VPLIV SELENA NA TRANSPORT ŽIVEGA SREBRA VZDOLŽ PREHRANJEVALNE VERIGE

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA

Predmetno poučevanje Biologija-Kemija

Špela Kržišnik

VPLIV SELENA NA TRANSPORT ŽIVEGA SREBRA VZDOLŽ PREHRANJEVALNE VERIGE

Magistrsko delo

Ljubljana, 2015

PEDAGOŠKA FAKULTETA Predmetno poučevanje

Biologija-Kemija

Špela Kržišnik

VPLIV SELENA NA TRANSPORT ŽIVEGA SREBRA VZDOLŽ PREHRANJEVALNE VERIGE

Magistrsko delo

Mentor: prof. dr. Katarina Vogel Mikuš Somentor: doc. dr. Primož Zidar

Ljubljana, 2015

Magistrsko delo je zaključek univerzitetnega študija II. bolonjske stopnje, smer predmetno poučevanje: Biologija‒Kemija. Opravljeno je bilo na Katedri za botaniko in fiziologijo rastlin, oddelka za biologijo, Biotehniške fakultete, Univerze v Ljubljani. Priprava materiala za meritve elementov je potekala na Inštitutu Jožef Štefan ter na Kemijskem inštitutu.

Meritve koncentracije elementov smo izvedli v Laboratoriju za analizno kemijo na Kemijskem inštitutu v Ljubljani.

Študijska komisija je za mentorico magistrske naloge imenovala prof. dr. Katarino Vogel- Mikuš in somentorja doc. dr. Primoža Zidarja.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: doc. dr. Anita Jemec

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Mentor: prof. dr. Katarina Vogel-Mikuš

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Somentor: doc. dr. Primož Zidar

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Recenzentka: prof. dr. Mateja Germ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Datum zagovora: 9.11. 2015

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Podpisana se strinjam z objavo svojega magistrskega dela v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Pedagoške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.

ZAHVALA

Zahvaljujem se mentorici prof. dr. Katarini Vogel-Mikuš in somentorju doc. dr. Primožu Zidarju za pomoč in vodenje v času pripravljanja magistrskega dela.

Za pomoč pri meritvah se zahvaljujem Dr. Hansu van Elternu in mladi raziskovalki Marti Debeljak iz Laboratorija analizne kemije na Kemijskem inštitutu Ljubljana.

Zahvaljujem se tudi Evi Kovačec, Mateji Potisek, Moniki Kos in Mileni Kubelj za pomoč in usmeritve pri izvedbi poskusov.

Zahvaljujem se vsem zaposlenim na Inštitutu Jožef Štefan, še posebno Petri Osterman in Diani Marguč, ki sta mi pomagali pri pripravi materiala za analizo elementov.

Topla zahvala gre tudi vsem ostalim, ki jih nisem izrecno omenila in ste mi kakor koli pomagali pri izvedbi mojega magistrskega dela.

POVZETEK

Idrija je mesto, ki je poznana po 500‒letnem rudarjenju živega srebra v drugem največjem rudniku na svetu. Vpliv živega srebra je v Idriji še vedno zelo velik, kljub dejstvu, da tam že več kot trideset let ne rudarijo več. V zadnjih dvajsetih letih so pričeli živemu srebru v okolju zaradi njegove strupenosti posvečati veliko pozornost. Večletno rudarjenje je v Idriji pustilo velike posledice za okolje, tla in tudi za zdravje ljudi. Živo srebro je kemijsko zelo aktivno, prisotno je v verigi biogeokemijskega kroženja in globalnega razširjanja. Proučuje se ga zaradi njegovih pretvorb v okolju ter kopičenja v prehranjevalnih verigah. Koncentracija živega srebra se je tekom rudarjenja in predelave rude v tleh močno povečala. Danes so v tleh še vedno prisotne koncentracije živega srebra nad dovoljeno mejno vrednostjo (0,05 mg kg^-1 suhe snovi), vendar pa so le-te še zmeraj nižje od časa rudarjenja.

Z magistrskim delom smo hoteli ugotoviti, ali selen (Se) vpliva na privzem in transport živega srebra preko prehranjevalne verige. Najprej smo proučili, kako različne koncentracije živega srebra in selena vplivajo na rast rastlin in privzem različnih elementov v rastline.

Zemljo smo tretirali z različnimi koncentracijami živega srebra in vanjo posadili solato. Po štirinajstih dneh rasti smo na solato, foliarno nanesli raztopino selena. Nadalje so nas zanimale koncentracije živega srebra in selena v rakih enakonožcih, ki smo jih hranili s solato, tretirano z različnimi koncentracijami živega srebra.

Rezultati kažejo, da vnos Se zavira prenos Hg preko prehranjevalne verige. Biofortifikacija rastlin s Se lahko tako pomembno prispeva k zmanjšanju vnosa Hg v živalski organizem.

KLJUČNE BESEDE

Živo srebro, selen, onesnaženost, prehranjevalna veriga, raki enakonožci

ABSTRACT

Idrija is a small city well known for its 500 year mining history of mercury (Hg) in the second largest Mg mine in the world. The impact of Hg in Idrija is still very prominent, despite the fact that the mining stopped more than 30 years ago. In the past thirty years lots of attention is paid to Hg in the environment due to its toxicity. Several years of mining in Idrija left a significant impact on the environment, soil and human health. Mercury (Hg) is chemically very active and present in the chain of biogeochemical cycling and global spreading. Hg can undergo several chemical transformations in environment and can accumulate in the food chains with biomagnification pattern.

Today the concentration of Hg in the soil at the near vicinity of Idrija still exceed the legal limits (0.05 mg kg^-1 of dry matter), but are lower than during the mining period.

The master's thesis aimed to investigate whether selenium affects the uptake and transport of mercury through the food chain. First, we examine how different concentrations of Hg and Se affect plant growth and Hg and Se uptake in plants. The substrate was contaminated with different concentrations of Hg and put in the pots where the lettuce was planted. After 14 days of growth the salad was foliarly sprayed with solution of selenium.

Furthermore, we were interested in concentrations of Hg and Se in crustaceans, isopods, which were fed with lettuce treated with different combinations of Hg and Se.

The results show that foliar spraying with Se lowers Hg concentrations in plants and therefore further in the food chains. Biofortification of plant with Se may therefore contribute to reduction of Hg load in animals and humans.

