UPORABA KOMBUČE ZA PRIPRAVO FERMENTIRANIH PIJAČ

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Mojca JELOVČAN

UPORABA KOMBUČE ZA PRIPRAVO FERMENTIRANIH PIJAČ

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Mojca JELOVČAN

UPORABA KOMBUČE ZA PRIPRAVO FERMENTIRANIH PIJAČ DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana

USE OF KOMBUCHA CONSORTIUM FOR THE PREPARATION OF FERMENTED BEVERAGES

B. SC. THESIS

Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition

Ljubljana, 2021

(3)

Jelovčan M. Uporaba kombuče za pripravo fermentiranih pijač.

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021 II

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Živilstvo in prehrana.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za živilstvo je za mentorico diplomskega dela imenovala izr. prof. dr. Leo Pogačnik in za recenzentko izr. prof. dr. Anjo Klančnik.

Mentorica: izr. prof. dr. Lea POGAČNIK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Recenzentka: izr. prof. dr. Anja KLANČNIK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik:

Mentorica:

Recenzentka:

Datum zagovora:

Mojca Jelovčan

(4)

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1

DK UDK 663.952:579.67(043)=163.6

KG fermentirane pijače, kombuča, priprava kombuče, fermentacija, rmanov čaj, grozdni sok, datljev sirup, sojina sirotka, kokosova voda, kava, biološka učinkovitost, kemijska sestava

AV JELOVČAN, Mojca

SA POGAČNIK, Lea (mentorica), KLANČNIK, Anja (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021

IN UPORABA KOMBUČE ZA PRIPRAVO FERMENTIRANIH PIJAČ TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana) OP VIII, 22 str., 4 sl., 25 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Kombuča je fermentirana pijača, tradicionalno pridobljena s fermentacijo sladkanega črnega ali zelenega čaja. Kombuča je tudi drugo ime za simbiotsko združbo bakterij in kvasovk, imenovano čajna goba. Namen diplomskega dela je bil s pomočjo strokovne literature ugotoviti, katere substrate še lahko fermentiramo z naravno kulturo kombuče, kaj se med fermentacijo dogaja, katere spojine vsebujejo fermentirane pijače in kako se razlikujejo biološke učinkovitosti teh pijač. Ker se kombuča pripravlja iz velikega števila različnih substratov, smo jih v diplomskem delu predstavljenih le nekaj: rmanov čaj, rdeč grozdni sok, datljev sirup, sojino sirotko, kokosovo vodo in kavo. Fermentacija z naravno kulturo kombuče je kombinacija alkoholne, ocetnokislinske in mlečnokislinske fermentacije. Poleg vrste substrata, na fermentacijo in kemijsko sestavo fermentirane pijače, med drugim vplivata tudi trajanje in temperatura. Vrednost pH je eden najpomembnejših parametrov, ki ga spremljajo med fermentacijo. V fermentirani pijači prevladujejo organske kisline in fenolne spojine, vsebujejo pa tudi etanol, ogljikov dioksid, aminokisline, nekatere vitamine in minerale ter mnoge druge spojine, ki jih še niso raziskali. Ob koncu diplomskega dela smo predstavili tudi biološke učinkovitosti, kot so antioksidativna učinkovitost, protimikrobna učinkovitost, antiproliferativna učinkovitost in učinkovitost zaviranja škrobne hidrolaze. Kombuča je priljubljena pijača tudi zaradi številnih pozitivnih učinkov na zdravje in počutje.

(5)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021 IV

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1

DC UDC 663.952:579.67(043)=163.6

CX fermented beverages, kombucha, preparation of kombucha, fermentation, yarrow tea, red grape juice, date syrup, soy whey, coconut water, coffee, biological activity, chemical composition

AU JELOVČAN, Mojca

AA POGAČNIK, Lea (supervisor), KLANČNIK, Anja (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology

PY 2021

TI USE OF KOMBUCHA CONSORTIUM FOR THE PREPARATION OF FERMENTED BEVERAGES

DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition) NO VIII, 22 p., 4 fig., 25 ref.

LA sl AL sl/en

AB Kombucha is a fermented beverage that is traditionally made by fermenting sweetened black or green tea. It is also another name for the symbiotic consortium of bacteria and yeast also known as tea fungus. The purpose of thesis is to study the scientific literature to determine what other substrates can be fermented with natural culture of kombucha, what happens during fermentation, what compounds fermented beverages contain, and how the biological activities of these beverages differ. Since kombucha is made from a large number of different substrates, only a few substrates will be presented in the thesis, namely yarrow tea, red grape juice, date syrup, soy whey, coconut water, and coffee. Fermentation with natural culture of kombucha is a combination of alcoholic, acetic acid and lactic acid fermentation. In addition to the type of substrate, the duration and temperature also affect the fermentation and the chemical composition of the fermented beverage. The pH is one of the most important parameters monitored during fermentation. Organic acids and phenolic compounds are predominant in fermented beverage, which also contain ethanol, carbon dioxide, amino acids, some vitamins and minerals, and many other compounds that have not yet been explored. At the end of the thesis, some biological activities are presented such as antioxidant activity, antimicrobial activity, antiproliferative activity and starch hydrolase inhibitory activity. Kombucha is also a popular drink because many other positive effects on health and well-being.

(6)

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO SLIK ... VII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... VIII

1 UVOD ... 1

2 PRIPRAVA KOMBUČE ... 2

2.1 NARAVNA KULTURA KOMBUČE ALI »ČAJNA GOBA« ... 3

2.2 TVORBA CELULOZNEGA BIOFILMA ... 4

2.3 POSTOPEK PRIPRAVE KOMBUČE ... 5

2.4 FERMENTACIJA Z NARAVNO KULTURO KOMBUČE ... 5

2.5 SUBSTRATI ZA PRIPRAVO KOMBUČE ... 6

2.5.1 Rmanov čaj ... 6

2.5.2 Grozdni sok ... 7

2.5.3 Datljev sirup ... 7

2.5.4 Sojina sirotka ... 8

2.5.5 Kokosova voda ... 8

2.5.6 Kava ... 8

2.6 VPLIV POGOJEV FERMENTACIJE NA KEMIJSKO SESTAVO KOMBUČE 9 2.6.1 Trajanje fermentacije ... 9

2.6.2 Temperatura fermentacije ... 9

2.6.3 Sprememba vrednosti pH in vsebnosti skupnih (titrabilnih) kislin ... 9

3 KEMIJSKA SESTAVA KOMBUČE ... 11

3.1 ORGANSKE KISLINE, PRISOTNE V KOMBUČI ... 11

3.2 FENOLNE SPOJINE PRISOTNE V KOMBUČI ... 12

3.3 PRISOTNOST DRUGIH SPOJIN V KOMBUČI ... 14

4 BIOLOŠKA UČINKOVITOST SPOJIN PRISOTNIH V KOMBUČI ... 15

4.1 ANTIOKSIDATIVNA UČINKOVITOST SPOJIN ... 15

4.2 PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST ... 17

4.3 ANTIPROLIFERATIVNA UČINKOVITOST ... 18

4.4 UČINKOVITOST ZAVIRANJA ŠKROBNE HIDROLAZE ... 18

(7)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021 VI

5 POVZETEK ... 19 6 VIRI ... 20

(8)

KAZALO SLIK

Slika 1: Kombuča s plavajočim celuloznim biofilmom (a), znižanje vrednosti pH zaradi metabolne učinkovitosti naravne kulture kombuče (b), glavne spremembe v biofilmu med fermentacijo (c) in struktura biofilma pod mikroskopom (d, e) (Knöllern in sod., 2020) ... 2 Slika 2: Tvorba celuloznih mikrofibril s pomočjo bakterij K. xylinus (Villarreal-Soto in sod., 2018) ... 5 Slika 3: Glavne metabolne poti naravne kulture kombuče (Villarreal-Soto in sod., 2018) .. 6 Slika 4: Spremembe vrednosti pH (a) in vsebnosti skupnih kislin (b) v čaju in vzorcih datljevega sirupa med fermentacijo s kombučo (Khosravi in sod., 2018) ... 10

(9)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021 VIII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

CO2 ogljikov dioksid

DPPH• 1,1–difenil–2–pikrihidrazil DSL D–saharinska kislina–1,4–lakton

SCOBY simbiotska združba bakterij in kvasovk (ang. symbiotic consortium of bacteria and yeast)

SEM vrstični elektronski mikroskop (ang. scanning electron microscope)

(10)

1 UVOD

Kombuča je pijača, ki je tradicionalno pridobljena s fermentacijo sladkanega črnega ali zelenega čaja. Kombuča pa je tudi ime za mikrobno združbo ocetnokislinskih in mlečnokislinskih bakterij ter kvasovk, ki jo imenujejo tudi čajna goba. Ta ponavadi kot celulozni disk plava na površini fermentirane pijače in nastaja med fermentacijo.

