja, lahko izzove brstenje membrane.

 Uporabljene koncentracije ionov morda zadoščajo za sproţitev apoptoze človeškega eritrocita (eriptoze). Znano je, da je spremenjeno delovanje Gárdosevega kanalčka del mehanizma apoptoze, ki se kaţe v nepovratnem zmanjševanju celičnega volumna in brstenju membrane.

(21)

 Produkti oksidacije NO lahko reagirajo z štirimi cisteinskimi ostanki v AQP-1 (predvsem Cys189) in tako s tvorbo nitrozotiolov začasno blokirajo kanalček.

 Ker je radikal NO paramagnetna molekula, lahko njeno sproščanje iz natrijevega nitroprusida v eritrocitni suspenziji dobro zasledujemo z NMR tehniko in s tem dokaţemo njeno od svetlobe neodvisno sproščanje.

 NO naj ne bi imel vpliva na obliko in volumen človeškega eritrocita.

(22)

2 PREGLED OBJAV

2.1 SPLOŠNE LASTNOSTI ERITROCITOV

Zreli eritrociti sodijo v zvrst najbolj visoko specializiranih celic. Njihova najpomembnejša vloga je prenos kisika iz pljuč do tkiv in odvajanje ogljikovega dioksida, ki nastane ob celičnem dihanju. Zaradi odsotnosti citoplazemskih organelov in jedra v eritrocitih ni proteinske sinteze, reakcij dihalne verige in celične delitve.

V mirujočem stanju ima eritrocit obliko bikonkavnega diska (Slika 1). Okoli 95 % eritrocitov ima volumen med 60 in 120 μm³ in povprečni premer od 7.2 do 7.4 µm (Wiggers, 2003).

Ţivljenjska doba eritrocitov je omejena. V povprečju ţivi posamezen eritrocit v krvnem obtoku do 120 dni. Ostareli eritrociti se fagocitirajo v vranici. Ţelezo iz hemoglobina se reciklira in porabi pri sintezi novih molekul hemoglobina (Halliwell in Gutteridge, 1999).

Slika 1. Mikrografija človeških eritrocitov s prepoznavno bikonkavno obliko.

(http://biology.uwsp.edu/faculty/SSepsenw)

Sestava nepoškodovanih eritrocitov je naslednja (Yawata, 2003):

 voda (721 ± 17 mg/mL eritrocitov),

 proteini (371 mg/mL eritrocitov), od tega

 hemoglobin (335 mg/mL eritrocitov ali 280 milijonov molekul Hb na celico),

 lipidi (5.1 mg/mL eritrocitov) in

 ogljikovi hidrati (80 mg/mL eritrocitov).

Hemoglobin predstavlja več kot 95 % vseh proteinov v eritrocitu in je odgovoren za prenos kisika in ogljikovega dioksida. V citosolu poteka glikoliza in pentoza fosfatna pot za pridobivanje ATP in redukcijskega potenciala, saj je prav vzdrţevanje nativne oblike eritrocita energijsko zelo zahteven proces (Yawata, 2003).

(23)

Citoskeletno mreţo eritrocitov, odgovorno za vzdrţevanje nativne oblike celice, sestavlja preplet proteinskih molekul spektrina in aktina, ki je na citosolni strani tik pod lipidnim dvoslojem. Povezavo celične membrane in citoskeletnih proteinov omogočajo sidrni proteini (palidin, ankirin, band 4.1), ki povezujejo spektrine in aktin s citoplazemsko domeno anionskega izmenjevalca AE1 in glikoforinov (Slika 2) (De Rosa in sod., 2007).

Slika 2. Topografska lokalizacija membranskih proteinov človeškega eritrocita in njihove povezave (De Rosa in sod., 2007).

2.2 OBLIKA ERITROCITA

Nenavadna bikonkavna, diskasta oblika eritrocitov sesalcev je vse od odkritja mikroskopa vzbujala zanimanje številnih raziskovalcev z različnih področij, od teoretične fizike do klinične medicine. Eritrociti nimajo notranje strukture, zato njihovo obliko določajo fizikalne lastnosti membrane in celični volumen (Svetina in sod., 2004.) Membrano sestavljata dva esencialna dela: lipidni dvosloj in membranski citoskelet, ki je pritrjen na notranji sloj membrane. Elastične lastnosti membrane in citoskeleta tako vplivajo na oblikovne spremembe kot tudi na odzivanje na zunanji stres, kar opišemo kot deformabilnost eritrocitov.