KEY WORDS

Mercury, Selenium, pollution, food chain, Isopods

Kazalo vsebine

1 UVOD ... 1

2 PREGLED OBJAV ... 3

2.1 TEŽKE KOVINE ... 3

2.1.1 Kaj so težke kovine ... 3

2.2 ŽIVO SREBRO ... 3

2.2.1 Fizikalne in kemijske lastnosti živega srebra ... 3

2.2.2 Živo srebro v okolju ... 4

2.2.3 Izpostavljenost težkim kovinam ... 5

2.2.3 Živo srebro v rastlinah ... 6

2.2.4 Živo srebro v živalih ... 7

2.3 SELEN ... 8

2.3.1 Fizikalne in kemijske lastnosti selena ... 8

2.3.2 Selen v okolju ... 8

2.3.3 Selen v rastlinah ... 9

2.3.4 Selen v živalih ... 10

2.4.1 Interakcije med živim srebrom in selenom ... 10

2.5 POSKUSNI ORGANIZMI ... 11

2.5.1 Solata (Lactuca sativa L.) ... 11

2.5.2 Navadni prašiček (Porcellio scaber) ... 11

3 CILJI RAZISKAVE IN HIPOTEZE ... 13

3.1 CILJI ... 13

3.2 HIPOTEZE ... 13

4 METODE DELA ... 14

4.1 VPLIV SELENA NA PRIVZEM IN AKUMULACIJO ŽIVEGA SREBRA NA PRVEM TROFIČNEM NIVOJU ... 14

4.1.1 Kontaminacija zemlje ... 14

4.1.2 Gojenje solate... 14

4.1.3 Tretiranje solate s selenom ... 15

4.1.4 Priprava rastlin za meritve... 16

4.1.5 Merjenje fotokemične aktivnosti fotosistema II ... 16

4.1.6 Merjenje fotosinteznih pigmentov ... 16

4.1.7 Določanje koncentracij elementov v vzorcih ... 17

4.2 VPLIV SELENA NA PRIVZEM IN AKUMULACIJO ŽIVEGA SREBRA NA DRUGEM TROFIČNEM NIVOJU ... 21

4.2.1 Izbira organizma za poskus ... 21

4.2.2 Priprava hrane ... 21

4.2.3 Zasnova poskusa ... 23

4.2.4 Priprava živali za LA ICP-MS ... 24

4.2.5 Metoda laserske ablacije masne spektroskopije ... 26

4.3 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV ... 26

5. REZULTATI ... 27

5.1 SUHA MASA RASTLIN ... 27

5.2 ANALIZA FOTOKEMIČNE AKTIVNOSTI FOTOSISTEMA II ... 28

5.3 ANALIZA FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV ... 29

5.4 ANALIZE ELEMENTOV V SOLATI ... 30

5.4.1 Koncentracije živega srebra ... 30

5.4.2 Vsebnosti živega srebra ... 32

5.4.3 Translokacijski faktor ... 33

5.4.4 Koncentracije Selena ... 34

5.3.5 Vsebnosti selena ... 35

5.5 MERJENI PARAMETRI PRI ŽIVALIH ... 37

5.5.1 Učinkovitost rasti ... 37

5.5.2 Stopnja prehranjevanja ... 38

5.5.3 Smrtnost poskusnih organizmov ... 39

5.6 ANALIZE ELEMENTOV V ŽIVALIH ... 40

5.6.1 Živo srebro in selen ... 40

5.7 LOKALIZACIJA IN MAPIRANJE ŽIVEGA SREBRA V ŽIVALIH ... 41

6 DISKUSIJA ... 47

6.1 SUHA MASA RASTLIN ... 47

6.2 FOTOKEMIČNA UČINKOVITOST FS II IN FOTOSINTEZNI PIGMENTI ... 47

6.3 ANALIZA Hg in Se V RASTLINAH ... 48

6.4 MERJENJE PARAMETROV PRI ŽIVALIH ... 49

6.5 ANALIZA ELEMENTOV V ŽIVALIH ... 49

7 SKLEPI ... 51

8 VIRI ... 52

Kazalo slik

Slika 1: Kroženje živega srebra ... 5

Slika 2: Rak enakonožec (Porcellio scaber) (wikimedia, 2013) ... 11

Slika 3: Prebavni sistem rakov enakonožcev (Hopkins, 1989) ... 12

Slika 4: Gojenje solate v rastnih komorah ... 15

Slika 5: Mikrovalovna pečica ... 17

Slika 6: ICP-MS (Kemijski inštitut, Ljubljana) ... 20

Slika 7: Hidravlična stiskalnica na IJS ... 23

Slika 8: Hranjenje živali v petrijevkah ... 24

Slika 9: Območje rezin pri rakih enakonožcih (Padovan, 2005) ... 25

Slika 10: Pripravljene rezine živali za LA ICP-MS ... 26

Slika 11: Prečni prerez raka enakonožca (Povzeto po Kos, 2013) ... 42

Slika 12: Prečni prerez raka enakonožca z oznakami ... 42

Slika 13: Koncentracijska mapa porazdelitve Hg in Se v živali z oznakami ... 42

Kazalo tabel Tabela 1: Tretmaji zemlje v poskusu ... 14

Tabela 2: Priprava standardnih raztopin za kalibracijo Hg ( IS-interni standard) ... 18

Tabela 3: Priprava standardnih raztopin za kalibracijo Hg (IS-interni standard) ... 19

Tabela 4: Povprečne koncentracije Hg in Se v hrani za hranjenje živali ... 22

Tabela 5: Hranjenje živali s solato ... 23

Tabela 6: Smrtnost rakov enakonožcev (Porcellio scaber) ... 39

Tabela 7: Lokalizacija Hg v tkivih živali (Porcellio scaber) iz različnih tretmajev ... 43

Kazalo prilog Tabela 8: Koncentracije Hg in Se v solati ... 56

Tabela 9: Vsebnosti Hg in Se v solati ... 57

Tabela 10: Vsebnost Hg in Se v živalih ... 58

Kazalo grafov

Graf 1: Kalibracijska krivulja ... 20

Graf 2: Suha masa poganjkov solate ... 27

Graf 3: Suha masa korenin solate ... 28

Graf 4: Fotokemična učinkovitost solate ... 29

Graf 5: Fotosintezni pigmenti pri solati ... 30

Graf 6: Koncentracije Hg v poganjkih solate ... 31

Graf 7: Koncentracije Hg v koreninah solate ... 31

Graf 8: Vsebnosti Hg v poganjkih solate... 32

Graf 9: Vsebnosti Hg v koreninah solate... 33

Graf 10: Translokacijski faktor v solati ... 33

Graf 11: Koncentracije Se v poganjkih solate ... 34

Graf 12: Koncentracije Se v koreninah solate ... 35

Graf 13: Vsebnosti Se v poganjkih solate ... 36

Graf 14: Vsebnost Se v koreninah solate... 36

Graf 15: Translokacijski faktor v solati ... 37

Graf 16: Učinkovitost rasti pri rakih enakonožcih ... 38

Graf 17: Stopnja prehranjevanja pri rakih enakonožcih ... 39

Graf 18: Vsebnost Hg pri rakih enakonožcih ... 40

Graf 19: Vsebnost Se pri rakih enakonožcih ... 41

Okrajšave in simboli

Ca kalcij

CaCO3 kalcijev karbonat Ca(NO3)2 kalcijev nitrat (CH3)2Hg dimetil živo srebro Cys aminokislina cistein

Cu baker

Cd kadmij

Co kobalt

Fe železo

FeNaEDTA železo natrijev etilendiamintetraocetna kislina Ga galij

Ge germanij

Hg živo srebro

Hg⁰ elementarno živo srebro Hg⁺ enovalentno živo srebro Hg²⁺ dvovalentno živo srebro HCl klorovodikova kislina HNO3 dušikova (V) kislina

H2O voda

HgO živosrebrov oksid

HgS živosrebrov sulfid

HgSe živorebrov selen

ICP-MS induktivno sklopljena plazma z masno spektrometrijo IS interni standard

K kalij

KNO3 kalijev nitrat K2SeO4 dikalijev selenat

LA ICP-MS laserska ablacija masne spektrometrije

Ni nikelj

Me-Hg+ metil živo srebro MetSeCys metionin seleno cistein Mg magnezij

MgSO4 x 7 H20 magnezijev sulfat

Mn mangan

P fosfor

Pb svinec

Ppm parts per million Ppb parts per billion

S žveplo

Sc skandij

Se selen

Se⁰ elementaren selen

Se²⁺ dvovalentni selen

Se(IV) štirivalentni selen Se Met seleno metionin Se Cys aminokislina cistein SeO32- selenit

SeO42- selenat Te telur

TK težke kovine

WHO svetovna zdravstvena organizacija

Y itrij

Zn cink

1 UVOD

Mesto Idrija leži v severozahodnem delu Slovenije in je poznana po 500‒letnem rudarjenju živega srebra v drugem največjem rudniku na svetu. V Idriji že več kot trideset let ne rudarijo več, a vendar je vpliv Hg še vedno prisoten. Večletno rudarjenje je pustilo velike posledice za okolje, tla in zdravje ljudi. Koncentracija Hg se je tekom rudarjenja in predelave rude v tleh močno povečala. Danes so v tleh še vedno prisotne koncentracije Hg nad dovoljeno mejno vrednostjo (0,05 mg kg^-1 suhe snovi), čeprav so le-te manjše od časa rudarjenja (DEDI, 2015).

Hg je težka srebrno‒bela kovina, za industrijo sicer zelo zanimiva, medtem ko je za organizme zelo strupena. Kljub strupenosti se v industriji uporablja za polnjenje termometrov, barometrov, uporabljajo ga tudi v električnih stikalih, za amalgamiranje kovin ter v varčnih sijalkah (WIKIPEDIA, 2015).

Različne oblike Hg, ki se pojavljajo v okolju, se razlikujejo po njihovi strupenosti in vplivu na telo živih organizmov. V naših raziskavah smo ugotovili, da se v nekaterih rastlinah Hg pojavlja nad dovoljeno mejno vrednostjo, ki je 0,05 mg kg^-1 suhe snovi (Kržišnik, 2014).

Rastline privzemajo Hg iz tal, kot vse druge snovi, lahko pa tudi iz zraka skozi listne reže (Patra in Sharma, 2010).

Rastline so večinoma prve, ki sprejemajo kovine, ki vstopajo v kopenske ekosisteme iz zraka, tal ali vode (Povzeto po Gnamuš, 2002). Hg je kovina, ki nima poznane biološke vloge. Živosrebrove spojine so za rastline zelo strupene, koncentracije v rastlinskih tkivih pa se večajo s starostjo rastline (Jimenez in sod., 2005). Dolgoročno gledano se rastline na močno onesnaženih območij lahko prilagodijo z razvojem nekaterih fizioloških mehanizmov, ki omogočajo toleranco na zračne in talne vsebnosti Hg (Prasad, 1997).

Privzem tega elementa v rastline naravnih rastišč je v veliki meri odvisen od stopnje obremenjenosti okolja, meteoroloških pogojev, načina in obsega izpostavljenosti, značilnosti rastišča, metabolnega stanja in starosti rastlin ter mikroklimatskih pogojev.

Rastline akumulirajo Hg v ionski obliki. Kopenske rastline privzemajo hlapni Hg⁰ z zrakom skozi listne reže, Hg²⁺ in Me‒Hg⁺ pa vstopata v rastline skozi koreninski sistem. Privzem Hg je najbolj učinkovit pri mladih rastlinah (Povzeto po Gnamuš, 2002).

Selen (Se) je esencialen element za ljudi, za rastline pa esencialnost ni dokazana. Pri rastlinah lahko pozitivno vpliva na njihovo rast in obrambo pred antioksidacijskim stresom.

Vsebnost v rastlinah je odvisna od vsebnosti elementa v tleh in sposobnosti rastline za privzem tega elementa (Smrkolj idr., 2005). V prevelikih koncentracijah je za rastline strupen, zato se pri dodatku K2SeO4 ne sme preseči tolerančnega območja. Tolerančno območje za rastline je odvisno od starosti rastlin, pri čemer so mlajše bolj občutljive, od vrste rastlin (neakumulacijske, indikatorske ali akumulacijske) ter od prisotnosti sulfatnih ionov (Terry in sod., 2000).