Mikroorganizmi sladkorje pretvarjajo v etanol, ocetno kislino, mlečno kislino, glukonsko kislino in druge kisline ter ogljikov dioksid (CO2). Poleg teh snovi pa vsebuje tudi nekatere aminokisline, vitamine, minerale in hidrolizne encime. To pa lahko uporabimo tudi za fermentacijo drugih pijač (npr. drugi čaji, sadni sokovi in sirupi, mleko, sirotka, vino).

(Jayabalan in sod., 2014).

Fermentacija je ena najstarejših metod konzerviranja hrane in je nizkoenergijski proces, ki ima bistven pomen za zagotovitev obstojnosti in varnosti hrane (Villarreal-Soto in sod., 2018). Od substrata je odvisna tako mikrobna sestava kot tudi kemijska sestava fermentirane pijače. Posamezen substrat ima različno sestavo, kar vpliva na tvorbo različnih spojin in posledično na kemijsko sestavo končnega izdelka. S fermentacijo se zaradi tvorbe biološko aktivnih snovi izboljšajo antioksidativna učinkovitost, protimikrobna učinkovitost in druge biološke učinkovitosti, spremenijo se tudi organoleptične lastnosti. Na lastnosti končnega produkta poleg omenjenih parametrov vplivajo tudi trajanje in temperatura fermentacije, koncentracija sladkorja in čaja oziroma druge pijače, ki jo uporabimo za fermentacijo (Chakravorty in sod., 2019).

V diplomskem delu bomo predstavili pregled strokovne znanstvene literature o kombuči, kaj se med procesom fermentacije dogaja in kako vpliva na sestavine v teh pijačah. Predvsem nas zanimajo alternativni viri, kaj lahko poleg črnega čaja uporabimo za fermentacijo s kombučo. V delu bomo opisali le nekaj pijač, kot so rmanov čaj, rdeč grozdni sok, datljev sirup, kava in sojina sirotka. Opisali bomo spremembe, ki se dogajajo med fermentacijo teh pijač, katere spojine se tvorijo in spremembe bioloških učinkovitosti, ki so jih avtorji določali v posamezni pijači.

(11)

Jelovčan M. Uporaba kombuče za pripravo fermentiranih pijač. 2

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021

2 PRIPRAVA KOMBUČE

Kombuča je pijača, ki jo pripravimo s fermentacijo sladkanega črnega čaja. Kombuča je tudi ime za simbiotsko združbo kvasovk in bakterij, ki jo imenujemo tudi čajna goba, in se tvori na površini fermentirane pijače kot bela gumijasta »palačinka«. Pijača je rahlo gazirana, prijetno kislega in sladkastega okusa. Tradicionalno je kombuča pripravljena s fermentacijo sladkanega črnega čaja z majhnim deležem naravne kulture kombuče in/ali fermentirane pijače iz predhodne fermentacije (Chakravorty in sod., 2016; Mukadam in sod., 2016;

Khosravi in sod., 2019).

Kombuča izvira iz Mandžurije, ki se nahaja na severovzhodu Kitajske. Že v času dinastije Tsin, okoli 220 let pr. n. št. so ji pripisovali detoksifikacijske in energijske lastnosti. Leta 414 so jo pripeljali na Japonsko za zdravljenje prebavnih težav cesarja. Nato se je po trgovski poteh razširila v Rusijo in vzhodno Evropo. Pijača je do 2. svetovne vojne postala priljubljena po Evropi, dokler ni prišlo do pomanjkanja čaja in sladkorja. Nekaj let po vojni se je njena uporaba ponovno razširila. Okoli leta 1960 so v Švici ugotovili, da ima pitje kombuče podobne učinke na zdravje kot uživanje jogurta, morda tudi zaradi produktov (slika 1), kar je še pripomoglo k priljubljenosti kombuče. Danes kombučo (pijačo in tudi samo naravno kulturo kombuče) prodajajo po vsem svetu preko številnih spletnih trgovin (Jayabalan in sod., 2014). Do danes so razvili kombučo z različnimi okusi.

Slika 1: Kombuča s plavajočim celuloznim biofilmom (a), znižanje vrednosti pH zaradi metabolne učinkovitosti naravne kulture kombuče (b), glavne spremembe v biofilmu med fermentacijo (c) in struktura biofilma pod mikroskopom (d, e) (Knöllern in sod., 2020)

(12)

Slika 1 prikazuje (a) kombučo s plavajočim celuloznim biofilmom in mehurčki plinastega CO2 levo spodaj; (b) med fermentacijo se vrednost pH zniža zaradi metabolne učinkovitosti naravne kulture kombuče, kar je shematsko prikazano tudi na sliki (c): I. kvasovke najprej hidrolizirajo saharozo na glukozo in fruktozo; II. nato ta dva monosaharida pretvorijo v etanol in CO2 ter druge stranske produkte. Te produkte nato bakterije pretvorijo v ocetno kislino, posledično se zniža tudi vrednost pH; III. določene bakterije iz teh monosaharidov tvorijo celulozni vlakna oziroma biofilm in glukonsko kislino; (d) SEM (vrstični elektronski mikroskop) sliko nastajanja celuloznega biofilma; (e) SEM sliko zapletene mreže celuloznih vlaken. SEM sliko so dobili s pomočjo vrstičnega elektronskega mikroskopa, s katerim so raziskali mikrostrukturo celične membrane in celuloznega biofilma (Knöllern in sod., 2020).

2.1 NARAVNA KULTURA KOMBUČE ALI »ČAJNA GOBA«

Čajna goba ni goba, ampak je le ime za simbiotsko združbo bakterij in kvasovk. Imenujejo jo tudi SCOBY (ang. symbiotic consortium of bacteria and yeast). Nahaja se na površini fermentirane pijače kot bela gumijasta »palačinka«, ki je rezultat delovanja bakterij Komagataeibacter xylinus (Marsh in sod., 2014; Jayabalan in sod., 2014; Villarreal-Soto in sod., 2018). Barva naravne kulture kombuče se med fermentacijo zaradi vsebnosti taninov spreminja iz kremno bele v temnejšo (Mukadam in sod., 2016). Mikrobna sestava kombuče se razlikuje glede na podnebje, geografsko območje in uporabljene vire (Mukadam in sod., 2016; Marsh in sod., 2014). Močna simbiotska povezava, ki jo ustvarijo bakterije in kvasovke v kombuči, lahko zavira rast nekaterih nezaželenih mikroorganizmov, ki bi lahko kontaminirali kombučo (Mukadam in sod., 2016).

Med bakterijami prevladujejo ocetnokislinske bakterije, v nekaterih vzorcih pa so identificirali tudi mlečnokislinske bakterije. Ocetnokislinske bakterije v primerjavi s kvasovkami potrebujejo kisik za rast in delovanje. Metabolni proces temelji na presnovi acetaldehida v etanol in acetaldehid hidrata v ocetno kislino s pomočjo encima acetaldehid dehidrogenaze. Ocetnokislinske bakterije izkoriščajo glukozo za proizvodnjo glukonske in glukuronske kisline ter etanol za proizvodnjo ocetne kisline (Jayabalan in sod., 2007).

Prevladujejo bakterije rodu Gluconacetobacter, v manjši koncentraciji pa najdemo tudi bakterije rodov Acetobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc in Bifidobacterium (Marsh in sod., 2014; Watawana in sod., 2016). Identificirali so številne ocetnokislinske bakterije, kot so Acetobacter xylinoides, Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus, Bacterium gluconicum, Gluconobacter oxydans, Gluconoacetobacter sp. A4, Gluconoacetobacter sacchari, Gluconoacetobacter hansenii, Komagaeibacter saccharivorans, Komagaeibacter kombuchae, Komagaeibacter xylinus, Komagaeibacter europaeus (Jayabalan in sod., 2014; Mukadam in sod., 2016; Marsh 2014).

(13)

Mlečnokislinske bakterije so v kombuči prisotne v manjšem številu. Prevladujejo bakterije Lactobacillus plantarum in Lactococcus lactis subsp lactis. Ayed in sod. (2017) so ugotovili, da se je med fermentacijo število mlečnokislinskih bakterij v prvih dneh povečalo, nato pa zmanjšalo. Ti rezultati se razlikujejo od podatkov, ki so jih pridobili Marsh in sod. (2014), ki so poročali, da je bilo število mlečnokislinskih bakterij večje deseti dan kot tretji dan fermentacije.

V tej združbi najdemo tudi kvasovke iz rodov Zygosaccharomyces, Candida, Hanseniaspora, Torulaspora, Pichia, Dekkera, Saccharomyces, Saccharomycoides, Schizosaccharomyces in Kluyveromyces (Chakravorty in sod., 2016). Kvasovke Schizosaccharomyces pombe, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces bruttanomyces, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces lambicus, Brettanomyces custersii, Brettanomyces intermedius, Saccharomyces cerevisae, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces kombuchaensis, Zygosaccharomyces bailli, Zygosaccharomyces lentus, Zygosaccharomyces bisporus, Saccharomycodes ludwigii, Candida famata, Pichia membranofaciens in Torulaspora delbrueckii so le nekatere kvasovke, ki so jih izolirali in identificirali v kombuči (Mukadam in sod., 2016; Marsh in sod., 2014).