Oblika eritrocitov je prilagojena njihovi najpomembnejši funkciji - prenosu kisika in ogljikovega dioksida. Ugodno razmerje med velikostjo površine eritrocita in njegovo prostornino omogoča olajšan prenos plinov skozi celično membrano ter laţje premikanje eritrocitov po krvnem obtoku. Eritrociti se ob prerivanju skozi kapilare občutno deformirajo, a se kmalu po prehodu povrnejo v prvotno normalno obliko, ne da bi se ob tem izgubila njihova integriteta. Pravimo, da so eritrociti dobro deformabilni. Sposobnost spreminjanja oblike jim omogoča laţje premikanje po kapilarah, navkljub visokemu nativnemu hematokritu (okoli 44 %) (Deuticke, 2003; Yawata, 2003).

(24)

2.2.1 Sprememba bikonkavne oblike eritrocitov

Spremenjena oblika eritrocitov je lahko posledica dejavnikov, ki so vzrok ali povod sprememb v celičnem volumnu, ali posledica sprememb oblike v odsotnosti celičnih volumskih sprememb (Deuticke, 2003).

V fizioloških pogojih eritrociti vzdrţujejo nekroglasto, nativno bikonkavno obliko.

Predpogoj vseh nekroglastih celic je prebitek celične površine, ustvarjen z aktivnim izčrpavanjem ionov in vode. Količina znotrajcelične tekočine je edini citoplazemski parameter, ki neposredno določa celični volumen normalnih eritrocitov sesalcev. Ostale sestavine citoplazme, kot so ATP, kationi ali H⁺, ga določajo posredno, bodisi z nadzorom mehanizmov za vzdrţevanje celičnega volumna ali z modifikacijo celične membrane ali citoskeleta.

Povečevanje celičnega volumna ob nespremenjeni velikosti celične površine ali zmanjšanje površine celice ob nespremenjenem znotrajceličnem volumnu vodi do izgube značilne bikonkavne oblike eritrocita. Končni rezultat obeh procesov je nastanek sferocitne (kroglaste) oblike eritrocitov (Deuticke, 2003). Drugi tip sprememb oblike eritrocitov je posledica dejavnikov, ki ne spremenijo znotrajceličnega volumna. Oblikovne spremembe tega tipa so posledica sprememb celične membrane in citoskeleta. Tovrstne spremembe oblike včasih vodijo do sprememb v celičnem volumnu, kar razmejuje opisano razdelitev oblikovnih sprememb. Predstavnici tega tipa sprememb oblike sta ehinocitna in stomatocitna oblika, imenovani tudi bodičasta in čašasta oblika (Deuticke, 2003).

2.2.1.1 Model sklopljenega lipidnega dvosloja

Pojav ehinocitnih in stomatocitnih oblik eritrocita razlaga hipoteza t.i. sklopljenega lipidnega dvosloja (ang. bilayer couple hypothesis), ki sta jo postavila Sheetz in Singer (1974). Hipoteza razlaga izovolumske spremembe oblike eritrocitov zaradi asimetričnih sprememb med površinama lipidnih slojev v membrani. Lipidna sloja sta povezana s hidrofobnimi interakcijami, ki ju drţijo skupaj. Pravimo, da sta sloja sklopljena, vendar se ob lateralnih pritiskih lahko sprostita neodvisno drug od drugega. Mehanska odzivnost fosfolipidnega dvosloja je odvisna od ekspanzivnosti dvosloja in njegove lokalne in nelokalne ukrivljenosti. Ker je energija, ki bi bila potrebna za kompresijo dvosloja nekaj redov večja kot energija za njegovo ukrivitev velja, da je površina med spremembami oblike konstantna.

(25)

Slika 3. : Različne oblike eritrocitov. Razlika med površino zunanjega in notranjega dela lipidnega dvosloja (ΔA) narašča od leve proti desni. A: stomatocit, B: diskocit, C: ehinocit I, D: ehinocit III.

