UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Lara BOŽIČ
VPLIV MEZENHIMSKIH MATIČNIH CELIC NA PROLIFERACIJO IN INVAZIVNOST CELIC GLIOBLASTOMA V MOŽGANIH ZARODKOV
CEBRIC (Danio rerio)
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Lara BOŽIČ
VPLIV MEZENHIMSKIH MATIČNIH CELIC NA
PROLIFERACIJO IN INVAZIVNOST CELIC GLIOBLASTOMA V MOŽGANIH ZARODKOV CEBRIC (Danio rerio)
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
IMPACT OF MESENCHYMAL STEM CELLS ON THE
PROLIFERATION AND INVASION OF GLIOBLASTOMA CELLS IN THE ZEBRAFISH (Danio rerio) EMBRYONIC BRAIN
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa druge stopnje Biotehnologija. Delo je bilo opravljeno na Katedri za zoologijo Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani in na Oddelku za genetsko toksikologijo in biologijo raka Nacionalnega inštituta za Biologijo v Ljubljani
Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala doc. dr. Miloša Vittorija in za somentorico doc. dr. Barbaro Breznik.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: doc. dr. Miloš VITTORI
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Član: doc. dr. Barbara BREZNIK
Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za genetsko toksikologijo in biologijo raka
Član: doc. dr. Jernej OGOREVC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum zagovora: 15.07.2021
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 602.9:591.81:601.4:577.21(043.2)
KG glioblastom, glioblastomske matične celice, mezenhimske matične celice, cebrice, rast celic, invazija, parafinske rezine, imunohistokemijsko barvanje AV BOŽIČ, Lara
SA VITTORI, Miloš (mentor), BREZNIK, Barbara (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Magistrski študijski program druge stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN VPLIV MEZENHIMSKIH MATIČNIH CELIC NA PROLIFERACIJO IN INVAZIJO CELIC GLIOBLASTOMA V MOŽGANIH ZARODKOV CEBRIC
(Danio rerio)
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja) OP X, 47 str., 1 pregl., 18 sl., 68 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Možganski tumor glioblastom (GB) je najpogostejši in najagresivnejši primarni tumor osrednjega živčnega sistema pri odraslih. Zdravljenje je zaradi odpornosti tumorja na kemo- in radioterapijo ter nepopolne kirurške odstranitve neuspešno.
K temu prispeva heterogenost GB. Rakave celice so v tumorju obdane s kompleksnim tumorskim mikrookoljem. Medcelična komunikacija v mikrookolju prispeva k razvoju tumorja. Glioblastomske matične celice (GMC) so odporne na terapijo in zaščitene v posebnem mikrookolju – niši. V niši sobivajo z nerakavimi stromalnimi celicami, kot so mezenhimske matične celice (MMC). Preučevali smo vpliv MMC na rast in invazijo GMC v možganih zarodkov cebric (Danio rerio). V možgane zarodkov smo vnesli GMC ter mešanice GMC in MMC, kar nam je omogočilo primerjavo tumorjev. S programom ImageJ smo kvantificirali relativno spremembo površine in dolžine tumorjev monokultur in sokultur celic v možganih in vivo. Razvili in optimizirali smo metodo priprave tkivih rezin možganov z vnesenimi označenimi humanimi celicami za imunohistokemijsko barvanje. Uporabili smo označevalce matičnosti in invazije GMC, s katerimi smo analizirali medsebojni vpliv celic. Ugotovili smo, da GMC in MMC v možganih cebric tvorijo mešane tumorje. Pokazali smo, da prisotnost MMC ne spremeni proliferacije, ne sproži diferenciacije in ne spremeni invazije GMC v možganih cebric. Prisotnost GMC je povečala rast in invazijo MMC.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDK 602.9:591.81:601.4:577.21(043.2)
CX glioblastoma, glioblastoma stem cells, mesenchymal stem cells, zebrafish, invasion, cell growth, imunohistochemistry, paraffin sections
AU BOŽIČ, Lara
AA VITTORI, Miloš (supervisor), BREZNIK, Barbara (co-adviser) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI IMPACT OF MESENCHYMAL STEM CELLS ON THE PROLIFERATION AND INVASION OF GLIOBLASTOMA CELLS IN THE ZEBRAFISH (Danio rerio) EMBRYONIC BRAIN
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO X, 47 p., 1 tab., 18 fig., 68 ref.
LA sl AL sl/en
AB Glioblastoma (GB) is the most common and most aggressive brain tumor of primary central nervous system in humans. Treatment is unsuccessful due to the tumor's resistance to chemotherapy, radiotherapy and incomplete surgical removal. GB displays extensive cellular heterogeneity which represents a major obstacle for effective treatment. Cancer cells in a tumor are surrounded by a complex tumor microenvironment (TMO). Intercellular interactions within the TMO drive tumor progression. Glioblastoma stem cells (GMC) are resistant to therapy and protected in a special microenvironment - a niche. They coexist in the niche with non-cancerous stromal cells such as mesenchymal stem cells (MMC).
We studied the impact of MMC on the proliferation and invasion of GMC in the zebrafish embryonic brain. We injected GMC and mixtures of GMC and MMC into the embryonic brain, which allowed us to compare tumors. The program ImageJ was used to quantify the relative difference of area and length of monoculture and coculture tumors in the brain in vivo. We developed and optimized a method of preparing zebrafish brain tissue sections, with injected labeled human cells, for immunohistochemistry. We used stem cell markers and markers of cancer cell invasion for interaction analysis. We found that GMC and MMC form mixed tumors in the zebrafish brain. We have shown that the presence of MMC does not alter proliferation, does not trigger differentiation, and does not alter invasion of GMC in the zebrafish brain. The presence of GMC increased the growth and invasion of MMC.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VIII KAZALO SLIK IX
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X
1 UVOD 1
1.1OPREDELITEVPROBLEMA ... 1
1.2NAMENRAZISKAVE ... 1
1.3DELOVNEHIPOTEZE ... 1
2 PREGLED OBJAV 2 2.1RAZVOJTUMORJA ... 2
2.2.MOŽGANSKITUMORGLIOBLASTOM ... 2
2.3TUMORSKOMIKROOKOLJE ... 3
2.4GLIOBLASTOMSKEMATIČNECELICE–GMC ... 4
2.4.1 Mikrookolje glioblastoma in niše tumorskih celic ... 5
2.5MEZENHIMSKEMATIČNECELICE ... 6
2.5.1 Splošno o MMC ... 6
2.5.2 Medcelični stiki in signalizacija v tumorjih ... 6
2.5.3 Vloga MMC v gliomih ... 7
2.6CELIČNIOZNAČEVALCI ... 8
2.6.1 Proliferacija ... 8
2.6.2 Diferenciacija 8 2.6.3 Invazija ... 9
2.7CEBRICEKOTMODELVRAZISKAVAHRAKA ... 9
3 MATERIALI IN METODE 12 3.1GOJIŠČA,RAZTOPINEINPUFRI ... 12
3.1.1 Gojišče za celično linijo NCH644 ... 12
3.1.2 Gojišče za MMC ... 12
3.1.3 Voda ISO (ISO, 1996) ... 12
3.1.4 Pufer za blokado protiteles (10 % FBS, 1 % BSA, 0,1 % Triton
X-100 v 1x PBS) ... 12
3.1.5 Citratni pufer ... 13
3.1.6 Pufer za redčenje protiteles ... 13
3.2MEZENHIMSKEMATIČNECELICEINGLIOBLASTOMSKEMATIČNE CELICE ... 13
3.3.DELOSCELIČNIMIKULTURAMI ... 13
3.3.1 Gojenje celičnih kultur ... 13
3.3.1.1 MMC ... 13
3.3.1.2 GMC ... 14
3.4 KSENOTRANSPLANTACIJATERANALIZARASTIININVAZIJEGMC INMMCVMOŽGANIHZARODKOVCEBRIC ... 14
3.4.1 Priprava GMC za ksenotransplantacijo ... 14
3.4.2 Priprava MMC za ksenotransplantacijo ... 14
3.4.3 Priprava celičnih suspenzij za ksenotransplantacijo ... 15
3.4.4 Priprava zarodkov ter ksenotransplantacija GMC in MMC v zarodke cebric ... 15
3.4.5 Gojenje in mikroskopiranje zarodkov cebric ... 16
3.4.6 Analiza rasti in invazije celic v možganih cebric ... 16
3.4.7 Statistična obdelava podatkov ... 18
3.4.8 Fiksacija zarodkov s 4 % paraformaldehidom ... 18
3.4.9 Imobilizacija zarodkov v agarozi in bistrenje ... 18
3.4.10 Barvanje jeder z barvilom metil zeleno ... 19
3.4.11 Slikanje s konfokalnim mikroskopom ... 19
3.5PRIPRAVAPARAFINSKIHREZINMOŽGANOVCEBRICIN IMUNOHISTOKEMIJSKOBARVANJE ... 19
3.5.1 Izdelava parafinskih rezin možganov cebric ... 19
3.5.2 Imunohistokemijsko barvanje označevalcev proliferacije, diferenciacije in invazije ... 20
3.5.3 Slikanje parafinskih rezin s konfokalnim mikroskopom ... 21
4 REZULTATI 22 4.1INJICIRANJECELICGMCINMMCVMOŽGANECEBRIC ... 22
4.2VPLIVINTERAKCIJMEDGMCINMMCNARASTININVAZIJO TUMORJA ... 23
4.33DSLIKETUMORJEVVMOŽGANIHZARODKOVCEBRIC ... 25
4.3.1 3D slike tumorjev v možganih cebric ... 25
