UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
DIPLOMSKO DELO
Sumeja Kudelić
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO Univerzitetni študijski program 1. stopnje BIOKEMIJA
Vzpostavitev metode za vzbujanje oksidativnega stresa v algi Chlamidomonas reinhradtii s svetlobo UV
DIPLOMSKO DELO
Sumeja Kudelić
MENTOR: doc. dr. Marina Klemenčič
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
diplomskega dela
Spodaj podpisana Sumeja Kudelić sem avtorica diplomskega dela z naslovom Vzpostavitev metode za vzbujanje oksidativnega stresa v algi Chlamydomonas reinhardtii s svetlobo UV.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je diplomsko delo izključno rezultat mojega lastnega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr. Marine Klemečič;
• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zaveda, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorskih in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UP3) (Ur. list RS, št- 16/2007);
• sem poskrbela za slovnično in oblikovano korektnost diplomskega dela;
• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.
V Ljubljani, datum Podpis avtorice:
Zahvala
Zahvaljujem se mentorici, doc. dr. Marini Klemenčič, da sem lahko pod njenim mentorstvom opravljala diplomsko nalogo. Vedno mi je bila pripravljena pomagati in svetovati, zahvaljujem pa se ji tudi za hiter in temeljit pregled diplomskega dela.
Posebna zahvala gre tudi Katarini van Midden za laboratorijsko uvajanje, sodelovanje pri izvajanju eksperimentov in čas, ki ga je posvetila temeljitemu pregledu diplomskega dela.
Zahvaljujem se tudi izr. prof. Marku Novincu za hiter pregled diplomskega dela.
Največja zahvala gre mojim staršem, bratu in fantu, ki so mi stali ob strani ob težkih trenutkih in me podpirali med celotnim študijem.
KAZALO
1 UVOD ... 1
1.1. Zelene alge ... 1
1.2. Chlamydomonas reinhardtii ... 1
1.2.1. Zgradba alge Chlamydomonas reinhardtii ... 2
1.2. Regulirana celična smrt ... 2
1.2.1. Regulirana celična smrt pri rastlinah ... 3
1.2.2. Regulirana celična smrt pri algi C. rainhardtii... 4
1.3. Proteaze, povezane s RCD... 4
1.3.1. Kaspaze ... 5
1.3.3. Legumain ... 6
1.3.4. Parakaspaze ... 7
1.4. Regulirana celična smrt kot odziv na stresne pogoje ... 8
1.4.1. Solni stres ... 8
1.4.2. Abiotski stres z vodikovim peroksidom ... 9
1.4.3. Izpostavljenost proteaznim inhibitorjem ... 9
1.4.4. Izpostavljenost ocetni kislini ... 9
1.4.5. Indukcija RCD s pomočjo UV-svetlobe ... 10
2 NAMEN DELA ... 13
3 MATERIALI ... 15
3.1. Reagenti ... 15
3.1.1. Kemikalije ... 15
3.1.2. Pufri ... 15
3.1.3. Zmesi organskih topil ... 16
3.1.5. Reagentska barvila ... 16
3.1.6. Standard velikosti ... 16
3.2. Laboratorijska oprema ... 17
3.3. Gojišča ... 18
3.4. Sev ... 19
4 METODE ... 21
4.1. Gojenje celične kulture C. reinhardtii ... 21
4.2. Obsevanje celic z UV-svetlobo ... 21
4.3. Merjenje optične gostote pri valovni dolžini 740 nm ... 21
4.4. Opazovanje celic s svetlobnim mikroskopom ... 22
4.5. Izolacija genomske DNA in analiza z agarozno gelsko elektroforezo ... 22
4.5.1. Izolacija genomske DNA... 22
4.5.2. Izvedba agarozne gelske elektroforeze ... 24
4.6. Test CAVA ... 24
4.7. Encimski test... 25
4.7.1. Priprava topne frakcije celic C. reinhardtii ... 25