2.2 TVORBA CELULOZNEGA BIOFILMA

Med bakterijami, ki proizvajajo biofilm, v naravni kulturi kombuče prevladujejo bakterije K. xylinus. V prvi fazi se bakterije razmnožujejo in porabljajo kisik za oksidacijo glukoze v glukonsko kislino, nato pa tvorijo mikrobno celulozo in oblikujejo biofilm, ki ostane na površini. Proces vključuje sintezo uridin difosfo-glukoze (UDPGlc), ki je prekurzor celuloze. Bakterije v nadzorovanih pogojih hitro rastejo in tvorijo celulozo iz različnih virov ogljika (glukoza, etanol, saharoza in glicerol). Vsaka bakterijska celica v eni sekundi polimerizira okoli 200.000 glukoznih ostankov v ß-1,4-glukozidne verige. Proizvodnja celuloze poteka ekstracelularno, v obliki vlaken, ki so pritrjena na površini bakterijskih celic.

Verige se nato med seboj povežejo in tvorijo debelejša vlakna ali makrofibirile, ki ustvarjajo 3-D strukturo okoli 1000 posameznih verig glukana.

Bakterije lahko tvorijo dve obliki celuloze, celulozo I in celulozo II. Celuloza I je polimer, podoben traku, sestavljen iz snopov mikrofibril, celuloza II pa je amorfen polimer, ki je bolj stabilen kot celuloza I. Med fermentacijo se biofilm debeli z nastajanjem novih slojev celuloze na površini gojišča. Razvoj biofilma se nadaljuje skozi celotno fermentacijo in doseže mejo, ko z rastjo navzdol doseže vse mikroorganizme, katerih učinkovitost se zmanjša zaradi nezadostne oskrbe s kisikom (Villarreal-Soto in sod., 2018). Določene spojine, kot so kofein in sorodni ksantini, pospešujejo tvorbo mikrobnega biofilma (Chakravorty in sod., 2019). Na sliki 2 je prikazano, kako se na celični membrani bakterijskih celic K. xylinus tvorijo vlakna, ki se med seboj povezujejo v vedno večje snope oziroma celulozni biofilm.

(14)

Slika 2: Tvorba celuloznih mikrofibril s pomočjo bakterij K. xylinus (Villarreal-Soto in sod., 2018)

2.3 POSTOPEK PRIPRAVE KOMBUČE

Kombučo pripravimo tako, da sladkanemu in ohlajenemu čajnemu poparku dodamo majhen del naravne kulture kombuče in fermentirane tekočine iz prejšnje fermentacije. Količina čajnih listov, sladkorja, naravne kulture kombuče in fermentirane tekočine se lahko razlikujejo. Po standardni recepturi najprej zavremo 1 L vode in dodamo 50 g sladkorja, da se raztopi. Nato dodamo 5 g čajnih listov in pustimo 5 minut, da se namakajo, ter jih nato odstranimo s filtracijo. Ohlajeni čajni poparek (20 C) prelijemo v predhodno sterilizirano stekleno posodo. Dodamo še 24 g naravne kulture kombuče in 0,2 L fermentirane pijače ter pokrijemo s papirnato brisačo, da preprečimo vdor insektov. Tako pripravljeno pustimo pri temperaturi od 20 C do 30 C približno od 7 dni do 14 dni. V prvih nekaj dneh se začne oblikovati nova hčerinska kultura, ki jo po končani fermentaciji poberemo s površine in jo skupaj z nekaj fermentirane pijače shranimo v manjši posodi ali pa jo uporabimo za naslednjo fermentacijo. Pridobljeno pijačo pa potem prefiltriramo in hranimo pri temperaturi 4 °C (Jayabalan in sod., 2014; Villarreal-Soto in sod., 2018).

2.4 FERMENTACIJA Z NARAVNO KULTURO KOMBUČE

Fermentacija z naravno kulturo kombuče je kombinacija alkoholne, ocetnokislinske in mlečnokislinske fermentacije. Proces fermentacije začnejo ozmotolerantni mikroorganizmi, zaključijo pa ga acidotolerantni mikroorganizmi (Villarreal-Soto in sod., 2018). Kvasovke s pomočjo encimov invertaze hidrolizirajo saharozo na glukozo in fruktozo (Chakravorty in sod., 2016). V drugem koraku proizvajajo etanol, pri čemer kot vir ogljika prvenstveno uporabljajo fruktozo (Neffe‐Skocińska in sod., 2017). Ocetnokislinske bakterije nato oksidirajo etanol v ocetno kislino ter glukozo v glukonsko in glukuronsko kislino. Tvori se gosti celulozni biofilm na površini fermentirane pijače (Ayed in sod., 2017). Pojavljati se začnejo mehurčki kot rezultat tvorbe plina CO2 (Mukadam in sod., 2016). Slika 3 prikazuje glavne metabolne poti naravne kulture kombuče, in glavne produkte, ki jih kvasovke in bakterije presnovijo iz saharoze.

(15)

Slika 3: Glavne metabolne poti naravne kulture kombuče (Villarreal-Soto in sod., 2018)

2.5 SUBSTRATI ZA PRIPRAVO KOMBUČE

Običajno je kombuča pripravljena s fermentacijo sladkanega zelenega ali črnega čaja.

Kombučo pa lahko pripravimo tudi iz drugih pijač, kot so drugi zeliščni čaji oziroma poparki, sadni sokovi in sirupi, vino, kis, mleko, sirotka (Ayed in sod., 2017; Watawana in sod., 2016, Vitas in sod., 2018; Jayabalan in sod., 2014). Glede na te raziskave je mogoče sklepati, da bi bilo raziskovanje terapevtskega potenciala kombuče, pripravljene iz različnih substratov, zanimivim pristop.

V nadaljevanju bomo predstavili nekatere najbolj zanimive substrate za fermentacijo z naravno kulturo kombuče in sicer rmanov čaj, grozdni sok, datljev sirup, sojina sirotka, kokosova voda in kava. Vsi vsebujejo sladkor (dodan ali naravno prisoten) in ostale spojine, ki jih potrebujejo mikroorganizmi za normalen potek fermentacije. V vseh substratih mikroorganizmi tvorijo podobne glavne produkte, razlike so v stranskih produktih, saj ne vsebujejo enakih mikroorganizmov in nimajo enake kemijske sestave. Na količino tvorjenih spojin vpliva tudi koncentracija sladkorja ter trajanje in temperatura fermentacije.

2.5.1 Rmanov čaj

Rmanov čaj je pijača iz posušenih rmanovih cvetov ali zeli, ki se ga pripravlja kot poparek ali ekstrakt. Ker ne vsebuje listov čajevca, ne spada med prave čaje. Vsebuje več kot sto biološko aktivnih spojin. Med najpomembnejše sodijo ahilin, apigenin, luteolin, azulen, kafra, kumarin, inulin, mentol, kvercitin, rutin, jantarna, salicilna in kofeinska kislina, tujoni idr. Vitas in sod. (2018) so v raziskavi primerjali lastnosti rmanovega čaja, pripravljenega na dva načina, z namakanjem v vroči vodi (poparek) in z ekstrakcijo s subkritično vodo (ekstrakt).

(16)

Ekstrakcija s subkritično vodo je napredna tehnika ekstrahiranja, ki temelji na ekstrakciji z vročo vodo pri temperaturah pod vreliščem, pri čemer se vzdržuje visok tlak z namenom ohranjanja vode v tekočem stanju skozi celoten proces. Ti pogoji vplivajo na fizikalno- kemijske lastnosti vode in lastnosti raztapljanja. S povišanjem temperature se poveča prenos mase kot rezultat zmanjšanja površinske napetosti vode, kar omogoča boljše prodiranje v matriko vzorca. To pa vpliva tudi na prekinitev intermolekularnih vezi (van der Waalsove vezi, vodikove vezi in dipolne vezi) v matriki vzorca. Najpomembnejši vpliv povišane temperature vode je oslabitev vodikovih vezi in posledično nižja dielektrična konstanta.

Tako bi lahko bila alternativa za uporabo nepolarnih organskih topil v nekaterih aplikacijah.

Vzorcem rmanovega čaja so dodali 7 % saharoze in 10 % naravne kulture kombuče ter fermentirali 7 dni pri temperaturi 25 °C. Fermentacija je bila izrazitejša pri ekstraktu, tudi vrednost pH fermentirane pijače je bila nižja. To nakazuje, da je ekstrakt bolj primeren za fermentacijo z naravno kulturo kombuče. Na fermentacijo vpliva tudi koncentracija zelišča, saj večja koncentracija okrepi proces (Vitas in sod., 2018).