4.4ANALIZAIZRAŽANJACELIČNIHOZNAČEVALCEVNA PARAFINSKIHREZINAH ... 28
4.4.1 Detekcija MMC in GMC na parafinskih rezinah ... 28
4.4.2 GFAP ... 30
4.4.3 SOX2 ... 32
4.4.4 Ki-67 ... 33
4.4.5 Katepsin B ... 34
5 RAZPRAVA 35 5.1KSENOTRANSPLANTACIJAINRASTCELIC ... 35
5.2VPLIVMMCNARASTININVAZIJOGMC ... 35
5.2.1 Sprememba relativne površine ... 36
5.2.2 Sprememba relativne dolžine ... 36
5.3VPLIVGMCNARASTININVAZIJOGMC ... 37
5.4OPTIMIZACIJAPOSTOPKAPRIPRAVETKIVNIHREZIN ... 37
5.4.1 Krio rezine ... 37
5.4.2 Rezine v smoli ... 38
5.4.3 Parafinske rezine ... 38
5.5IMUNOHITOKEMIJSKOBARVANJEINANALIZAOZNAČEVALCEV .... 39
5.5.1 Katepsin B ... 39
5.5.2 Ki67 ... 39
5.5.3 SOX2 IN GFAP ... 40
5.6ZAKLJUČEK ... 41
6 SKLEPI 42
7 VIRI 43
ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Protitelesa uporabljena za IHC parafinskih rezin 18
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Mikrookolje glioblastoma (Roos in sod., 2017). 4 Slika 2: Riba cebrica in zarodek ribe cebrice (Vittori in sod., 2015). 10 Slika 3: Zarodek cebrice 3 dni po oploditvi (Vittori in sod., 2015). 11
Slika 4: Prikaz merjenja površine tumorja. 17
Slika 5: Prikaz merjenja dolžine tumorja v x- in y-osi. 17 Slika 6: Zarodki cebric 1. in 3. dan po injiciranju monokulture GMC (zeleno),
monokulture MMC (rdeče) in sokulture GMC in MMC. 23
Slika 7: Relativne spremembe površine tumorjev MMC in GMC v monokulturah in
sokulturah. 24
Slika 8: Sprememba relativne dolžine tumorjev MMC in GMC v monokulturah in
sokulturah. 24
Slika 9: Zarodek cebrice – GMC. 26
Slika 10: Zarodek cebrice – MMC. 26
Slika 11: Zarodki cebric – mešani tumorji GMC in MMC. 27
Slika 12: Parafinska rezina pred IHC. 28
Slika 13: Prikaz celotne parafinske rezine po IHC. 29
Slika 14: Analiza izražanja GFAP v tumorjih GMC in MMC. 30
Slika 15: Vijolično obarvane strukture. 31
Slika 16: Analiza izražanja SOX2 v tumorjih GMC in MMC. 32 Slika 17: Analiza izražanja Ki-67 v tumorjih GMC in MMC. 33 Slika 18: Analiza izražanja katepsina B v tumorjih GMC in MMC. 34
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI BSA Goveji serumski albumin
BM-MMC Mezenhimske matične celice izolirane iz kostnega mozga BMP Kostni morfogeni protein
CA5 Karbonska anhidraza V
CD73 Označevalec pripadnosti 73 (ang. cluster of differentiation 73) CD105 Označevalec pripadnosti 105 (ang. cluster of differentiation 105) CD90 Označevalec pripadnosti 90 (ang. cluster of differentiation 90) DMEM Dulbeccovo modificirano Eaglovo gojišče
EDTA Etilendiaminotetraocetna kislina EGF Epidermalni rastni dejavnik FGF Fibroblastni rastni dejavnik
FBS Fetalni goveji serum (ang. fetal bovine serum) FGF Fibroblastni rastni dejavnik
GB Glioblastom
GFAP Glijska fibrilarna kisla beljakovina GMC Glioblastomske matične celice GTPaza Gvanozintrifosfataza
CXCL7 kemokin 7, vsebujoč motiv CXC
IGFBP7 Insulin-like growth factor-binding protein 7 HIF-1α Hipoksični inducibilni dejavnik 1α
IHC Imunohistokemija
IL6 Interlevkin 6
IL8 Interlevkin 8
ISO Mednarodna organizacija za standardizacijo MMC Mezenhimske matične celice
NBE Nevrobazalno gojišče NF-𝜅B Jedrni dejavnik kapa B
PBS Fosfatni pufer s soljo (ang. phosphate-bufferded saline)
PFA Paraformaldehid
PTU 1-fenil-2-tiourea
Rho Oznaka za vrsto monomernih GTPaz
SHH Sonic hedgehog
SDF-1α Dejavnik stromalnih celic 1 alfa (ang. stromal cell derived factor 1α) SOX2 Gen za določitev spola (ang. SRY (sex determining region Y)-box 2) STAT 3 Pretvornik celičnih signalov in aktivator celične transkripcije 3 TGFβ Beta transformirajoči rastni dejavnik
TMO Tumorsko mikrookolje
VEGF Vaskularni endotelijski rastni dejavnik
WHO Svetovna zdravstvena organizacija (ang. World health organization)
1 UVOD
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA
Možganski tumor glioblastom (GB) je najpogostejši, najinvazivnejši in najagresivnejši primarni tumor osrednjega živčnega sistema pri odraslih. K temu prispeva heterogenost GB, ki otežuje natančno napovedovanje občutljivosti oz. odpornosti tumorja na kemo- in radioterapijo (Lah in sod., 2019). Glioblastomske matične celice (GMC) lahko povzročijo ponovitev tumorja, saj so odporne na terapijo in zaščitene v svoji niši, posebnem mikrookolju, ki jih ščiti pred terapijo in napadom imunskih celic. V niši sobivajo z nerakavimi stromalnimi celicami, kot so mezenhimske matične celice (MMC), ki vplivajo na lastnosti GMC in na njihov odziv na terapijo (Breznik in sod., 2017; Kološa in sod., 2015).
Interakcije med GMC in MMC so slabo raziskane. Z njihovim razumevanjem lahko pripomoremo k poznavanju mehanizmov napredovanja GB in posledično odkritju novih pristopov pri zdravljenju in premagovanju odpornosti GMC na terapijo.
1.2 NAMEN RAZISKAVE
Namen magistrskega dela je razvoj in optimizacija priprave tkivnih rezin možganskih tumorjev v zarodkih rib cebric (Danio rerio), ki bodo uporabne za imunohistokemijsko barvanje (IHC) na prisotnost označevalcev matičnosti in invazije GMC v možganih.
Injiciranje GMC ter mešanice GMC in MMC v možgane zarodkov nam bo omogočilo primerjavo tumorjev, ki jih sestavljajo zgolj GMC in tistih, v katerih so ob GMC prisotne tudi MMC.
1.3 DELOVNE HIPOTEZE
V okviru magistrske naloge nas je zanimal vpliv celičnih interakcij med GMC in MMC na proliferacijo in invazijo celic GB v zarodkih rib cebric, v katere smo injicirali človeške celice GB. Z analizo izražanja označevalcev matičnosti in invazije GMC v možganih lahko pripomoremo k poznavanju mehanizmov napredovanja GB.
H1: Glede na do sedaj znane ugotovite predhodnih raziskav predpostavljamo, da bodo GMC in MMC tvorile tumorje v možganih cebric.
H2: Prisotnost MMC bo vplivala na proliferacijo GMC v možganih cebric.
H3: Prisotnost MMC bo vplivala na diferenciacijo GMC v možganih cebric.
H4: Prisotnost MMC bo vplivala na invazijo GMC v možganih cebric.
2 PREGLED OBJAV 2.1 RAZVOJ TUMORJA
Rak je bolezen, ki nastane zaradi mutacij in epigenetskih sprememb v telesnih celicah. Pride do maligne pretvorbe normalnih celic in nastanka tumorja. Proces imenujemo kancerogeneza. Začne se z iniciacijo, ki vključuje poškodbe DNA celic in epigenetske spremembe. Zaradi raznovrstnih zunanjih in notranjih dejavnikov pride do kopičenja poškodb DNA, genomske nestabilnosti transformiranih celic ter nastanka rakavih celic.
Proces se nato nadaljuje s promocijo, ki pomeni pospešeno nenadzorovano deljenje rakavih celic. Naslednja stopnja je invazija v okoliško tkivo. Sledi zasevanje (metastaziranje) v druge organe, ki je zadnja stopnja kancerogeneze (Strojan in Hočevar, 2018). Med potekom karcinogeneze rakave celice pridobijo specifične lastnosti, kot so: neodzivnost na rastne zaviralce, odpornost na apoptozo, neomejena sposobnost podvajanja, spremenjen celični cikel, spodbujanje angiogeneze, sposobnost prodiranja v sosednja ter oddaljena tkiva in izogibanja imunskemu sistemu (Hanahan in Werinberg, 2011). Za razumevanje nastanka in razvoja raka je potrebno poznati tudi delovanje nerakavih celic, ki predstavljajo t. i.
tumorsko stromo znotraj tumorske mase. Te celice lahko prispevajo k razvoju raka z neposredno komunikacijo in izmenjavo signalnih molekul. S tem ustvarjajo ugodno mikrookolje za rast tumorske mase in metastaziranje tumorja po telesu (Obrez in sod., 2013).
2.2. MOŽGANSKI TUMOR GLIOBLASTOM
Glioblastom je najagresivnejši primarni tumor osrednjega živčnega sistema pri odraslih osebah. Glavni organ omenjenega sistema so možgani, ki nadzorujejo večino telesnih dejavnosti, zato je GB zelo smrtonosen in pričakovano preživetje bolnikov kratko (Hayat, 2011). Nastanek GB vodita aktivacija onkogenov in inaktivacija tumor supresorskih genov ter spremenjeno izražanje genov, ki sodelujejo pri ohranjanju celične homeostaze, regulaciji celičnega cikla in interakciji z drugimi celicami v osrednjem živčnem sistemu (Goldlust in sod., 2008). GB je heterogeno tkivo, ki ga sestavlja veliko raznolikih celic, ki so tako diferencirane rakave celice kot tudi nediferencirane rakave matične celice. Zaradi večjega ali manjšega deleža matičnih celic v tumorju imajo celice, ki ga sestavljajo, različno sposobnost samoobnavljanja in proliferacije. Rezultat tega je fenotipska heterogenost GB (Soeda in sod., 2015).