4.7.2. Bradfordova metoda ... 26
4.7.3. Merjenje proteolitične aktivnosti ... 26
5 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 27
5.1. Analiza rasti celic po krajših intervalih obsevanja z UV-svetlobo ... 27
5.2. Optimizacija časa izpostavljenosti celic UV-svetlobi ... 29
5.2.1. Spremljanje optične gostote celic ... 29
5.2.2. Analiza morfoloških sprememb v celicah C. reinhardtii ... 31
5.2.3. Analiza poškodb genomske DNA v celicah C. reinhardtii ... 35
5.3. Karakterizacija celičnih sprememb po 5-minutnem obsevanju z UV-svetlobo .. 37
5.3.1. Spremljanje celične rasti po 5-minutnem obsevanju z UV-svetlobo ... 37
5.3.2. Preživetje celic po obsevanju z UV-svetlobo ... 38
5.3.4. Proteazni test... 41
6 ZAKLJUČEK ... 45
7 LITERATURA... 47
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
A526
absorbanca pri valovni dolžini 526 nm A595
absorbanca pri valovni dolžini 595 nm A740
absorbanca pri valovni dolžini 740 nm AGE agarozna gelska elektroforeza
AMC 7-amino-4-metilkumarin angl. angleško
Asn asparagin
Arg arginin
bp bazni par
CBB barvilo Coomasie Brilliant Blue
CHAPS 3-[(3-kolamidopropil)dimetilamonijev]-1-propansulfonat
Cys cistein
Da dalton
dH2O deionizirana voda
DNA deoksiribonukleinska kislina DTT ditiotreitol
EDTA etilendiamintetraocetna kislina FR-AMC Phe-Arg-AMC
HEPES 1-piperazinetansulfonska kislina Hys histidin
Ig imunoglobulin
Leu leucin
OD optična gostota
Phe fenilalanin
Pro prolin
R-gen odpornostni gen (angl. response gene) RNA ribonukleinska kislina
ROS reaktivne kisikove zvrsti
rpm vrtljaji na minuto (angl. revolutions per minute) TAE Tris-acetat-EDTA
TAP Tris-acetat-fosfat
TE Tris-EDTA
Tris 2-amino-2-(hidroskimetil)-1,3-propandiol UV ultravijolično
VCD vakuolarna celična smrt VPE vakuolarni procesivni encimi TLCK N-tozil-lizin-klorometil-keton TPCK N-tozil-fenilalanin-klorometil-keton
v/v razmerje volumna snovi in volumna končne raztopine w/v razmerje mase snovi in volumna končne raztopine
Vzpostavitev metode za vzbujanje oksidativnega stresa v algi Chlamidomonas reinhradtii s svetlobo UV
Povzetek:
Regulirana celična smrt (angl. regulated cell death, RCD) je na nivoju genov uravnavan proces, ki pri rastlinah omogoča kontrolirano rast in prilagoditev na stresne pogoje. Pred kratkim je bilo pokazano, da tudi pri enocelični zeleni algi Chlamydomonas reinhardtii pod določenimi stresnimi pogoji pride do procesov, ki so podobni regulirani celični smrti v kopenskih rastlinah.
Alga C. reinhardtii je modelni organizem za raziskovanje različnih fizioloških procesov kot so fotosinteza, respiracija, prilagoditev na različna sevanja, osmotski in oksidativni stres. Pri C. reinhardtii lahko regulirano celično smrt opazimo pri več stresnih pogojih, kot so dodatek vodikovega peroksida ali ocetne kisline, značilnosti RCD pa lahko opazimo tudi po obsevanju z UV-svetlobo. Izpostavljenost celic C. reinhardtii različnim sevanjem povzroči morfološko značilne spremembe, kot so povečanje volumna vakuol, lestvičenje DNA (angl. DNA laddering) in prisotnost fosfatidilserina na zunanji strani celične membrane.
Ker mehanizmi, ki privedejo v regulirano celično smrt pri tem organizmu še niso jasni, smo želeli vzpostaviti novo metodo za vzbujanje oksidativnega stresa v C. reinhardtii.
