UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE
Ajda VRABIČ
TOKSIČNOST BILIRUBINA ZA ASTROCITE MOŽGANSKE SKORJE PODGANE
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE
Ajda VRABIČ
TOKSIČNOST BILIRUBINA ZA ASTROCITE MOŽGANSKE SKORJE PODGANE
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
TOXICITY OF BILIRUBIN TO RAT CORTICAL ASTROCYTES
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Molekulske in funkcionalne biologije. Delo je bilo opravljeno na Inštitutu za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo Medicinske fakultete.
Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala prof. dr. Metodo Lipnik- Štangelj in za recenzenta prof. dr. Toma Turka.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Marko KREFT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Tom TURK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Metoda LIPNIK-ŠTANGELJ
Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo
Datum zagovora: 20. september 2021
Ajda VRABIČ
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 612.111(043.2)
KG bilirubin, astrociti, regulirana celična smrt, apoptoza, nekroptoza, hormeza AV VRABIČ, Ajda, dipl. biol. (UN)
SA LIPNIK-ŠTANGELJ, Metoda (mentorica), TURK, Tom (recenzent) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij molekulske in funkcionalne biologije
LI 2021
IN TOKSIČNOST BILIRUBINA ZA ASTROCITE MOŽGANSKE SKORJE PODGANE
TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja) OP IX, 58 str., 1 pregl., 15 sl., 171 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Bilirubin je endogena snov, ki nastaja pri razgradnji hemoglobina. Kadar ga je v organizmu preveč, deluje toksično. Znana je toksičnost bilirubina v osrednjem živčevju, kjer se odlaga v bazalnih ganglijih, hipokampusu in možganskem deblu, vključno s ponsom in srednjimi možgani. Bilirubin je tudi močan antioksidant, ki osrednje živčevje varuje pred oksidativnim stresom, ki ga med drugim povzroča tudi stavrosporin. Cilj naše naloge je bil ugotoviti vpliv bilirubina na apoptozo in nekroptozo kot dve obliki regulirane celične smrti astrocitov. Zanimalo nas je tudi, kako bilirubin vpliva na tvorbo ATP, ki služi kot indikator fiziološkega stanja celic. Kot eksperimentalni model smo uporabili kulture astrocitov možganske skorje novorojenih podgan. Z analizo celic na pretočnem citometru smo ugotovili, da bilirubin nima vpliva na apoptozo astrocitov, medtem ko v visokih koncentracijah (100 nM in 250 nM) poveča delež nekroptotičnih celic. Po drugi strani je v primeru nekroptoze bilirubin izkazal hormetičen učinek, kjer je v nizki koncentraciji (10 nM) deloval zaščitno in je zmanjšal nekroptozo astrocitov, sproženo z 1 µM stavrosporinom. Vpliva bilirubina na količino ATP v astrocitih v uporabljenih eksperimentalnih razmerah nismo dokazali. Zaključili smo, da je bilirubin v visokih koncentracijah toksičen za astrocite, medtem ko v nizkih koncentracijah lahko deluje tudi zaščitno.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 612.111(043.2)
CX bilirubin, astrocytes, regulated cell death, apoptosis, necroptosis, hormesis AU VRABIČ, Ajda
AA LIPNIK-ŠTANGELJ, Metoda (supervisor), TURK, Tom (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master study Programmes in Molecular and Functional Biology
PY 2021
TI TOXICITY OF BILIRUBIN TO RAT CORTICAL ASTROCYTES DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes)
NO IX, 58 p., 15 tab., 1 fig., 171 ref.
LA sl AL sl/en
AB Bilirubin is an endogenous substance, formed during the breakdown of hemoglobin. When there is too much of it in the body it becomes toxic. Bilirubin toxicity is well known in the central nervous system, where it is deposited in the basal ganglia, hippocampus and brainstem, including the pons and midbrain.
Bilirubin is also a powerful antioxidant, which protects the central nervous system from oxidative stress, caused by staurosporine. The aim of our study was to determine the effect of bilirubin on apoptosis and necroptosis as two forms regulated cell death of astrocytes. We were also interested in how bilirubin affects the production of ATP, which serves as an indicator of cell's physiological state.
As an experimental model we used astrocyte cultures of the cerebral cortex of newborn rats. As a result of a flow cytometer analysis bilirubin was found to have no effect on astrocyte apoptosis, whereas at high concentrations (100 nM and 250 nM) it increased the proportion of necroptotic cells. On the other hand, in the case of necroptosis, bilirubin has shown a hormestic effect, where at a low concentration (10 nM) it acted protectively and reduced astrocyte necroptosis, triggered by 1 µM staurosporine. Our experimental conditions did not show any effect of bilirubin on the amount of ATP in astrocytes. We came to the conclusion, that bilirubin in high concentrations is toxic to astrocytes, while in low concentrations it can also act protectively.
KAZALO VSEBINE
1 UVOD ... 1
2 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE ... 2
2.1 CILJI MAGISTRSKEGA DELA ... 2
2.2 DELOVNE HIPOTEZE ... 2
3 PREGLED OBJAV ... 3
3.1 BILIRUBIN ... 3
3.2 METABOLIZEM BILIRUBINA ... 3
3.3 VLOGA BILIRUBINA V TELESU ... 5
3.4 HIPERBILIRUBINEMIJA ... 7
3.5 ASTROCITI ... 8
3.5.1 Vloga astrocitov v osrednjem živčevju ... 8
3.6 VPLIV BILIRUBINA NA OSREDNJE ŽIVČEVJE ... 10
3.6.1 Zaščitne lastnosti bilirubina v osrednjem živčevju ... 10
3.6.2 Toksičnost bilirubina za osrednje živčevje ... 10
3.7 NADZOROVANA CELIČNA SMRT ... 12
3.7.1 Apoptoza ... 12
3.7.2 Nekroptoza ... 14
3.8 STAVROSPORIN IN INDUKCIJA CELIČNE SMRTI ... 15
3.9 ATP ... 16
4 MATERIAL IN METODE DELA ... 18
4.1 MATERIAL ... 18
4.1.1 Kemikalije in reagenti ... 18
4.1.2 Gojišče in pufri ... 18
4.1.3 Kompleti reagentov ... 19
4.1.4 Oprema ... 19
4.2 METODE DELA ... 19
4.2.1 Poskusne živali ... 19
4.2.2 Priprava medijev ... 20
4.2.3 Priprava primarnih kultur astrocitov iz korteksa podgane ... 20
4.2.4 Obdelava celic z bilirubinom in stavrosporinom ... 20
4.3 DOLOČANJE KONCENTRACIJE PROTEINOV IN KONCENTRACIJE ATP 21
4.3.1 Obdelava celic za določanje koncentracije proteinov in koncentracije
ATP 21
4.3.2 Določanje koncentracije proteinov ... 22
4.3.3 Določanje koncentracije ATP ... 23
4.4 DOLOČANJE CELIČNE SMRTI S PRETOČNIM CITOMETROM ... 24
4.4.1 Obdelava celic za določanje celične smrti s pretočnim citometrom .. 24
4.4.2 Barvanje celic z aneksinom V in 7-aminoaktinomicinom D za detekcijo in relativno ovrednotenje obsega apoptoze in nekroptoze ... 24
4.4.3 Merjenje s pretočnim citometrom... 25
4.5 STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV ... 25
5 REZULTATI ... 27
5.1 ANALIZA CELIC S PRETOČNIM CITOMETROM ... 27
5.1.1 Ugotavljanje celične smrti s pretočnim citometrom ... 27
5.1.1.1 Vpliv bilirubina na viabilnost celic astrocitov ... 28
5.1.1.2 Vpliv bilirubina na viabilnost celic pri indukciji celične smrti s stavrosporinom ... 29
5.1.2 Ugotavljanje deleža apoptotičnih celic s pretočnim citometrom... 30
5.1.2.1 Vpliv bilirubina na apoptozo celic astrocitov ter vpliv bilirubina na apoptozo celic pri indukciji celične smrti s stavrosporinom ... 30
5.1.3 Ugotavljanje deleža nekroptotičnih celic s pretočnim citometrom .... 32
5.1.3.1 Vpliv bilirubina na nekroptozo celic astrocitov ... 32
5.1.3.2 Vpliv bilirubina na delež nekroptotičnih celic med indukcijo celične smrti s stavrosporinom ... 34
5.2 REZULTATI ANALIZE CELIC S ČITALCEM MIKROTITRSKIH PLOŠČ 36 6 RAZPRAVA ... 39
6.1 VPLIV BILIRUBINA NA VIABILNOST, APOPTOZO IN NEKROPTOZO ASTROCITOV ... 39
6.2 VPLIV BILIRUBINA NA KOLIČINO ATP V ASTROCITIH ... 42
7 SKLEP ... 44
8 VIRI ... 45
KAZALO SLIK
Slika 1: Mikrotitrska plošča z vzorci za merjenje znotrajcelične koncentracije proteinov
... 23
Slika 2: Enačba reakcije ATP z luciferinom in luciferazo ... 23
Slika 3: Pretočni citometer, Quanta SC MPL (Beckman Coulter, Inc, Brea, Kalifornija, ZDA) ... 25
Slika 4: Nativni posnetek kontrolnih celic I. (A) in nativni posnetek celic po dodatku 1 µM stavrosporina (B). ... 27
Slika 5: Grafični prikaz analize astrocitov možganske skorje novorojenih podgan s pretočnim citometrom... 28
Slika 6: Vpliv različnih koncentracij BR na viabilnost astrocitov možganske skorje. .. 29
Slika 7: Vpliv BR na viabilnost astrocitov pri indukciji celične smrti z STS ... 30