Se je eden izmed elementov, ki lahko reagira z Me‒Hg⁺ in Hg⁺ ali Hg²⁺. V nedavnih študijah so dokazali, da Se lahko zmanjša negativne vplive Hg in pozitivno vpliva na rast in preživetje živali (Penglase in sod., 2014).

Cilj našega raziskovanja je bil proučiti prenos Hg in Se po prehranjevalni verigi. V prvem delu poskusov smo želeli ugotoviti, kako Se in Hg vplivata na rast solate, in kako se v njej razporejata. V drugem delu poskusov pa smo želeli ugotoviti, kako Hg in Se vplivata na prehranjevalne navade, rast in preživetje rakov enakonožcev, ki so primarni herbivori in razkrojevalci.

2 PREGLED OBJAV

2.1 TEŽKE KOVINE

2.1.1 Kaj so težke kovine

Težke kovine (TK) so definirane kot kovinski elementi, ki imajo relativno visoko gostoto v primerjavi z vodo in so strupene že pri nizkih koncentracijah. So skupina kovin, ki imajo specifično gostoto večjo od 5 kg dm^-3. Med TK uvrščamo Hg, Pb, Cd, Ni, Co, Fe, Ag idr.

Čeprav so naravni elementi, ki jih najdemo po vsej zemeljski skorji, je onesnaženje okolja s temi kovinami vpliv človekove dejavnosti, npr. rudarjenje, industrijske proizvodnje in uporabe, ter domače in kmetijske rabe kovin in spojin z vsebnostjo kovin (Tchounwou in sod., 2014). TK so pomembni onesnaževalci v okolju, zaradi svoje strupenosti pa predstavljajo vedno večje težave tako z vidika ekologije, evolucije, kot tudi prehrane (Nagajyoti in sod., 2010).

2.2 ŽIVO SREBRO

2.2.1 Fizikalne in kemijske lastnosti živega srebra

Ime Hg izhaja iz besede hydrargyrium, kar v grščini pomeni hidros ‒ voda in agyrum ‒ srebro. Hg se z atomskim številom 80 v periodnem sistemu nahaja med prehodnimi elementi.

Oksidacijsko število vseh elementov v tej skupini je +2, le za Hg pa so znane tudi spojine z oksidacijskim številom +1. Je edina kovina, ki je pri sobni temperaturi (25 ºC) v tekočem stanju (Povzeto po Brenčič in Lazarini, 1995).

Hg se lahko v naravi nahaja v elementarnem stanju (Hg⁰), večinoma pa je v obliki minerala cinabarita (HgS), ki je škrlatno rdeče do temno rdeče barve. Pri segrevanju minerala cinabarita na zraku nastaneta Hg in SO2. Na zraku je Hg obstojen in se pri 300 ºC spoji s kisikom v oksid (HgO). Reagira lahko s kislinami, ki so oksidanti, in lahko raztaplja različne kovine. Zlitine, ki pri tem nastanejo, imenujemo amalgami (Povzeto po Brenčič in Lazarini, 1995).

Živo srebro v naravi nastopa v treh oksidacijskih stanjih:

 elementarno živo srebro (Hg⁰),

 enovalentno živo srebro (Hg⁺),

 dvovalentno živo srebro (Hg²⁺).

Živo srebro lahko v naravi nastopa tudi v organski obliki, ki nastane iz anorganske.

Anorganske oblike se v organske pretvarjajo s procesom metilacije‒dimetilacije s pomočjo bakterij (Holmes, 2009).

Najbolj poznani organski obliki sta:

 Me–Hg: metil živo srebro (CH3Hg⁺),

 dimetil živo srebro (CH3)2Hg.

Hg je element, ki se pretvarja v različne kemijske oblike zaradi vpliva abiotskih dejavnikov, kot so vlažnost, temperatura in pH in biotske dejavnosti (Nolde idr., 2004). Obstaja v različnih oblikah: elementarno živo srebro, anorgansko, kateremu so ljudje lahko poklicno izpostavljeni, in organsko, kateremu so lahko ljudje izpostavljeni preko hrane. Te oblike Hg se razlikujejo po stopnji njihove strupenosti in njihovih učinkov na živčni, prebavni in imunski sistem, pljuča, ledvice, kožo ter oči. Elementaren Hg in Me‒Hg sta strupena za centralni in periferni živčni sistem. Vdihavanje hlapov lahko povzroči škodljive učinke na živčni, prebavni in imunski sistem, pljuča ter ledvice. Anorganske soli tega elementa so jedke za kožo, oči in prebavni trakt, ob zaužitju pa lahko povzročijo tudi odpoved ledvic (WHO, 2013).

V preteklih raziskavah smo ugotovili, da se Hg na območju Idrije še vedno pojavlja v visokih koncentracijah, ki so nad dovoljeno mejno vrednostjo 0,5 mg kg^-1 suhe snovi (Kržišnik, 2013; Miklavčič in sod., 2013).

2.2.2 Živo srebro v okolju

V atmosferi je približno 95 % Hg⁰. V atmosfero vstopa preko naravnih emisij, kot so izhlapevanje iz tal, skal ter vulkanov, antropogenih emisij, ki vključujejo termoelektrarne na premog, sežigalnice odpadkov, klor‒alkalne naprave, predelavo rude (Stein in sod., 1996).

V biogeokemijskem kroženju se Hg izmenjuje med atmosfero ter med kopnim in vodnim okoljem (Slika 1). V atmosferi je večinoma v plinasti fazi, ki vključuje živosrebrovo paro, anorganske spojine klorida in oksida ter alkil Hg. Elementaren Hg lahko iz atmosfere prehaja v vodno in kopensko okolje v elementarni obliki, lahko pa se tudi oksidira do topne oblike Hg²⁺, ki se s suhim in mokrim odlaganjem kopiči v tleh (Teršič in sod., 2006).

Slika 1: Kroženje živega srebra

2.2.3 Izpostavljenost težkim kovinam

Zemlja je bila vedno pomemben vir za produkcijo biomase, ki je vir hrane za živali in ljudi.

Tla predstavljajo nestabilen medij za odlaganje in kopičenje strupenih in škodljivih snovi iz okolja. Hg se iz onesnaženih tal izpira v podtalnico in površinske vode, sprejemajo ga rastline in organizmi. Privzem Hg v rastline je odvisen od pedoloških, biokemijskih in okolijskih parametrov (Povzeto po Gnamuš, 2002).

Pedološki parametri:

 Kemizem tal je ki je odvisen od pH tal ter električne prevodnosti, ki je merilo prostih ionov v talni raztopini.

 Količina organske snovi, ki z močno vezavo Hg na huminske in fulvinske kisline zmanjšuje njegovo dostopnost rastlinam.

 Tekstura tal vključuje deleže osnovnih talnih frakcij (delež peska, melja in gline v tleh).

 Kationska izmenjalna kapaciteta opredeljuje količino izmenljivih kationov v tleh.

 Spremembe redoks potenciala vplivajo na mobilnost kovin v vlažnih tleh.

 Koncentracije organskih ligandov, ki so sposobni kompleksirati Hg.

 Metilacija (Povzeto po Gnamuš, 2002).

Koncentracije Hg v tleh so lokalno zelo različne. Na onesnaženih območjih ima onesnaženje tal velik pomen zaradi emisij Hg v zrak, njegovega prehajanja v vegetacijo in naprej po

prehranjevalni verigi v živali, izpiranja v podtalnico in vodotoke ter vključevanja v biogeokemijsko kroženje (Povzeto po Gnamuš, 2002).

Glavni obliki Hg v okolju, ki sta odgovorni za vnos kovine v kopenske organizme, sta elementarni Hg in Me‒Hg. Za organizme je organska oblika Hg Me-Hg zelo nevarna, saj zaradi biodostopnosti z lahkoto prehaja vanje (Rimmer in sod., 2009). Za biotsko aktivnost v tkivih in celicah organizmov pa je poleg organskega Me‒Hg pomembna tudi ionska oblika Hg²⁺, ki v organizmih predstavlja metabolit organskih in anorganskih Hg spojin (Gnamuš, 2002).

2.2.3 Živo srebro v rastlinah

V naravi so lahko koncentracije nekaterih kovin zelo visoke, kar predstavlja pomemben okoljski stresni faktor (Godbold in Hüttermann, 1985). Visoke vrednosti Hg lahko rastlinam zmanjšajo odpornost na škodljivce in nekatere bolezni (Bargagli, 1993). Razpoložljivost Hg v tleh je za rastline nizka, saj je privzem skozi koreninski sistem omejen. Vnos in vsebnost Hg v rastlinah je odvisen predvsem od stopnje onesnaženosti okolja in od tega, ali je rastlina izpostavljena Hg preko korenin ali poganjkov. Koncentracije Hg v poganjkih so odvisne od številnih dejavnikov, eden ključnih je, kakšen je privzem Hg⁰ iz tal (Patra in Sharma, 2010).

Dejavniki, ki vplivajo na privzem Hg v rastline (Patra in Sharma, 2010):

 vrsta tal ali sedimentov,

 vsebnost organskih snovi,

 kapaciteta izmenjave ogljika,

 redoks potencial tal,

 vsebnost vseh kovin v tleh.

Višje rastline lahko privzamejo Hg⁰ neposredno iz zraka in ga absorbirajo v asimilacijska tkiva (Browne in Fang, 1978). Privzem Hg je odvisen od zmožnosti absorpcije in od vrste rastline (Lodenius, 1991).

Izpostavljenost Hg lahko povzroči poškodbe na nivoju celotne rastline in na celičnem nivoju.