Celice C. reinhardtii smo zato različno dolgo obsevali z UV-svetlobo, da bi ugotovili pri kakšni izpostavitvi sevanja pride do procesov povezanih z RCD. Parametri, ki smo jih spremljali pri celicah, obsevanih z UV-svetlobo, so preživetje celic po obsevanju ter nukleazna in proteolitična aktivnost. Opazovali smo tudi morfološke spremembe s svetlobnim mikroskopom. Ugotovili smo, da pride do povečanja volumna vakuol v celicah, ki so bile daljši čas izpostavljene stresorju. Z agarozno gelsko elektroforezo smo preverjali aktivnosti nukleaz, ki razgrajujejo genomsko DNA na urejene fragmente enakih velikosti DNA. Nastanek urejenih fragmentov DNA je namreč značilen znak, da je prišlo do RCD. Z izvedbo encimskega testa smo preverjali aktivnost tripsinu podobnih proteaz, za katere sklepamo, da so ključne pri RCD. Na žalost smo izbrali precej kratek čas obsevanja celic z UV-svetlobo in nespecifičen substrat (Z-FR-AMC), zaradi česar razlik v aktivnosti proteaz nismo opazili.
Ključne besede: Chlamydomonas reinhardtii, regulirana celična smrt, oksidativni stres, UV-svetloba, osmotski stres, metakaspaze.
Establishement of a method for induction of oxidative stress in a green alga Chlamydomonas reinhardtii using UV light
Abstract:
Regulated cell death (RCD) is a gene-regulated process that allows plants to grow and develop and adapt to stressful conditions. It has recently been shown that even in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii, processes similar to regulated cell death in plants are observed under certain stress conditions.
Alga C. reinhardtii is a model organism for researching various physiological processes such as photosynthesis, respiration, adaptation to various radiations, osmotic and oxidative stress. In C. reinhardtii, regulated cell death may be observed under several stressful conditions, such as the addition of hydrogen peroxide or acetic acid, and the characteristics of RCD may also be observed after irradiation with UV light. Exposure of C. reinhardtii cells to various radiations, such as UV light, causes morphologically characteristic changes such as an increase in vacuole volume, DNA laddering, and the presence of phosphatidylserine on the outside of the cell membrane.
Since the mechanisms that lead to regulated cell death in this organism are not clear yet, we wanted to establish a new method for inducing oxidative stress that would facilitate our study of the RCD process in C. reinhardtii. C. reinhardtii cells were therefore irradiated with UV light for different time periods to determine the radiation exposure associated with RCD-related processes. The parameters monitored in cells irradiated with UV light are cell survival after irradiation and nuclease and proteolytic activity. After irradiation of the cells with UV light, morphological changes were observed with a light microscope. We observed an increase in the volume of vacuoles in cells that have been exposed to the stressor for a long time. Agarose gel electrophoresis allowed us to verify the activity of nucleases that degrade genomic DNA into ordered fragments of equal DNA sizes. The formation of ordered DNA fragments is a characteristic feature of cells in which RCD has occurred. By performing proteolytic assay, we monitored the activity of proteases with tripsin-like activity, which were presumed to be crucial in RCDs.
Unfortunately, we chose a rather short irradiation time of cells with UV light and a nonspecific substrate (Z-FR-AMC), which coved be the reason why no difference in protease activity was observed.
Keywords: Chlamydomonas reinhardtii, regulated cell death, oxidative stress, UV light, osmotic stress, metacaspases.
1
1 UVOD
1.1. Zelene alge
Zelene alge so evkariontski enocelični organizmi. Na osnovi filogenije sodijo v kraljestvo rastlin in jih uvrščamo v deblo Chlorophyta [1]. V deblo Chlorophyta sodijo alge, ki so nastale s primarno endosimbiozo med heterotrofnim evkariontom in fotosintetskim organizmom. Z endosimbiozo so alge pridobile posebne organele-kloroplaste, ki vsebujejo barvila klorofil a in b. Zaradi vsebnosti klorofila, so imeli tako nastali evkariontski organizmi sposobnost pridobivanja hranilnih produktov s pomočjo fotosinteze in so živeli v stabilnem okolju za razvoj in razmnoževanje [1]. Ti organizmi naseljujejo predvsem sladkovodna okolja, najedemo pa jih tudi v morski vodi [2].
1.2. Chlamydomonas reinhardtii
Chlamydomonas reinhardtii (od tu naprej C. reinhardtii) je haploidna enocelična zelena alga iz rodu Chlamydomonas [2]. Naseljuje sladkovodna okolja in prsti [1][4].