Slika 8: Vpliv različnih koncentracij BR na apoptozo astrocitov ... 31
Slika 9: Vpliv različnih koncentracij BR na apoptozo astrocitov, sproženo z STS ... 32
Slika 10: Vpliv različnih koncentracij BR na nekroptozo astrocitov ... 33
Slika 11: Grafični prikaz primerjave kontrolnih celic II. (A) in celic, izpostavljenih BR v koncentraciji 250 nM (B) ... 34
Slika 12: Vpliv različnih koncentracij BR na nekroptozo astrocitov, sproženo z STS.. 35
Slika 13: Grafični prikaz rezultatov s pretočnega citometra ... 36
Slika 14: Vpliv različnih koncentracij BR na količino ATP v astrocitih ... 37
Slika 15: Vpliv bilirubina na sproščanje ATP ob indukciji celične smrti z STS ... 38
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Protokol obdelave vzorcev za meritve s pretočnim citometrom in čitalcem mikrotiterskih ploščic ... 21
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI BR – bilirubin
OŽ – osrednje živčevje ATP – adenozin trifosfat STS – stavrosporin
RCS – regulirana celična smrt LDL – lipoproteini nizke gostote HO – oksigenaza
BV – biliverdin
UDPGT – uridin-difosfoglukuronska glukuronoziltransferaza TB – bilirubin v serumu
B – topni bilirubin DB – direktni bilirubin
UCB – nekonjugiran bilirubin Bf – prost nekonjugiran bilirubin DNA – deoksiribonukleinska kislina ROS – reaktivne kisikove zvrsti NOX – NADPH oksidaza
PPAR α – (angl. peroxisome proliferator-activated receptor α) NO – dušikov oksid
GFR – glomerulne filtracije
TNF – tumor-nekrotizirajoči faktor
RIPK – z receptorjem interreagirajoča protein kinaza NFκB – jedrni faktor kappa-B
TRAIL – (angl. tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) CAMKII – proteinska kinaza II, odvisna od kalcija/kalmodulina
DISC – smrt inducirajoči signalni kompleks PS – translokacija fosfatidilserina
7-AAD – 7-aminoaktinomicinom D Bcl-2 – B-celični limfom 2
1 UVOD
Bilirubin (BR) je telesu lastna snov, ki nastaja pri razgradnji hemoglobina. Pomemben je pri nastajanju žolča, poleg tega pa ima v organizmu številne ugodne učinke: deluje kot antioksidant, povečuje občutljivost na inzulin, zmanjšuje koncentracijo lipoproteinov nizke gostote (LDL), zavira agregacijo trombocitov in ima protivnetne lastnosti. Ugodno vpliva na homeostazo v žilju in zmanjšuje tveganje za srčno-žilne zaplete (Kalakonda in sod., 2020; Tsai in sod., 2018). Kadar je v organizmu BR preveč, deluje toksično. Znana je toksičnost BR v osrednjem živčevju (OŽ); BR se odlaga v bazalnih ganglijih, hipokampusu in možganskem deblu, vključno s ponsom in srednjimi možgani (Riordan in sod., 2019). Pri novorojenčkih povzroča z BR sproženo encefalopatijo, ki se kaže z epileptičnimi napadi, opistotonusom in hipertermijo. Različne študije so pokazale, da BR deluje toksično na nevrone v rezinah možganov, izoliranih živčnih končičih in nevrone v celičnih kulturah (Silva in sod., 2002). V nevronih povzroča tako nekrozo kot tudi apoptozo (Hanko in sod., 2005). BR poleg nevronov vpliva tudi na funkcijo astrocitov, ki ključno prispevajo k razvoju in homeostazi OŽ ter pri nevrodegenerativnih in nevroregenerativnih procesih v OŽ (Verkhratsky in sod., 2019). Znano je, da BR v astrocitih vpliva na procese, kot so privzem glutamata, sproščanje laktatne dehidrogenaze in spremembe citoskeleta (Silva in sod., 2002). Čeprav so astrociti relativno rezistentni proti celični smrti, novejše raziskave kažejo, da lahko BR v astrocitih sproža različne oblike nadzorovane celične smrti (NCS): apoptozo, nekroptozo in piroptozo (Feng in sod., 2018; Simenc in sod., 2019). Raziskave nakazujejo, da lahko okvare in propadanje astrocitov prispevajo k patogenezi številnih akutnih in kroničnih nevrodegenerativnih bolezni, kot so Alzheimerjeva bolezen, Parkinsonova bolezen in cerebralna ishemija, zato je poznavanje mehanizmov toksičnosti ključnega pomena za razumevanje nastanka bolezni in za morebitne nove pristope k zdravljenju (Takuma in sod., 2004).
2 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE 2.1 CILJI MAGISTRSKEGA DELA
BR je tetrapirolična spojina značilne rumene barve, ki jo poznamo predvsem kot metabolit hema. V telesu ima BR različne funkcije, med drugim tudi to, da na celice deluje toksično ali pa ima do njih zaščitno vlogo. Medtem ko je njegov vpliv na nevrone dobro poznan, pa to ne velja za astrocite, številne celice glije, ki imajo pomembno vlogo pri razvoju, homeostazi, strukturi in odzivu OŽ na poškodbe. Spremembe, ki jih povzroči nenormalno delovanje astrocitov, vplivajo na patologijo številnih bolezni, zato je poznavanje mehanizmov delovanja ključnega pomena za razvoj terapevtskih strategij za zdravljenje bolezni v OŽ. V magistrskem delu smo preverili, ali BR vpliva na količino adenozin trifosfata (ATP) v kulturah astrocitov novorojenih podgan. Zanimalo nas je tudi, kakšen je vpliv različnih koncentracij BR na viabilnost astrocitov ter apoptozo in nekroptozo – dveh oblik regulirane celične smrti, pri katerih lahko propadajo astrociti.
2.2 DELOVNE HIPOTEZE
V magistrskem delu smo preverili naslednje hipoteze:
1. Bilirubin povzroča apoptozo astrocitov možganske skorje podgane.
2. Bilirubin povzroča nekroptozo astrocitov možganske skorje podgane.
3. Bilirubin zmanjša nastanek ATP v astrocitih možganske skorje podgane.
3 PREGLED OBJAV 3.1 BILIRUBIN
BR je snov značilne rumene barve. Spada v superdružino tetrapiroličnih spojin, ki služijo številnim biološkim funkcijam pri živalih in rastlinah (Vítek in Ostrow, 2009). Je pomemben metabolit hema in sodeluje v več bioloških procesih, kot so prenos in shranjevanje kisika, prenos elektronov, presnova zdravil in steroidov, transdukcija signala in obdelava mikro RNA (Kalakonda in John, 2019; Chiabrando in sod., 2014). 75 % do 80 % dnevne proizvodnje BR je posledica presnove hema (Mancuso, 2017; Vítek in Ostrow, 2009), preostali delež BR pa izvira iz različnih beljakovin, ki vsebujejo hem in jih najdemo v drugih tkivih, predvsem v jetrih in mišicah. Te beljakovine so mioglobin, citokromi, katalaze, peroksidaze in triptofan pirolaze (Kalakonda in John, 2019). Količina dnevno proizvedenega bilirubina je ocenjena na 4,4 ± 0,7 mg BR/kg telesne teže, od tega manjši del predstavlja sinteza de novo, preostalo pa izhaja iz hemoglobina, ki nastane pri razgradnji rdečih krvnih celic v retikulo-endotelnem sistemu (Vítek in Ostrow, 2009).
Ker je BR za organizem potencialno toksična snov, je telo zanj razvilo učinkovite mehanizme za razstrupljanje in odstranjevanje (Kalakonda in John, 2019).
3.2 METABOLIZEM BILIRUBINA
BR nastane iz hema preko dvostopenjske reakcije katalitične razgradnje, ki poteka v endoplazemskem retiklu, pretežno v celicah vranice, preostanek pa v fagocitih in Kuppferjevih celicah jeter (Kalakonda in John, 2019). V teh celicah na hem deluje encim hem oksigenaza (HO). Reakcija s HO tvori ekvimolarno količino ogljikovega oksida, ki ga pljuča izločijo, zeleni pigment biliverdin (BV) in železo (Wilks in sod., 1994; Hinds in sod., 2019). BV se v nadaljevanju z biliverdin reduktazo (BVR) reducira v BR (Memon in sod., 2016). Odrasla oseba, ki izraža podtip BVR A, proizvaja izključno BR IXα, medtem ko plod izraža specifičen izomer, biliverdin reduktazo BVR B, in tako je pri plodu prevladujoči izomer BR bilirubin IXβ (Baranano in sod., 2002).
BR, ki se sprosti iz retikulo-endotelnega sistema, je slabo topen v vodi in se zato večinoma veže na serumski albumin (Joseph in Samant, 2020). Vezava albumina omejuje uhajanje BR iz vaskularnega prostora, zmanjša filtracijo skozi glomerule in preprečuje njegovo obarjanje in odlaganje v tkivih. Vezava albumina na BR je reverzibilna. V manjši meri, zlasti pri stanjih hipoalbuminemije, pride tudi do vezave BR z lipoproteini z visoko gostoto (Kalakonda in John, 2019). BR, vezan na albumin, je topen v vodi in se tako prenaša v jetra, natančneje v hepatocite. Med prenosom se vez med albuminom in BR pretrga in tako v hepatocite preide samo BR (Joseph in Samant, 2020). Natančen
mehanizem privzema BR ni znan, vendar se zdi, da je pasivna transmembranska difuzija kombinirana z aktivnim prenosom, ki ga posreduje več sinusnih prenašalcev (Sticova in Jirsa, 2013). Najnovejše raziskave kažejo, da pri privzemu BR v hepatocite sodelujejo tudi prenašalci organskih anionov (Memon in sod., 2016).