Ob močno povišanih koncentracijah Hg opažamo na nivoju rastline znake, npr.

zmanjševanja intenzivnosti rasti in reprodukcijske sposobnosti; medtem ko se na celičnem nivoju povišana koncentracija Hg odraža na spremenjenih fizioloških procesih (Prasad, 1997).

Posledice povišanja koncentracij Hg na celičnem nivoju so (Azevedo in sod., 2012):

 blokiranje pomembnih molekul (npr. encimov in polinukleotidov),

 zaviranje transporta ionov,

 premikanje ali zamenjava kovinskih ionov iz molekul (Mg iz klorofila),

 denaturacija ali inaktivacija beljakovin in

 motnje celičnih membran in organelov.

Dolgoročno se rastline na močno onesnaženih območij lahko prilagodijo z razvojem nekaterih fizioloških mehanizmov, ki omogočajo toleranco na zračne in talne vsebnosti Hg (Prasad, 1997).

Prilagoditve rastlin (Prasad, 1997):

 izgradnja fitokelatinov,

 vezava Hg na fitokelatine,

 kompleksiranje strupenih kovinskih ionov,

 izločitev Hg iz aktivne celične presnove z vezavo v celične stene.

2.2.4 Živo srebro v živalih

Presnova različnih kovin pri živalih je drugačna in bolj zapletena kot pri rastlinah, zato je vplive kovin na organizme težko vrednotiti. Pri živalih je težko ugotavljati spremembe pri kronični izpostavljenosti zmerno povišanim koncentracijam kovin v okolju. Zaradi različnih lastnosti, npr. strupenosti, fizikalno‒kemijskih pretvorb in vključenosti v biogeokemijsko kroženje, ki vključuje strupeno organsko obliko Me‒Hg, se Hg močno razlikuje od ostalih kovin. Me‒Hg v organizmih izraža težnjo po dolgoročnem kopičenju in ima v procesih presnove v sesalcih drugačno pot, čas zadrževanja in mesta kopičenja kot anorganska oblika Hg (Povzeto po Gnamuš, 2002).

Kopenski organizmi sprejemajo Hg preko vdihavanja Hg⁰ in CH3Hg⁺, privzema Hg²⁺ ter anorganskih in organskih spojin Hg s hrano in vodo (D'Itri, 1972). Vse oblike Hg škodljivo vplivajo na življenjske procese in presnovo v organizmih, vendar so odstopanja glede učinkov posameznih oblik elementa (Gnamuš, 2002).

Anorganske in organske spojine (Me–Hg) se prerazporedijo v telesnih tkivih takoj po privzemu iz prebavnega trakta. Vsebnost anorganskih in organskih oblik v organizmu je odvisna od absorpcije v prebavnem traktu (Norseth in Clarkson, 1971).

Me–Hg se v telesu organizma 100 % absorbira, zato ima večjo nagnjenost do vezave v tkiva (Walsh, 1982). Me-Hg se v krvi veže in transportira preko rdečih krvničk (Berlin, 1983).

Skupaj s hranilnimi snovmi se resorbira iz prebavnega sistema in veže v kri, nato pa po krvožilnem sistemu potuje do ciljnih organov, kjer se deloma razgradi, ali pa veže na različne makrobiomolekule in beljakovinske strukture v celicah (Norseth in Clarkson, 1971).

Me‒Hg lahko v celicah povzroča različne strupene učinke (povzeto po Gnamuš, 2002), npr.:

 mutagene učinke,

 kancerogene učinke,

 teratogene učinke.

Strupenost in koncentracije posameznih oblik Hg, ki povzročajo strupene učinke, so odvisni od (povzeto po Gnamuš, 2002):

 zapletenosti zgradbe opazovanega organizma,

 telesne mase organizma,

 koncentracije posameznih oblik elementa,

 načina in trajanja izpostavljenosti.

2.3 SELEN

2.3.1 Fizikalne in kemijske lastnosti selena

Kemijski element Se je leta 1817 odkril Jöns Jacob Berzelius. Odkril ga je v tovarni žveplove kisline v blatu na dnu svinčevih komor. Poimenoval ga je po luni (grško selene ‒ Luna), saj je opazil veliko podobnost le-tega elementa z že poznanim elementom telurjem (Te). S kemijskim simbolom Se se nahaja v VI. skupini periodnega sistema, med Te in S.

Elementarni Se nastane z redukcijo selenatov (IV) s prisotnostjo žveplovega dioksida. Z atomskim številom 79 spada med metaloide saj ima lastnosti tako kovin kot nekovin. V naravi se nahaja šest naravnih izotopov Se:⁷⁴Se, ⁷⁶Se, ⁷⁷Se, ⁷⁸Se, ⁸⁰Se, ⁸²Se (Povzeto po Brenčič in Lazarini, 1995).

Selen v anorganskih spojinah lahko nastopa v različnih oksidacijskih stanjih:

 -2 (selenid),

 0 (elementarni Se),

 +4 (Se032- selenit),

 +6 (Se042- selenat).

V naravi se Se pojavlja tako v hlapnih kot nehlapnih organskih oblikah (Foster in Sumar, 1997):

 Se v obliki hlapnih spojin: dimetil selenid in dimetil diselenid,

 Se v obliki nehlapnih spojin: Se‒metionin, Se‒cistein in Se‒sečnina.

2.3.2 Selen v okolju

Se je kemijski element, ki ima za ljudi velik pomen. V človekovem dostopnem delu zemlje je 1,3x10^-5 masnih procentov Se. Viri Se v naravi so selenidi, ki so primešani sulfidom. V prehranjevalno verigo prihaja preko rastlin in je odvisno od dostopnosti, količine in porazdelitve le-tega elementa v tleh (Combs, 2001). Vsebnost Se v tleh je zelo neenakomerna in je odvisna od narave in izvora tal, klimatskih razmer in posegov človeka v okolje (Kabata in Pendias, 2001).

Se se v okolju nahaja v sledovih in lahko deluje kot esencialni element za ljudi in živali, lahko pa je tudi toksičen za okolje. Meja med tem je lahko zelo nizka, odvisna je predvsem od kemijske oblike Se, v kateri se nahaja, koncentracije Se in drugih okoljskih spremenljivih dejavnikov (Smrkolj in sod., 2006).

Slovenija je ena izmed držav z nizko vsebnostjo Se v tleh (Kreft in sod., 2002). Gojenje rastlin s Se (t. i. biofortifikacija), je lahko učinkovit način za pridobivanje rastlin, bogatih s Se, kar pa je seveda koristno za naše zdravje. Znano je, da je Se mikrohranilo, ki je potrebno za preprečevanje oksidativne škode in podporo hormonskemu ravnovesju v človeških in živalskih celicah (Germ, 2013). Priporočen dnevni vnos Se za odraslega človeka je približno 55 µg kg^-1 telesne teže (Institute of medicine, 2000).

Se je esencialni mikroelement, ki je v naravnem okolju normalno prisoten v rastlinah (med 10 in 100 ng g^-1 suhe snovi), ter v nekoliko višjih koncentracijah v živalskih tkivih in človeku (Magee in sod., 1994). V normalnih količinah je za živalske organizme bistvenega pomena, saj je povezan s številnimi metabolnimi procesi v sklopu prehranjevalnih verig (Behne idr., 1988). Njegove koncentracije so odvisne od vrste organizma in tipa organa, kjer se le-ta element kopiči. Pri organizmih je prisoten v nekaterih encimih in beljakovinah v obliki seleno‒aminokislin (Neve, 1991).

Dostopnost Se v tleh za rastline je odvisna od oblike, v kateri se element nahaja. Na njegovo dostopnost vplivajo naslednji dejavniki (Barclay in Macpherson, 1992):

 pH tal,

 zbitost tal,

 vsebnost organskih snovi,

 mikrobiološka aktivnost,

 fiksacijska kapaciteta tal,

 klimatske razmere,

 prisotnost drugih elementov in spojin

2.3.3 Selen v rastlinah

Pri rastlinah lahko Se pozitivno vpliva na njihovo rast in obrambo pred stresom. Vsebnost v rastlinah je odvisna od vsebnosti elementa v tleh in sposobnosti rastline za privzem tega elementa (Smrkolj in sod., 2005).

Rastlina lahko privzame in akumulira toliko Se, kolikor ga je razpoložljivega v tleh. Rastline imajo različno sposobnost absorpcije Se iz zemlje, peska, vodne raztopine in kopičenja le- tega elementa v tkivih rastline (Terry in sod., 2000).

Dostopnost Se za rastline je odvisna od lastnosti tal, npr. pH, slanosti zemlje ter vsebnosti CaCO3. V kisli zemlji je Se prisoten v obliki selenita (SeO32-), ki ima zelo nizko topnost v vodi in slabo dostopa v rastline. V alkalni zemlji pa Se oksidira do selenata (SeO42-), ki je dobro topen v vodi in dobro vstopa v rastline. Rastline tako privzemajo Se iz zemlje kot selenat ali selenit (Mechora in sod., 2011).

Se je v prevelikih koncentracijah za rastline strupen, zato se pri dodatku K2SeO4 ne sme preseči tolerančnega območja, ki se giblje med 0,1 in 1 mg kg^-1 (Žnidarčič, 2010).