C. reinhardtii je modelni organizem s premerom do približno 10 µm [2][6]. Hitra rast, enostavno gojenje in možnost manipulacije genoma so najpomembnejše karakteristike alge C. reinhardtii kot laboratorijskega modelnega organizma [3]. Glavni metabolni proces, ki poteka znotraj celice C. reinhardtii je fotosinteza. Poleg proučevanja fotosinteze, je C. reinhardtii zanimiv tudi za preučevanje strukture in nalog evkariontskih bičkov [5]. Rezervne energijske zaloge so v obliki škroba, razen v primeru stresnih pogojev, ko se začne namesto škroba sintetizirati triacilgliceride. Pridobivanje triacilgliceridov je biotehnološko zelo pomemben proces za proizvodnjo biogoriv v industrijskem merilu. Tudi za pridobivanje drugih bioloških molekul je C. reinhardtii zelo pomemben [7].
Poznavanje genoma C. reinhardtii nam omogoča, da z različnimi tehnikami z njim manipuliramo in tako tračno pridobivamo različne želene produkte [5][8][9]. Pri C.
reinhardtii je prisotna tako jedrna, kot tudi plastidna in mitohondrijska DNA [5]. Velikost jedrnega genoma je 111 Mbp in vsebuje 17 kromosomov, po velikosti pa je podoben genomu Arabidopsis thaliana. Plastidna DNA je velika 206 kbp, najmanjša pa je mitohondrijska DNA, ki je velika 15,8 kbp [5].
Alga C. reinhardtii je sposobna tako spolnega kot nespolnega razmnoževanja.
Vegetativne celice se razmnožujejo z mitozo tako, da iz ene materinske celice nastanejo štiri hčerinske celice. Pri vegetativnih celicah je prisotna haploidnost. Spolno razmnoževanje se pojavlja le v primeru stresnih pogojev tako, da se srečata dva paritvena tipa, ki tvorita diploidno celico – zigosporo [3]. Neugodne razmere lahko induciramo tudi v laboratoriju ob odsotnosti dušika ali z osvetlitvijo z modro svetlobo. Po prenehanju
2
neugodnih razmer pride do kalitve zigospore, pri čemer se sprostijo štiri haploidne celice po poteku mejoze [3][6]. Sposobnost razmnoževanja v temi pri aerobnih pogojih je posebnost C. reinhardtii, ker je prilagojen, da lahko kot vir energije uporablja tudi acetat prisoten v gojišču [10].
1.2.1. Zgradba alge Chlamydomonas reinhardtii
Osnovni organeli, ki sestavljajo C. reinhardtii so jedro, endoplazmatski retikulum, mitohondriji, Golgijev aparat in celična stena. Pri C. reinhardtii je prisotna necelulozna celična stena, ki jo sestavljajo glikoproteini, bogati s hidroksiprolini in glicini [11].
Dodatni organeli v celicah C. reinhardtii so kloroplasti in pari bičkov, ki jim omogočajo preživetje v vodnih okoljih in opravljanje fotosinteze [4][6].
Kloroplast je organel, obdan z dvema membranama, ki zapolnjuje velik del volumna celice. V notranjosti kloroplastov najdemo fotosintetska barvila klorofil a in b, karotenoide, plastoglobule, energetske rezerve škroba in pirenoide [3]. Pirenoidi so celične strukture, v katerih je shranjen encim rubisko. Rubisko katalizira reakcijo nastanka sladkorjev iz CO2. Poleg teh v notranjosti kloroplastov najdemo še celično strukturo imenovan oko (angl. eyespot), ki vsebuje dva fotoreceptorja, sorodna bakterijskemu rodopsinu. Oko celici omogoča premikanje na področja svetlobe z ustrezno valovno dolžino za aktivacijo fotoreceptorskih centrov. Ta pojav imenujemo fototaksija [3][5][6]. Celice C. reinhardtii se odzivajo tudi na druge dejavnike, ki vplivajo na njihovo rast in razmnoževanje. Negativna gravitaksija C. reinhardtii omogoča gibanje navzgor v temi in v kislem okolju, kemotaksija pa premikanje C. reinhardtii v okolje bogato z dušikom [3].
Gibanje pri C. reinhardtii je omogočeno preko sistema dveh bičkov, ki sta anteriorno razporejena po vzorcu mikrotubula 9+2 [3]. Bička sodelujeta tako pri razmnoževanju, kot pa tudi pri odgovoru na abiotski ali biotski stres. V stresnih pogojih celice C. reinhardtii bičke izgubijo. Predvidevajo, da razgradnja bičkov zmanjša površino celice, skozi katero lahko vstopajo toksične snovi [3].