V citoplazmi hepatocitov se BR veže na ligandin in se prenese v endoplazemski retikel, kjer poteka konjugacija z glukuronsko kislino (Sticova in Jirsa, 2013). Glukuronidacija poteka z encimom uridin difosfat glikoziltransferaza 1A1 (UGT1A1; EC2.4.1.17), ki spada v družino encimov, imenovano uridin-difosfoglukuronska glukuronoziltransferaza (UDPGT); ti encimi so v endoplazemskem retiklu in v jedrski ovojnici hepatocitov (Sticova in Jirsa, 2013; Vítek in Ostrow, 2009).
Med konjugacijo sta lahko s kovalentno vezavo polarnih skupin glukuronske kisline modificirani ena (monoglukuronid) ali obe (diglukuronid) -COOH skupini (Vítek in Ostrow, 2009). V normalnih razmerah je prevladujoča molekula BR diglukuronid. Če je v razmerah prekomerne sinteze BR sistem konjugacije preobremenjen, je lahko večina BR v konjugirani obliki bilirubin monoglukuronid (Kalakonda in John, 2019). Pri odraslih ljudeh je več kot 80 % BR v obliki diglukuronida, medtem ko pri novorojenčkih prevladujejo monoglukuronidi. Polarne glukuronidne skupine in izpostavljenost polarnih skupin BR, ki so posledica razcepa dveh H-vezi, naredijo diglukuronid vodotopen, kar omogoča prenos do žolča brez beljakovinskega nosilca (Vítek in Ostrow, 2009). Proces konjugacije spremeni še nekaj drugih fizikalno-kemijskih lastnosti BR. Konjugacija poveča velikost molekule, posledično pa preprečuje pasivno resorpcijo BR v črevesni sluznici zaradi njegove hidrofilnosti in velikosti molekule. Konjugacija tako spodbuja odstranjevanje potencialno strupenih presnovkov. Poleg tega konjugacija zmerno zmanjša afiniteto BR za albumin (Kalakonda in John, 2019).
Konjugirani BR se aktivno prenaša skozi žolčno kanalikularno membrano hepatocita.
Gradient koncentracije je zelo visok in lahko doseže 1:1000. Prenos poteka skozi štiri poznane kanalikularne prenašalce. Del konjugiranega BR se prenese v sinusoide in portalni obtok in ga lahko hepatociti ponovno privzamejo preko prenašalcev za organske anione. Tako lahko nekaj konjugiranega in nekonjugiranega bilirubina (UCB) pobegne iz citosola hepatocitov v plazmo, kjer se veže na albumin in prenaša po telesu. V žolč lahko vstopi samo konjugirani BR. Konjugirani BR se z žolčem izloča v tanko črevo (Kalakonda in John, 2019). Črevesne bakterije ga razgradijo v urobilinogen. Polovica urobilinogena se preko portalnega sistema ponovno absorbira v krvni obtok in se izloča
skozi ledvice, preostanek pa se pretvori v sterkobilinogen in se izloči z blatom (Tripathi in Jialal, 2020).
Hitrost pretoka BR je omejena s sposobnostjo izločanja konjugiranega BR iz jeter. Del konjugiranega BR se lahko kopiči v serumu, kadar je izločanje konjugiranega BR iz jeter oslabljeno, kot se to zgodi pri dolgotrajni žolčni obstrukciji ali intrahepatični holestazi.
Ta frakcija konjugiranega BR se kovalentno veže na albumin in se imenuje delta BR ali delta frakcija ali biliprotein. Ker se delta BR veže na albumin, njegovo odstranjevanje iz seruma v nasprotju z običajnimi 2 do 4 urami (razpolovni čas BR) traja približno 12 do 14 dni (kar ustreza razpolovnemu času albumina) (Kalakonda in John, 2019).
3.3 VLOGA BILIRUBINA V TELESU
Bilirubin je dolgo veljal za neuporaben presnovek razgradnje hema. Danes vemo, da ima v telesu številne pomembne funkcije. Najdemo ga v vlogi signalne molekule (Vítek, 2020), kot presnovni hormon (Creeden in sod., 2021), ima pomembno vlogo imuno modulatorja (Liu in sod., 2008), je močan endogeni antioksidant (Hansen in sod., 2020), pri povišanih koncentracijah pa na telo deluje toksično (Vítek, 2020; Vitek in Ostrow, 2009; Hansen, 2001). Koncentracije, pri katerih je BR povišan, se gibajo med 15-20 mg/dl bilirubina v serumu (TB), kar je približno 260-340 µmol/L (Jangi in sod., 2013). McGeary in sod. (2003) navajajo, da TB obstaja v štirih glavnih oblikah:
• UCB: prost ali vezan na albumin;
• konjugiran bilirubin: monoglukuronid ali diglukuronid.
BR pripisujemo protektivno vlogo v organizmu predvsem zaradi njegove sposobnosti, da deluje kot antioksidant (Ostrow in Tiribelli, 2003; Mancuso, 2017). Antioksidativne lastnosti ima ne glede na to, ali je prost ali vezan na albumin, konjugiran ali nekonjugiran.
Koncentracije, pri katerih ima antioksidativni učinek, so pri odraslih med 2 in 12 mg/dL UCB (Jangi in sod., 2013). V primeru oksidativnega stresa se koncentracije BR v telesu povečajo (Gupta in sod., 2016). Protektivno vlogo ima BR takrat, ko je v telesu blago ali zmerno povišan (Sticova in Jirsa, 2013).
Antioksidativni mehanizem BR temelji na razširjenem sistemu konjugiranih dvojnih vezi in reaktivnem vodikovem atomu, ki ga lahko BR donira tako, da se pretvori v radikal (Mancuso, 2017). S tem neposredno vpliva na odstranitev reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS), ki preko redukcije kisika nastanejo v organizmu. BR sodeluje tudi z drugimi antioksidanti, kot je vitamin E, s čimer organizem dodatno zaščiti pred povečano proizvodnjo ROS (Hinds in sod., 2019). BR rabi tudi kot substrat za peroksidaze v prisotnosti vodikovega peroksida ali organskih hidroperoksidov (Vítek, Schwertner, 2007). Med oksidacijo BR v biliverdin lahko en mol UCB, vezanega na albumin, odstrani dva mola peroksidnih radikalov (Mancuso, 2017). V nasprotju z glutationom in cisteinom, ki sta ena izmed glavnih antioksidantov v telesu, lahko BR reagira tudi z O2 •- (superoksidnim anionom) (Vasavda in sod., 2019). Poleg ključne vloge, ki jo ima UCB pri obrambi pred ROS v različnih vrstah celic, je UCB vključen tudi v odstranjevanje reaktivnih dušikovih zvrsti in ima sposobnost preprečevanja znotrajceličnih reakcij nitrozativnega stresa (Mancuso in sod., 2003).
Bilirubin s svojimi antioksidativnimi lastnostmi vpliva na srčno-žilni sistem, imunski sistem, na nevrone, gladko mišičje dihal itd. (Kapitulnik, 2004). Njegovi učinki na srčno- žilni sistem se kažejo kot sposobnost UCB, da inhibira oksidacijo LDL in s tem zmanjšuje tveganje za nastanek ateroskleroze (Neuzil in Stocker, 1994). Poznavanje antioksidativnih lastnosti BR je zelo pomembno, saj ROS sodelujejo pri patologiji raka, staranja, nastanka tumorjev, srčnih bolezni itd. (Stocker in Yamamoto, 1987).
Poleg antioksidativnega učinka BR deluje tudi kot vsestranski biološki »efektor« z antiapoptotičnimi, protirakavimi in celo endokrinimi funkcijami (Vítek in Tiribelli, 2020). Znano je, da na več načinov vpliva na imunski sistem (Vítek in Tiribelli, 2020).
Ker ima podobno strukturo kot aktivatorji PPARα (angl. peroxisome proliferator- activated receptor α), lahko aktivira tudi jedrne receptorje, ki uravnavajo srčno-žilno in presnovno fukcijo. UCB deluje tudi kot selektivni modulator PPARα za posredovanje njegovih antilipemičnih, protivnetnih in protidiabetičnih lastnosti (Vítek, 2020). V žilnih stenah BR zavira nastajanje aterosklerotičnih oblog, tako da vpliva na adhezijske molekule in na presnovo holesterola (Barone in sod., 2009). V ledvicah BR ohranja hitrost glomerulne filtracije (GFR) in ledvični pretok krvi preko interakcije z NO. V jetrih preko direktne vezave na PPARα poveča njegovo aktivnost, kar vodi v aktivacijo genov za razgradnjo lipidov CPT1 in FGF2 in na ta način preprečuje nalaganje lipidov (Mancuso in sod., 2003; Stec in sod., 2016), v OŽ pa aktivira sproščanje protivnetnih citokinov iz mikroglije in astrocitov (Bites, 2012).
3.4 HIPERBILIRUBINEMIJA
Hiperbilirubinemija je povišanje koncentracije TB nad referenčno laboratorijsko vrednost (Singh in Jialal, 2021). Le-to običajno določijo s pomočjo koncentracije topnega bilirubina (B) in neposredno reagirajočega/direktnega bilirubina (DB).
Hiperbilirubinemija je zato definirana kot nekonjugirana hiperbilirubinemija, kadar je razmerje DB/B pod 20-30 %, konjugirana hiperbilirubinemija pa nastopi, ko je razmerje DB/B > 70 %. Poznamo tudi mešani tip, to je takrat, ko so vrednosti vmes, med obema (Fevery, 2008). Povišane ravni TB v nekonjugirani ali konjugirani obliki pri odraslih so lahko pomemben pokazatelj bolezni (Fargo in sod., 2017).
Motnje, ki povzročajo hiperbilirubinemijo, lahko razdelimo na tiste, pri katerih je nastajanje BR prekomerno, na tiste, pri katerih ragradnja BR ne poteka v zadostni meri, in kombinacijo obeh (Memon in sod., 2016). Nekonjugirana hiperbilirubinemija se pojavi zaradi povečanega nastajanja BR, zaradi propadanja rdečih krvničk pri hemolitičnih motnjah in motnjah konjugacije BR. Konjugirana hiperbilirubinemija pa se pojavi pri okvarah jetrnih celic, ki so lahko posledica virusnega in alkoholnega hepatitisa ter holestatskih motenj (Fargo in sod., 2017).