2.5.2 Grozdni sok

Grozdni sok je pridobljen s stiskanjem grozdnih jagod. Grozdje je dobro poznan vir različnih hranilnih elementov, kot so vitamini, minerali, ogljikovi hidrati, prehranske vlaknine in antioksidanti. Najmočnejši antioksidanti so polifenoli, kot so polifenolne kisline, resveratrol, proantocianidi in flavonoidi (npr. antocianini). Antocianini so glavni predstavniki polifenolnih spojin v rdečih sortah grozdja, medtem ko so flavan-3-oli bolj obilni v belih sortah grozdja. V raziskavi so Ayed in sod. (2016) uporabili rdeče grozdje. Grozdnemu soku so dodali 3 % naravne kulture kombuče in 10 % fermentirane pijače ter fermentirali 12 dni pri temperaturi 30 °C.

2.5.3 Datljev sirup

Datelj je pridobljen iz datljeve palme (Phoenix dactylifera L.). Več kot 30 % dateljnov zaradi prekomerne zrelosti in pogostih fizikalnih in fizioloških motenj spada v drugo ali tretjo kategorijo kakovosti. Te sadeže uporabijo za predelavo v datljev sirup, ki je poceni naravno sladilo. Datljev sirup je pomemben vir fermentabilnih sladkorjev (od 60 % do 70 %), mineralov in fenolnih spojin, ki imajo visoko antioksidativno učinkovitost. Te lastnosti naredijo sirup ugoden substrat za fermentacijo z naravno kulturo kombuče. Datljev sirup, ki so ga uporabili za študijo, je imel začetno vrednost 78  Brix. Za fermentacijo z naravno kulturo kombuče in nadaljnje analize so ga razredčili z vodo do vrednosti 6  Brix, 8  Brix in 10  Brix. Te so nato sterilizirali in v ohlajene dodali 10 % fermentirane pijače ter fermentirali 15 dni pri temperaturi 30 °C (Khosravi in sod., 2019).

(17)

2.5.4 Sojina sirotka

Sojina sirotka je stranski produkt pri proizvodnji tofuja ali sojinih proteinov. Večina sojine sirotke, ki jo zavržejo kot neobdelan odpadek, predstavlja okoljsko onesnaženje in izgubo hranilnih virov, predvsem proteinov, oligosaharidov, izoflavonov, organskih kislin in mineralov. Da bi zmanjšali odpadek, so izvedli več različnih poskusov. Na primer, uporabili so jo kot rastni medij za rast mlečnokislinskih bakterij, vključno z bakterijami Lactobacillus acidophilius in L. plantarum, za proizvodnjo funkcionalne pijače ali kot substrat za tvorbo prebiotičnih fruktooligosaharidov in novih fruktoziliranih α-galaktozidov. Vendar pa ti pristopi še vedno proizvajajo velike količne odpadkov na koncu procesa in še niso vključeni v industrijsko proizvodnjo. Sojini sirotki so dodali 10 % naravne kulture kombuče ter fermentirali 8 dni pri temperaturi 28 °C. Najboljšo senzorično oceno je dobila sojina sirotka po šestih dnevih fermentacije, zato so za vse nadaljnje analize uporabili sojino sirotko, fermentirano šest dni (Tu in sod., 2019).

2.5.5 Kokosova voda

Kokosova voda je pridobljena iz sadeža kraljevega kokosa (Cocos nucifera var. aurantiaca), ki ga gojijo na plažah tropskih držav. Voden sok znotraj sadeža je zelo popularna in hranljiva pijača v tropskih krajih, saj je bogata s sladkorji, vitamini, aminokislinami in minerali. Voda ima hladilni efekt v toplem in vlažnem tropskem okolju. Uživajo jo tudi kot energijsko pijačo in rehidracijsko sredstvo pri športnih učinkovitostih. Vsebuje spojine z antioksidativno učinkovitostjo. Njihova vsebnost se je zmanjšala s toplotno obdelavo, uporabo kislin ali baz ter z zorenjem sadeža. Vendar pa je kokosova voda razmeroma manj poznan medij za pridobivanje fermentirane pijače. Kokosovi vodi so dodali 3 % naravne kulture kombuče in fermentirali 7 dni pri temperaturi 24 ± 3 °C (Watawana in sod., 2016).

2.5.6 Kava

Kava spada v družino Rubiaceae, ki vsebuje več kot 70 vrst. Ekonomsko sta pomembni le dve vrsti, arabica (Coffea arabica) in robusta (Coffea canephora). Vsebuje številne koristne antioksidante in druge pomembne bioaktivne snovi. Je ena najbogatejših poznanih virov klorogenske kisline. Kofein je glavna spojina, zdravju koristna, ki ima številne farmakološke učinke, večina na ravni centralnega živčnega sistema, kot poživilo. Ostale prehranske spojine v kavi so lipidi, polisaharadi, fenolne spojine, melanoidi, topne prehranske vlaknine in minerali. Analizirali so kavo, pridobljeno na tri različne načine. Te so fino mleta kava, grobo mleta kava in instant kava. Kavnim poparkom so dodali 10 % saharoze ter ohlajenim primešali 3 % naravne kulture kombuče ter fermentirali 7 dni pri temperaturi 24 ± 3 °C (Watawana in sod., 2015).

(18)

2.6 VPLIV POGOJEV FERMENTACIJE NA KEMIJSKO SESTAVO KOMBUČE

Sestava in lastnosti kombuče so odvisne od vira dodanih mikroorganizmov ter posameznih vrst naravno prisotnih mikroorganizmov, koncentracije sladkorja in čaja ali drugega uporabljenega substrata, trajanja ter uporabljene temperature. Vsaka sprememba pogojev fermentacije vpliva na lastnosti končnega izdelka (Villarreal-Soto in sod., 2018). Lončar in sod. (2006) so potrdili vpliv koncentracije naravne kulture kombuče, temperature in trajanja na kemijsko sestavo kombuče. Največji vpliv naj bi imelo trajanje fermentacije, sledi temperatura, najmanjši vpliv pa naj bi imela koncentracija naravne kulture kombuče.

2.6.1 Trajanje fermentacije

Fermentacija traja od 7 dni do 60 dni. Najboljše senzorične lastnosti dobimo v povprečju 15 dni. Predolga fermentacija ni priporočljiva zaradi akumulacije organskih kislin, saj so pijače s previsoko koncentracijo kislin škodljive za neposredno uživanje. Poleg tega se začne nastali CO2 akumulirati med biofilmom in tekočino ter tako preprečuje prehod hranil in izčrpa okolje (Villarreal-Soto in sod., 2018).

2.6.2 Temperatura fermentacije

Vzdrževanje temperature med 22 °C in 30 °C skozi celoten proces fermentacije vpliva na boljšo rast mikroorganizmov, encimsko učinkovitost in antioksidativno učinkovitost (Hur in sod., 2014). Pri višji temperaturi fermentacije so določili večje število mikroorganizmov, posledično tudi večje koncentracije njihovih metabolitov, kot so različne organske kisline in vitamini (Lončar in sod., 2006).

2.6.3 Sprememba vrednosti pH in vsebnosti skupnih (titrabilnih) kislin

Vrednost pH je eden najpomembnejših parametrov, ki vplivajo na fermentacijo ter nastanek in ohranitev biološke učinkovitosti spojin v fermentiranih pijačah. Prav tako vrednost pH vpliva na rast mikroorganizmov in strukturne spremembe spojin prisotnih v kombuči, ki lahko vplivajo na antioksidativno učinkovitost (Hur in sod., 2014). Nizka vrednost pH zagotavlja zaščito fermentirane pijače pred patogenimi mikroorganizmi. Znižanje vrednosti pH ima tudi pozitiven vpliv na kemijsko stabilnost polifenolov, saj preprečuje njihovo hidrolizo in posledično ohranitev barve pijače (Ayed in sod., 2017). Za prijetno kisel okus je najnižja še sprejemljiva vrednost pH 3, kar je blizu vrednosti pH v našem želodcu (Lončar in sod., 2006). Optimalna vsebnost skupnih kislin je med 4,0 g/L in 4,5 g/L. Čas, da dosežemo to vrednost, je odvisna od vira hranil za mikroorganizme in zunanjih pogojev fermentacije (Velićanski in sod., 2014; Villarreal-Soto in sod., 2018).

(19)

Vrednost pH je v fermentiranih pijač nižja kot v začetnih substratih. Znižanje vrednosti pH je posledica povečanja vsebnosti skupnih kislin, ki se tvorijo med fermentacijo (Watawana in sod., 2016; Watawana in sod., 2015). Po določenem trajanju fermentacije se vrednost pH stabilizira kljub povečanju vsebnosti skupnih kislin. Ena od možnih razlag je disociacija CO2

in tvorba amfiprotičnega hidgrogenkarbonatnega aniona (HCO3-). Ta anion zlahka reagira z vodikovim ionom (H⁺), ki se sprošča iz prisotnih organskih kislin, kar preprečuje nadaljnje spremembe vrednosti pH (Chen in Liu 2000; Ayed in sod., 2017).