E,F,G,H: za primerjavo različne oblike fosfolipidnih veziklov ob enakih pogojih kot zgoraj prikazani eritrociti (Svetina in sod., 2004).

Spremembe eritrocitov tipa diskocit-stomatocit (Slika 3A), lahko primerjamo z oblikovnimi spremembami fosfolipidnih veziklov (Slika 3E). Eritrocitni prehod iz diskoidne v stomatocitno obliko je identičen z ustrezajočo spremembo fosfolipidnih veziklov. Spremembo lahko interpretiramo kot zmanjšanje razlike med površino zunanjega in notranjega sloja membrane. Citoskelet ne igra vloge pri nastanku stomatocitov, saj se poloţaj citoskeletnih elementov v stomatocitu ne razlikuje dosti od poloţaja v diskocitu (Svetina in sod., 2004).

Citoskelet je dvodimenzionalna struktura, ki se lahko premika le lateralno. Vpliv viskoelastičnih lastnosti citoskeleta je viden, kadar je razlika med površinama zunanjega in notranjega sloja (ΔA ) večja od razlike med površinama sproščenih dvoslojev (ΔA0). V tem primeru eritrociti ne sledijo oblikovnim spremembam fosfolipidnih veziklov (Slika 3G, 3H), ki tvorijo povezane sferične oblike, ampak nastanejo ehinociti (Slika 3C, 3D).

Prispevek citoskeleta je zelo pomemben pri velikih deformacijah, kot je nastanek ehinocitov, saj je odziv citoskeleta nelinearen in se močno poveča ob velikih pritiskih.

Tako se morajo relativno ploščati deli citoskeleta ukriviti v notranjost bodic ehinocita. Za stabilno formacijo bodic moramo upoštevati tako elastičnost citoskeleta kot elastičnost membranskega dvosloja (Svetina in sod., 2004).

Po modelu sklopljenega lipidnega dvosloja lahko vse snovi, ki se vgrajujejo v lipidno membrano, spremenijo obliko eritrocita. Kationske spojine se zlahka kopičijo v notranjem

A B C D A B C D

E F G H

(26)

negativno nabitem sloju, anionske spojine pa v zunanjem nevtralnem sloju. Klorpromazin, vinblastin, saponin, etanol, Ca²⁺, idr. so znani povzročitelji ehinocitoze. Stomatocitne oblike pa povzročajo fosfatidilholin, holična kislina, Triton-X, idr. Obliko lipidnega dvosloja eritrocitov znatno spremeni ţe majhna sprememba v velikosti notranje ali zunanje površine sloja (manj kot 0.4 %) (Sheetz in Singer, 1974; Deuticke, 2003; Yawata, 2003; Svetina in sod., 2004).

Model sklopljenega lipidnega dvosloja predstavlja osnovo mnogim novejšim hipotezam o pojavu ehinocitnih in stomatocitnih oblik (Gimsa in Ried, 1995; Gedde in Heustis, 1997;

Gimsa, 1995,1998; Glaser, 1998; Rasia in Bollini, 1998; Tachev in sod., 2004; Betz in sod., 2006).

Spremenjene oblike eritrocitov imajo manjšo deformabilnost od diskocitov (Gimsa in Ried, 1995).

2.2.1.2 Brstenje (mikrovezikulacija) eritrocitov

Brstenje eritrocitov je bilo opaţeno pod določenimi eksperimentalnimi pogoji. Do njega pride najverjetneje zaradi povečanja razlike med površinama zunanjega in notranjega sloja (ΔA). Nastali brsti večinoma ne vsebujejo spektrina in aktina. Motnja v povezavah med citoskeletom in lipidno membrano je glavna značilnost brstenja eritrocitov (Iglič in sod., 1998).

Zniţanje znotrajceličnega pH, zaradi inkubacije v mediju z nizkim pH, zmanjša ΔA, kar privede do nastanka stomatocitov. Sledeča agregacija citoskeleta in s tem hipno zmanjšanje površine relaksiranega citoskeleta lahko povzroči nezvezne prehode od stomatocitne k sferični obliki s hčerinskimi celicami (Bobrowska-Hägerstrand in sod., 1998).