Poleg vseh naštetih organelov, C. reinhardtii vsebuje še kontraktilne vakuole, ki so prisotne v sprednjem delu celice. Naloga kontraktilnih vakuol je uravnavanje koncentracije znotrajcelične vode v hipoosmotskih pogojih [1][3][6].
1.2. Regulirana celična smrt
Regulirana celična smrt (angl. regulated cell death, RCD) je z geni uravnavan proces, s katerim se odstranjujejo neželene ali pa poškodovane celice tekom življenja živali in rastlin [12]. Ta proces je ključen za obnavljanje tkiva in embrionalni razvoj pri rastlinah ter pravilen razvoj in delovanje imunskega sistema pri živalih [13][14][15].
Apoptoza, nekroza in avtofagija so glavni trije tipi celične smrti, ki jih poznamo pri živalskih celicah [16]. Najbolj raziskana med njimi je apoptoza.
Apoptozo definiramo kot energijsko odvisen proces, v katerega je vključena kondenzacija kromatina, zmanjšanje celičnega volumna ter aktivacija proteaz, ki aktivirajo nukleaze,
3
ki privedejo do pojava fragmentacije DNA. V procesu apopotoze se tvorijo organeli imenovani apoptostka telesca. Apoptotska telesca so organeli, ki s svojimi membranami obdajajo poškodovane dele celic. Celice imunskega sistema, ki so sposobne fagocitoze, jih nato požrejo in razgrajujejo v lastnih fagolizosomih [13][14].
Za razliko od apoptoze, ki je reguliran proces, poznamo pri živalskih celicah tudi gensko nereguliran proces celične smrti, imenovan nekroza. Vseeno pa se tudi pri tem procesu aktivirajo določene metabolne poti, ki so ključne za sprožitev nekrotične celične smrti.
Pri nekrozi pride do nabrekanja celic in organelov ter pretrganja celične membrane.
Značilna je tudi naključna razgradnja DNA, kar je za celico smrtno nevarno. Vsi morfološki znaki nekroze so pomembni za aktivacijo vnetnega odziva v organizmu [17][18].
Avtofagija je tretji način celične smrti pri živalski celici. Pri tem se v avtofagosomu razgradijo odvečni ali poškodovani deli celice. Razgradnja poteče po združitvi avtofagosoma in lizosoma, pri čemer nastane avtolizosom. Avtolizosom vsebuje vse potrebne encime za razgradnjo vsebine avtofagosoma do organskih molekul, ki so ponovno uporabne za nastanek proteinov ali drugih kompleksnih molekul [16][17].
1.2.1. Regulirana celična smrt pri rastlinah
Regulirana celična smrt rastlinam omogoča kontrolirano rast in prilagoditev na stresne pogoje. Glavne razlike med rastlinsko in živalsko celično smrtjo je odsotnost proteaz, natančneje kaspaz, pa tudi fagocitov, ki so sposobni razgraditi apoptotska telesca [15][19][20].
Podobno kot pri živalih tudi pri rastlinah poznamo različne tipe regulirane celične smrti.
V primeru vakuolarne celične smrti (angl. vacuolar cell death, VCD) pride do destruktivnega odmiranja rastlinske celice. Glavne stopnje VCD se zgodijo v litičnih vakuolah. To so organeli, ki odstranjujejo in reciklirajo nepotrebne znotrajcelične kompontente. Litične vakuole med drugimi vsebujejo cisteinske proteaze, poimenovane vakuolarni procesivni encimi (VPE). Ti encimi, tako kot kaspaze, cepijo za negativno nabitimi aminokislinskimi ostanki v substratu. Aktivnost VPE je najbolj podobna tisti, ki jo ima kaspaza-1 [15]. Po aktivaciji VPE se razgradi tonoplast, kar povzroči sprostitev hidrolitičnih encimov v citoplazmo. To privede do razgradnje protoplasta in ostalih komponent celice ter posledično tudi do smrti celic. Tekom VCD lahko, poleg zmanjšanja volumna citoplazme, opazimo tudi druge značilne morfološke spremembe celice. Pride do razgradnje ovojnice jedra in lestvičenja DNA, ki je rezultat aktivacije endonukleaz.