Poznamo več dednih bolezni, ki zaradi okvar na različnih nivojih vodijo do hiperbilirubinemije. Memon in sod. (2016) poročajo, da je to lahko posledica:
• napake v konjugaciji glukuronske kisline z BR (npr. Gilbertov sindrom, Crigler- Najjarov sindrom, Lucey-Driscollov sindrom, materino mleko – zlatenica),
• napake pri izločanju BR v žolč (Dubin-Johnsonov sindrom) ali
• napake v privzemu konjugiranega BR (Rotorjev sindrom).
Novorojenčki so še posebej dovzetni za razvoj hiperbilirubinemije (Memon in sod., 2016). Pri njih hiperbilirubinemijo poznamo tudi pod imenom zlatenica. Ta se izrazi kot rumena obarvanost tkiv, ki je posledica kopičenja presežka BR (Joseph in Samant, 2020).
Do hiperbilirubinemije pri novorojenčkih pride prej, saj ob rojstvu procesi, kot so učinkovit privzem, shranjevanje, konjugacija in izločanje BR preko jeter, še ne delujejo enako uspešno kot pri odraslem človeku (Memon in sod., 2016; Ostrow, 2002). Pri njih nastopi povečana sinteza BR (sekundarno zaradi povišane koncentracije hemoglobina in krajše življenjske dobe rdečih krvnih celic) (Memon in sod., 2016). Za primerjavo je koncentracija BR v plazmi pri zdravem odraslem človeku pod 20 µmol/L, od česar je več kot 96 % te vrednosti UCB (Ostrow, 2002), pri »fiziološki zlatenici« pa je količina TB
med 20 µmol/L in 170 µmol/L. Te vrednosti so zaradi antioksidativnih lastnosti UCB in biliverdina prej nevroprotektivne kot toksične. Nasprotno lahko višje koncentracije, ki nastanejo zaradi povečane hemolize, poslabšanega postnatalnega zorenja jetrnega prenosa ali konjugacije UCB in okrepljene enterohepatične cirkulacije (Ostrow, 2002), povzročijo hudo hiperbilirubinemijo, ki vodi do vročinskih krčev, bruhanja, težav s hranjenjem in drugih simptomov (Shaw, 2007). Primeri, ki se pojavijo pri manj kot 2 % dojenčkov, kjer je skupna koncentracija TB tudi več kot 342,1 μmol/L, pa lahko privedejo do kernikterusa (kronične bilirubinske encefalopatije) (Muchowski, 2014) in s tem trajnih nevroloških okvar, kot so zakasnjen motorični razvoj, nižji inteligenčni kvocient itd.
(Ostrow, 2002).
3.5 ASTROCITI
Osrednje živčevje je sestavljeno iz dveh tipov celic – nevronov in glijalnih celic (Kandel in sod., 2000). Glijalne celice predstavljajo raznoliko populacijo nenevronskih celic v OŽ in zavzemajo približno polovico prostornine človeških možganov (Verkhratsky in sod., 2019). Delimo jih na tri podskupine: mikroglijo, oligodendrocite in astrocite. Astrociti so specializirane celice makroglije, ki jih je številčno kar petkrat več kot nevronov (Sofroniew in Vinters, 2010). So ektodermalnega, nevroepitelnega izvora, po obliki in delovanju so zelo heterogeni in kažejo izjemno plastičnost, ki omogoča funkcionalno vzdrževanje OŽ med razvojem in staranjem (Verkhratsky in Nedergaard, 2018). Glede na celično morfologijo so razdeljeni na dva podtipa: protoplazmatske in vlaknaste astrocite (Sofroniew in Vinters, 2010). Protoplazmatske astrocite najdemo v sivi možganovini, vlaknaste astrocite pa najdemo v celotni beli možganovini (Molofsky in Deneen, 2015). Signaliziranje pri astrocitih poteka večinoma s pomočjo Ca2+ ionov (Verkhratsky in sod., 1998). Na zunajcelične dražljaje se odzivajo z zvišanjem znotrajcelične koncentracije Ca2+ ionov, ki modulira različne signalne procese, kot so diferenciacija, reorganizacija citoskeleta in izločanje nevroaktivnih molekul (Araque in sod., 1998; Sofroniew in Vinters, 2010; Verkhratsky in Kettenmann, 1996). Astrociti lahko prenašajo tudi kalcijeve signale na dolge razdalje v sosednje celice in vplivajo na aktivnost nevronov z modulacijo nevrotransmisije (Coco in sod., 2003).
3.5.1 Vloga astrocitov v osrednjem živčevju
Astrociti so z okoliškimi nevroni in drugimi celicami, kot so mikroglija, endotelijske celice itd., integrirani v zapletena omrežja (Verkhratsky, 2010). Opravljajo številne funkcije, ki so pomembne za normalno fiziologijo OŽ. Astrociti s heterogeno strukturo in funkcijo zagotavljajo homeostazo v možganih in predstavljajo njihov obrambni sistem
(Verkhratsky in Nedergaard, 2018). Sodelujejo tudi v razvoju, pri sinaptični homeostazi, metabolizmu, imunskem odzivu in patoloških procesih v OŽ (Jurič in sod., 2016).
Med razvojem možganov so astrociti glavni elementi nevrogeneze, saj nudijo podporo migracijskim nevronom in igrajo vlogo pri sinaptogenezi in sinaptičnem zorenju.
Sodelujejo tako pri embrionalni nevrogenezi kot pri nevrogenezi v odraslih možganih (Verkhratsky in Nedergaard, 2018). V odraslih možganih sodelujejo v krvno-možganski pregradi, kjer s pomočjo protoplazmatskih astrocitov, ki razširjajo svoje podaljške na krvne žile, nadzorujejo možganski pretok krvi (Tabata, 2015). Astrociti vzdržujejo sinaptično homeostazo. So tesno povezani s sinapsami in sodelujejo pri modulaciji sinaptične aktivnosti in plastičnosti, udeleženi so tudi pri nastanku in preoblikovanju sinaps (Tabata, 2015). Astrociti nadzorujejo funkcijo tripartitnih sinaps in tako regulirajo signaliziranje med nevroni. So nosilci izmenjave nevrotransmiterjev, kot sta na primer glutamat in glutamin, za sinaptični prenos med nevroni (Turner in Adamson, 2011).
Astrociti vplivajo na usodo endogenih prekurzorjev, odstranjujejo nevrotoksine in ščitijo nevrone pred oksidativnim stresom. Skrbijo tudi za oskrbo nevronov z energijskimi substrati, saj njihove presnovne potrebe zaznavajo preko različnih medceličnih molekul, kot so glutamat, K+, NO, vodikov peroksid (H2O2) in amonijak (Turner in Adamson, 2011). Astrociti so mediatorji vnetnega odgovora in so regulatorji tako prirojenega kot pridobljenega imunskega odziva (Aschner, 1998). Aktivnost astrocitov lahko spodbudi vnetne reakcije in poškodbe tkiva ali pa spodbudi imunosupresijo in obnovo tkiva (Colombo in Farina, 2016).
Astrociti se na poškodbe in bolezni OŽ odzovejo z mehanizmom, imenovanim reaktivna astroglioza, ki predstavlja glavni obrambni sistem OŽ (Verkhratsky in Nedergaard, 2018;
Anderson, 2014). Reaktivna astroglioza je izraz za morfološke in funkcionalne spremembe v astrocitih, ki se odzivajo na okvaro v OŽ. Medtem ko je ta obrambna reakcija astrocitov namenjena obvladovanju akutnega stresa, omejevanju okvare tkiva in obnovi homeostaze, lahko zavira tudi mehanizme nevronske plastičnosti, na katerih temelji funkcija okrevanja (Pekny in Pekna, 2014). Obstaja vsaj sedem različnih mehanizmov, s katerimi astrociti ščitijo nevrone pred poškodbami, to so: (1) zaščita pred toksičnostjo glutamata, (2) zaščita pred oksidativnim stresom, (3) posredovanje mehanizmov popravljanja mitohondrijev, (4) zaščita pred presnovnim stresom, ki ga povzroča glukoza, (5) zaščita pred toksičnostjo železa, (6) modulacija imunskega odziva v možganih in (7) vzdrževanje tkivne homeostaze ob prisotnosti poškodb deoksiribonukleinske kisline (DNA) (Bylicky in sod., 2018). Motnje v delovanju astrocitov so vpletene v številne bolezni, kot so multipla skleroza, Alzheimerjeva bolezen, amiotrofična lateralna skleroza in Huntingtonova bolezen (Molofsky in sod., 2012).
3.6 VPLIV BILIRUBINA NA OSREDNJE ŽIVČEVJE
O vplivu BR na OŽ je bilo opravljenih veliko raziskav, ki pojasnjujejo njegovo potencialno toksičnost oziroma njegove zaščitne učinke v OŽ (Chuniaud in sod., 1996).
Astrociti so za poškodbe, ki jih povzroči UCB, nekoliko manj dovzetni kakor nevroni (Brites, 2012), kar je po vsej verjetnosti posledica višje vsebnosti glutationa (Brito in sod., 2008) Prav tako je pri nevronih ob izpostavljenosti UCB višja raven ROS, oksidacije beljakovin in peroksidacije lipidov, kot je ta pri astrocitih (Brites, 2012).