Khosravi in sod. (2018) so dokazali, da se vzorci datljevega sirupa med seboj bolj razlikujejo po vsebnosti skupnih kislin kot po vrednosti pH (slika 4). Vsebnost skupnih kislin je bila večja v fermentiranem datljevem sirupu kot v fermentiranem čaju, kar lahko pripisujemo večji puferski kapaciteti. Povečanje puferske kapacitete povzroči kemijske reakcije med šibkimi organskimi kislinami in minerali iz datljevega sirupa zaradi večje vsebnosti mineralov in sladkorjev (predvsem saharoza). Višja hitrost tvorbe kislin med fermentacijo datljevega sirupa kot med fermentacijo čaja nakazuje na večje število bakterijskih celic v datljevem sirupu. Vsebnost skupnih kislin je bila pred fermentacijo v vzorcih datljevega sirupa podobna, po koncu fermentacije pa je bila vsebnost skupnih kislin v fermentiranem datljevem sirupu z vrednostjo 10 °Brix, zaradi večje vsebnosti fermentabilnih sladkorjev, večja kot pri ostalih vzorcih. Najmanjšo vsebnost skupnih kislin so dokazali v fermentiranem črnem čaju.

Slika 4: Spremembe vrednosti pH (a) in vsebnosti skupnih kislin (b) v čaju in vzorcih datljevega sirupa med fermentacijo s kombučo (Khosravi in sod., 2018)

Watawana in sod. (2015) so med fermentacijo treh različnih kavnih poparkov dokazali znižanje vrednosti pH in povečanje vsebnosti skupnih kislin le po koncu fermentacije poparka iz fino mlete kave. Te spremembe so povezane z velikostjo delcev, saj ima le-ta izmed preiskovanih kavnih poparkov najmanjšo velikost delcev. To pa pomeni, da je reakcijskemu mediju in mikroorganizmom izpostavljena večja površina, kjer lahko poteče več kemijskih reakcij in se tvori večja vsebnost skupnih kislin.

(20)

3 KEMIJSKA SESTAVA KOMBUČE

Kemijska sestava kombuče je zelo kompleksna in ni v celoti poznana. Glavne spojine v kombuči so organske kisline, polifenoli, glukoza, fruktoza, etanol, vitamini, minerali in aminokisline. Sestava in koncentracija posameznih spojin je odvisna od uporabljenega substrata, sestave naravne kulture kombuče, vrste in koncentracije sladkorjev, ter trajanja in temperature fermentacije (Chakravorty in sod., 2019).

3.1 ORGANSKE KISLINE, PRISOTNE V KOMBUČI

Med fermentacijo se tvorijo organske kisline, ki vplivajo na senzorične lastnosti ter kemijsko in mikrobiološko stabilnost hrane (Vitas in sod., 2018). Prevladujejo ocetna, glukonska in glukuronska kislina ter v manjši koncentraciji citronska in mlečna kislina (Chakravorty in sod., 2019; Jayabalan in sod., 2007; Jayabalan in sod., 2014).

Ocetna kislina je značilen produkt fermentacije in je prevladujoča organska kislina, ki jo najdemo v vseh pijačah, fermentiranih z naravno kulturo kombuče. Je glavna spojina, ki vpliva na znižanje vrednosti pH. Nastane z oksidacijo etanola, ki jo povzročajo ocetnokislinske bakterije. Ima pomembno vlogo pri okusu fermentirane pijače, saj večja koncentracija povzroči neprijeten okus po kisu. Koncentracija ocetne kisline se postopoma povečuje skozi celoten proces fermentacije in je močno povezana s številom bakterijskih celic v naravni kulturi kombuče. Večja koncentracija ocetne kisline je povezana tudi z večjo začetno koncentracijo sladkorjev in daljšim trajanjem fermentacije (Jayabalan in sod., 2007;

Ayed in sod., 2017; Jayabalan in sod., 2014).

Poleg ocetne kisline v kombuči prevladujeta tudi glukonska in glukuronska kislina.

Koncentraciji glukonske in glukuronske kisline se med fermentacijo povečujeta in sta odvisni od začetne koncentracije sladkorjev. Po koncu fermentacije sta koncentraciji glukonske in glukuronske kisline večji v datljevem sirupu z večjo koncentracijo saharoze.

Glukuronska kislina velja za eno pomembnejših spojin, ki so jih identificirali v kombuči, saj konjugacija glukuronske kisline z nezaželenimi sestavinami poveča topnost slednjih in olajša njihovo odstranjevanje iz telesa (Ayed in sod., 2017; Khosravi in sod., 2019).

Vitas in sod. (2018) so v fermentiranem rmanovem čaju dokazali vsebnost oksalne, mravljične, ocetne, jantarne, jabolčne in citronske kisline. Na koncentracijo ocetne kisline in drugih organskih kislin vpliva tudi koncentracija zelišča v začetnem substratu.

Koncentracija organskih kislin je večja v fermentiranem rmanovem čaju z večjo koncentracijo zelišča. Izjema je jantarna kislina, katere koncentracija je bila manjša v fermentiranem rmanovem poparku z večjo koncentracijo zelišča. Koncentracija organskih kislin je večja v fermentiranih rmanovih ekstraktih kot v fermentiranih rmanovih poparkih.

(21)

V fermentiranem datljevem sirupu so Khosravi in sod. (2019) dokazali le ocetno in glukonsko kislino. Koncentracija organskih kislin je povezana s številom mikroorganizmov v naravni kulturi kombuče ter koncentracijo sladkorjev. Slednja je večja v datljevem sirupu kot v čaju, posledično je večja tudi koncentracija organskih kislin. Vendar pa je po koncu fermentacije večjo koncentracijo ocetne kisline vseboval datljev sirup z vrednostjo 8 °Brix kot datljev sirup z vrednostjo 10 °Brix, medtem ko koncentracija glukonske kisline premo sorazmerno narašča s koncentracijo sladkorjev. Koncentraciji organskih kislin sta najmanjši v fermentiranem čaju in podobni kot v fermentiranem datljevem sirupu z vrednostjo 6 °Brix.

V fermentiranem čaju pa so poleg teh kislin identificirali še mlečno kislino.

Tu in sod. (2019) so dokazali, da se koncentracija glukuronske kisline med fermentacijo sojine sirotke z naravno kulturo kombuče povečuje do šestega dneva fermentacije, nato se rahlo zmanjša. To so dokazali tudi Jayabalan in sod. (2007) pri fermentaciji črnega in zelenega čaja. Koncentracija glukuronske kisline je bila večja v fermentirani sojini sirotki kot v fermentiranem črnem in zelenem čaju. V fermentirani sojini sirotki so identificirali še tri organske kisline, in sicer mravljinčno, ocetno in citronsko kislino. Te koncentracije so se med fermentacijo spreminjale in najbolj prispevale k oceni senzorične kakovosti. Citronska kislina v fermentirani sojini sirotki pozitivno vpliva na okus (Tu in sod., 2019). Citronske kisline pa niso določili v fermentiranem črnem in zelenem čaju (Jayabalan in sod., 2007).

Ti rezultati dokazujejo, da je vrsta in koncentracija proizvedenih organskih kislin v fermentiranih pijačah odvisna od substrata in koncentracije saharoze v začetnem substratu.

3.2 FENOLNE SPOJINE PRISOTNE V KOMBUČI

Fenolne spojine z antioksidativno učinkovitostjo lovijo škodljive proste radikale v telesu.

Najdemo jih v črnem in zelenem čaju, dober vir antioksidantov so tudi nekateri sadni sokovi, ki jih lahko uporabimo kot alternativni substrat za fermentacijo z naravno kulturo kombuče, saj vsebujejo tudi več vitaminov in hranil za človeško telo (Ayed in sod., 2017).

Izmed fenolnih spojin, v kombuči prevladujejo čajni polifenoli. Chakravorty in sod. (2016) so dokazali povečanje koncentracije teaflavinov in zmanjšanje koncentracije tearubiginov med fermentacijo črnega čaja, predvsem zaradi pretvorbe tearubiginov v teaflavine. Ta proces vpliva tudi na spremembo barve iz rdečkasto rjave v svetlejšo rjavo barvo. Nasprotno Jayabalan in sod. (2007) niso dokazali razlik v koncentraciji teh dveh polifenolov. Večje spremembe so bile opažene v koncentraciji katehinov, kot so epikatehin (EC), epigalokatehin (EGC), epikatehin-3-galat (ECG) in epigalokatehin-3-galat (EGCG). V prvih devetih dneh fermentacije se je koncentracija vseh katehinov zmanjšala, nato sta se do dvanajstega dneva povečali koncentraciji EC in EGC. Pri ECG in EGCG povečanja niso opazili, zato so predvidevali, da se del ECG in EGCG pretvori v EC ali v EGC (Jayabalan in sod., 2007; Chakravorty in sod., 2016).

(22)

Vitas in sod. (2018) so v fermentiranem rmamovem čaju dokazali večjo koncentracijo fenolnih spojin kot v rmanovem čaju pred fermentacijo. Na koncentracijo fenolnih spojin vpliva tudi koncentracija zelišča, saj rmanov čaj z večjo koncentracijo zelišča vsebuje večjo koncentracijo fenolnih spojin. Razlike v koncentraciji fenolnih spojin v rmanovih poparkih in rmanovih ekstraktih so majhne, večjo koncentracijo fenolnih spojin so vsebovali rmanovi ekstrakti.