Tolerančno območje za rastline je odvisno od starosti rastlin (mlajše so bolj občutljive), od vrste rastlin (neakumulacijske, indikatorske ali akumulacijske) ter od prisotnosti sulfatnih ionov (Terry in sod., 2000).

Vsebnost Se v tleh, ki naj bi znašal med 0,1 in 1 mg kg^-1, vpliva na to kakšna je vsebnost le- tega elementa v rastlinah. Če so rastline izpostavljene prevelikim koncentracijam Se, se to vidi na bledičavosti in črnih pikah na listih (Černe, 2007).

Pri rastlinah lahko Se upočasni njihovo staranje in zmanjša transpiracijo v sušnih obdobjih (Germ in sod., 2005).

2.3.4 Selen v živalih

Se je eden izmed elementov, ki je v sledovih pri prehrani živali zelo pomemben. Igra pomembno vlogo pri antioksidativnem encimu glutation peroksidazi, ki ščiti celične membrane pred poškodbami.

Vse živalske vrste so dovzetne za zastrupitev s preveliko količino Se. Najpogosteje se zastrupitev pojavi pri pašnih živalih, npr. govedo, ovce, konji in druge rastlinojede živali.

Vzrok za to so krmne rastline, ki kopičijo Se, pogoste pa so predvsem na določenih območjih ZDA in Kitajske, medtem ko so v Evropi taka območja redka (Hall, 2014).

Resnost zastrupitve s Se je odvisna od količine in trajanja izpostavljenosti hranjenja živali.

Zastrupitev s Se je lahko akutna, subkronična in kronična.

Organski Se ima večjo biološko razpoložljivost, je manj toksičen in se kopiči v tkivih živali dlje kot anorganski Se (Hall, 2014).

2.4.1 Interakcije med živim srebrom in selenom

Raziskave o interakcijah med Hg in Se imajo dolgo zgodovino. Se lahko reagira tako z Me‒

Hg, kot tudi z eno ali dvovalentnim Hg (Watanabe, 2002). V nedavnih študijah so dokazali, da lahko Se zmanjša negativne vplive Hg in pozitivno vpliva na rast in preživetje živali (Penglase in sod., 2013).

Se lahko zmanjšuje negativne vplive Hg na rast in preživetje organizmov, vendar je le malo znanega o tem, kako ta dva elementa integrirata v reprodukciji organizmov. Povišanje koncentracij Se v hrani naj bi zmanjševalo koncentracije Hg v organizmih (Ralston in sod., 2010).

Kompleksiranje Hg z endogenim Se je eden izmed zaščitnih mehanizmov celic pred strupenostjo Hg ionov in sodi med počasnejše in dolgotrajne prilagoditve organizma na strupenost Hg in nekaterih drugih kovin (Cherian in sod., 1983).

Znano je, da ob sočasnem kopičenju Hg in Se, kljub dosegu toksičnih koncentracij obeh mikroelementov, ne prihaja do zastrupitev, ki bi se sicer ob odsotnosti vsaj enega mikroelementa pojavile že prej (Gnamuš, 2002).

Parizek in sod. (1978) v svoji raziskavi opisujejo vpliv Se na zmanjševanje strupenih učinkov Hg. Raziskavo so izvedli na podganah in dokazali, da selenit ščiti podgane pred odpovedjo ledvic, ki jo povzroča vbrizgani HgCl2.

Acetilholin esteraza (AChE) je encim, ki pospešuje hidrolizo acetilholina v živčnem sistemu, prav tako pa vpliva na njegovo zaviranje. Zaviranje hidrolize acetilholina je dober pokazatelj strupenosti težkih kovin. Demerdash (2001) je v raziskavi, ki jo je izvedla na podganah, ugotovila, da ima Hg zaviralni učinek na aktivnost AChE, medtem, ko ga Se nima. Prisotnost Se v interakciji s Hg zmanjša toksičen učinek Hg na aktivnost AChE (Demerdash, 2001).

2.5 POSKUSNI ORGANIZMI

2.5.1 Solata (Lactuca sativa L.)

Solata je vrtna rastlina, ki spada v družino solatnic (Cichoriaceae) in je poznana že iz časa grške, egipčanske in rimske visoke kulture. Rastline so pomemben vir surovin za proizvodnjo uporabnih dobrin v človeški prehrani saj vsebujejo mikronutriente, ki so potrebni za zdrav razvoj. Solatnice so vrtnine, katerih nadzemne dele (liste) se uporablja v prehrani ljudi in živali. Glavnata solata sorte Exquise razvije liste na skrajšanem steblu. Listi solate se v zrelosti zvijejo v bolj ali manj kompaktno in rastnim razmeram ter genskim lastnostim primerno veliko glavico (Osvald in Kogoj Osvald, 2005).

2.5.2 Navadni prašiček (Porcellio scaber)

Navadnega prašička uvrščano v podred Oniscidea. To so raki enakonožci (red Isopoda), ki so kot edini raki uspešno poselili kopno. Raki enakonožci so živali s podolgovatim ovalnim telesom, ki je navadno dorziventralno sploščeno (Slika 2). Ime enakonožci izhaja iz značilnosti, saj imajo na trupu sedem parov precej podobnih nog. Čeprav so raki enakonožci uspešno poselili tudi kopno, se večino časa zadržujejo na mestih z visoko zračno vlago, saj nimajo voskaste kutikule kot žuželke, ki bi jih ščitila pred izsuševanjem. Večinoma poseljujejo zgornji sloj tal, bogat z razpadajočim rastlinskim materialom. Navadni prašiček je pogost v okolici človekovih bivališč, vrtovih, kompostu, hlevih ipd. Je vsejed organizem, ki se večinoma hrani z razpadajočim organskim materialom. Zaradi tega je pomemben za razgradnjo organske snovi in njeno kroženje v naravi (Mršić, 1997).

Slika 2: Rak enakonožec (Porcellio scaber) (wikimedia, 2013)

Navadni prašiček (Porcellio scaber) je bil prepoznan kot dober modelni organizem za izvajanje ekofizioloških in ekotoksikoloških študij na področju biodostopnosti in strupenosti kovin (Drobne, 1997). Kovine privzemajo predvsem skozi prebavilo, ki je sestavljen iz več delov (Slika 3). Sprednji del prebavila je iz požiralnika in želodca, ki imata vlogo mletja, filtriranja in razvrščanja hrane. V hrbtnem delu želodca se nahajajo posebne mišice, ki stiskajo hrano in ločujejo tekočino od nje. Tekočina, ki se izloči, gre skupaj z zelo drobnimi

delci skozi filtre v srednje črevo, preostanek vsebine pa gre v zadnji del prebavila. Srednje črevo je sestavljeno iz štirih slepo zaprtih cevk, ki skupaj tvorijo prebavno žlezo ali hepatopankreas. Tu je tudi osrednje mesto kopičenja kovin, ki so vezane na nizkomolekularne beljakovine ali nakopičene v obliki granul v celicah žlez. Zadnji del prebavila je sestavljen iz tiflosolne regije (anteriorno), papilatne regije (posteriorno) in rektuma (Hames in Hopkin, 1989).

Slika 3: Prebavni sistem rakov enakonožcev (Hopkins, 1989)

3 CILJI RAZISKAVE IN HIPOTEZE

3.1 CILJI

 Določiti vpliv različnih koncentracij Hg in Se na rast rastlin.

 Izmeriti koncentracije Hg in Se v koreninah in poganjkih solate ter določiti v katerem delu rastline so koncentracije Hg najvišje.

 Ugotoviti vpliv Se na privzem in razporejanje Hg v rastlinah.

 Ugotoviti, kako hranjenje s solato, onesnaženo s Hg in obogateno s Se, vpliva na prehranjevanje, rast in preživetje rakov enakonožcev.

 Ugotoviti, kako hranjenje rakov enakonožcev s solato, onesnaženo s Hg in obogateno s Se, vpliva na privzem in lokalizacijo živega srebra v tkivih enakonožcev.

3.2 HIPOTEZE

 Zaradi slabe mobilnosti Hg, se bo Hg pri rastlinah večinoma akumuliral v koreninah, vendar bodo koncentracije Hg v listih sledljive.

 Tretiranje rastlin s HgCl2 in K2SeO4 bo zaradi razlike v biodostopnosti in mobilnosti povzročilo razlike v razporeditvi Hg in Se v rastlinskih tkivih.

 Hrana, obogatena s Se, bo vplivala na privzem in strupenost Hg pri rakih enakonožcih.

 Hg se bo kopičil v hepatopankreasu rakov enakonožcev.

 Pri rakih, hranjenih s solato kontaminirano s Hg in obogateno s Se, pričakujemo manjše koncentracije Hg v hepatopankreasu zaradi vezave Hg na Se v prebavilih.

4 METODE DELA

4.1 VPLIV SELENA NA PRIVZEM IN AKUMULACIJO ŽIVEGA SREBRA NA PRVEM TROFIČNEM NIVOJU

4.1.1 Kontaminacija zemlje

Zemljo za poskus smo pripravili tako, da smo zmešali substrat za rože in zemljo iz vrta Biotehniške fakultete v razmerju 1:1 (1 kg substarta za rože in 1 kg zemlje iz vrta).

Pripravljeno zemljo smo v vrečki na zraku pustili dva dneva, da se je posušila, nato smo jo tretirali z različnimi koncentracijami Hg. V poskusu smo uporabili tudi zemljo z vrta v Idriji, ki je onesnažena s Hg (Tabela 1) .