Kadar je BR v fizioloških koncentracijah, je močan antioksidant in služi za zaščito možganskega tkiva pred oksidativnim stresom. Po drugi strani pa je BR v mnogih patoloških stanjih vpleten tudi v napredovanje nevroloških disfunkcij, pri katerih se koncentracija BR zviša nad fiziološko raven. V tem primeru začnejo toksični učinki BR presegati njegove zaščitne učinke in povzročajo poškodbe (Mendez in sod., 2013). Tako kot mnoge šibko polarne, slabo topne spojine, se UCB v krvi prenaša tesno vezan na albumin, zaradi česar manj kot 0,01 % celotnega BR kroži po telesu v nevezani obliki (prosti bilirubin, Bf). Ta frakcija BR ima sposobnost prehajanja skozi krvno možgansko bariero, Bf je lahko tako koristen kot tudi strupen za celice, odvisno od njegove koncentracije (Vítek in Ostrow, 2009).
3.6.1 Zaščitne lastnosti bilirubina v osrednjem živčevju
Bilirubin ima v OŽ pomembno zaščitno vlogo (Mancuso, 2017). Izkazal se je za zaščitnika možganskega tkiva (Zahir in sod., 2015). V koncentracijah od 25 do 50 nM BR iz nevronov učinkovito odstranjuje vodikov peroksid, ne glede na vezavo na albumin (Doré in sod., 1999). Poleg sposobnosti odstranjevanja ROS pa lahko BR iz OŽ odstranjuje tudi RNS (reaktivne dušikove zvrsti), kot je peroksinitrit (Mancuso, 2017).
Poleg antioksidativnih lastnosti pa lahko BR sproži tudi sproščanje protivnetnih citokinov iz mikroglije in astrocitov (Bites, 2012).
3.6.2 Toksičnost bilirubina za osrednje živčevje
Raziskave, izvedene z namenom razkritja molekularnih mehanizmov toksičnosti, so pokazale, da se BR kopiči v celicah, kjer moti več vitalnih funkcij (Brito in sod., 2004;
Rodrigues in sod., 2000; Silva in sod., 2001) in ima več kot en mehanizem toksičnosti (Ostrow in sod., 2004). K toksičnosti BR v največji meri prispeva predvsem UCB, saj lahko skozi hidrofobno lipidno jedro membrane difundira s pasivno difuzijo v katerokoli celico (Bianco in sod. 2020; Zucker in sod., 1999). Kot glavno tarčo toksičnosti UCB
sicer štejemo nevrone in celice glije (Brito, 2006), vendar je bila toksičnost BR dokazana tudi v drugih celicah, kot so eritrociti (Mireles in sod., 1999), limfociti in granulociti (Miler in sod., 1985), fibroblasti, celice L-929 (Hansen in sod., 2020) in osteoblasti (Janes in sod., 1995). Odlaganje BR se v OŽ pojavlja v bazalnih ganglijih, malih možganih, hipokampusu in možganskem deblu (vključno s ponsom) in srednjimi možgani (Riordan in Shapiro, 2019). BR znotraj teh predelov povzroča izgubo nevronov, demielinacijo in gliozo (Bites, 2012). Kopičenje BR v OŽ je omejeno z njegovim aktivnim izvozom, ki ga omogoča sistem MRP1/Mrp1, prisoten v epiteliju žilnega pleksusa in kapilarnih endotelijih astrocitov in nevronov. To je od ATP-odvisen transporter, povezan z odpornostjo na več zdravil, ki posreduje prenos organskih anionov in tudi BR. Povišanje ravni beljakovin MRP1/Mrp1 predstavlja pomemben prilagoditveni mehanizem, ki ščiti OŽ pred toksičnimi učinki BR (Mancuso in sod., 2017).
Toksičnost BR se odraža predvsem v zaviranju rasti, celične proliferacije, zmanjšani vsebnosti znotrajceličnega ATP, zmanjšani sintezi beljakovin in DNA, membranski prepustnosti, zmanjšanem membranskem potencialu, membranskih fuzijskih dogodkih, spremenjeni vsebnosti in porazdelitvi membranskih fosfolipidov, zaviranju oksidativne fosforilacije, oksidativnem stresu in zaviranju privzema alanina in konjugacije BR ter celični smrti (Hansen in sod., 2020).
Vzrok za nastanek poškodb celic OŽ, ki jih povzroča BR, je predvsem posledica njegovega vpliva na celične membrane. V višjih koncentracijah BR vpliva na plazemsko membrano, mitohondrijsko membrano in membrano endoplazemskega retikla (Watchko, 2006). BR povečuje polarnost in fluidnost lipidov in mobilnost beljakovin (Rodrigues in sod., 2002). Motnja v strukturi membran povzroči zmanjšano absorpcijo presnovnih substratov (Vázquez in sod., 1988). Spremembe v strukturi celičnih membran vodijo tudi do motenj delovanja mitohondrijev in povišane znotrajcelične koncentracije kalcija [Ca2+]i. Povišana [Ca2+]i povzroča aktivacijo proteolitičnih encimov, aktivacijo RCS in propad celic (Watchko, 2006). Povečana fluidnost membrane ugodno vpliva na eksternalizacijo fosfatidilserina, kar omogoča fagocitno prepoznavanje propadlih celic in s tem njihovo odstranitev iz sistema (Jessel in sod., 2002). Aktivacija teh procesov je odvisna od koncentracije in časa izpostavljenosti celic UCB (Watchko, 2006). UCB pa ne učinkuje toksično samo na membrane, njegovi učinki vključujejo tudi zaviranje sinteze DNA in beljakovin, spremembe v presnovi ogljikovih hidratov ter modulacijo sinteze in sproščanja nevrotransmiterjev v nevronskih tkivih in nevronskih celičnih linijah (Kapitulnik, 2004). Pri citotoksičnosti bilirubina ima pomembno vlogo tudi apoptoza. S poskusi na podganah so dokazali, da BR inducira sproščanje citokroma c v procesu, ki je povezan z aktivacijo kaspaze-3, kar povzroči depolarizacijo mitohondrijev skupaj s
translokacijo Bax. Prav tako bi lahko imel vpliv na apoptozo preko aktivacije receptorjev N-metil-d-aspartata (NMDA), kot so to opisali pri in vivo modelu podgan Gunn (Grojean in sod., 2001).
3.7 NADZOROVANA CELIČNA SMRT
Nadzorovana celična smrt (RCS) je fiziološka oblika celične smrti, ki je odgovorna za uravnavanje proliferacije in vzdrževanje konstantnega števila celic v tkivih in predstavlja obrambni mehanizem, s katerim telo odstrani poškodovane in potencialno nevarne celice iz organizma (Cooper, 2000). Za RCS so značilni energijsko odvisni biokemični mehanizmi, ki potekajo preko signalnih kaskad, izvajajo pa jo nizi določenih efektorskih molekul (Tang in sod., 2019). RCS ima različne morfološke značilnosti, kot sta krčenje celic in krčenje jedra, medtem ko potekajo kondenzacija kromatina in citoplazme ter razpad celičnih organelov in brstenje membrane (Elmore, 2007; Šimenc in Lipnik- Štangelj, 2012).
RCS deluje preko nadzornih mehanizmov, ki uravnavajo proces celične smrti. To jo loči od nekroptoze, ki jo sprožijo nepričakovane poškodbe in okvare, ki prevladajo nad nadzornimi mehanizmi (Tang in sod., 2019). Pri RCS se celice iz telesa odstranjujejo na način, ki minimalno škodi okoliškim tkivom, za nekrozo pa je običajno, da zaradi hudih poškodb pride do razlitja vsebine celic v okoliška tkiva, izgube celic in lokalnega vnetja (D'Arcy, 2019). Desetletja je veljalo, da je apoptoza edina oblika RCS, ki naj bi zagotavljala odstranjevanje umirajočih celic brez motenj za sosednje celice in strukture.
Odbor za nomenklaturo o celični smrti (NCCD), ki v zadnjem desetletju oblikuje smernice za opredelitev in razlago celične smrti z morfološkega, biokemičnega in funkcionalnega vidika, navaja, da apoptoza ni edina oblika RCS, ampak obstaja več oblik neapoptotične RCS, kot so: nekroptoza, feroptoza, NEToza, piroptoza, entoza (celični kanibalizem), partanatos, mitotska katastrofa in druge (Galluzzi in sod., 2018; Wimmer in sod., 2020). Vse oblike RCS so definirane glede na morfološke kriterije (Chen in sod., 2020).
3.7.1 Apoptoza
Apoptoza je pogosta oblika RCS in se običajno pojavi med razvojem in staranjem kot homeostatski mehanizem za vzdrževanje populacij celic v tkivih. Pojavlja se tudi kot obrambni mehanizem pri imunskih odzivih ali kadar bolezni poškodujejo celice (Norbury in Hickson, 2001).
Morfološke spremembe, ki spremljajo apoptozo, so kriterij, po katerem ločimo apoptozo od drugih oblik RCS. Apoptozo spremlja krčenje celic in jedra ob hkratni kondenzaciji jedrnega kromatina. Zatem razpade jedro, celice pa se odcepijo od okoliškega tkiva.
Plazemska membrana se medtem oblikuje na način, da oblikuje posebne izrastke, ki se med procesom brstenja (angl. budding) ločijo in tvorijo t. i. apoptotična telesa, ki so sestavljena iz celičnega materiala (Van Cruchten in Van Den Broeck, 2002). Sosednje celice in makrofagi nato apoptotična telesa odstranijo (Kerr, 1972).
Molekularni mehanizem apoptoze vključuje različne dejavnike, predvsem skupino znotrajceličnih cisteinskih proteaz, imenovanih kaspaze, ki so neposredno ali posredno odgovorne za značilne morfološke in biokemične spremembe med apoptozo (Reed, 2020). Obstaja veliko število dražljajev in stanj, tako fizioloških kot patoloških, ki lahko sprožijo apoptozo, vendar ni nujno, da bodo vse celice propadle zaradi odziva na isti dražljaj (Elmore, 2007). Celica lahko apoptozo začne sama, ko preko številnih znotrajceličnih senzorjev zazna škodo. Ta mehanizem je znan kot intrinzična ali mitohondrijska pot apoptoze. Lahko pa je posledica interakcije med celico imunskega sistema in poškodovano celico, ki ji pravimo ekstrinzična pot, ali pa se sproži zaradi vezave določenih ligandov na membranske receptorje smrti (Sica in sod., 1990;
Oppenheim in sod., 2001). Čeprav se ti dve poti pogosto obravnava ločeno in lahko delujeta neodvisno, pa lahko med njima pride tudi do križanja na več nivojih, odvisno od nabora izraženih proteinov, ki modulirajo apoptozo (Reed, 2020).