Opazimo tudi preureditev citoskeleta [21][22]. Poleg VCD poznamo še dva tipa rastlinske celične smrti, in sicer mešano celično smrt in nekrozo [16].
4
Do mešane celične smrti običajno pride pri biotskem stresu, torej ob okužbi rastline s patogenom. Preobčutljivostni odgovor (angl. hypersensitive response) prepreči nadaljnje širjenje okužbe [23] tako, da se pri tej obliki celične smrti se aktivirajo avirulenčni geni, značilni za določen patotogen [24][25]. Avirulenčni geni imajo determinante, ki jih prepoznajo R-geni rastlin (angl. response genes). Pri tem procesu pride od imunskega odgovora [26] in na mestu okužbe lahko opazimo nastanek litičnih vakuol. Te omogočajo aktivacijo ključnih proteaz pri imunskem odgovoru ter pri tem procesu ne opazimo pa popolne poškodbe protoplasta [24][27].
Nekroza je programirana celična smrt, ki se pri rastlinah aktivira po napadu nekrotičnih patogenov in izpostavljenosti različnim abiotskim stresom (mehanska poškodba, osmotski stres, visoke koncentracije H2O2…) [25]. Za razliko od VCD pri nekrozi ne opazimo nastanka litičnih vakuol. Ta proces je gensko manj regulirani in vodi do povečanja volumna celice in nabrekanja organelov. Pri poškodbi celice se poruši razmerje med nastankom ATP in reaktivnih kisikovih zvrsti, kar je povezano z blokiranjem dihalne verige na mitohondrijski membrani [17][27][28].
1.2.2. Regulirana celična smrt pri algi C. rainhardtii
Tudi pri enocelični zeleni algi C. reinhardtii so bili odkriti procesi podobni regulirani celični smrti pri rastlinah. Ti procesi se običajno aktivirajo, ko je celica izpostavljena stresnim pogojem. Regulirano celično smrt v C. reinhardtii običajno spremljajo podobne morfološke spremembe, kot jih lahko opazimo tudi pri živalski apoptozi. Te vključujejo krčenje celice, povečanje volumna vakuol, morfološke spremembe jedra, izpostavitev fosfatidilserina na zunanjo stran membrane in pojav lestvičenja DNA (angl. DNA laddering). Ena izmed značilnosti je tudi pozitivni test TUNEL (angl. terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labbeling) pri katerem pride do obarvanja jeder na osnovi odkritih fragmentov DNA, ki so posledica sprožitve RCD [29]. Pri izpostavljanju C. reinhardtii različnim stresorjem je opažena povečana kaspazam podobna proteolitična aktivnost [25].
1.3. Proteaze, povezane s RCD
Kljub temu, da mehanizmi, ki regulirajo proces RCD pri C. reinhardtii še niso znani, pa je bilo odkritih nekaj protez, ki bi lahko imele ključno vlogo pri regulaciji celične smrti v tem organizmu.
Mnogim proteazam, ki so bile do sedaj povezane s procesom RCD v različnih organizmih je skupno to, da spadajo v klan CD. To je raznolika skupina cisteinskih proteaz, sestavljena iz sedmih družin in dveh poddružin strukturno sorodnih encimov. V aktivnem mestu je cisteinski ostanek, ki katalizira hidrolizo in cepitev peptidne vezi v tarčno specifičnih substratih. Cisteinske proteaze imajo visoko ohranjeno katalitično diado, ki jo sestavljata histidin in cistein. Značilna je specifična afiniteta do aminokislinskega ostanka
5
P1 v substratu. Različne družine imajo različne afinitete za aminokislinske ostanke na mestu P1 v substratu [30][31].
Značilna je strukturna sorodnost katalitičnega mesta, ki je sestavljeno iz osrednje β- ploskve s šestimi β-trakovi (5 paralelnih β-trakov in 1 antiparalelen β-trak), ki so obdani s konzervativno ohranjenimi α-vijačnicami [30]. Topološko gledano so si kaspaze (družina CD14A), parakaspaze (CD14B) in legumain (CD13) strukturno zelo podobne, medtem kot so na osnovi topologije metakaspaze (družina CD14B) popolnoma drugačne.