Ob svoji veliki malignosti je GB tudi najpogostejši možganski tumor, ki se pojavlja v 5 do 7 primerih na 100.000 posameznikov na leto. Zdravljenje vključuje kirurško odstranitev tumorja, ki mu sledi obsevanje in kemoterapija s temozolomidom. Kljub temu je ponovitev GB zelo pogosta in se zgodi v več kot 90 % primerov. Novonastali tumor je zelo odporen na nadaljnja obsevanja in kemoterapijo, zato je povprečna doba preživetja bolnikov 15 mesecev po diagnozi (Philips in sod., 2018).
GB je gliom astrocitnega izvora. Svetovna zdravstvena organizacija (ang. World Health Organization, WHO) opredeljuje GB kot gliom IV. stopnje (Ho in Shim, 2017).
Popolna odstranitev GB s kirurškim posegom večkrat ni mogoča, zaradi infiltracije posameznih tumorskih celic v zdravo možganovino, zato se bolezen ponovi (Ocvirk, 2009;
Gallego, 2015). Poseg v zdravo tkivo predstavlja previsoko tveganje za poškodbe možganov.
(Mrugla, 2013; Gallego, 2015). Tudi zdravljenje s kemoterapijo ima omejitve, saj krvno- možganska pregrada onemogoči prehod številnih kemoterapevtikov v osrednji živčni sistem.
Prehod zdravil v možganski parenhim in tumor je znatno oslabljen. Tudi najbolj aktivne učinkovine kemoterapije dosegajo relativno nizke koncentracije v tkivih, ki obdajajo tumor (Mrugla, 2013). GB je fenotipsko heterogen – sestavljajo ga različni tipi celic in kemoterapija ni enako učinkovita za vse tipe celic GB (Mrugla, 2013; Motaln in sod., 2015).
Poleg tega tumorske celice razvijejo odpornost na kemoterapijo zaradi prilagoditve na zdravljenje (odpornost na kemoterapevtik) in hipoksije v tumorskem mikrookolju (Harr in sod., 2012), ki vpliva tudi na učinkovitost radioterapije (Chang in sod., 2007). Molekulski mehanizmi razvoja GB se razlikujejo od bolnika do bolnika in otežujejo učinkovito zdravljenje in razvoj novih zdravil (Noch in sod., 2018). Izziv pri zdravljenju predstavljajo glioblastomske matične celice (GMC), ki lahko povzročijo ponovitev tumorja.
2.3 TUMORSKO MIKROOKOLJE
Značilna heterogenost znotraj posameznega tumorja GB ni le posledica genetsko različnih tumorskih celic, temveč tudi posledica infiltracije nerakavih stromalnih celic v mikrookolje tumorja (Whiteside in sod., 2008). To je okolje, katerega nastanek povzroči tumor z interakcijami s celicami normalnega tkiva in imunskimi celicami. Okolje tumorja, katerega del so tako celice, kot zunajcelični matriks, se spreminja in preoblikuje med rastjo tumorske mase (Liotta in Kohn, 2001).
Rakave celice so v tumorju obdane s kompleksnim tumorskim mikrookoljem (TMO), ki obsega številne tipe celic (slika 1) (Roos in sod., 2017). TMO sestavljajo različne komponente zunajceličnega matriksa (ECM), topne signalne molekule, kot so kemokini in citokini ter ne-rakave celične komponente, kot so endotelijske celice krvnih žil, fibroblasti, astrociti, nevroni, celice, ki izvirajo iz kostnega mozga (npr. monociti, ki izražajo TIE2) in mezenhimske matične celice (MMC) (Barcellos in sod., 2013). V tumorju so prisotne tudi celice imunskega sistema. Med njimi so makrofagi, limfociti B, dendritične celice, polimorfnonuklearni levkociti in naravne celice ubijalke (Joyce in Pollard, 2008). Med drugim TMO nudi strukturno oporo tumorski stromi z nitastimi proteini (Melzer in sod., 2016).
Slika 1: Mikrookolje glioblastoma (Roos in sod., 2017).
TMO sestavljajo različne komponente zunajceličnega matriksa (ECM) in številni tipi celic, kot so endotelijske celice, astrociti, celice GB, GMC in s tumorjem povezani makrofagi.
TMO ima pomembno vlogo pri regulaciji razvoja in napredovanja tumorja. V tem procesu igrajo ključno vlogo interakcije, ki jih posredujejo avtokrini in parakrini dejavniki (Ho in Shim, 2017). Invazija tumorja se začne na lokaliziranem območju in je pospešena zaradi komunikacije med celicami strome in rakavimi celicami preko rastnih dejavnikov in kemokinov, kot so vaskularni endotelijski rastni dejavnik (VEGF), beta transformirajoči rastni dejavnik (TGFβ), kemokin CXCL7 (kemokin 7, vsebujoč motiv CXC) in monocitni kemoatraktant 1 (MCP1) (Mbeunkui in Johann, 2009). Te molekule pospešujejo proces migracije, razgradnje zunajceličnega matriksa, preživetja v krvi in rasti v novem okolju, kar so ključni dejavniki za metastaziranje. Mikrookolje je za uspešnost tega procesa kritično pomembno (Mbeunkui in Johann, 2009).
2.4 GLIOBLASTOMSKE MATIČNE CELICE – GMC
Matične celice so nediferencirane celice, ki imajo zaradi zmožnosti asimetrične delitve sposobnost samoobnavljanja in diferenciacije v specializirane celične tipe organizma. V odraslem organizmu opravljajo vlogo obnavljanja celic v tkivih in sodelujejo pri regeneraciji ob poškodbah (Zakrzewski in sod., 2019). Zaključki številnih raziskav kažejo, da je za ohranjanje tako raka kot normalnih tkiv potrebno učinkovito sodelovanje med matičnimi in diferenciranimi celicami (Dell’Albani in sod., 2011). Za ponovitev možganskih tumorjev je lahko odgovornih le nekaj celic. Gre za GMC, ki so spremenjene celice centralnega živčnega sistema in imajo lastnosti matičnih celic ter sposobnost iniciacije in širjenja GB (Liebelt in sod., 2016). V niši tumorskih celic pride do preobrazbe celic GB, ki se dediferencirajo v
GMC zaradi vplivov okolja niše, s čimer se GMC vzdržujejo in ohranjajo v stanju mirovanja (Vescovi in sod., 2006). GMC lahko prehajajo med dormantnim (mirujočim) stanjem z nizko stopnjo proliferacije v hitro se deleče predniške celice z visoko stopnjo proliferacije. Poleg tega lahko GMC prehajajo iz neinvazivnih celic v invazivne ter posledično pripomorejo k invaziji GB (Hayat, 2011). GMC so odporne na terapijo zaradi izražanja učinkovitih mehanizmov popravljanja DNA in rezistence na kemoterapevtike (Bao in sod., 2006). Poleg tega so GMC v nišah v dormantnem stanju, kar vodi v odpornost na citostatike in radioterapijo, ki delujejo predvsem na hitro deleče se celice. GMC tako preživijo v možganskem tkivu po terapiji in povzročijo ponovitev tumorja (Bao S. in sod., 2006).
Identifikacija GMC v tumorju oziroma iskanje specifičnih označevalcev GMC predstavlja izziv zaradi njihove heterogenosti in prilagodljivosti na signale v njihovih nišah.
Identifikacija GMC je predmet številnih raziskav (Uribe in sod., 2017). Rakave matične celice lahko določimo na podlagi izražanja membranskih antigenov in izražanja transkripcijskih dejavnikov (Ho in sod., 2012). Najbolj raziskani celični označevalci GMC so: CD133, CD44, CD15, CD9, CXCR4, SOX2, Nestin, Musashi in Olig2 (Uribe in sod., 2017).
2.4.1 Mikrookolje glioblastoma in niše tumorskih celic
Za GMC je značilno naseljevanje v niše, ki jih zaščitijo pred škodljivimi učinki obsevanja in kemoterapije (Lah in sod., 2019). Tkivna niša predstavlja mikrookolje, v specifičnih regijah znotraj tumorja, v katerem se nahajajo matične celice (Roos in sod., 2017). V niši GMC sobivajo z nerakavimi stromalnimi celicami, ki vplivajo na lastnosti GMC in na njihov odziv na terapijo (Breznik in sod., 2017; Kološa in sod., 2015). Te celice so fibroblasti, endotelijske in imunske celice ter mezenhimske matične celice (Kološa in sod., 2015). Med stromalnimi in matičnim celicami znotraj niše poteka celična komunikacija (Breznik in sod., 2017). Za glioblstom so značilna hipoksična območja, saj se GB celice hitro množijo, nastajajoče žile pa so ne pravilne oblike in posledično ne funkcionalne. Niše GMC najdemo predvsem ob tumorskih žilah, saj endotelijske celice izločajo topne signalne molekule kot so rastni dejavniki (IGFBP7, FGF4) in citokini (SDF-1α, IL6, IL8), ki aktivirajo številne signalne poti (NOTCH, WNT) in transkripcijske dejavnike (HIF-1α, STAT3) v GMC.