Eritrociti, ki jih prenesemo iz nevtralnega medija v medij z visokim pH (pH≈11), tvorijo populacijo sferičnih celic z eno ali več manjših sferičnih hčerinskih celic pribliţno enake velikosti (Iglič in sod., 1998). Zvišanje znotrajceličnega pH po doslej še nepoznanem mehanizmu poveča ΔA. Ker pride zaradi povišanega pH do prekinitve stikov med lipidi in citoskeletom, se lipidni sloj obnaša kot lipidni vezikli in tvori mikrosfere (Iglič in sod., 1998).

Brstenje membrane nastopi tudi ob fosforilaciji tirozina anionskega izmenjevalalca (AE1) (Minetti in sod., 2004), ob aktivaciji Gárdosevega kanalčka ali ob porasti znotrajcelične koncentracije Ca²⁺(Lang in sod., 2005). To povzroči povečan iztok ionov K⁺, krčenje in

(27)

sproščanje brstov (mikroveziklov). Brstenje membrane spremlja proces programirane celične smrti (eriptoza) (Lang in sod., 2005).

Slika 4. : A: Mikrografija eritrocitov, inkubiranih v mediju s pH≈11 (Iglič in sod., 1998). B,C,D:

Mikrografija eritrocitov, inkubiranih v mediju s pH ≈ 5 (Bobrowska-Hägerstrand in sod., 1998).

2.3 VZDRŢEVANJE VOLUMNA ERITROCITOV

Za vzdrţevanje konstantnega volumna so celice razvile mnogo regulatornih mehanizmov.

Ob vsaki spremembi celičnega volumna se ti mehanizmi aktivirajo in uravnajo volumen na normalno velikost. V citosolu eritrocitov se nahajajo anionske makromolekule (proteini, organski fosfati, idr.), ki jih membrana ne prepušča. Te molekule ustvarjajo Donnanov efekt. Ob spremembi zunajcelične ali znotrajcelične osmolarnosti, inducirani transmembranski tok vode povzroči nabrekanje ali krčenje eritrocitov. Vzpostavitev normalnega volumna se zagotavlja s transportom ionov skozi ionske kanalčke, s pomočjo ionskih prenašalcev ali črpalk. Med vsemi ionskimi transportnimi sistemi je najpomembnejša Na⁺/K⁺ črpalka, ki v največji meri uravnava transmembranske gradiente ionov. S tem se vzpostavi usmerjen tok vode, ki uravna volumen celice na normalno velikost (Sardini in sod., 2003).

V hipotoničnem mediju začnejo eritrociti nabrekati. To je signal za vključitev mehanizmov za zmanjšanje celičnega volumna, kar imenujemo regulatorno zmanjšanje celičnega volumna ali RZV. Mehanizem RZV deluje, dokler se celični volumen ne pribliţa normalni, optimalni velikosti. Krčenje eritrocitov (npr. v hipertoničnem mediju) aktivira drug niz mehanizmov za povečevanje celičnega volumna do normalne velikosti, ki se imenuje regulatorno povečanje celičnega volumna ali RPV (Lang in sod., 1998;

Wehner in sod., 2003).

2.3.1 Membranski transport ionov v eritrocitih

Ena od značilnosti celic je neenakomerna porazdelitev anorganskih ionov med zunajceličnim prostorom in notranjostjo celice. Taka porazdelitev je bistvena za

A B C D

(28)

uravnavanje celičnih metabolnih procesov in procesov prenosa celičnih signalov.

Vzdrţevanje znotrajceličnih koncentracij ionov, kot tudi celičnega volumna, temelji na povezanem delovanju aktivnih in pasivnih transportnih procesov.