Intrinzična pot:
Intrinzična ali mitohondrijska pot se aktivira z vrsto eksogenih in endogenih dražljajev, vključno s poškodbami DNA, ishemijo in oksidativnim stresom. Na intrinzično pot vplivajo člani družine proteinov Bcl, vezani na mitohondrijsko membrano, vključno z Bax in Bcl-2 (B-celični limfom 2), ki delujejo kot proapoptotični oziroma antiapoptotični regulatorni proteini. Funkcionalna posledica proapoptotične signalizacije intrinzične poti so motnje v delovanju mitohondrijske membrane in sproščanje citokroma c v citoplazmo, kjer tvori kompleks ali apoptosom z APAF 1 (apoptotičnim faktorjem, ki aktivira proteazo 1) in neaktivno obliko kaspaze 9. ATP ta kompleks hidrolizira, tako da razcepi in aktivira kaspazo 9. Kaspaza 9 nato razcepi in povzroči kaspazno kaskado, ker aktivira kaspaze 3, 6 in 7 in posledično povzroči apoptozo celic. Antiapoptotična proteina Bcl-2 in Bcl-XL pa po drugi strani zavirata sproščanje citokroma C in tako preprečujeta proces apoptoze (Loreto in sod., 2014).
Ekstrinzična pot:
Ekstrinzične signalne poti, ki sprožijo apoptozo, vključujejo interakcije, ki jih posredujejo transmembranski receptorji. Ti vključujejo receptorje smrti, ki so člani superdružine receptorjev tumor-nekrotizirajočega faktorja (TNF). Najbolj znana sta TNF 1 in Fas receptor (Locksley in sod., 2001). Članom družine je skupno, da imajo podobne zunajcelične domene, bogate s cisteinom, in citoplazemsko domeno s približno 80 aminokislinami, imenovano »smrtna domena« (Ashkenazi in Dixit, 1998). Ta smrtna domena igra ključno vlogo pri prenosu signala s celične površine na znotrajcelične signalne poti. TRAIL (angl. tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) je ligand, ki inducira apoptozo preko njegovih receptorjev smrti DR4 in DR5 in ima vlogo v imunskih in homeostaznih procesih. Ti dogodki nato aktivirajo inicijacijsko kaspazo 8, ki cepi in aktivira efektorsko kaspazo 3. Aktivacija kaspaz pa vodi do biokemičnih in morfoloških sprememb, kot so kondenzacija kromatina, fragmentacija jedra in razgradnja citoskeleta. Ko se kaspaze aktivirajo, postane apoptoza ireverzibilna (Loreto in sod., 2014).
Apoptozo lahko od nekroze ločimo tako vizualno pod mikroskopom kot z različnimi molekularnimi tehnikami, npr. s pretočno citometrijo v kombinaciji z barvilom Aneksinom V-FITC, DNA fragmentacijskimi testi in ELISA testi (angl. enzyme linked immunosorbent assay) (D'Arcy, 2019). Parametri, ki spadajo med biomarkerje za apoptozo, so aktivacija kaspaz (kaspaza 3), sproščanje citokroma c, fragmentacija oligonukleosomske DNA, ekstracelularni vezikli itd. Za določanje nekroze se pogosto uporablja negativno označevanje oziroma odsotnost apoptotičnih parametrov, obstajajo pa tudi specifični označevalci nekroze, predvsem cirkulirajoči biomarkerji, kot so High- mobility group box-1 protein in zunajcelična miRNA (Krysko in sod., 2008; Wimmer in sod., 2020).
3.7.2 Nekroptoza
Nekroptoza je oblika RCS, ki posnema značilnosti apoptoze in nekroze. Po morfoloških značilnostih, kot je nabrekanje celic in organelov ter trganje plazemske membrane, bi lahko nekroptozo uvrstili med nekrozo, vendar pa zaradi značilne signalne poti posnema tudi značilnosti apoptoze. Aktivacijo nekroptoze posredujejo imunski ligandi, vključno s Fas, TNF in LPS, kar vodi v aktivacijo avtokatalitične receptorsko proteinske kinaze RIPK (regulator vnetja, preživetja celic in bolezni), ki s fosforilacijo aktivira MLKL (angl. mixed lineage kinase domain-like protein). Fosforilacija, posredovana z RIPK, sproži oligomerizacijo MLKL, ki vodi do translokacije membrane in posledično motnje v delovanju membrane (Dhuriya in Sharma , 2018).
Najbolj preučena pot, ki vodi do nekroptoze, je pot, ki jo sproži TNFα. TNFα se veže na TNF-R1 (angl. tumor necrosis factor receptor) in povzroči strukturne spremembe, ki omogočajo vezavo TRADD proteina (angl. receptor-associated death domain) in ubikvintinskih ligaz, ki ustvarijo membranski kompleks. Poliubikvintinacija RIPK1 povzroči aktivacijo proteinskega kompleksa jedrnega faktorja kappa-B (NFκB) (Galluzzi in sod., 2017), ki je transkripcijski faktor, ki omogoča ekspresijo številnih vnetnih genov (Moriwaki in sod., 2016).
Poleg izmenjave nekaterih pogostih sprožilcev celične smrti sta apoptoza in nekroptoza med postopkom prenosa signala povezani na več točkah. Tako na primer lahko aktivirana kaspaza-8 cepi mediatorja nekroptoze RIPK1 in RIPK3 ter s tem narekuje celično smrt z apoptozo (Khoury in sod., 2019; Weinlich in sod., 2016; Wang in sod., 2019). Različni tipi RCS imajo različne imunološke posledice, zato je razlikovanje med njimi ključnega pomena za razumevanje patofiziologije nevroloških motenj in raka ter za zagotavljanje novih terapevtskih pristopov (Khoury in sod., 2019; Simenc in Lipnik-Stangelj, 2012).
Velik klinični pomen ima na primer nekroptotični tip celične smrti, povezan z dejavnikom tumorske nekroze, ki inducira apoptozo preko TRAIL, ta pa inducira apoptozo v različnih človeških rakastih celičnih linijah, ob tem pa normalne celice ostanejo nedotaknjene (Dunai in sod., 2012).
3.8 STAVROSPORIN IN INDUKCIJA CELIČNE SMRTI
Stavrosporin (STS) je naravni alkaloid, izoliran iz streptomicete Streptomyces staurosporeus, ki ga pogosto uporabljajo kot induktor apoptoze (Gescher, 1998). STS je neselektivni zaviralec proteinskih kinaz, ki deluje že v nanomolarnih koncentracijah (Koh in sod., 1995). Na inhibicijo proteinskih kinaz deluje z vezavo v »žep«, ki je sicer vezavno mesto za ATP. Na ta način močno zavira > 70 % človeških kinaz z več kot 300 kinaznimi strukturami, vključno s proteinsko kinazo C (Davis in sod., 2011; Wang in sod., 2014).
STS inducira apoptozo v več različnih nevronskih in nenevronskih vrstah celic (Koh in sod., 1995). Mehanizmi, s katerimi STS inducira celično smrt, so raznoliki in odvisni od vrste celic (Stepczynska in sod., 2001). Pri miših z akutno limfoidno levkemijo celic L1210, različnih vrstah celic človeškega melanoma in celicah karcinoma dojke so dokazali, da stavrosporin povzroča apoptozo preko obeh poti – od kaspaz odvisne in od kaspaz neodvisne poti (Šimenc in Lipnik-Štangelj, 2012). STS povzroča apoptotično smrt glijalnih celic v odvisnosti od koncentracije in časa izpostavljenosti (Olguín-Albuerne in sod., 2014), ne inducira pa le apoptoze, ampak tudi nekroptozo. Mehanizem nekroptoze v astrocitih laboratorijskih podgan, induciran z STS, je odvisen od RIP1 kinaze in neodvisen od kaspaz (Šimenc in Lipnik-Štangelj, 2012).
3.9 ATP
Adenozin trifosfat (ATP) je osnovna znotrajcelična energijska valuta živih celic (Plattner in Verkhratsky, 2016). ATP se pojavlja tudi v vlogi nevrotransmiterja in sodeluje pri medcelični komunikaciji v živčevju in imunskem sistemu (Verderio in Matteoli, 2001;
Rodrigues in sod., 2015), deluje tudi kot nadzornik vnetnih procesov in regulira diferenciacijo ter mielinizacijo oligodendrocitov (Verderio in Matteoli, 2001). Astrociti sproščajo ATP ob mehanski stimulaciji ali aktivaciji glutamatnega receptorja. Sproščanje ATP poteka odvisno in neodvisno od Ca2+. Od Ca2+ odvisno sproščanje poteka preko sekretornih veziklov, ki vsebujejo ATP in se zlijejo s plazemsko membrano v odvisnosti od dražljaja, ki je običajno povečanje citosolne [Ca2+]. Sproščanje ATP, ki je neodvisno od Ca2+, pa poteka preko sproščanja ATP skozi kanale na plazemski membrani astrocitov, kot so anionski kanal, koneksinski hemikanali (aktivirani z nižjimi koncentracijami Ca2+) in ionotropni purinergični receptorski kanali (Xiong in sod., 2018). Astrociti se na ATP odzovejo s povečanjem koncentracije znotrajceličnega Ca2+ (Verderio in Matteoli, 2001).