Tabela 1: Tretmaji zemlje v poskusu

Kontrola 1 mg Hg/kg zemlje

10 mg Hg/ kg zemlje

50 mg Hg/ kg zemlje

Idrija Hg

Kontrola + Se 1 mg Hg/kg zemlje + Se

10 mg Hg/ kg zemlje + Se

50 mg Hg/ kg zemlje + Se

Idrija Hg + Se

Kontaminacijo zemlje s Hg smo izvedli v digestoriju. Zemljo smo tretirali tako, da smo v 2 dcl destilirane vode raztopili različne predpisane količine HgCl2 (Merck, Nemčija), glede na različne zastavljene koncentracije. Različne raztopine HgCl2 (Merck, Nemčija) smo razporedili po zemlji in jo dobro premešali. Različno tretirano zemljo smo dali v vrečko za smeti, jo dobro zavezali, da smo preprečili izhlapevanje Hg, in jo pustili stati pet dni, da se je Hg dobro vezal na zemljo. Kontrolni zemlji in zemlji iz Idrije nismo dodajali Hg.

4.1.2 Gojenje solate

Sadike solate vrste Lactusa sativa L. smo posadili v zemljo, tretirano z različno koncentracijo Hg. Na vsak tretma smo posadili po deset sadik solate, eno sadiko v vsak lonček. Solato smo gojili šest tednov v kontroliranem okolju, v rastnih komorah pri relativni zračni vlagi 60 % in temperaturi 24 ºC (Slika 4).

Slika 4: Gojenje solate v rastnih komorah

Solato smo za boljšo rast dvakrat tedensko zalivali s hranilno Hoglandovo razstopino z naslednjo sestavo (Machils in Torrey, 1956):

 0.5 M Ca(NO3)2 (Merck, Nemčija),

 0.5 M KNO3 (Merck, Nemčija),

 0.5 M MgSO4 (Merck, Nemčija),

 0.5 M KH2PO4 (Merck, Nemčija),

 0,1 mM FeNaEDTA (Sigma – aldrich),

 mikroelementi,

 dH2O.

Solato smo v rastnih komorah gojili šest tednov, po tem času smo solato pospravili za nadaljnje poskuse.

4.1.3 Tretiranje solate s selenom

Del solate smo po treh tednih rasti v zemlji s Hg tretirali s Se. Vsak list solate smo poškropili z raztopino K2SeO4 (Alfa aesar) koncentracije 5 µg L^-1. Dosežena koncentracija Se na listu je bila približno 1 µg g^-1 sveže teže. Solato smo s Se tretirali dvakrat v razmaku enega tedna.

4.1.4 Priprava rastlin za meritve

Po šestih tednih smo solato ločili od zemlje, rastlino sprali z vodovodno in nato še z destilirano vodo. Ločili smo poganjke od korenin, vsak poganjek razdelili še na dva dela (del za analize, del za hranjenje) ter stehtali svežo maso. Po tehtanju smo korenine in poganjke zavili v aluminijasto folijo in jih zmrznili v tekočem dušiku. Zmrznjene rastline smo nato posušili v liofilizatorju. Po končanem sušenju smo stehtali še suho maso poganjkov in korenin.

4.1.5 Merjenje fotokemične aktivnosti fotosistema II

Fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II) pri rastlinah smo merili z modulacijskim fluorometrom (tip OS‒500, Opti‒Sciences). Merili smo jo na zatemnjenih (potencialna fotokemična učinkovitost) in na osvetljenih delih lista (dejanska fotokemična učinkovitost).

Pred merjenjem potencialne fotokemične učinkovitosti FS II smo na liste solate pritrdili ščipalke za temotno adaptacijo. Po dvajsetih minutah adaptacije smo list osvetlili s pulzom bele svetlobe in na aparatu odčitali vrednost. Dejansko fotokemično učinkovitost FS II smo merili pri danih svetlobnih pogojih, tako da smo ščipalko pritrdili na list solate in takoj izmerili fotokemično učinkovitost.

4.1.6 Merjenje fotosinteznih pigmentov

Posušene rastline smo strli v terilnicah s pomočjo tekočega dušika. V centrifugirke smo natehtali po 30 mg poganjkov, vzorcu dodali 5 ml 80 % acetona in vsebino premešali na stresalu. Centrifugirke smo zaprli in jih pokrili z aluminijasto folijo, tako da smo preprečili izhlapevanje acetona, in jih čez noč postavili v hladilnik. Naslednji dan smo vzorce ponovno premešali na stresalu in jih tri minute centrifugirali na 2500 obratih.

S spektrofotometrom 8452A (HP‒Hewlett Packard) smo nato izmerili absorpcijo pri valovnih dolžinah 470 nm, 647 nm in 664 nm. Za umeritev spektrofotometra smo uporabili 80 % aceton. Iz dobljenih absorpcij smo preračunali koncentracije pigmentov v μmol/l za klorofil a, klorofil b in karotenoide. (Graan in Ort, 1984)

𝑐ℎ𝑙

(

) = 13,19 ∗ 𝐴

− 2,57 ∗ 𝐴

…………..……….(1) 𝑐ℎ𝑙

(

) = 22,10 ∗ 𝐴

− 5,26 ∗ 𝐴

………...(2)

∑ 𝑘𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛𝑜𝑖𝑑𝑜𝑣 (

𝑙

) =

198 ……….

(3)

𝑥 (

) =

𝑝𝑜𝑔𝑎𝑛𝑗𝑘𝑜𝑣∗1000 ………....

(4)

4.1.7 Določanje koncentracij elementov v vzorcih

Rezultate koncentracij elementov smo pridobili z metodo ICP‒MS. S to metodo smo izmerili koncentracije posameznih elementov (Hg, Se) v rastlinskem in živalskem materialu.

Meritve koncentracij elementov so bile opravljene na Kemijskem inštitutu Ljubljana, na oddelku za analizno kemijo, s pomočjo induktivno sklopljene plazemske masne spektroskopije (ICP‒MS).

4.1.7.1 Razklop vzorcev za ICP-MS

V teflonske posodice smo dali predpisano količino, 100 mg posušenega vzorca, ki smo ga predhodno strli s pomočjo terilnice in tekočega dušika. V vzorec smo dodali 3 ml dušikove kisline (HNO3), nato pa pripravljen vzorec dali v mikrovalovno pečico MarsXpress (Slika 5) za razklop. Mineralizacija je potekala tako, da smo vzorce najprej dvajset minut segrevali do 180 °C pri 1600 W, nato pa trideset minut vzdrževali konstantno temperaturo pri 180 °C.

Zaradi varnosti, da bi s segretimi parami ušlo preveč Hg, smo vzorce ohlajali čez noč v tesno zaprtih teflonskih posodicah. Ohlajene vzorce smo prelili v epruvete in jih razredčili z destilirano vodo do 20 ml. Pri vsakem razklopu smo sočasno naredili še slepi razklop.

Slika 5: Mikrovalovna pečica

4.1.7.2 Priprava raztopin za merjenje koncentracij Hg in Se

Za namen kalibracije sistema smo pripravili tri sklopljene založne raztopine z različnimi koncentracijami Hg, nato pa smo pripravili še standardne raztopine.

Najprej smo pripravili tri sklopljene raztopine z različnimi koncentracijami, ki smo jih nato uporabili za pripravo standardnih raztopin (Tabela 2):

 0,2 ppm: raztopino smo pripravili tako, da smo v epruveto dali 2 μL Hg (1000 ppm) in 200 μL 2 % HNO3, vse skupaj smo razredčili z destilirano vodo do volumna 10 ml.

 1 ppm: raztopino smo pripravili tako, da smo v epruveto dali 10 μL Hg (1000 ppm) in 200 μL 2 % HNO3, vse skupaj smo razredčili z destilirano vodo do volumna 10 ml.

 5 ppm: raztopino smo pripravili tako, da smo v epruveto dali 50 μL Hg (1000 ppm) in 200 μL 2 % HNO3, vse skupaj smo razredčili z destilirano vodo do volumna 10 ml.

V sklopljene raztopine smo dodali še interne standarde Ge, Y, Ga in Sc (Tabela 3).

Tabela 2: Priprava standardnih raztopin za kalibracijo Hg ( IS-interni standard, V-volumen)

Koncentracija Hg (ppb)

V Hg (0,2 ppm) (μL)

IS (Ge, Y, Ga, Sc)

(μL)

V HNO3

(μL)

V HCl (μL)

Končni volumen

(ml)

0,01 2,5 250 1250 3750 50

0,05 12,5 250 1250 3750 50

Koncentracija Hg (ppb)

V Hg (1

ppm) (μL) IS (Ge, Y, Ga, Sc)

(μL)

V HNO³

(μL) V HCl (μL)

Končni volumen

(ml)

0,1 5 250 1250 3750 50

0,25 12,5 250 1250 3750 50

0,5 25 250 1250 3750 50

Koncentracija Hg (ppb)

V Hg (5

ppm) (μL) IS (Ge, Y, Ga, Sc)

(μL)

V HNO³

(μL) V HCl (μL)

Končni volumen

(ml)

0 0 250 1250 3750 50

1 10 250 1250 3750 50

5 50 250 1250 3750 50

10 100 250 1250 3750 50

20 200 250 1250 3750 50

50 500 250 1250 3750 50

100 1000 250 1250 3750 50

Tabela 3: Priprava standardnih raztopin za kalibracijo Hg (IS-interni standard, IV- multi elementi)

Koncentracija (ppb)

V IV (1

ppm) (μL) IS (Ge, Y, Ga, Sc)

(μL)

Končni volumen

(ml)

0,1 5 250 50

0,25 12,5 250 50

0,5 25 250 50

Koncentracija (ppb)

V IV(5

ppm) (μL) IS (Ge, Y, Ga, Sc)

(μL)

Končni volumen

(ml)

0 0 250 50

1 10 250 50

2.5 25 250 50

5 50 250 50

10 100 250 50

20 200 250 50

50 500 250 50

100 1000 250 50

250 2500 250 50

500 25

(1000ppm)

250 50

Priprava raztopine vzorcev:

Raztopine vzorcev za merjenje Hg smo pripravili tako, da smo v epruveto dali po 1 ml vzorca, 50 μL IS (Ge, Y, Ga, Sc), 250 μL HNO3 in 750 μL HCl. Vse skupaj smo nato razredčili z destilirano vodo do volumna 10 ml.