Med fermentacijo grozdnega soka se je koncentracija fenolnih spojin povečala do sedmega dneva nato pa se je rahlo zmanjšala do dvanajstega dneva fermentacije. Zmanjšanje koncentracije pripisujejo polimerizaciji nekaterih fenolnih spojin (Ayed in sod., 2017).

Po koncu fermentacije je največjo koncentracijo polifenolov vseboval datljev sirup z vrednostjo 10 °Brix, najmanjšo koncentracijo pa datljev sirup z vrednostjo 6 °Brix (Khosravi in sod., 2019). Spremembe v koncentracijah fenolnih spojin so posledica pretvorb fenolnih spojin. Te so lahko posledica znižanja vrednosti pH ali delovanja encimov (npr. fitaza, α- galaktozidaza, tanaza), ki jih proizvajajo bakterije in kvasovke (Velićanski in sod., 2014;

Chakravorty in sod., 2016; Jayabalan in sod., 2008).

Tu in sod. (2019) so v sojini sirotki dokazali spreminjajočo koncentracijo skupnih flavonoidov, katerih koncentracija se je povečala v prvih šestih dneh fermentacije, nato pa zmanjšala v naslednjih dveh dneh. Eden izmed razlogov je izločanje encimov (npr. ß- glukozidaze) med fermentacijo, ki vplivajo na hidrolizo flavonoidnih spojin. Na povečanje koncentracije flavonoidov vpliva tudi sprememba koncentracije kislin. Tu in sod. (2019) so v sojini sirotki dokazali izoflavone glicitin, genistin, glicitein in genistein. Izoflavoni so v sojini sirotki pred fermentacijo prevladali v obliki glukozidov, katerih del se je med fermentacijo pretvoril v aglikone in glukozo. Hidrolizo glukozidov do aglikonov lahko povzročijo tudi kvasovke rodu Saccharomyces.

V fermentirani kokosovi vodi so dokazali povečano koncentracijo skupnih fenolnih spojin, ferulne in p-kumarne kisline (Watawana in sod., 2016). Koncentracija skupnih fenolnih spojin je bila po fermentaciji največja v kavnih poparkih iz fino mlete kave, nato v kavnih poparkih iz grobo mlete kave, po fermentaciji kavnih poparkov iz instant kave pa ni bilo večjih sprememb. Dokazali so prisotnost klorogenske in kofeinske kisline. Koncentraciji teh kislin sta bili po fermentaciji povečani le v kavnih poparkih iz fino mlete kave (Watawana in sod., 2015).

Khosravi in sod. (2019) so dokazali pozitivni vpliv začetne koncentracije sladkorjev na vsebnost polifenolov. Postopno povečanje vsebnosti fenolnih spojin je posledica hidrolize kompleksnih fenolnih spojin, zaradi nižje vrednosti pH ali izločanja encimov, ki jih proizvajajo mikroorganizmi v naravni kulturi kombuče.

(23)

3.3 PRISOTNOST DRUGIH SPOJIN V KOMBUČI

V kombuči so prisotne tudi druge spojine, kot so etanol, CO2 ter sladkorji, kot so saharoza, glukoza in fruktoza, in jih mikroorganizmi niso porabili med fermentacijo. Tu in sod. (2019) so med fermentacijo sojine sirotke določili nihajoče spremembe v koncentraciji reducirajočih sladkorjev. Koncentracija se je prvi dan povečala, nato se je zmanjšala do tretjega dne, ko se je ponovno povečala. Pri fermentaciji kvasovke sladkor pretvorijo v etanol in CO2. Ocetnokislinske bakterije pa nato proizvedeni etanol oksidirajo v ocetno kislino.

Večja koncentracija vodikovih ionov pospeši hidrolizo saharoze v glukozo in fruktozo, ki ju nato porabljajo mikroorganizmi. To lahko razloži ohranjanje koncentracije sladkorjev po tretjem dnevu fermentacije.

Koncentraciji glukoze in fruktoze sta odvisni od koncentracije saharoze. Pri večji koncentraciji saharoze sta bili tudi koncentraciji glukoze in fruktoze večji. Koncentraciji glukoze in fruktoze sta bili po koncu fermentacije v datljevem sirupu zmanjšani, v čaju pa povečani. Povečanje koncentracije glukoze in fruktoze v fermentiranem čaju je posledica hidrolize saharoze. Mikroorganizmi za svoj metabolizem bolje izkoriščajo glukozo, saj se je koncentracija glukoze hitreje zmanjšala kot koncentracija fruktoze (Khosravi in sod., 2019).

V kavnih poparkih so določili tudi koncentracijo kofeina. Največjo koncentracijo so določili v fermentiranem kavnem poparku iz fino mlete kave. Pred fermentacijo kavnim poparkom niso odstranili kofeina. Zaradi povezanosti kofeina s pozitivnimi terapevtskimi učinki za zdravje je povečanje njegove koncentracije med fermentacijo zaželeno.

Kombuča vsebuje tudi aminokisline, vodotopne vitamine, kot so vitamin B1, vitamin B6, vitamin B12 in vitamin C ter nekatere minerale, kot so mangan, železo, nikelj, baker in cink.

Prisotni so tudi ioni, kot so fluorid, klorid, bromid, jodid, nitrat, fosfat in sulfat. Med fermentacijo se tvorijo tudi spojine, ki jih v začetnem substratu ne najdemo, in sicer D–

saharinska kislina–1,4–lakton (DSL) in isorhamnetin. Mnogo spojin pa znanstveniki še niso uspeli identificirati (Chakravorty in sod., 2019). Opazili so tudi zmanjšanje koncentracije kofeina, ter predvideli, da ga kot vir dušika porabijo mikroorganizmi (Chakravorty in sod., 2016).

(24)

4 BIOLOŠKA UČINKOVITOST SPOJIN PRISOTNIH V KOMBUČI

Kombuča je priljubljena pijača predvsem zaradi svojih pozitivnih lastnosti, povezanih z biološko učinkovitostjo. Med njimi so najpomembnejše: antioksidativna učinkovitost, protimikrobna učinkovitost, antiproliferativna učinkovitost, hipoglikemični učinek, preprečevanje nevrodegenerativnih bolezni, znižanje krvnega tlaka in ravni holesterola.

Kombuča pozitivno spodbuja delovanje jetrnih funkcij, uravnava apetit, lajša bronhitis in astmo, vpliva na znižanje menstrualnih motenj in vročinskih blisk v menopavzi. Ima tudi pozitiven vpliv na izboljšanje zdravja las, kože, nohtov in vida, lajša glavobole in nespečnost, preprečuje staranje in še mnoge druge. Poleg pozitivnih učinkov ima nekaj negativnih učinkov, ki pa jih je precej manj kot pozitivnih (Jayabalan in sod., 2014;

Villarreal-Soto in sod., 2019).

Spojine z biološko učinkovitostjo v kombuči so predvsem fenolne spojine, med katerimi prevladujejo flavonoidi (še posebej katehini), nekatere organske kisline, kot sta ocetna in glukuronska kislina ter vitamini B2, B6 in C ter katalaza (Jayabalan in sod., 2007; Malbaša in sod., 2011). Med fermentacijo potekajo pretvorbe konjugiranih oblik fenolnih spojin v njihove proste oblike. To dodatno izboljša biološko učinkovitost fermentirane kombuče in poveča njen pozitiven vpliv na zdravje (Villarreal-Soto in sod., 2018).

Biološke učinkovitosti spojin v kombuči so dokazali in vitro, redke pa so dokazali in vivo.

Nekaj raziskav so opravili na podganah ter miših (Jayabalan in sod., 2014). Vendar pa je za potrditev bioloških učinkovitosti in pozitivnih učinkov spojin prisotnih v kombuči potrebno opraviti tudi klinične raziskave.

4.1 ANTIOKSIDATIVNA UČINKOVITOST SPOJIN

Antioksidanti so spojine, ki imajo sposobnost zaviranja oksidacije drugih spojin.

Antioksidativna učinkovitost pa je učinkovitost odstranjevanja prostih radikalov (Hur in sod., 2014) in je posledica prisotnosti polifenolov, flavonoidov in askorbinske kisline (Chakravorty in sod., 2019; Jayabalan in sod., 2014). Odvisna je od strukture izomera posamezne molekule, substituentne skupine, ki je vezana na flavonoid, in od stopnje polimerizacije (Dutta in Paul, 2019). V kombuči oziroma fermentiranem čaju so dokazali večjo antioksidativno učinkovitost kot v čaju. Povečana antioksidativna učinkovitost je odvisna od trajanja fermentacije, vrste substrata in sestave naravne kulture kombuče. S trajanjem fermentacije se antioksidativna učinkovitost povečuje, a predolga fermentacija ni priporočljiva, predvsem zaradi povečane koncentracije organskih kislin med fermentacijo (Jayabalan in sod., 2014).

Metoda za določanje antioksidativne učinkovitosti je metoda lovljenja prostega radikala DPPH• (1,1–difenil–2–pikrihidrazil). Radikal DPPH• je sintetičen in je zelo stabilen.