Predstavniki družine CD14 so prisotni pri enoceličnih evkariontih (alge, glive, praživali) in višjih rastlinah [30][31].
1.3.1. Kaspaze
Kaspaze so proteaze, ki sodelujejo pri regulirani celični smrti pri živalih [32]. Na osnovi zbirke MEROPS jih uvrščamo v družino CD14 klana CD. Specifično cepijo peptidno vez v substratu za aspartatom na mestu P1 [30]. Kaspaze so proteini, ki se sintetizirajo v neaktivni obliki kot prokaspaze, kar pomeni, da pred njihovo aktivacijo pride do cepitve in konformacijskih sprememb [30].
Prokasapaze imajo na N-koncu prodomeno, ki se po aktivaciji prokaspaz odstrani.
Prodomeni sledi velika katalitična domena velikosti 20 kDa (p20) in regulatorna domena velikosti 10 kDa (p10). Prodomena se avtokatalitično odstrani in omogoči povezovanje domene p20 in p10 v aktvino obliko encima [33][34]. Vsi člani družine CD14 imajo domeno p20, medtem, ko je domena p10 prisotna le pri kaspazah in metakaspazah [31].
Kaspaze delimo na dve skupini, in sicer na inflamatorne in apoptotske kaspaze. Med apoptoskim kaspazami razlikujemo iniciacijske in izvršilne kaspaze. Med iniciacijske kaspaze uvrščamo kaspaze 1, 2, 4, 5, 8, 9, 10, 11 in 12, med izvršilne pa kaspaze 3, 6, in 7 [35].
Inflamatorne in iniciacijske kaspaze imajo N-končno prodomeno veliko približno 100 do 200 aminokislinskih ostankov, medtem ko je pri izvršilnih kaspazah prodomena velika približno 25 aminokislinskih ostankov. Prodomena iniciacijskih kaspaz vsebuje domeno CARD (angl. caspase recruitment domain) in prepoznavne motive DED (angl. death effector domain ali motive efektorske domene smrti). Obe sodelujeta pri aktivaciji prokaspaz. Aktivacija prokaspaz se zgodi po interakciji z adapterskimi proteini na receptorju celične smrti (angl. death receptor) tako, da nastane kompleks DISC (angl.
death-inducing signaling complex). Izvršilne kaspaze se za razliko od iniciacijskih aktivirajo po tvorbi kompleksa Apaf-1 ki ga sestavljajo citokrom c, ATP in prokaspaza.
[30][33][34].
Pri RCD neživalskih organizmov naj bi sodelovale tudi proteaze, ki so za razliko od kaspaz aktivne že kot monomeri. Te proteaze imenujemo metakaspaze [30].
6 1.3.2. Metakaspaze
Pri višjih rastlinah so genetsko regulirani procesi celične smrti nadzorovani z različnimi tipi proteaz. Proteaze, ki naj bi bile vključene v RCD pri rastlinah, so strukturni homologi kaspaz, ki jim pravimo metakaspaze. Poleg višjih rastlin so metakaspaze odkrili tudi pri enoceličnih evkariontih in prokariontih [32].
Metakaspaze predstavljajo največjo poddružino družine CD14 [36][37] in so sestavljene iz ohranjene katalitične domene p20 in regulatorne domene p10. Domena p20 vsebuje ohranjeno katalitično diado, ki jo sestavljata aminokislini cistein in histidin. Poleg katalitične diade so v vezavnem žepu prisotni ohranjeni aspartatni ostanki, ki tvorijo specifičen žep [38]. Poznamo tri tipe metakaspaz. Vse trije tipi so za cepitev odvisni od kalcijevih ionov [32].
Metakaspaze tipa I rastlin imajo N-končno prodomeno, ki je prisotna pri zelenih algah, višjih rastlinah, evbakterijah in sekundarnih endosimbiotih in je bogata s prolinskimi ponovitvami in vsebuje motiv cinkovega prsta [30][37]. Ta je v neaktivni obliki encima vezana v aktivno mesto. Za odcepitev N- končne prodomene so potrebni kalcijevi ioni, ki stimulirajo proteolitično procesiranje metakaspaze [30].