Izločanje teh dejavnikov stimulira proliferacijo in samoobnavljanje GMC in omogočajo njihovo zadrževanje v nišah (Zhao in sod., 2018). Fiziološka raven kisika močno vpliva na koncentracijo HIF2α, ki ga inducira hipoksija. HIF2α pomembno vpliva na regulacijo celične diferenciacije (Heddleston in sod., 2010). MMC se nahajajo v niši GMC ob žilah arteriolah (Hira in sod., 2019). Položaj ob žilah je bistven, saj je tam hipoksično okolje, ki je ključen regulator preživetja in ohranjanja matičnosti tumorskih celic (Hira in sod., 2019).
2.5 MEZENHIMSKE MATIČNE CELICE 2.5.1 Splošno o MMC
Mezenhimske matične celice (MMC) so multipotentne matične celice, ki so sposobne diferenciacije v celice kosti, hrustanca, veziva, mišic in maščevja (Behnan in sod., 2014).
Karakteriziramo jih s preverjanjem sposobnosti diferenciacije ter z določanjem označevalcev na celični površini CD73, CD105 in CD90 (Dominici in sod., 2006). Nahajajo se v večini tkiv in organov v telesu ter omogočajo regeneracijo poškodovanega tkiva. Bogat vir MMC je kostni mozeg (Behnan in sod., 2014). V kostnem mozgu imajo kot stromalne celice, ki tvorijo nišo matičnih celic, dvojno vlogo: so izvor nekrvotvornih celic kostnega mozga in hkrati hranilne in podporne celice za rast in diferenciacijo krvnih celic. MMC imajo tropizem do poškodovanih tkiv, mest vnetja in tumorjev (Behnan in sod., 2014).
2.5.2 Medcelični stiki in signalizacija v tumorjih
Študije so pokazale, da signalne molekule (vnetni mediatorji), ki jih izločajo tumorske celice, sprožijo mobilizacijo MMC iz kostnega mozga in njihovo migracijo po krvnem obtoku do tumorja. Slednje se infiltrirajo v tumor in postanejo del tumorja (Barcellos-de-Souza in sod., 2013). Ključno vprašanje je, kako komunikacija med MMC in celicami GB v TMO vpliva na razvoj in napredek tumorja. MMC na tumorske celice lahko vplivajo parakrino s citokini, rastnimi dejavniki in zunajceličnimi vezikli ali preko neposrednega celičnega stika, kot je fuzija celic (Motaln in Lah, 2015; Breznik in sod., 2017; Melzer in sod., 2016). V primeru fuzije celic nastanejo hibridi, ki imajo lastnosti tako GMC kot MMC (Melzer in sod., 2016).
MMC se na mestu tumorja lahko diferencirajo v fibroblaste, pericite in endotelijske celice in tako prispevajo k njegovemu razvoju (Barcellos in sod., 2013). MMC stimulirajo angiogenezo v tumorjih s sproščanjem angiogenih dejavnikov (Lee in Hong, 2017). MMC s proizvajanjem citokina SDF-1α privabljajo celice GB v zaščitne niše preko signalne osi SDF-1α-CXCR4 (Hira in sod., 2018). MMC izločajo visoke ravni citokina interlevkina 6 , ki pripomore k vzdrževanju matičnosti GMC (Hossain in sod., 2015). MMC delujejo kot regulatorji imunskega sistema in lahko zavrejo prirojen in pridobljen imunski odziv (Lee in Hong, 2017). Zaradi vpliva MMC na imunski sistem se tumorske celice lahko izognejo posredovanju le tega in tako preživijo (Fu in sod., 2018).
Dokazano je, da medcelična komunikacija med MMC in tumorskimi celicami povečuje invazivni potencial tumorskih celic preko epitelijsko-mezenhimske preobrazbe (Ridge in sod., 2017). Epitelijsko-mezenhimska preobrazba ali prehod je mehanizem, ki močno prispeva k razvoju invazivnih lastnosti tumorskih celic, saj celice pridobijo spospobnost vdiranja v okoliško tkivo. Gre za biološki proces, pri katerem polariziran sloj epitelijskih celic prestane več biokemijskih transformacij. Pride do preoblikovanja citoskeleta, izgube sposobnosti adhezije in povečanja migracijske sposobnosti celic. Tako se razvije visoko invaziven fenotip celic. Bistveno je, da je ta fenotipska sprememba reverzibilna. Obratni
postopek, imenovan mezenhimsko-epitelijski prehod, je nujen za nastanek tumorskih zasevkov. Dokazano je, da MMC vplivajo na tumorske celice na primarnem mestu tumorja in med procesom metastaziranja (Ridge in sod., 2017).
2.5.3 Vloga MMC v gliomih
Objavljene so že nekatere raziskave o vlogi MMC v gliomih in vitro in in vivo (Vittori in sod., 2016). Pri GB so poročali o nasprotujočih si vlogah MMC, torej o spodbujanju in zaviranju rasti tumorja (Schichor in sod., 2012; Torsvik in Bjerkvig, 2013), vendar večje število študij nakazuje, da MMC spodbujajo razvoj tumorjev. Na splošno molekularni mehanizmi interakcij MMC s celicami GB še niso natančno opredeljeni in so slabo poznani (Breznik in sod., 2017).
Shahar in sod. so potrdili, da višji odstotek MMC v gliomih napoveduje slabšo prognozo bolnika. Določili so odstotek celic, ki so sočasno izražale celične označevalce, značilne za MMC, iz vzorcev tkiva bolnikov, ki so imeli na novo diagnosticiran gliom visoke stopnje.
Analizirali so povezavo med odstotkom takšnih celic in preživetjem. Rezultati so pokazali, da odstotek MMC v tumorju obratno korelira s preživetjem, kar kaže na vpliv MMC pri spodbujanju agresivnega vedenja gliomov (Shahar in sod., 2016).
Hossain in sod. (2015) so pokazali, da MMC, izolirane iz človeških gliomov, povečajo proliferacijo in ohranjajo matičnost GMC. MMC so povečale proliferacijo in samoobnavljanje GMC in vitro ter povečale njihovo sposobnost tvorbe tumorjev v miših. Te učinke posreduje interlevkin-6, ki ga izločajo MMC. Behnan in sod. (2014) so raziskovali interakcije med mišjimi GB celicami in MMC v mišjem modelu. Pokazali so, da se lahko celice, ki so fenotipsko podobne MMC, infiltrirajo v mišjo stromo in imajo pomembno vlogo pri napredovanju tumorja. Podatki te raziskave so pokazali na spremembe izražanja molekulskih označevalcev GMC ob interakciji z MMC in vivo. Dokazali so, da imajo MMC imunosupresivni učinek, ki lahko vpliva na to, da se tumor izogne imunskemu sistemu gostitelja (Behnan in sod., 2014).
V nasprotju s temi študijami so Kološa in sod. (2015) preučevali možne protitumorske učinke dejavnikov, ki jih izločajo človeške MMC, na GMC. Ugotovili so, da gojišče, v katerem so gojili MMC, ki so izvirale iz kostnega mozga in popkovine, zavira celični cikel GMC z znižanjem izražanja ciklina D1. GMC so povečano izražale gene, povezane s celično senescenco. Dokazali so tudi, da parakrini signali MMC povečajo občutljivost GMC na kemoterapevtik temozolomid. Njihove ugotovitve podpirajo idejo, da lahko MMC sprožijo senescenco ter diferenciacijo GMC (Kološa in sod., 2015). Pojasnilo za razlike med omenjenimi študijami je lahko, da imajo MMC v direktnem stiku z GMC drugačen učinek, kot gojišče, v katerem so MMC le gojili.
Breznik in sod. (2017) so preučevali učinke MMC iz kostnega mozga na dve različni celični liniji GB U87 in U373, v sferoidih (in vitro) ter v cebricah (in vivo). Ugotovili so, da MMC zavirajo invazijo celične linije GB U87 in spodbujajo invazijo celične linije U373. K intenzivnejši invaziji U373 prispeva povečano izražanje in aktivnost proteaz (katepsina B, metaloproteaz 9 in 14, kalpaina 1). Nasprotno pa izražanje teh proteaz ni bilo spremenjeno v celični liniji U87 v sokulturi z MMC. Identificirali so različno izražene gene v celičnih linijah U87 in U373, ki bi lahko razložili različen odziv teh dveh celičnih linij na prisotnost MMC. V omenjeni raziskavi so opazili tudi vpliv GB celic na MMC. Neposredna komunikacija med MMC in obema celičnima linijama GB je povečala migracijo MMC (Breznik in sod., 2017).
V literaturi najdemo nasprotujoče rezultate glede vpliva MMC na razvoj gliomov. Nekatere študije nakazujejo, da MMC pospešijo razvoj gliomov, druge da ga inhibirajo. Glede na študije je lahko razlog v testiranju različnih celic gliomov in njihovi heterogenosti, različnih donorjev in tkiv, iz katerih so bile pridobljene MMC, in uporabljenem tumorskemu modelu.
2.6 CELIČNI OZNAČEVALCI 2.6.1 Proliferacija
Proliferacija je množenje celic z njihovo delitvijo. Ovrednotimo jo lahko s celičnim označevalcem Ki-67 z uporabo IHC. Izražen je med aktivnimi fazami celičnega cikla (faze G1, S, G2 in mitoza), odsoten pa je pri celicah, ki se ne delijo (faza G0), zato je odličen celični označevalec deleža rastočih celic dane celične populacije. Celična vsebnost proteina Ki-67 se med fazo S celičnega cikla izrazito poveča. Imunobarvanje s protitelesi proti Ki-67 se uporablja za ocenjevanje prognoze bolezni pri bolnikih s tumorji. Delež tumorskih celic, pozitivnih na Ki-67, je pogosto povezan s kliničnim potekom bolezni (Scholzen in Gerdes, 2000).