(25)

Antioksidativna učinkovitost, določena s to metodo, se uporablja za splošno oceno in vitro sposobnosti inhibicije prostih radikalov z antioksidativnimi spojinami. Ta je večja v fermentiranih pijačah (Khosravi in sod., 2019; Tu in sod., 2019), kar pomeni, da ima fermentacijski proces pomembno vlogo pri izboljšanju sposobnosti lovljenja prostih radikalov. Ayed in sod. (2017) so mnenja, da je antioksidativna učinkovitost posledica antioksidativnih učinkovitosti različnih spojin, ki so prisotne v fermentirani pijači, in njihovih sinergističnih učinkov med določenimi metaboliti, ki nastanejo med fermentacijo.

Če imajo spojine dokazano dobro antioksidativno učinkovitost pri eni analizni metodi, jo imajo ponavadi tudi pri ostalih metodah (Watawana in sod., 2015).

Vitas in sod. (2018) so večjo antioksidativno učinkovitost določili v fermentiranem rmanovem ekstraktu kot v fermentiranem rmanovem poparku. Količina zelišča ima večji vpliv na antioksidativno učinkovitost fermentiranega rmanovega poparka kot na antioksidativno učinkovitost fermentiranega rmanovega ekstrakta.

Koncentracija skupnih fenolnih spojin je pozitivno povezana z antioksidativno učinkovitostjo spojin v pijači pred in po fermentaciji. Večja koncentracija fenolnih spojin je na splošno povezana z večjo antioksidativno učinkovitostjo. Vendar pa se antioksidativna učinkovitost povečuje do določene koncentracije fenolnih spojin, ki ji pravimo tudi meja koncentracijske nasičenosti. To pomeni, da se antioksidativna učinkovitost ne povečuje več, kljub povečevanju koncentracije fenolnih spojin (Ayed in sod., 2017).

Khosravi in sod. (2019) so dokazali, da je antioksidativna učinkovitost večja v fermentiranem črnem čaju kot v vseh vzorcih fermentiranega datljevega sirupa. Odvisna je tudi od koncentracije saharoze, saj je večja v fermentirani pijači z večjo koncentracijo saharoze v začetnem substratu. Kljub temu, da je koncentracija fenolnih spojin večja v fermentiranem datljevem sirupu (8 °Brix in 10 °Brix) kot v fermentiranem črnem čaju, je antioksidativna učinkovitost večja v slednjem. To je lahko posledica različne sestave in strukture fenolnih spojin, ki so prisotne v fermentiranem črnem čaja in datljevem sirupu.

Tu in sod. (2019) so primerjali antioksidativno učinkovitost sojine sirotke, ki so ji dodali naravno kulturo kombuče, in antioksidativno učinkovitost sojine sirotke brez kulture. V obeh vzorcih se je antioksidativna učinkovitost sčasoma povečala, a je bila v sojini sirotki s kulturo po desetih dneh precej večja. Med fermentacijo poteka tudi hidroliza izoflavonskih glikozidov na ustrezne aglikone. Slednji naj bi imeli močnejšo antioksidativno učinkovitost kot njihovi pripadajoči prekurzorji β-glukozidi. Zato lahko povečanje vsebnosti aglikonov pojasni razlog za izboljšano antioksidativno učinkovitost. Poleg tega so se med fermentacijo tvorile tudi druge spojine, kot so razni polifenoli, glukonska in glukuronska kislina.

Antioksidativna učinkovitost je bila v fermentirani kokosovi vodi precej večja kot v kokosovi vodi pred fermentacijo (Watawana in sod., 2016). Med fermentiranimi kavnimi

(26)

poparki je imel največjo antioksidativno učinkovitost kavni poparek iz fino mlete kave, tako pred fermentacijo kot po njej (Watawana in sod., 2015).

4.2 PROTIMIKROBNA UČINKOVITOST

Fermentirane pijače imajo dokazano protibakterijsko in protiglivno učinkovitost (Ayed in sod., 2017; Vitas in sod., 2018; Tu in sod., 2019). Protimikrobno učinkovitost je posledica prisotnosti organskih kislin, in tudi drugih bioaktivnih spojin ali metabolitov, ki nastanejo med fermentacijo (npr. polifenoli, flavonoidi, bakteriocini in encimi) (Tu in sod., 2019).

Vitas in sod. (2018) so dokazali protimikrobno učinkovitost fermentiranega rmanovega čaja proti bakterijam Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis in Bacillus subtilis, in kvasovkam Candida albicans in Aspergillus niger. Večjo protimikrobno učinkovitost so imeli fermentirani rmanovi poparki.

Tudi fermentiran grozdni sok je ime protimikrobno učinkovitost proti bakterijam E. coli, Pseudomonas aeruginosa, K pneumonia, S. aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus in Staphylococcus epidermis. Največjo protimikrobno učinkovitost so dokazali proti bakterijam S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumonia, E. coli in B. cereus. Primerjali so tudi protimikrobno učinkovitost nefermentiranega grozdnega soka in nevtraliziranega ferementiranega grozdnega soka. Nefermentiran grozdni sok ni imel protimikrobne učinkovitosti, nevtraliziran fermentiran grozdni sok je imel le bakteriostatično učinkovitost proti S. aureus, vendar je bila le-ta precej manjša kot v fermentiranem grozdnem soku (Ayed in sod., 2017). Ti rezultati pa so v nasprotju z rezultati, ki so jih pridobili Sreeramulu in sod.

(2000), ki so dokazali, da imata nevtralizirana kombuča in kombuča po termični denaturaciji protimikrobno učinkovitost proti bakterijam E. coli, Shigella sonnei, Salmonella enteriditis in Salmonella typhimurium.

Protimikrobno učinkovitost sojine sirotke so testirali proti bakterijam S. aureus, E. coli in B.

subtilis. Primerjali so nefermentirano sojino sirotko, fermentirano sojino sirotko, nevtralizirano fermentirano sojino sirotko, toplotno denaturirano fermentirano sojino sirotko in raztopino ocetne kisline. Nefermentirana sojina sirotka ni imela protimikrobne učinkovitosti. Najboljšo protimikrobno učinkovitost je imela fermentirana sojina sirotka.

Nevtralizirana fermentirana sojina sirotka in toplotno denaturirana fermentirana sojina sirotka sta imeli podobno protimikrobno učinkovitost proti bakterijam S. aureus in E. coli.

Protimikrobno učinkovitost proti bakterijam B. subtilis sta imela le fermentirana sojina sirotka in ocetna kislina (Tu in sod., 2019).

Protimikrobna učinkovitost ni le posledica nizke vrednosti pH, ampak tudi vsebnosti drugih biološko aktivnih spojin ali metabolitov, ki se tvorijo med fermentacijo. Ocetna kislina je poznana kot glavna spojina s protimikrobno učinkovitostjo v kombuči (Sreeramulu in sod.,

(27)

2000). Spojine v kombuči so pokazale dobro protimikrobno učinkovitost, in pridobljeni rezultati kažejo, da ima kombuča potencial kot protimikrobno sredstvo.

4.3 ANTIPROLIFERATIVNA UČINKOVITOST

Z MTT (3–(4,5-dimetiltiazol–2–il)–2,5 difenil tetrazolij bromid) analizo so Vitas in sod.

(2018) ugotavljali vpliv fermentiranega rmanovega čaja na zaviranje tvorb in razvoja rakastih celic. Uporabili so tri različne rakave celice: celično linijo, ki izvira iz človeške rabdomiosarkome (RD), celično linijo, ki izvira iz človeške karcinogenega materničnega vratu Hep2c (HeLa) in celično linijo, ki izvira iz murin fibroblasta (L2OB). Vsi vzorci so pokazali antiproliferativno učinkovitost. Fermentirane pijače iz rmanovih poparkov so najučinkovitejše zavirali razvoj celic Hep2c, fermentirane pijače iz rmanovih ekstraktov so najučinkovitejše zavirale razvoj celic RD. Antiproliferativna učinkovitost je bila večja v fermentiranih rmanovih poparkih kot v fermentiranih rmanovih ekstraktih (Vitas in sod., 2018).

4.4 UČINKOVITOST ZAVIRANJA ŠKROBNE HIDROLAZE

Škrobna hidrolaza je ime za skupino encimov, ki hidrolizirajo škrob do enostavnih sladkorjev. V to skupino spadata α-amilaza in α-glukozidaza. Zaviralci oziroma inhibitorji so snovi, ki zavirajo delovanje encimov. Polifenoli so poznani zaviralci škrobne hidrolaze (Watawana in sod., 2016).

Učinkovitost zaviranja škrobne hidrolaze so Watawana in sod. (2015; 2016) določali med fermentacijo kokosove vode in kave. Po koncu sedemdnevne fermentacije so večjo učinkovitost zaviranja škrobne hidrolaze določili v fermentirani kokosovi vodi. Povečana učinkovitost bi lahko bila posledica povečanja koncentracije polifenolov in drugih spojin, ki nastajajo med fermentacijo in zavirajo delovanje škrobne hidrolaze. To pomeni, da naj bi imele vse fermentirane pijače učinkovitost zaviranja razgradnje škroba in posledično sproščanja glukoze v fiziološki sistem.