Raztopine vzorcev za merjenje ostalih elementov smo pripravili tako, da smo v epruveto dali po 1 ml vzorca in 50 µL IS (Ge, Y, Ga, Sc). Vse skupaj smo razredčili z destilirano vodo do volumna 10 ml.

V standardnih raztopinah in vzorcih smo nato zmerili koncentracije Hg s pomočjo induktivno sklopljene plazemske masne spektroskopije (ICP‒MS) (Slika 6).

4.1.7.3 Induktivno sklopljena plazemska masna spektroskopija (ICP-MS)

Pri metodi ICP-MS prihaja do ionizacije vzorca v plazmi, ki je raztopljen v kislini. Masna spektrometrija z vzbujanjem v induktivno sklopljeni plazmi je tehnika, namenjena za elementno analizo saj ima veliko občutljivost oz. nizko mejo zaznavnosti (0,01 - 1 μg g^-1) za večino elementov.

ICP-MS (Slika 6) združuje visoko temperaturo ICP (induktivno sklopljeno plazmo) in vir z masnim spektrometrom. ICP vir sprejme aerosole, ki jih plin pošlje iz vzorca. Tu se aerosoli zaradi visoke temperature ionizirajo, in nato se v masnem spektrometru ločijo na podlagi njihove mase.

Slika 6: ICP-MS (Kemijski inštitut, Ljubljana)

Koncentracije živega srebra smo odčitali iz kalibracijske krivulje, ki smo jo dobili iz pripravljenih standardnih raztopin (Graf 1).

Graf 1: Primer kalibracijske krivulje

Koncentracije ostalih elementov smo odčitali iz kalibracijske krivulje, ki smo jo dobili iz pripravljenih standardnih raztopin. Kalibracijsko krivuljo smo naredili za vsak element in tretma.

Postopek kalibracije temelji na merjenju standardnih raztopin elementov, katerih koncentracijo poznamo. Nato na istem inštrumentu merimo še vzorec. Koncentracija merjenega elementa v vzorcu mora biti med najnižjo in najvišjo vrednostjo na kalibracijski krivulji, tako da lahko odčitamo dejansko koncentracijo elementa v vzorcu.

Sposobnost akumuliranja TK se meri z bioakumulacijskim (BAF), sposobnost transporta pa s translokacijskim faktorjem (TF). (Robinson in sod., 1998)

𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑙𝑜𝑘𝑎𝑐𝑖𝑗𝑠𝑘𝑖 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 =𝑘𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑗𝑎 𝑇𝐾 𝑣 𝑝𝑜𝑔𝑎𝑛𝑗𝑘𝑖ℎ 𝑘𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑗𝑎 𝑇𝐾 𝑣 𝑘𝑜𝑟𝑒𝑛𝑖𝑛𝑎ℎ

4.2 VPLIV SELENA NA PRIVZEM IN AKUMULACIJO ŽIVEGA SREBRA NA DRUGEM TROFIČNEM NIVOJU

4.2.1 Izbira organizma za poskus

Pri poskusu smo za prehranjevalni test uporabili rake enakonožce, vrste Porcellio scaber, (Isopoda, Crustacea).

Izvorna populacija rakov enakonožcev je bila nabrana v čistem okolju, v okolici Logatca.

Živali smo nato prenesli na Katedro za zoologijo, kjer smo rake enakonožce vzgajali v kontroliranem okolju. Živali smo gojili v veliki plastični posodi, ki je bila napolnjena z zemljo in vlažno listno steljo. Plastične posode so bile v klimatiziranih prostorih s temperaturo 20 °C, z 80 % vlažnostjo in dnevno‒nočnim režimom 16/8 h. Živali smo hranili s posušenimi listi leske.

4.2.2 Priprava hrane

Za hranjenje živali smo uporabili liofilizirano mešanico zmletih poganjkov in korenin solate v masnem razmerju 1:1 (Tabela 4). Uporabili smo del solate, ki je bila vzgojena v zemlji z najvišjo koncentracijo Hg (50 mg kg^-1) in del solate, ki je bila vzgojena v zemlji iz Idrije.

Del te solate je bil tudi tretiran s Se. Mešanico poganjkov in korenin smo stisnili na hidravlični stiskalnici in naredili rastlinsko tabletko (Slika 7). Vsaki živali smo v petrijevke dali približno 50‒100 mg hrane.

Tabela 4: Povprečne koncentracije Hg in Se v hrani za hranjenje živali

TRETMA Povprečne

koncentracije Hg v hrani poganjki + korenine (mg kg^-1)

Povprečne koncentracije Se v

hrani poganjki + korenine (mg kg^-1)

Skupne povprečne koncentracije v hrani v razmerju

1:1 (mg kg^-1)

Kontrola 1.040 0.362 0,701

Kontrola 0.439 0.245 0,342

Kontrola 0.904 0.326 0,651

Kontrola 0.573 1.344 0.959

Kontrola+Se 0.925 1.210 1.068

Kontrola+Se 1.621 1.108 1.365

Kontrola+Se 0.758 1.046 0.902

Kontrola+Se 0.167 0.960 0.564

1 mg kg^-1 0.438 0.192 0.315

1 mg kg^-1 1.024 0.178 0.601

1 mg kg^-1 0.471 0.159 0.315

1 mg kg^-1 0.351 0.128 0.240

1mg kg^-1 + Se 0.191 0.669 0.43

1mg kg^-1 + Se 0.193 0.565 0.379

1mg kg^-1 + Se 0.097 1.018 0.558

1mg kg^-1 + Se 0.038 0.173 0.106

10 mg kg^-1 0.711 0.202 0.457

10 mg kg^-1 0.868 0.179 0.524

10 mg kg^-1 0.814 0.209 0.512

10 mg kg^-1 0.545 0.163 0.354

10 mg kg^-1 + Se 0.313 0.934 0.624

10 mg kg^-1 + Se 0.275 0.617 0.446

10 mg kg^-1 + Se 0.359 0.885 0.622

10 mg kg^-1 + Se 0.341 0.844 0.593

50mg kg^-1 4.346 0.158 2.252

50mg kg^-1 4.023 0.239 2.131

50mg kg^-1 5.022 0.161 2.592

50mg kg^-1 2.295 0.183 1.239

50mg kg^-1 + Se 3.031 1.067 2.049

50mg kg^-1 + Se 5.861 1.378 3.620

50mg kg^-1 + Se 1.653 1.523 1.588

50mg kg^-1 + Se 1.929 1.216 1.573

Idrija 0.731 0.193 0.462

Idrija 0.438 0.356 0.397

Idrija 0.630 0.306 0.468

Idrija 0.442 0.225 0.334

Idrija + Se 0.165 0.715 0.440

Idrija + Se 0.087 0.799 0.443

Idrija + Se 0.359 0.665 0.512

Idrija + Se 0.299 0.610 0.455

Slika 7: Hidravlična stiskalnica na IJS

4.2.3 Zasnova poskusa

Poskus smo naredili na Katedri za zoologijo, oddelka za biologijo, BF, v komori z 80 % vlažnostjo dnevno‒nočnim ciklom 12/12 h in 20 °C.

Za poskus smo izbrali osebke obeh spolov in maso med 30 in 50 mg.

Živali smo pred poskusom pregledali in izločili tiste, ki so bili neprimerni za poskus (premajhna/prevelika masa, levitev, samice z jajci oz. mladiči v valilniku (marzupij)). Živali smo pred in po poskusu stehtali ter tako beležili spremembo teže v času poskusa.

Za poskus smo uporabili 20 osebkov za vsak tretma (Tabela 5).

Tabela 5: Hranjenje živali s solato

Kontrolna solata Solata tretirana s 50 mg kg^-1 Hg

Solata vzgojena na zemlji iz Idrije

Kontrolna solata + Se Solata tretirana s 50 mg kg^-1 Hg + Se

Solata vzgojena na zemlji iz Idrije + Se

V sterilne petrijevke smo natehtali določeno maso hrane za vsako žival. Osebke smo v petrijevkah zložili v steklene posode, katere dno smo za vzdrževanje vlage pokrili z navlaženimi brisačami (Slika 8). Stekleno posodo smo pokrili s prozorno folijo in jo naluknjali. V petrijevkah smo vlago vzdrževali tako, da smo vsake tri dni pokrovček petrijevke na rahlo poškropili z razpršilkami.

Slika 8: Hranjenje živali v petrijevkah

Hrano (rastlinske tabletke) smo menjali vsakih pet dni. Količina hrane je bila v prebitku.