2.6.2 Diferenciacija
Diferenciacija celic je proces, v katerem se manj specializirane celice razvijejo v specializirane celične tipe. Pri tem pride do sprememb izražanja genov, fiziologije celic in njihove oblike. Med diferenciacijo se zmanjša tudi sposobnost samoobnavljanja.
Diferenciacijo GMC lahko ovrednotimo z zmanjšanim izražanjem označevalca SOX2 in povečanim izražanjem označevalca diferenciacije v astrocite GFAP (ang. glial fibrillary acidic protein) (Gangemi in sod., 2008).
SOX2 je transkripcijski dejavnik, ki ima ključno vlogo pri vzdrževanju embrionalnih in nevralnih matičnih celic. SOX2 je dobro raziskan transkripcijski dejavnik matičnih celic, ki je potreben za indukcijo in ohranjanje matičnosti GMC in je zato dober označevalec zanje (Gangemi in sod., 2008).
GFAP je protein intermediarnih filamentov, ki ga izražajo številni celični tipi osrednjega živčnega sistema, kot so astrociti in ependimske celice. Je celični označevalec astrocitov (Middeldorp in Hol, 2011).
2.6.3 Invazija
Invazija tumorskih celic je sposobnost celic vraščanja v okoliško tkivo, pri čemer pride do razgradnje zunajceličnega matriksa (Friedl in Alexander, 2011). Je petstopenjski proces, pri katerem pride do spremembe oblike celice, spremembe položaja celice in do spremembe v strukturi tkiva, skozi katerega poteka migracija. Prvi korak je polimerizacija aktina in nastanek psevdopodija z izvihom membrane na vodilnem delu celice. V drugem koraku izrastek vodilnega roba z receptorji na svoji površini vzpostavi stike z zunajceličnim matriksom. V tretjem koraku nekoliko za vodilnim robom celice zunajcelične proteaze pridejo v stik s proteini zunajceličnega matriksa in jih razgrajujejo. Po proteolizi nastane prostor za premik rakave celice. V četrtem koraku GTPaza Rho aktivira miozin II in krčenje.
S tem se ustvari napetost znotraj celice. Krčenju sledi peti korak, v katerem se prekinejo stiki na zadnjem robu celice, ki drsi naprej. Sočasno vodilni rob celice prodira globje v medceličnino (Friedl in Aleksander, 2011).
Značilnost malignih tumorjev so tumorske celice, ki invadirajo v okoliško tkivo. To je odvisno od kaskade proteoliznih dogodkov, ki vključujejo več vrst proteolitičnih encimov (imenovanih tudi proteinaze ali proteaze), med njimi katepsine, kar omogoča razgradnjo zunajceličnega matriksa (Jevnikar in Kos, 2009). Katepsini so povezani z nastankom in napredovanjem raka, tudi GB. Zmožnost invazije celic ovrednotimo s prisotnostjo katepsina B v tumorskih celicah (Gole in sod., 2012). Katepsin B je cisteinska proteaza, ki se v zdravih celicah nahaja v lizosomih, med napredovanjem tumorja pa se povečano izraža na površini tumorskih celic in se tudi izloča v mikrookolje. Katepsin B se nahaja v celicah GB in pospeši njihovo invazijo (Gole in sod., 2012; Breznik in sod., 2017).
2.7 CEBRICE KOT MODEL V RAZISKAVAH RAKA
Pogoji v laboratoriju (in vitro) ne odražajo dejanskih razmer v živem organizmu, zato je rezultate raziskav potrebno potrditi še z raziskavami in vivo. Cebrica (ang. zebrafish) je majhna sladkovodna riba in je modelni organizem v raziskavah na področjih razvojne biologije, molekularne genetike, človeških bolezni ter tudi v toksikoloških študijah (Rahman in sod., 2018). Cebrica (slika 2) predstavlja vretenčarski modelni organizem za raziskave raka (Rahman in Alhewarini, 2018). Mehanizme razvoja raka je mogoče preučevati skozi celoten življenjski cikel cebrice. Vsaka razvojna faza ribe ponuja svoje eksperimentalne prednosti (Rahman in sod., 2018). Cebrica ima veliko fizioloških in genetskih podobnosti s človekom, vključno z nekaterimi lastnostmi možganov, prebavnega trakta, mišičja, obtočil in naravne imunosti (Santoriello in Zon, 2012). Kot modelni organizem ima številne prednosti, kot so hitro razmnoževanje in enostavno vzdrževanje. Glavna prednost je
prozornost njihovih zarodkov in mladic, ki omogoča vizualizacijo celičnih procesov, povezanih z napredovanjem raka, na nivoju posamezne celice v realnem času (Welker in sod., 2016). Prednost zarodkov cebric je nerazvitost imunskega sistema. Pri ksenotransplantaciji človeških rakavih celic imunosupresija ni potrebna, saj ne pride do zavrnitve vstavljenih celic. Ksenotransplantacija bodisi z barvili ali s fluorescenčnimi proteini označenih človeških celic v zarodke cebric postaja vse bolj uporabljana metoda za preučevanje rakavih obolenj osrednjega živčnega sistema (Rahman in sod., 2018).
Celice GB so uspešno presadili v cebrice in izvedli uspešne študije (Vittori in sod., 2015).
Celice lahko vstavimo v rumenjakovo vrečko ali pa v centralni živčni sistem, ki ga sestavljajo hrbtenjača, sprednji, srednji in zadnji možgani (slika 3) (Rahman in Alhewairini, 2018). Obe možnosti imata tako prednosti kot slabosti. Vnos v rumenjakovo vrečko omogoča direktne študije angiogenih učinkov. Problem pa je, da se rumenjakova vrečka po nekaj dneh razgradi. Tako je preživetje GB celic omejeno (Rahman in sod., 2018). Vnos celic GB v možgane ima kar nekaj prednosti. GB celice v možganih bolje preživijo in proliferirajo kot v rumenjakovi vrečki. Možgani cebric so primerni za študijo invazije. Prav tako ortotopično injiciranje poda relavantnejše rezultate (Rahman in sod., 2018).
Slika 2: Riba cebrica in zarodek ribe cebrice (Vittori in sod., 2015).
Riba cebrica in zarodek ribe cebrice. (A) Odrasla cebrica. (B) Antomija zarodka ribe cebrice dva dni po oploditivi.
Možgani
Rumenjakova vrečka Osrčnik
Perivitelinski prostor Cuvierjev vod
Slika 3: Zarodek cebrice 3 dni po oploditvi (Vittori in sod., 2015).
Jedra celic so obarvana z metil zelenim (rdeča barva) in slikana s konfokalnim mikroskopom. Merilo predstavlja 200 µm.
Sprednji možgani
Srednji
možgani Zadnji
možgani vrečka Hrbtenjača
3 MATERIALI IN METODE
3.1 GOJIŠČA, RAZTOPINE IN PUFRI 3.1.1 Gojišče za celično linijo NCH644 Sestava gojišča:
• L-glutamin (20 µM/mL; Sigma, G7513),
• Osnovno gojišče za matične celice - nevrobazalno gojišče (Gibco, 21103049)
• penicilin in streptomicin (10,000 U/mL penicilina, 10 mg/mL streptomicina; Sigma),
• B-27 (2 % v/v; Gibco, 17504-044),
• heparin (1 U/mL; Sigma, H3149-10KU),
• bFGF (20 ng/mL; Gibco, 13256029),
• EGF (20 ng/mL; Gibco, OHG0311L).
3.1.2 Gojišče za MMC Sestava gojišča:
• DMEM (Sigma-Aldrich, D5921),
• FBS (fetalni goveji serum, 10 % (v/v); Gibco, 10500-064),
• natrijev piruvat (100 mM; Gibco),
• L-glutamin (2 mM; Sigma, G7513),
• raztopina neesencialnih aminokislin (Gibco, 11140050, 1x10!" mL/1 mL),
• penicilin/streptomicin (10 000 U/mL, 1 mg; Sigma).
3.1.3 Voda ISO (ISO, 1996) Sestava vode:
• kalcijev klorid dihidrat (294 mg/L; Merck Milipore),
• kalijev klorid (5,5 mg/L; Merck Milipore),
• magnezijev sulfat heptahidrat (123,25 mg/L; Merck Milipore),
• natrijev hidrogenkarbonat (63 mg/L; Penreac AppliChem).
3.1.4 Pufer za blokado protiteles (10 % FBS, 1 % BSA, 0,1 % Triton X-100 v 1x PBS) Sestava pufra:
• FBS (500 μL; Gibco, 10500-064),
• BSA (0,05 g; Sigma, A3059-100G),
• 10x PBS (500 μL; Gibco, 70011044),
• destilirana voda (4 mL),
• triton X-100 (5 μL; Merck, 1122980101).
3.1.5 Citratni pufer (10 mM citratni puffer, pH=6,0) Sestava pufra:
• natrijev citrat (2,94 g; Merck),
• destilirana voda (1000 mL),
• klorovodikova kislina (do pH = 6, Sigma),
• tween20 (0,5 mL; Merck).
3.1.6 Pufer za redčenje protiteles Sestava pufra:
• 10x PBS (50,0 mL; Gibco, 70011044),
• BSA (5,0 g; Sigma, A3059-100G),
• destilirana voda (450 mL),
3.2 MEZENHIMSKE MATIČNE CELICE IN GLIOBLASTOMSKE MATIČNE CELICE Primarna kultura MMC (Lonza) so humane mezenhimske matične celice, izolirane iz kostnega mozga. V kulturi MMC rastejo v monosloju, pritrjene na podlago in so morfološko podobne fibroblastom. NCH644 so GMC (darilo prof. Herold-Mende iz Univerze v Heidelbergu), izolirane iz tumorja GB. V pogojih in vitro rastejo v suspenziji (nepritrjene na podalgo) in tvorijo sferične strukture.