Koncentracije ionov v citoplazmi eritrocitov in krvni plazmi so različne. V krvni plazmi zdravih ljudi prevladujejo ioni Na⁺ (140 mM) in Cl^-(110mM), sledijo ioni K⁺ (5 mM) in Ca²⁺ (1.5 mM). Znotraj eritrocita so koncentracije teh ionov drugačne, prevladujejo ioni K⁺(140 mM), sledijo ioni Na⁺ (10 mM) in Cl^-(2 mM) ter Ca²⁺ (60 nM) (Apps in sod., 1992). Za vzdrţevanje stalnih transmembranskih ionskih gradientov in stalnega celičnega volumna so v membrani eritrocita posebni sistemi (Yawata, 2003), to so:

 membranske črpalke za aktivno izčrpavanje ionov,

 prenašalci za prenos topljencev skozi membrano in

 ostali kanalčki (vodni kanalček, Gárdosev kanalček in neselektivni kationski kanalčki).

Slika 5. Shema nekaterih transportnih poti v membrani humanega eritrocita: 1: Na⁺-K⁺ črpalka, 2: Na⁺-K⁺-2Cl^- kotransporter, 3: K⁺-Cl^- kotransporter, 4: glukozni prenašalec, 5: vodni kanalček

(AQP-1), 6: Na⁺/Mg²⁺ izmenjevalec, 7: Na⁺/H⁺ izmenjevalec, 8: anionski (HCO3-/Cl^-) izmenjevalec (AE1), 9: K⁺(Na⁺)/H⁺ izmenjevalec, 10: Ca²⁺-črpalka, 11: neselektivni kationski kanalček in 12: Gárdosev kanalček (Bernhardt in Weiss, 2003; Maher in Kuchel, 2003).

2 Cl^-

Cl^-

(29)

2.3.1.1 Membranske črpalke

Znani sta dve od ATP odvisni kationski črpalki, ki v notranjosti celice vzdrţujeta nizke koncentracije Na⁺ in Ca²⁺ ter visoke koncentracije K⁺ s črpanjem ionov v nasprotni smeri njihovih elektrokemijskih gradientov. Za ta energetsko neugoden proces koristita energijo hidrolize ATP.

Ena je Na⁺-K⁺-ATPaza ali Na⁺-K⁺-črpalka (Slika 5 (1)). Ta izčrpava ione Na⁺ iz celice v zameno za K⁺, in sicer v razmerju 3 : 2 (Sachs, 2003). Na⁺-K⁺-ATPaza z izčrpavanjem Na⁺ uravnava celični volumen, vendar le ob manjših spremembah prepustnosti celične membrane. Ob večjih spremembah prepustnosti (3 do 4-krat) pride do hemolize (Martinov in sod., 1999).

Druga je Ca²⁺-ATPaza (Slika 5 (10)). Z aktivnim izčrpavanjem ionov Ca²⁺ s to črpalko se vzdrţuje izredno nizka koncentracija ionov Ca²⁺ v celici (okoli 60 nM). Povišane znotrajcelične koncentracije Ca²⁺ namreč vodijo do ehinocitogene deformacije membrane, proteolize, dehidracije in zniţane deformabilnosti eritrocitov (Yawata, 2003).

Obe črpalki v človeških eritrocitih ustvarjata glavne gradiente kationov preko membrane in zagotavljata integriteto ter normalno preţivetje eritrocitov. Črpalki za delovanje porabljata energijo hidrolize ATP, pri čemer vir energije predstavlja glukoza, ki se v celico prenese s pospešeno difuzijo preko posebnega prenašalca (glukoznega prenašalca, (Slika 5 (4)) (Yawata, 2003).

2.3.1.2 Prenašalci ionov skozi membrano eritrocita

Večina celic se v nekaj sekundah odzove na nenadno nabrekanje oz. krčenje celic, tako da aktivirajo membranske prenašalce. V membrani eritrocitov najdemo naslednje prenašalce ionov:

 K⁺- Cl^-kotransporter,

 Na⁺-K⁺-2Cl^- kotransporter,

 Na⁺/Mg²⁺ izmenjevalec,

 K⁺(Na⁺)/H⁺ izmenjevalec,

 anionski izmenjevalec (AE1) in

 Na⁺/H⁺ izmenjevalec.

S prenašalci poteka transport ionov s pospešeno difuzijo v smeri njihovega elektrokemijskega gradienta. Prenašalci imajo afiniteto za ione, ki jih trasportirajo in so zanje specifični ter kaţejo saturacijsko kinetiko prenosa (Wehner in sod., 2003).