Vse pijače boljše zavirajo delovanje α-amilaze kot α-glukozidaze. Ker je α-amilaza potrebna za kaskadno reakcijo α-glukozidaze, je zaviranje a α-amilaze bolj pomembno. Zato bi lahko bile kava, kokosova voda in nekatere druge pijače, fermentirane z naravno kulturo kombuče, obravnavane kot koristne v smislu preprečevanja razgradnje škroba in kasnejšega izločanja glukoze v fiziološki sistem (Watawana in sod., 2015; Watawana in sod., 2016).

(28)

5 POVZETEK

V sklopu diplomske dela smo najprej opredelili kaj je kombuča, nato pa raziskali potek fermentacije ter opredelili vpliv različnih pogojev med fermentacijo na vsebnost spojin in njihovo biološko učinkovitost. Fermentacija z naravno kulturo kombuče je kombinacija alkoholne, ocetnokislinske in mlečnokislinske fermentacije. Proces začnejo ozmotolerantni mikroorganizmi, zaključijo pa ga acidotolerantni mikroorganizmi. Raziskali smo tudi potencialne druge substrate, kot so rmanov čaj, grozdni sok, datljev sirup, sojino sirotko, kokosovo vodo in kavo.

Na potek fermentacije vplivajo izbira substrata, trajanje fermentacije, temperatura, vrednost pH in vsebnost skupnih kislin. Trajanje fermentacije je pogojeno s senzoričnimi lastnostmi, ki so povezane z izbiro substrata ter naraščanjem vsebnost skupnih kislin. Senzorično najbolj primerna za uživanje je sojina sirotka po šestih dnevih fermentacije pri konstantni temperaturi med 20 °C in 30 °C.

Mnenja raziskovalcev so v literaturi velikokrat nasprotujoča, predvsem zaradi uporabe različnih metod in različnih analiz spojin kombuče. Vsi pa so enotni, da dodatek naravne kulture kombuče pozitivno vpliva na fermentacijo ter posledično sestavo, senzorične lastnosti in biološke učinkovitosti spojin. Po fermentaciji so dokazali znižanje vrednosti pH ter povečanje vsebnosti skupnih kislin. Koncentracija organskih kislin po fermentaciji je odvisna od kemijske sestave uporabljenega substrata, prevladujejo pa: ocetna, glukonska in glukuronska kislina.

V fermentirani pijači prevladujejo fenolne spojine: teaflavini, tearubigini, katehini in drugi.

Med fermentacijo poteka pretvorba fenolnih spojin iz ene v drugo. Kot glavna produkta alkoholne fermentacije kombuča vsebuje tudi etanol in CO2. V manjših koncentracijah se v kombuči nahajajo tudi aminokisline, nekateri vitamini in minerali ter nekatere neraziskane spojine.

Kombuča je priljubljena pijača tudi zaradi biološke učinkovitosti prisotnih spojin. V prihodnosti so potrebne raziskave povezane s kinetiko fermentacije, s katerimi bi identificirali proizvedene spojine in metabolite ter njihove biološke učinkovitosti.

(29)

6 VIRI

Ayed L., Ben Abid S., Hamdi M. 2017. Development of a beverage from red grape juice fermented with the Kombucha consortium. Annals of Microbiology, 67, 1: 111–121

Chakravorty S., Bhattacharya S., Bhattacharya D., Sarkar S., Gachhui R. 2019. Kombucha:

a promising functional beverage prepared from tea. V: The science of beverages. Vol.

6: Non-alcoholic beverages. Grumezescu A.M., Holban A.M. (ur.). Cambridge, Woodhead Publishing: 285-327

Chakravorty S., Bhattacharya S., Chatzinotas A., Chakraborty W., Bhattacharya D., Gachhui R. 2016. Kombucha tea fermentation: Microbial and biochemical dynamics.

International Journal of Food Microbiology, 220: 63–72

Chen C., Liu B.Y. 2000. Changes in major components of tea fungus metabolites during prolonged fermentation. Journal of Applied Microbiology, 89: 834-839

Dufresne C., Farnworth E. 2000. Tea, Kombucha, and health: a review. Food Research International, 33: 409-421

Dutta H., Paul S.K. 2019. Kombucha drink: production, quality and safety aspects. V: The science of beverages. Vol. 1: Production and management of beverages. Grumezescu A.M., Holban A.M. (ur.). Cambridge, Woodhead Publishing: 259-288

Hur S.J., Lee S.J, Kim Y.C., Choi I., Kim G.-B. 2014. Effect of fermentation on the antioxidant activity in plant-based foods. Food Chemistry, 160: 346–356

Jayabalan R., Malbaša R.V., Lončar E.S., Vitas J.S., Sathishkumar M. 2014. A review on kombucha tea – Microbiology, composition, fermentation, beneficial effects, toxicity and tea fungus. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 13: 538- 550

Jayabalan R., Marimuthu S., Swaminathan K. 2007. Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation. Food Chemistry, 102: 392-398

Jayabalan R., Subathradevi P., Marimuthu S., Sathishkumar M., Swaminathan K. 2008.

Changes in free-radical scavenging ability of kombucha tea during fermentation. Food Chemistry, 109: 227–234

Khosravi S., Safari M., Emam-Djomeh Z. 2019. Development of fermented date syrup using Kombucha starter culture. Journal of Food Processing and Preservation, 43, 2: e13872,

(30)

doi: 10.1111/jfpp.13872: 10 str.

Knöllern A., Widenmeyer M., Bill J. 2020. Fast-growing bacterial cellulose with outstanding mechanical properties via cross-linking by multivalent ions. Materials, 13: 2838, doi:10.3390/ma13122838: 9 str.

Lončar E., Djurić M., Malbaša R., Kolarov L.J., Klašnja M. 2006. Influence of working conditions upon kombucha conducted fermentation of black tea. Food and Bioproducts Processing, 84, 3: 186-192

Malbaša R.V., Lončar E.S., Vitas J.S., Čanadanović‐Brunet J.M. 2011. Influence of starter cultures on the antioxidant activity of kombucha beverage. Food Chemistry, 127, 4:

1727-1731

Marsh A.J., O'Sullivan O., Hill C., Ross R.P., Cotter P.D. 2014. Sequence-based analysis of the bacterial and fungal compositions of multiple kombucha (tea fungus) samples. Food Microbiology, 38: 171-178

Mukadam T.A., Punjabi K., Deshpande S.D., Vaidya S.P., Chowdhary A.S. 2016. Isolation and characterization of bacteria and yeast from kombucha tea. International Journal of Current Microbiology Applied Sciences, 5, 6: 32–41

Neffe‐Skocińska K., Sionek B., Ścibisz I., Kołożyn‐Krajewska D. 2017. Acid contents and the effect of fermentation condition of Kombucha tea beverages on physicochemical, microbiological and sensory properties. CyTA – Journal of Food, 15, 4: 601–607

Sreeramulu G., Zhu Y., Knol W. 2000. Kombucha fermentation and its antimicrobial activity. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 48, 6: 2589-2594

Tu C., Tang S., Azi F., Hu W., Dong M. 2019. Use of kombucha consortium to transform soy whey into a novel functional beverage. Journal of Functional Foods, 52: 81-89

Velićanski A.S., Cvetković D.D., Markov S.L., Šaponjac V.T.T., Vulić J.J. 2014.

Antioxidant and antibacterial activity of the beverage obtained by fermentation of sweetened lemon balm (Melissa officinalis L.) tea with symbiotic consortium of bacteria and yeasts. Food Technology and Biotechnology, 52, 4: 420-429

Villarreal-Soto S.A., Beaufort S., Bouajila J., Souchard J.-P., Taillandier P. 2018.

Understanding kombucha tea fermentation: a review. Journal of Food Science, 83, 3:

580-588

(31)

Villarreal-Soto S.A., Beaufort S., Bouajila J., Souchard J.-P., Renard T., Rollan S., Taillandier P. 2019. Impact of fermentation conditions on the production of bioactive compounds with anticancer, antiinflammatory and antioxidant properties in kombucha tea extracts. Process Biochemistry, 83: 44–54

Vitas J. S., Cvetanović A. D., Mašković P. Z., Švarc-Gajić J. V. 2018. Chemical composition and biological activity of novel types of kombucha beverages with yarrow. Journal of Functional Foods, 44: 95-102

Watawana M. I., Jayawardena N., Gunawardhana C. B., Waisundara V. Y. 2016.

Enhancement of the antioxidant and starch hydrolase inhibitory activities of king coconut water (Cocos nucifera var. aurantiaca) by fermentation with kombucha “tea fungus”. International Journal of Food Science and Technology, 51: 490-498

Watawana M. I., Jayawardena N., Waisundara V. Y. 2015. Enhancement of the functional properties of coffee through fermentation by “tea fungus” (kombucha). Journal of Food Processing and Preservation, 39: 2596–2603