3.3. DELO S CELIČNIMI KULTURAMI 3.3.1 Gojenje celičnih kultur
3.3.1.1 MMC
Celice smo gojili v gojitvenih posodicah s perforiranim zamaškom v gojišču za MMC v stalnih razmerah v celičnem inkubatorju (37 °C, 5 % CO2, z vlago nasičena atmosfera). Rast celic smo opazovali z invertnim svetlobnim mikroskopom. Ko so celice dosegle 70-80 % konfluentnost, smo jih presadili. Presajanje celic je potekalo v aseptičnih pogojih v laminariju. Najprej smo z vakuumskim sesalnikom odstranili gojišče in celice sprali s 5 mL PBS. Po 2 min smo PBS odstranili ter dodali 1,5 mL 0,25 % tripsina z EDTA, ki celice odlepi s površine. Gojitveno posodico smo med petminutno inkubacijo rahlo stresali, nato pa dodali 5 mL svežega gojišča in tako zaustavili delovanje tripsina. Suspenzijo celic smo prenesli v 15 mL centrifugirko in centrifugirali 3 min pri 1000 obr./min. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant ter resuspendirali celice v 1 mL svežega gojišča. Celice smo prešteli, nato pa ustrezni volumen celic prenesli v novo gojitveno posodico v katero smo predhodno dodali 5 mL gojišča za MMC. Gojitvene posodice smo po presaditvi prenesli v celični inkubator. Gojišče celične kulture smo zamenjali vsak drugi dan.
3.3.1.2 GMC
Celice smo gojili v gojitvenih posodicah s perforiranim zamaškom v gojišču za GMC v stalnih razmerah v celičnem inkubatorju (37 °C, 5 % CO2, z vlago nasičena atmosfera). Rast tumorja smo opazovali z invertnim mikroskopom. Ko so sfere GMC presegle velikost 200 µm, smo jih presadili. Najprej smo celice iz gojitvene posodice prenesli v 15 mL centrifugirko in centrifugirali 3 min pri 900 obr./min. Sfere GMC smo mehansko razbili s pomočjo pipete približno 15 sekund. Celice smo prešteli, nato pa ustrezni volumen celic prenesli v novo gojitveno posodico ter dodali 5 mL svežega gojišča. 1 mL svežega gojišča smo dodali vsak 2. dan.
3.4 KSENOTRANSPLANTACIJA TER ANALIZA RASTI IN INVAZIJE GMC IN MMC V MOŽGANIH ZARODKOV CEBRIC
Celicam smo pred ksenotransplantacijo dodali barvili CellTracker Orange (ThermoFisher Scientific) in CellTracker Green (ThermoFisher Scientific). Gre za stabilni, netoksični fluorescenčni barvili, ki prehajata skozi celične membrane. V celici se preoblikujeta v produkt, ki fluorescira in ne prehaja celične membrane. V živih celicah se zadržita več generacij. Barvilo se prenese v hčerinsko populacijo, ne pa tudi na sosednje celice, kar omogoča dobro sledenje željenim celicam. Maksimuma ekscitacije in emisije CellTracker Green sta pri 488 in 517 nm, maksimuma ekscitacije in emisije CellTracker Orange pa pri 532 in 576 nm (CellTracker fluorescent probes, 2020a, 2020b).
3.4.1 Priprava GMC za ksenotransplantacijo
V centrifugirko s celično suspenzijo (2 × 106 celic) smo dodali 5 mL PBS in centrifugirali 3 min pri 900 obr./min. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant. Tako smo celicam odstranili ostanke gojišča, ki lahko zmanjšajo učinkovitost barvanja. Celicam smo dodali delovno koncentracijo (15 µM) barvila CellTracker Green (ThermoFisher Scientific), ki smo ga predhodno pripravili (2 μL barvila + 998 μL gojišča NBE - Gibco). Celice smo nato inkubirali 60 minut pri 37 °C.
3.4.2 Priprava MMC za ksenotransplantacijo
V centrifugirko s celično suspenzijo (2 × 106 celic) smo dodali 5 mL 1 x PBS in centrifugirali 5 min pri 1000 obr./min. Po centrifugiranju smo odstranili spernatant. K celicam smo dodali delovno koncentracijo(15 µM) barvila CellTracker Orange (ThermoFisher Scientific), ki smo ga predhodno pripravili (3 μL barvila + 1997 μL gojišča za MMC brez FBS). Celice smo nato inkubirali 60 minut pri 37 °C.
3.4.3 Priprava celičnih suspenzij za ksenotransplantacijo
Po inkubaciji smo suspenzijo MMC z barvilom CellTracker Orange ter suspenzijo GMC z barvilom CellTracker Green dvakrat spirali s 5 mL PBS. Med spiranjem smo suspenzijo MMC centrifugirali 5 minut na 1000 obr./min, suspenzijo GMC pa 3 minute na 900 obr./min.
Za tem smo odstranili supernatant in celicam dodali 2 mL PBS in znova prešteli celice. Glede na število preštetih celic smo pripravili 3 centifugirke:
- prva je vsebovala monokulturo MMC s koncentracijo 1 × 107 MMC/mL,
- druga sokulturo GMC in MMC (1:1) s koncentracijo 500.000 MMC/mL in 500.000 GMC/mL,
- tretja monokulturo GMC s koncentracijo 1 × 107 GMC/mL.
Celice v vseh treh centrifugirkah smo še enkrat sprali s 5 mL PBS, centrifugirali 5 minut na 1000 obr./min in nato odstranili supernatant. Za tem smo odpipetirali 50 μL celic iz vsake centrifugirke in jih prenesli v ustrezno označene mikrocentrifugirke.
3.4.4 Priprava zarodkov ter ksenotransplantacija GMC in MMC v zarodke cebric Postopki uporabe zarodkov cebric so bili odobreni s strani Komisije za medicinsko etiko Republike Slovenije pri Ministrstvu za zdravje Republike Slovenije (št. dovoljenja 92/06/12). Poskusi so bili izvedeni na zarodkih rib, ki smo jih vzgojili v akvariju Oddelka za genetsko toksikologijo in biologijo raka na Nacionalnem inštitutu za Biologijo v Ljubljani v skladu s smernicami za vzdrževanje rib cebric OECD (OECD 2013). Vsak poskus je trajal 6 dni. Prvi dan po oploditvi smo zarodke premestili iz akvarijske vode v petrijevko z vodo ISO, katere sestava je opredeljena v standardu ISO 7346-3 (ISO, 1996). Drugi dan smo zarodkom zamenjali vodo ISO z 0,005 % feniltioureo - PTU (5 mg PTU v 100 mL ISO vode). PTU (Sigma) inhibira encim tirozinazo, ki sodeluje pri pretvorbi tirozina v melanin, zato zarodki ne izdelujejo melanina. Zaradi odsotnosti pigmenta je omogočena lažja vizualizacija struktur v notranjosti zarodkov (Camp in Lardelli, 2001; Li in sod., 2012).
Tretji dan smo izvedli dehorionizacijo zarodkov in ksenotransplantacijo celic. Pred poskusom smo zarodke cebric uspavali z 0,08 % trikainom (Sigma) tako, da je bila končna koncentracija trikaina v petrijevki z vodo ISO 0,02 %. S pincetami smo pod stereomikroskopom (Nikon SMZ1500) previdno odstranili horionsko ovojnico, po tem pa še večino tekočine v petrijevki, kar je olajšalo injiciranje celic v zarodke. S podaljšanim nastavkom za pipeto smo v borosilikatno stekleno kapilaro prenesli 5 μL celične suspenzije ter kapilaro namestili v mikroinjektor (Tritech research). Z mikroinjektorjem smo injicirali 50-100 celic v možgane zarodkov. Pod mikroskopom (Nikon Eclipse TE300) smo preverili uspešnost injiciranja fluorescentno označenih GMC in MMC. Zarodke, v katere nismo vnesli dovolj celic, smo izločili iz nadaljnje analize. Posamezne zarodke z injiciranimi celicami smo z 1 mL tekočine prenesli v vdolbinice mikrotitrskih plošč s 24 vdolbinicami. Vodo ISO
s trikainom smo zamenjali z ISO vodo s PTU in mikrotitrske plošče prestavili v inkubator na 31 °C. Poskus z injiciranjem celic v možgane zarodkov smo ponovili dvakrat.
3.4.5 Gojenje in mikroskopiranje zarodkov cebric
Po ksenotransplantaciji GMC in MMC v zarodke cebric je sledilo mikroskopiranje (Nikon Eclipse TE300 s programsko opremo NIS-Elements). Zarodke cebric smo slikali 1. dan po injiciranju celic (4. dan poskusa) in 3. dan po injiciranju celic (6. dan poskusa). Pred vsakim slikanjem smo zarodke cebric uspavali z 0,08 % trikainom (v vsako vdolbinico smo kanil 2 kapljici). Slikali smo z invertnim mikroskopom (Nikon Eclipse TE300) pri 40-kratni povečavi, vsako vdolbinico oz. zarodek. Uporabili smo set filtrov za ekscitacijo z zeleno in modro svetlobo in zaznali emisijo celic v rdečem in zelenem delu spektra. Čas zajemanja slike MMC celic je bil 333 ms, celic GMC pa 417 ms. Vse slike smo shranjevali v formatu TIFF. Po prvem slikanju smo vso tekočino zamenjali s svežo vodo ISO z 0,005 % PTU in mikrotiterske plošče prestavili v inkubator (ICP 500, Memmert) na 31 °C do naslednjega slikanja.
3.4.6 Analiza rasti in invazije celic v možganih cebric
Slike celic in vivo smo analizirali s programom ImageJ (različica 1.49v; Abràmoff in sod., 2004; Ferreira in Rasband, 2012). Pridobljene podatke vsake slike smo shranili v programu Microsoft Office Excel 2019.