ATP v telesu nastaja v aerobnih razmerah s celičnim dihanjem, beta-oksidacijo, ketozo lipidov in katabolizmom beljakovin, pa tudi v anaerobnih razmerah z glikolizo (Dunn in sod., 2021). Količina ATP in razmerje med ATP in ADP sta osrednja kazalnika stanja energijskega statusa celice (Tantama in Yellen, 2014). Ker je možgansko tkivo zapleteno in heterogene narave, signalna dejavnost pa je neprekinjena in dinamična, predstavlja preučevanje energijske presnove v možganih na nivoju celične in molekularne ločljivosti poseben izziv (Tantama in Yellen, 2014). Mitohondriji imajo ključno vlogo pri regulaciji ravni ATP (Zhang in sod., 2018), poleg tega imajo tudi zelo pomembno vlogo pri celičnem signaliziranju, regulaciji genov in mnogih drugih funkcijah (Friedman in Nunnari, 2014; Bock in Tait, 2020). Mitohondriji imajo tudi osrednjo vlogo pri apoptotični celični smrti. Po indukciji mitohondrijske apoptoze permeabilizacija zunanje membrane mitohondrija običajno povzroči, da celica propade. Permeabilizacija membrane je vodena preko pro-apoptotičnega efektorja Bcl-2 iz družine beljakovin Bax in Bak (Bock in Tait, 2020). Posledično se v citoplazmo sproščajo različni pro-apoptotični proteini, ki aktivirajo kaspaze in proteaze, te pa orkestrirajo celično smrt. Tudi po permeabilizaciji zunanje membrane lahko mitohondriji v zelo majhnem deležu ohranijo svoje funkcije, med drugim tudi proizvodnjo ATP (Waterhouse, 2003). Mitohondriji proizvajajo tudi ROS kot stranski produkt proizvodnje ATP, s katerimi prav tako inducirajo apoptozo (Waterhouse, 2003). Že Mustafa in sod. (1969) so pokazali, da se BR veže na fospolipide mitohondrijske membrane (Mustafa in sod., 1969). Vezava BR na mitohondrije povzroči spremembe na mitohondrijski membrani, ki vodijo do permeabilizacije membrane in posledično inhibicije prenosa elektronov. Poleg omenjenega BR deluje kot učinkovit inhibitor glutamat dehidrogenaze, encima, ki sodeluje pri nastanku α-ketoglutarata, ta pa preko Krebsovega cikla vodi do nastanka ATP
(Noir in sod., 1972). ATP se v celici neprestano obnavlja in tako vzdržuje stalno delujočo celico (Dunn in Grider, 2021).
4 MATERIAL IN METODE DELA 4.1 MATERIAL
4.1.1 Kemikalije in reagenti
• Leibowitzev medij (L-15), (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Škotska)
• goveji fetusni serum (FBS), (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Škotska)
• Dulbeccov modificirani medij Eagle: Hamova mešanica nutrientov F-12 (DMEM/F-12) v razmerju 1:1, (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Škotska)
• penicilin-streptomicin (10,000 U Pen/ml, 10,000 μg Strep/ml), (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Škotska)
• fosfatni pufer (PBS), (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Škotska)
• 0,05 % tripsin-etilendiamintetraocetna kislina (EDTA), (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Škotska)
• 7,5 % raztopina NaHCO3, sterilno filtrirana, primerna za celične kulture (Sigma- Aldrich, Steinheim, Nemčija)
• visoko prečiščena voda
• bilirubin (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)
• stavrosporin, ≥ 95 % (HPLC) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)
• tripsin (0,05 % Trypsin-EDTA, Gibco, Life Technologies, Paisley, Škotska)
• DMSO (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija)
• HCl 37 % (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) za umerjanje pH gojitvenega seruma
• -2-7-diklordihidrofluorescin diacetat (DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ZDA)
4.1.2 Gojišče in pufri
• lizni pufer – boratni pufer (0,1 M: 1,90 g Na-tetraborata + 1,24 g borove kisline v 400 ml visoko prečiščene vode, pH 8,5)
• založna raztopina poli-l-lizina (PLL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, ZDA, P1524 – 25 mg, raztopljeno v 25 ml boratnega pufra za koncentracijo 1 mg/ml)
4.1.3 Kompleti reagentov
• BIO-RAD komplet za določevanje proteinov (Bio-Rad Laboratories, München, Nemčija)
• ATPliteTM 1 step (Perking Elmer, Boston, USA)
• aneksin V/fluorescin izotiocianat (aneksin V-FITC)/7-aminoaktinomicin D (7- aad) komplet reagentov (Beckman Coulter, Inc, Brea, Kalifornija, ZDA)
4.1.4 Oprema
• centrifuga (SIGMA 3K30)
• pretočni citometer Quanta SC MPL; Beckman Coulter, Inc (Brea, Kalifornija, ZDA)
• čitalec za mikrotitrske plošče (SynergyHT, Bio Tek, Winooski, ZDA,)
• fazno kontrastni mikroskop (Nikon TS 100, Nikon Corp., Tokio, Japonska)
• steklenice in petrijevke za celične kulture (TPP AG, Trasadingen, Švica)
• orbitalni mešalnik (Thermomixer comfort, Eppendorf, Hamburg, Nemčija)
• elekronska pipeta (Eppendorf, Hamburg, Nemčija)
4.2 METODE DELA 4.2.1 Poskusne živali
Za izvedbo poskusov smo uporabili novorojene (stare 1-2 dni) podgane obeh spolov, vrste Rattus norvegicus, seva Wistar. Živali so bile iz lastne vzrejne kolonije, vzrejene v stabilnih razmerah s temperaturo 22 °C, relativno vlažnostjo 55 % in naravnim ciklusom svetlobe in teme. Živele so v kletkah Ehret tip IV (Ehret, Emmendingen, Nemčija).
Material v kletkah je bil Lignocel 3-4, živali pa so dobivale standardno dieto za glodavce Altromin (oboje Altromin, Lage, Nemčija). Omogočen jim je bil prost dostop do hrane in vode.
Poskuse na živalih smo izvedli na podlagi dovoljenja za izvajanje poskusov na živalih številka 34401-7/2012/3, ki ga je izdala Veterinarska uprava Republike Slovenije.
Postopke smo izvedli v skladu z Evropsko konvencijo št. 123 za zaščito vretenčarjev, ki se uporabljajo v poskusne in druge znanstvene namene.
4.2.2 Priprava medijev
Medij za gojitev celic (gojitveni medij): 89 % osnovnega medija + 10 % FBS (Gibco) + 1 % penicilin/streptomicin mešanice (Gibco)
4.2.3 Priprava primarnih kultur astrocitov iz korteksa podgane
Za poskuse smo uporabili 1-3 dni stare mladiče podgan (sev Wistar). Podgane smo dekapitirali in jim odvzeli možgane, ki smo jim s fino pinceto odstranili meninge (možganske ovojnice). Po ločitvi mening od možganske skorje (korteksa), smo le-te prenesli v petrijevko z medijem L-15 ter jih prenesli v medij za gojenje celičnih kultur (10 ml), sestavljen iz DMEM/F12 (1:1; pH 7,0), FBS (10 % vol/vol), penicilina (100 U/ml) in streptomicina (100 μg/ml). Celično suspenzijo smo nato prenesli v steklenico za gojenje celičnih kultur (75 𝑐𝑚2). Tako pripravljene celice smo inkubirali v vlažni atmosferi pri 37 °C, 10 % CO2 in menjavi medija vsake 3-4 dni. Celice smo na opisan način gojili do konfluentnosti, ki smo jo optično določili pod fazno kontrastnim mikroskopom. Konfluentne celice smo dali na stresalnik za 12 ur pri 150 obratih/min in 37 °C. Nato smo zamenjali medij za gojenje celičnih kultur, celice 6 ur inkubirali v zgoraj opisanih razmerah in na enak način ponovno stresali 12 ur. S tem smo odstranili celice mikroglije. Po drugem stresanju smo celice tripsinizirali in jih inkubirali 20 minut pri 37
°C. V plastenko smo dolili 16 ml medija za gojenje celičnih kultur, celice smo premešali in jih prenesli v dve novi plastenki. Celice smo nato en dan inkubirali v enakih razmerah, jim zamenjali medij za gojenje celičnih kultur in nadaljevali z gojenjem do konfluence.
Plastenkam s konfluentnimi celicami smo odstranili medij, celice tripsinizirali v 4 ml tripsina in jih inkubirali 20 minut pri 37 °C. V vsako plastenko smo nato dodali 36 ml medija za gojenje celic in vsebino razdelili na 40 petrijevk, ki smo jih postavili v inkubator in jim naslednji dan menjali medij za gojenje celic, vendar brez dodatka FBS.
Tako pripravljene celice v petrijevkah smo kasneje uporabili za obdelavo z različnimi spojinami.
4.2.4 Obdelava celic z bilirubinom in stavrosporinom
Kulture astrocitov smo obravnavali po protokolu, po katerem smo pripravili kontrolne celice I, ki so rasle zgolj v mediju brez dodatkov, kontrolne celice II, ki so rasle v mediju z dodatkom topila DMSO, ter vzorce, ki smo jih izpostavili 1 µM STS, različnim koncentracijam BR ali kombinaciji različnih koncentracij BR z STS (Preglednica 1).
Preglednica 1: Protokol obdelave vzorcev za meritve s pretočnim citometrom in čitalcem mikrotitrskih ploščic
Vzorcem smo dodali 1 ml gojitvenega medija, 10 µl BR v različnih koncentracijah (1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM in 250 nM) in jih predhodno inkubirali pol ure. Po pol ure smo v petrijevke, kjer smo inducirali celično smrt, dodali še 10 µl stavrosporina (1 µM). Vse petrijevke smo nato inkubirali še 5 ur. Po petih urah inkubacije smo v petrijevkah zamenjali medij in v vsako petrijevko dodali 2 ml gojitvenega medija. Zatem smo jih pustili 22 ur v inkubatorju, da so se celice regenerirale. Tako obdelane celice smo uporabili tako za merjenje s pretočnim citometrom kot za merjenje z čitalcem za mikrotitrske plošče.