Vsakih pet dni smo živali dali v novo sterilno petrijevko s svežo hrano v prebitku.

Nepojedeno hrano in iztrebke smo stehtali in zavili v aluminijasto folijo. S solato smo enakonožce hranili štirinajst dni.

Po štirinajstih dneh hranjenja s kontaminirano solato, smo vse živali prenesli v sterilne petrijevke z neonesnaženo (kontrolno) solato. Tako smo jih pustili tri dni, da se je njihovo črevo prečistilo onesnažene hrane.

Ob koncu poskusa smo prešteli preživele živali in jih stehtali. Preverjali smo učinkovitost rasti živali in njihovo stopnjo prehranjevanja.

Učinkovitost rasti živali smo izračunali po naslednji formuli:

𝑢č𝑖𝑛𝑘𝑜𝑣𝑖𝑡𝑜𝑠𝑡 𝑟𝑎𝑠𝑡𝑖: ((𝑚 (ž𝑖𝑣𝑎𝑙𝑖 𝑝𝑜 𝑝𝑜𝑠𝑘𝑢𝑠𝑢)−𝑚 (ž𝑖𝑣𝑎𝑙𝑖 𝑝𝑟𝑒𝑑 𝑝𝑜𝑠𝑘𝑢𝑠𝑜𝑚))/ 𝑚 (ž𝑖𝑣𝑎𝑙𝑖 𝑝𝑟𝑒𝑑 𝑝𝑜𝑠𝑘𝑢𝑠𝑜𝑚))∗100

14

4.2.4 Priprava živali za LA ICP-MS

Po končanem poskusu smo petnajst živali iz vsakega tretmaja zmrznili v tekočem dušiku in jih liofilizirali za merjenje elementov z ICP‒MS.

Po pet živali iz vsakega tretmaja smo zmrznili v propanu hlajenim s tekočim dušikom, naredili krio rezine s pomočjo kriomikrotoma (Leica) in liofilizirali (liofilizer Alpha‒Christ) za LA ICP‒MS.

Živali smo dali v plastične centrifugirke, jih zalili z zamrzovalnim medijem, jih najprej zmrznili v propanu, hlajenim s tekočim dušikom. Do rezanja na kriotomu smo jih shranili v tekočem dušiku v posebni posodi. Zamrznjene živali smo rezali na kriotomu (Leica). Živali smo pritrdili na nosilec, tako da smo vzorec oblili z zamrzovalnim medijem. Ko je zamrzovalni medij zmrznil, smo ga obrezali in namestili v komoro kriotoma. Delali smo 60 µm rezine in jih prenašali v ohlajene kovinske nosilce s parafilmom. Rezine živali so bile narejene med tretjim in petim obročem pereiona (Slika 9).

Slika 9: Območje rezin pri rakih enakonožcih (Padovan, 2005)

Rezine smo nato prenesli v liofilizator, kjer smo jih tri dni liofilizirali pri -20 ºC in tlaku 0,121 mbar. Liofilizirane rezine smo prenesli na objektna stekelca in jih z njimi tudi pokrili (Slika 10).

Slika 10: Pripravljene rezine živali za LA ICP-MS

4.2.5 Metoda laserske ablacije masne spektroskopije

Mapiranje porazdelitve Hg smo izvedli na Kemijskem inštitutu v Laboratoriju za analizno kemijo v Ljubljani, pod vodstvom dr. Bojana Budiča in dr. Hansa van Elterna.

Laserska ablacija z induktivno sklopljeno plazmo in masno spektrometrijo je najpomembnejša analitska metoda, s katero merimo multielemente na trdnih materialih. LA ICP‒MS je tehnika, ki s fokusiranjem žarka na površino vzorca poda informacije o razporeditvi elementov v različnih vzorcih (Becker, 2007; Debeljak, 2013).

4.3 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV

Podatke smo analizirali s standardnimi statističnimi metodami. Uporabili smo MS Excel 2013 in programski komplet Statistica (Statsoft 7.0.61.0 EN). Za izračun statistično značilnih razlik smo uporabili enosmerno ANOVA, post – hoc, Duncanov test, p<0,05 in Mann-Whitney-ev test.

5. REZULTATI

5.1 SUHA MASA RASTLIN

Analiza variance je pokazala, da je na suho maso poganjkov vplivala koncentracija Hg in dodan Se. Vrednosti suhe mase poganjkov so bile večje od vrednosti suhe mase korenin (Graf 2,3).

Opazili smo trend, da so bile biomase poganjkov večje tam, kjer je bil dodan Se, z izjemo kontrole (brez Hg + Se), kjer je bila biomasa nižja; to smo opazili le v primerjavi s skupino, ki je imela enako vsebnost Hg, a brez Se. Biomase poganjkov so bile pri tretmajih brez dodanega Se med seboj primerljive, razen pri tretmajih kontrola in Idrija, kjer so bile biomase poganjkov dvakrat višje. Pri tretmaju 1 mg kg^-1 Hg z dodanim Se so se pri poganjkih pokazale statistično značilne razlike v povečanju biomase glede na kontrolo. Pri tretmajih 10 mg kg^-1 Hg in Idrija z dodanim Se se je kazal trend zviševanja biomase glede na kontrolo, vendar statistično značilnih razlik ni bilo (Graf 2). Biomasa poganjkov se je značilno zmanjšala (Duncanov test, p<0,05) glede na kontrolo le pri tretmaju 1 mg kg^-1 Hg. Pri ostalih tretmajih ni bilo statistično značilnih razlik glede na kontrolo.

Pri koreninah, tretiranih z 1 in 50 mg kg^-1 Hg ter kontroli z dodanim Se, se je biomasa povečala v primerjavi s kontrolo pri rastlinah (Graf 3). Biomasa se je pri rastlinah glede na kontrolo povečala dvakrat. Pri drugih tretmajih razlik ni bilo.

Graf 2: Suha masa poganjkov solate (Lactuca sativa) po 42-dnevni izpostavitvi neonesnaženi zemlji/

onesnaženi zemlji s Hg s koncentracijami 1 mg kg^-1, 10 mg kg^-1, 50 mg kg^-1 in Idrija/ neonesnaženi in onesnaženi zemlji s Hg s koncentracijami 1 mg kg^-1, 10 mg kg^-1, 50 mg kg^-1 in Idrija in z foliarno dodanim Se.

Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05).

(črni karo – posamezne vrednosti; daljša rdeča črta – mediana; krajša zelena črta – povprečje)

Graf 3: Suha masa korenin solate (Lactuca sativa) po 42-dnevni izpostavitvi neonesnaženi zemlji/ onesnaženi zemlji s Hg s koncentracijami 1 mg kg^-1, 10 mg kg^-1, 50 mg kg^-1 in Idrija/ neonesnaženi in onesnaženi zemlji s Hg s koncentracijami 1 mg kg^-1, 10 mg kg^-1, 50 mg kg^-1 in Idrija in z foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). (črni karo – posamezne vrednosti; daljša rdeča črta – mediana; krajša zelena črta – povprečje)

5.2 ANALIZA FOTOKEMIČNE AKTIVNOSTI FOTOSISTEMA II

Vrednosti potencialne in dejanske fotokemične aktivnosti FS II so bile bolj ali manj enake pri vseh rastlinah (Graf 4). Potencialna fotokemična aktivnost FS II je bila v povprečju 0,83.

Statistično značilne razlike v potencialni fotokemični aktivnosti FS II so se pokazale le med tretmajema kontrola z dodanim Se in 10 mg kg^-1 Hg (Graf 4). Med ostalimi tretmaji glede na kontrolo ni bilo razlik (Duncanov test, p<0,05).

Statistično značilne razlike pri dejanski fotokemični aktivnosti FS II so bile opazne le pri rastlinah, tretirane z 1 in 10 mg kg^-1 Hg z dodanim Se, ki sta nižji glede na kontrolo. Pri ostalih rastlinah statistično značilnih razlik pri merjenju dejanske fotokemične aktivnosti FS II ni bilo (Duncanov test, p<0,05).

Graf 4: Fotokemična učinkovitost solate (Lactuca sativa) po 21 -dnevni izpostavitvi neonesnaženi zemlji/

onesnaženi zemlji s Hg s koncentracijami 1 mg kg-1, 10 mg kg-1, 50 mg kg-1 in Idrija/ neonesnaženi in onesnaženi zemlji s Hg s koncentracijami 1 mg kg-1, 10 mg kg-1, 50 mg kg-1 in Idrija in z foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). Legenda: FA – fotokemična aktivnost. (črni karo – posamezne vrednosti; daljša rdeča črta – mediana;

krajša zelena črta – povprečje)

5.3 ANALIZA FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV

Pri tretiranih rastlinah je bilo v poganjkih največ klorofila a, najmanj pa klorofila b (Graf 5).

Pri obeh klorofilih se kaže trend zviševanja koncentracij v poganjkih pri tretmajih z dodanim Se. Trend zviševanja koncentracij se ne kaže pri tretmaju 10 mg kg^-1, 50 mg kg^-1 in Idriji z dodanim Se, kjer so bile koncentracije nižje ali enake glede na kontrolo (Graf 5). Statistično značilne razlike glede na kontrolo so bile le pri tretmajih kontrola z dodanim Se in pri 50 mg kg^-1 (Duncanov test, p<0,05). Med drugimi tretmaji statistično značilnih razlik ni bilo.