Rast tumorja v možganih smo določili z merjenjem površine tumorjev v programu ImageJ.
Ko celice rastejo se povečuje tudi njihova površina. Površina se lahko poveča, ker celice postanejo večje (poveča se njihov volumen) ali pa se celice množijo (proliferacija). Za vsako sliko smo nastavili prag sivine (angl. Threshold) ki jo bo program zajel za analizo (slika 4).
Dobili smo parameter (»area«), ki predstavlja seštevek površine označenih pikslov.
Relativno spremembo površine tumorja smo izračunali tako, da smo površino celic tretji dan po injiciranju delili s površino celic prvi dan po injiciranju (1). Pri kokulturi smo dimenzije izmerili za MMC in GMC posebej.
𝑅𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑛𝑎 𝑠𝑝𝑟𝑒𝑚𝑒𝑚𝑏𝑎 𝑝𝑜𝑣𝑟š𝑖𝑛𝑒 = #$%&š()* ,-.(, )* /&-/0( 1*)
#$%&š()* ,-.(, )* #&%( 1*) … (1)
Slika 4: Prikaz merjenja površine tumorja.
Z rumeno barvo je obkroženo območje, ki jo bo program zajel za analizo.
Invazijo celic smo določili z merjenjem dolžine tumorjev. Dolžina tumorja se uporablja za merjenje invazije celic, ker je občutljiva na disperzijo celic, ki kaže na premikanje oziroma invazijo celic. V primeru, da celica odpotuje 1 mm daleč, pri meritvi površine tega ne zaznamo, pri meritvi dolžine pa se vrednost zelo spremeni. V programu ImageJ smo s pomočjo premice pomerili najdaljšo dolžino tumorja v x- in y-osi (invazija) na prvi in tretji dan po injiciranju celic v zarodke cebric (slika 5).
Slika 5: Prikaz merjenja dolžine tumorja v x- in y-osi.
Y
X
Najprej smo izračunali povprečno dolžino tumorja prvi (2) in tretji (3) dan slikanja tako, da smo izračunali povprečje vrednosti x in y osi:
1. dan
𝑃𝑜𝑣𝑝𝑟𝑒č𝑛𝑎 𝑑𝑜𝑙ž𝑖𝑛𝑎 𝑡𝑢𝑚𝑜𝑟𝑗𝑎 1 = 2!3 4" ! ... (2) 3. dan
𝑃𝑜𝑣𝑝𝑟𝑒č𝑛𝑎 𝑑𝑜𝑙ž𝑖𝑛𝑎 𝑡𝑢𝑚𝑜𝑟𝑗𝑎 3 = 2"3 4" " ... (3) Nato smo izračunali relativno spremembo invazije (4), tako da smo povprečno dolžino tretjega dne delili s povprečno dolžino prvega dne:
𝑅𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑛𝑎 𝑠𝑝𝑟𝑒𝑚𝑒𝑚𝑏𝑎 𝑖𝑛𝑣𝑎𝑧𝑖𝑗𝑒 = #$%#&-č)* 1$.ž()* /78$&0* 9
#$%#&-č)* 1$.ž()* /78$&0* : ... (4)
3.4.7 Statistična obdelava podatkov
Dobljene podatke smo statistično analizirali in grafično predstavili v programu Microsoft Office Excel 2019. Rezultati na grafu so za površino tumorja podani kot povprečje vseh vrednosti relativne površine s standardno napako. Rezultati na grafu so za invazijo podani kot povprečje vseh vrednosti relativne invazije s standardno napako.
Razlike med skupinami smo ovrednotili s t-testom. Skupine, pri katerih je bila izračunana vrednost p-vrednost manjša od 0,05 smo smatrali za statistično značilno različne (95 % interval zaupanja).
3.4.8 Fiksacija zarodkov s 4 % paraformaldehidom
Po opazovanju in slikanju smo zarodke cebric prenesli v 2 mL mikrocentrifugirke. Zarodke smo dali v tri mikrocentrifugirke, odvisno od tega, kaj smo jim injicirali. Nato smo s pipeto odstranili še preostanek tekočine ter v vsako mikrocentrifugirko dolili 1 mL 4 % PFA (Sigma) ter po 1 h inkubacije na sobni temperaturi mikrocentrifugirke prestavili v hladilnik (4 °C.). Po 24 urah smo 4 % PFA nadomestili z 1× PBS ter mikrocentrifugirke shranili v hladilniku pri 4 °C.
3.4.9 Imobilizacija zarodkov v agarozi in bistrenje
Za imobilizacijo smo uporabili agarozo z nizkim tališčem (Sigma), ki postane tekoča pri 40
°C. Zamešali smo 1 % agarozo v PBS (1g agaroze v 100 mL PBS) in segrevali do temperature 40 °C. Fiksirane zarodke smo prestavili v manjše petrijevke. S pipeto smo
odstranili vso tekočino, s kapalko dodali pripravljeno agarozo in zarodke postavili v ustrezen položaj za slikanje. Ko se je agaroza strdila, smo v vsako petrijevko dodali 2 mL raztopine za bistrenje Scale U2, ki je sestavljena iz 4 M uree (Sigma), 30 % glicerola (Fisher) in 0,1
% Tritona X-100 (Sigma) raztopljenih v vodi (Hama in sod., 2011). V Scale U2 postanejo možgani cebric prozorni, hkrati pa se ohrani fluorescenca barvil (Hama in sod., 2011).
Petrijevke smo nato shranili v temi na sobni temperaturi.
3.4.10 Barvanje jeder z barvilom metil zeleno
Iz petrijevk z imobiliziranimi zarodki smo odstranili raztopino za bistrenje. Pripravili smo 0,004 % raztopino barvila metil zeleno v Scale U2. Metil zeleno je barvilo, ki fluorescentno obarva jedra celic, saj ima specifično afiniteto do DNA. Maksimum ekscitacije barvila metil zeleno je med 244 in 388 nm, emisije pa med 488 in 633 nm. V vsako petrijevko smo dodali 2 mL te raztopine in zarodke inkubirali 1 teden v hladilniku, nato je sledilo slikanje s konfokalnim mikroskopom.
3.4.11 Slikanje s konfokalnim mikroskopom
Imobilizirane zarodke v petrijevkah smo slikali s konfokalnim mikroskopom (Leica TCS SPE) pri 50-kratni povečavi. Zarodke smo slikali v različnih ravninah in tako pridobili 3D slike. Uporabili smo set filtrov za ekscitacijo z modro (488 nm), zeleno (532 nm) in rdečo svetlobo (635 nm) in zajeli emisijo celic v rdečem, zelenem in daljno rdečem delu spektra.
Razpon valovnih dolžin, ki smo jih zajemali, smo za detekcijo zelenega barvila (CellTracker Green) nastavili od 500 nm do 650 nm, za detekcijo (CellTracker Orange) od 550 do 750 nm, za detekcijo barvila metil zeleno pa od 660 nm do 800 nm.
3.5 PRIPRAVA PARAFINSKIH REZIN MOŽGANOV CEBRIC IN
IMUNOHISTOKEMIJSKO BARVANJE 3.5.1 Izdelava parafinskih rezin možganov cebric
Iz mikrocentrifugirk, s shranjenimi zarodki, smo odstranili PBS, in dvakrat po 30 minut spirali s svežim 1x PBS. Sledila je dehidracija zarodkov z naraščajočimi koncentracijami etanola (70 %, 90 %, 100 %), v vsaki po 15 minut. Po dehidraciji smo 100 % etanol zamenjali s ksilenom (Honeywell) in inkubirali dvakrat po 15 minut. Nato smo zarodke prepojili s tekočim parafinom čez noč. Zatem smo oblikovali kalupe. V posamezen kalup smo vlili tekoč parafin in vanj vklapljali zarodke tako, da smo jih s pinceto prenesli v kalup s parafinom. Počakali smo, da se je parafin strdil na hladni plošči in nato odstranili kalup ter izdelali nosilce za kocke parafina z vklopljenimi zarodki. Sledilo je rezanje 7 µm debelih parafinskih rezin z mikrotomom (Leica RM2265) in pobiranje rezin na objektnike. Na objektno steklo smo po kapljicah dodali destilirano vodo, na kateri so rezine splavale, in ga
nato za 30-40 sekund položili na grelno ploščo. Za tem smo odstranili odvečno vodo in objektnike sušili na grelni plošči čez noč.
3.5.2 Imunohistokemijsko barvanje označevalcev proliferacije, diferenciacije in invazije
Najprej smo izvedli deparafinizacijo. Stekelca smo dvakrat po 3 min potopili v ksilen (ChemLab). Sledila je rehidracija, kjer smo stekelca za 3 min potopili v raztopine absolutnega etanola s padajočimi koncentracijami (absolutni etanol, 96 % etanol, 70 % etanol) in na koncu v destilirano vodo. Za tem smo razkrili antigene tako, da smo stekelca potopili v čašo s citratnim pufrom in jih kuhali v mikrovalovni pečici 30 min. Čašo s stekelci smo po segrevanju 15 minut pustili na sobni temperaturi in nato stekelca premaknili v destilirano vodo za 5 min na sobni temperaturi ter stresali na stresalniku. Za tem smo na posameznem stekelcu okoli tkiva narisali krog s hidrofobnim flomastrom (DAKO pen) in stekelca inkubirali v pufru za blokado z dodanim Triton X-100 (200 µL na rezino) 1h pri sobni temperaturi in s tem zmanjšali možnost za nespecifično vezavo protiteles. Sledilo je dodajanje (inkubacija v) raztopin primarnih protiteles, ki smo jih redčili v pufru za redčenje protiteles (preglednica 1). Na vsako stekelce smo dodali po 200 µL raztopine na rezino.