4.3 DOLOČANJE KONCENTRACIJE PROTEINOV IN KONCENTRACIJE ATP 4.3.1 Obdelava celic za določanje koncentracije proteinov in koncentracije ATP Po preteku regeneracije smo pobrali petrijevke iz inkubatorja in jih postavili na led. Iz njih smo odlili medij in vsaki dodali 600 µl PBS pufra, celice postrgali in jih prenesli v epruveto. Ta postopek smo ponovili še enkrat. Celice smo nato centrifugirali 7 minut pri 1200 obratih/min in temperaturi 4 °C. Po centrifugiranju smo odlili supernatant tako, da so v epruveti ostale samo celice (usedlina). Te smo zamrznili pri -70 °C in shranili do meritev z večfunkcijskim čitalcem.
Obdelava celic: Čas obdelave:
kontrola 5,5 ure + 22 ur regeneracije
kontrola DMSO 5,5 ure + 22 ur regeneracije
stavrosporin 1 µM 5 ur + 22 ur regeneracije
bilirubin 1 nM 5,5 ure + 22 ur regeneracije
bilirubin 1 nM+ stavrosporin 1 µM 5 ur stavrosporin + 5,5 ure bilirubin + 22 ur regeneracije
bilirubin 10 nM 5,5 ure + 22 ur regeneracije
bilirubin 10 nM + stavrosporin 1 µM 5 ur stavrosporin + 5,5 ure bilirubin + 22 ur regeneracije
bilirubin 50 nM 5,5 ure + 22 ur regeneracije
bilirubin 50 nM+ stavrosporin 1 µM 5 ur stavrosporin + 5,5 ure bilirubin + 22 ur regeneracije
bilirubin 100 nM 5,5 ure + 22 ur regeneracije
bilirubin 100 nM + stavrosporin 1 µM 5 ur stavrosporin + 5,5 ure bilirubin + 22 ur regeneracije
bilirubin 150 nM 5,5 ure + 22 ur regeneracije
bilirubin 150 nM + stavrosporin 1 µM 5 ur stavrosporin + 5,5 ure bilirubin + 22 ur regeneracije
bilirubin 250 nM 5,5 ure + 22 ur regeneracije
bilirubin 250 nM + stavrosporin 1µM 5 ur stavrosporin + 5,5 ure bilirubin + 22 ur regeneracije
4.3.2 Določanje koncentracije proteinov
Za določitev vsebnosti proteinov v vzorcih smo uporabili Bio-Rad Protein Assay, ki temelji na metodi po Brafordu in je preprost ter natančen postopek za določanje koncentracije solubiliziranih proteinov Test je osnovan na dodatku kislega barvila Coomassie® Brilliant Blue G-250, ki se specifično veže na aminokislinske ostanke proteinov. Sprememba barve vzorca je sorazmerna s koncentracijo proteinov v vzorcu (Bio-Rad Laboratories, Bradford, 2010).
Vzorce za umeritveno krivuljo smo pripravili po naslednjem postopku:
1. Pripravili smo standardno raztopino proteinov koncentracije 1 µg/ml z uporabo 158,3 µl govejega serumskega albumina in 41,7 µl bidestilirane vode.
2. V epruvete smo odpipetirali standardno raztopino v koncentracijah 0,5 µg/ml, 1,5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml, 30 µg/ml, 40 µg/ml, 50 µg/ml, 60 µg/ml, 75 µg/ml in jih dopolnili do 800 µl z bidestilirano vodo.
3. V vsako epruveto smo dodali 200 µl reagenta Bio-Rad Protein Assay in jo premešali.
4. Na mikrotitrsko ploščo smo v prazne luknjice nanesli 200 µl pripravljene raztopine.
Priprava ostalih vzorcev:
1. Vzorcem smo dodali 150 µl liznega pufra in tako razgradili celice.
2. V vsako luknjico, ki je vsebovala 5 µl vzorca, smo dodali 155 µl bidestilirane vode in 40 µl reagenta Bio-Rad Protein Assay.
Slika 1: Mikrotitrska plošča z vzorci za merjenje znotrajcelične koncentracije proteinov
Koncentracijo proteinov smo določili spektrofotometrično. Vzorce smo inkubirali 20-30 minut pri sobni temperaturi. Nato smo izmerili absorbanco s čitalcem za mikrotitrske plošče (SynergyHT, Bio Tek, Winooski, ZDA) pri valovni dolžini 595 nm z referenčno vrednostjo pri 600 nm in določili koncentracijo proteinov s pomočjo umeritvene krivulje.
4.3.3 Določanje koncentracije ATP
Koncentracijo ATP smo določili s pomočjo reagenta ATP lite. Med reakcijo ATP z D- luciferinom, ki jo katalizira luciferaza, nastaja svetloba, na podlagi katere smo določili koncentracijo ATP, saj je emitirana svetloba sorazmerna s koncentracijo ATP v vzorcih.
Slika 2: Enačba reakcije ATP z luciferinom in luciferazo. Nastanejo oksiluciferin, ogljikov dioksid, AMP, PPi: anorganski pirofosfat in emitirana svetloba (Tan in sod., 2019).
Postopek priprave vzorcev za določanje koncentracije ATP:
1. Na bele mikrotitrske plošče za merjenje luminiscence smo odpipetirali po 20 µl vzorca astrocitov. 20 µl liznega pufra je služilo kot slepi vzorec.
2. Za umeritveno krivuljo smo pripravili standardne raztopine ATP v koncentracijskem območju od 100 µM do 100 fM (1013 M) ter jih v dveh paralelkah odpipetirali na mikrotitrsko ploščo.
3. Vzorcem in mediju, ki je služil kot slepi vzorec, smo dodali 20 µl reagenta ATPlite™, ki smo ga predhodno ogreli na sobno temperaturo.
4. Mikrotitrsko ploščo smo 2 minuti stresali na orbitalnem mešalniku pri 700 obratih/min.
5. Luminiscenco smo izmerili s čitalcem za mikrotitrske plošče (SynergyHT, Bio Tek, Winooski, ZDA), jo normalizirali na vsebnost proteinov in izrazili kot RLU (relative light units)/mg proteina.
4.4 DOLOČANJE CELIČNE SMRTI S PRETOČNIM CITOMETROM 4.4.1 Obdelava celic za določanje celične smrti s pretočnim citometrom
Po regeneraciji smo iz petrijevk odstranili medij, dodali 500 μl tripsina in celice 20 minut inkubirali pri 37 °C. Po inkubaciji smo petrijevke pretresli, da so se astrociti ločili od površine. S pipeto smo celice premešali in nato suspenzijo celic v tripsinu prenesli v 1,5 ml plastične epruvete (gostota celic 5 x 106 celic/ml). Celice smo imeli ves čas na ledu.
4.4.2 Barvanje celic z aneksinom V in 7-aminoaktinomicinom D za detekcijo in relativno ovrednotenje obsega apoptoze in nekroptoze
Za barvanje celic smo uporabili kit Beckman Coulter IM3614 in postopek barvanja celic izvedli v skladu s priloženimi navodili. Za analizo enega vzorca smo uporabili 500 μl suspenzije z gostoto celic okoli 5 x 106 celic/ml.
Suspenzijo celic smo centrifugirali pri 400 x G, 3 minute pri 4 °C. Po končanem centrifugiranju smo odstranili supernatant in celice sprali s 500 μl ledeno hladnega PBS.
Po ponovnem centrifugiranju, ki smo ga izvedli na enak način kot v prejšnji fazi in odstranitvi supernatanta, smo celice resuspendirali v 100 μl ledeno hladnega vezavnega pufra in epruvete postavili na led. Vzorcem smo nato dodali barvili aneksin V in 7-AAD ter jih 15 minut inkubirali pri 4 °C in v temi. Po inkubaciji smo dodali še 400 μl ledeno
hladnega vezavnega pufra. Celice, pobarvane z aneksinom V in 7-AAD, smo nato v roku 30 minut analizirali s pretočnim citometrom. Do analize smo vzorce hranili na ledu.
4.4.3 Merjenje s pretočnim citometrom
S pretočnim citometrom smo analizirali 10 000 celic iz vsakega vzorca. S pomočjo 22 mW argonskega laserja, ki je predstavljal izvor svetlobe, smo izmerili elektronski volumen celic, stransko sipanje, fluorescenco fluorokroma FITC in fluorescenco 7-AAD.
Celice smo ločili glede na njihov fenotip v:
1. Viabilne: aneksin V −/7-AAD –
2. Zgodnje apoptotične: aneksin V +/ 7-AAD – 3. Nekroptotične: aneksin V −/7-AAD +
4. Sekundarno nekrotične: aneksin V +/7-AAD +
Rezultate smo zajeli in prikazali s pomočjo programske opreme Quanta SC MPL.
Slika 3: Pretočni citometer, Quanta SC MPL (Beckman Coulter, Inc, Brea, Kalifornija, ZDA)
4.5 STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV
Podatke smo statistično obdelali in podali v obliki grafov z računalniškim programom GraphPad Prism, verzija 9.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, ZDA). Predstavili smo jih s točkami, ki predstavljajo posamezne poskuse, in s srednjo vrednostjo ter standardno napako aritmetične sredine (x ± SEM). Statistično značilnost rezultatov smo preverili z enosmerno analizo variance (one-way ANOVA). Za primerjavo več različnih vzorcev z isto kontrolo smo uporabili Dunnettov post hoc test. Za medsebojno primerjavo dveh različnih skupin smo uporabili Studentov t-test. Za mejo statistične značilnosti smo
uporabili vrednost p < 0,05. Pri interpretaciji rezultatov smo na grafih statistično značilne rezultate označili z *. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001.