Stekelca smo nato inkubirali preko noči pri 4 °C. Stekelca smo po inkubaciji spirali dvakrat po 5 minut v pufru za redčenje protiteles. Sledila je inkubacija stekelc s sekundarnimi protitelesi. Pri tem smo izvedli še kontrolno barvanje rezin brez prisotnosti primarnih protiteles in s tem preverili specifičnost sekundarnih protiteles. Tkivo na stekelcih smo še enkrat obkrožil s hidrofobnim flumastrom, dodali redčino sekundarnega protitelesa (1:200, preglednica 1) v pufru za redčenje protiteles (100 µL na rezino) in inkubirali 1 h pri sobni temperaturi v temi. Stekelca smo po inkubaciji spirali dvakrat po 5 minut v pufru za redčenje protiteles z dodanim Triton X-100. Sledilo je barvanje jeder z barvilom Hoechst. Stekelca smo 5 minut inkubirali v redčini barvila Hoechst v PBS (2 × 10!; mol/L) in nato dvakrat po 5 minut spirali s PBS. Po končanem barvanju smo stekelca pripravili za mikroskopsko analizo. Na objektna stekelca smo dodali dve kapljici vklopnega medija proti bledenju fluorescence (Prolong Gold, Thermo Fisher Scientific) in jih pokrili s krovnimi stekelci.
Preparate smo 15 minut inkubirali v temi na sobni temperaturi. Robove krovnih stekelc smo premazali s prozornim lakom in jih do slikanja hranili v zamrzovalniku (-20 °C).
Preglednica 1: Protitelesa uporabljena za IHC parafinskih rezin.
Antigen Izvor primarnih protiteles
Proizvajalec primarnih protiteles in kataloška številka
Redčitev Sekundarna protitelesa
Proizvajalec sekundarnih protiteles in izvor
GFAP Kunčji Abcam,
ab211271
1:500 Protikunčje AlexaFluor 647
ThermoFisher Scientific, kozje Ab
Ki-67 Kunčji Abcam,
ab15580
1:200 Protikunčje, AlexaFluor 647
ThermoFisher Scientific, kozje Ab
SOX2 Mišji Abcam,
ab171380
1:200 Protimišje, AlexaFluor 647
ThermoFisher Scientific, kozje Ab
Katepsin B Mišji Fakulteta za
farmacijo (prof.
Janko Kos), 3E1
1:100 Protimišje, AlexaFluor 647
ThermoFisher Scientific, kozje Ab
3.5.3 Slikanje parafinskih rezin s konfokalnim mikroskopom
Parafinske rezine smo po IHC z označevalci proliferacije, diferenciacije in invazije slikali s konfokalnim mikroskopom (Leica TCS SP8, programska oprema LAS X) pri 200x in 400x povečavi. Uporabili smo laserje za ekscitacijo z modro, zeleno in rdečo svetlobo.
Ekscitacijske valovne dolžine so za Hoechst 405 nm, za Celltracker Green 488 nm, za Celltracker Orange 532 nm, za AlexaFluor 638 nm. Razpon valovnih dolžin, ki smo jih zajemali, smo za detekcijo Hoechst nastavili od 410 nm do 480 nm, za CellTracker Green od 507 nm do 545 nm, za CellTracker Orange od 576 nm do 606 nm, za AlexaFluore 647 pa od 660 nm do 709 nm.
4 REZULTATI
4.1 INJICIRANJE CELIC GMC IN MMC V MOŽGANE CEBRIC
Zarodke smo opazovali s fluorescenčnim invertnim mikroskopom. V začetku poskusa smo morali najprej potrditi uspešnost injiciranja in rast celic in vivo. Zarodke cebric smo slikali 1. in 3. dan po injiciranju celic, kar prikazuje slika 6. Na sliki 6 so v možganih zarodkov cebric vidne GMC in MMC, ki tvorijo tumorsko maso, kar dokazuje uspešen vnos celic. V mešanih tumorjih se GMC in MMC mešajo med sabo in so v tesnem stiku, kar kaže na medsebojni tropizem obeh vrst celic . Zarodki cebric z injiciranimi tumorji so bili tretji dan po injiciranju še vedno živi, njihov embrionalni razvoj je potekal normalno.
DAN 1 DAN 3
GMC
MMC
Slika 6 se nadaljuje GMC GMC
MMC
MMC
Nadaljevanje slike 6. Zarodki cebric 1. in 3. dan po injiciranju.
DAN 1 DAN 3
1:1 GMC : MMC
Slika 6: Zarodki cebric 1. in 3. dan po injiciranju monokulture GMC (zeleno), monokulture MMC (rdeče) in sokulture GMC in MMC. Slike so bile posnete s fluorescenčnim invertnim mikroskopom pri 40x povečavi. Merilo: 200 µm.
4.2 VPLIV INTERAKCIJ MED GMC IN MMC NA RAST IN INVAZIJO TUMORJA Rast tumorja smo določili z merjenjem površine celične mase. Statistično značilnih razlik med proliferacijo GMC v monukulturi v primerjavi s proliferacijo GMC v sokulturi nismo pokazali (slika 7). Je pa prisotnost GMC povečala rast MMC v sokulturi v primerjavi z MMC. Rast MMC je bila v sokulturi statistično značilno večja napram rasti MMC v monokulturi (p < 0,01) (slika 7). Relativna površina MMC je bila ob prisotnosti GMC tri dni po injiciranju v povprečju 2,16 krat večja od površine MMC v monokulturi (slika 7) . Invazijo celic smo določili z merjenjem dolžine celične mase tumorja v možganih zarodkov cebric ter izračunom relativne spremembe dolžine celične mase tumorja (razmerje med povprečno dolžino na dan 3 po injiciranju s povprečno dolžino na dan 1 po injiciranju).
Statistično značilnih razlik med invazijo GMC v monukulturi v primerjavi z invazijo GMC v sokulturi nismo pokazali (slika 8). Je pa prisotnost interakcij med GMC in MMC povečala invazijo MMC v sokulturi v primerjavi z monokulturo MMC. Invazija MMC je bila v sokulturi statistično značilno večja napram invaziji samih MMC (p < 0,05) (slika 8).
Podobno kot pri proliferaciji so interakcije med GMC in MMC povečale invazijo le MMC (slika 8).
MMC GMC
GMC
GMC MMC
Slika 7: Relativne spremembe površine tumorjev MMC in GMC v monokulturah in sokulturah.
Na grafu so prikazana povprečja meritev s standardnimi napakami. Statistično značilne razlike so prikazane z
** (p < 0.01), statistično neznačilne pa z n.s. GMC – monokultura, MMC - monokultura, 1:1 GMC - rezultati meritev GMC, ki so rastle v sokulturi, 1:1 MMC - rezultati meritev MMC, ki so rastle v sokulturi. Stolpci prikazujejo kakšna je relativna površina tumorja na 3. dan glede na 1. dan.
Slika 8: Sprememba relativne dolžine tumorjev MMC in GMC v monokulturah in sokulturah.
Na grafu so prikazana povprečja meritev s standardnimi napakami. Statistično značilne razlike so prikazane z
* (p < 0.05), statistično ne značilne pa z n.s. GMC – monokultura, MMC - monokultura, 1:1 GMC- rezultati meritev GMC, ki so rastle v sokulturi, 1:1 MMC - rezultati meritev MMC, ki so rastle v sokulturi. Stolpci prikazujejo kakšna je relativna dolžina tumorja na 3. dan glede na 1. dan.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
Relativna površina
Injicirane celice
GMC 1:1 GMC MMC 1:1 MMC
**
n.s
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Relativna dolžina
injicirane celice
GMC 1:1 GMC MMC 1:1 MMC
n.s
*
4.3 3D SLIKE TUMORJEV V MOŽGANIH ZARODKOV CEBRIC 4.3.1 3D slike tumorjev v možganih cebric
Zarodke smo slikali s konfokalnim mikroskopom v različnih ravninah in tako pridobili 3D slike. Pri mikroskopiranju smo bili pozorni na morfologijo, lokacijo in razpršenost injiciranih celic. Na slikah (slike 9, 10 in 11) so v možganih zarodkov cebric lepo vidne celice GMC in MMC v monokulturi in sokulturi, ki potrjujejo uspešno injiciranje celic v možgane. MMC tvorijo zaokrožene celične mase – locirane so bolj tesno skupaj, medtem ko so GMC bolj razpršene v možganih. MMC se nahajajo v skupkih, redke so individualne celice. Tumorji monokultur se nahajajo v sprednjih, srednjih in zadnjih možganih cebrice.
Nekatere celice so migrirale od izvornega mesta injiciranja in se v možganih razširjale anteriorno in posteriorno.
Pred izvedbo analize vpliva MMC na GMC smo preverili, ali injicirane celice v sokulturi tvorijo tumor in vivo. Na konfokalnih slikah so vidni skupki GMC in MMC. Injicirane celice GMC in MMC so v možganih oblikovale tumorsko maso. MMC so se med seboj povezale in tvorile maso ter izrinile GMC na rob tumorske mase (slika 9). Tumorji kokultur so se pretežno nahajali v hemisferah srednjih možganov in v ventriklih srednjih in zadnjih možganov. GMC so v monokulturi bolj razpršene kot MMC, ki so zbite skupaj oziroma se sprimejo v enotno maso. Pri vseh zarodkih so vstavljene celice ostale na mestu začetnega injiciranja – v možganih. Nismo zaznali celic izven območja možganov in hrbtenjače, kar kaže na to, da je invazija GMC celic v cebricah omejena na centralni živčni sistem. GMC v cebricah se torej obnašajo podobno kot v človeških možganih, kjer se prav tako ne zasevajo v druge organe.