Metakaspaze tipa II od tipa I ločimo po odsotnosti N-končne prodomene. Poleg tega je pri metakaspazah tipa II med domenama p20 in p10 prisotna dolga povezovalna regija [38]. Procesiranje te regije privede do približanja podenot in zank, ki so ključne za nastanek kislega žepa za vezavo substrata in vezavnega mesta za kalcijeve ione [30]. Pri tipu II namreč tudi lahko opazimo značilno zaporedje Asp-Leu-Pro na C-koncu domene p20. Prisotnost tega peptida je predlagan marker za razlikovanje med metakaspazo tipa I in II [39]. Metakaspaze tipa II najdemo samo pri rastlinah in zelenih algah [30][31][37].
Metakaspaze tipa III imajo drugačno razporeditev domen kot tipa I in II. In sicer se domena p10 nahaja na N-koncu, domena p20 pa na C-koncu proteina [34]. Tudi pri tipu III je prisoten N- končni podaljšek, ki se odstrani pri aktivaciji encima. Procesiranje med domenama p10 in p20 ni prisotno. Predvideva se, da so si metaksapaze tipa I in tipa III med seboj sorodne [32].
1.3.3. Legumain
Poleg encimov, ki so strukturni homologi kaspaz, pa so bile s procesom celične smrti pri rastlinah povezane tudi druge cisteinske proteaze. Ena izmed njih je legumain ali vakuolarni procesivni encim (VPE). Spada v družino CD13 klana CD [30].
V celicah se VPE nahaja v vakuoli. Sintetizira se na endoplazmatskem retikulumu kot neaktiven preproprotein. Signalni peptid je sestavljen iz 17 aminokislinskih ostankov, ki se pri vstopu v endoplazemski retikulum odstranijo [40]. V obliki preproproteina je sestavljen iz signalnega peptida, N-končnega propeptida in C-končne avtoinhibitorne
7
domene, ki je zadolžena za stabilizacijo in aktivacijo cimogena. Neaktiven cimogen vstopa v vakuolo ter se aktivira ob kislem pH (< 5,5) [41][42].
Topološko gledano je proteazna domena legumaina ekvivalentna proteazni domeni kaspaz in parakaspaz. Sestavljena je iz šestih β-ploskev in pet α-vijačnic. Ugotovili so, da je struktura vezavnega žepa in aktivnega mesta podobna kot pri kaspazi-1 [43]. Prav tako kot kaspaza-1 tudi VPE substrat cepi za aspartatnim aminokislinskim ostankom na mestu P1. Zato ga imenujejo tudi aspartat-specifična cisteinska proteaza [30].
Pokazano je bilo, da je VPE je ortologen z živalskimi asparaginilendopeptidazami (AEP).
AEP aktivirajo katepsine v lizosomu, ki sprožijo proteolitične kaskadne reakcije – podobno kot VPE pri rastlinah [42].
Pokazano je bilo, da tudi genom C. reinhardtii nosi zapis za vakuolarni procesivni encim (VPE) [44], katerega naloga še ni točno določena. Opazili so, da med procesom celične smrti opazimo povečano proteolitično aktivnost podobno kaspazi-1, zato na osnovi tega predvidevajo, da je encim VPE vpleten v regulacijo celične smrti [9][15][21].
1.3.4. Parakaspaze
Parakaspaze uvrščamo v družino CD14B, in so podobno kot metakaspaze strukturni homologi kaspaz. Najdemo jih le pri živalih in glivah sluzavkah [37]. Parakaspaze se podobno kot kaspaze aktivirajo z dimerizacijo, prav tako pa njihova aktivnost ni odvisna od prisotnosti kalcijevih ionov [30][36]. Specifično cepijo peptidno vez v substratu za bazičnim aminokislinskim ostankom (Arg) na mestu P1. Parakaspaze so sestavljene iz N- končne domene smrti (angl. death domain), imunoglobulinom podobnih domen (Ig1, Ig2, Ig3), domene p20 in približno 100 aminokislinskih ostankov na C-koncu. Opazimo lahko odsotnost domene p10 (slika 1) [30][36].
8
Slika 1: Shematski prikaz struktur kaspaz, parakaspaz in metakaspaz. Katalitične domene p20 so obarvane modro, regulatorne domene p10 s svetlo zeleno, regulatorne od kalcijevih ionov odvisne domene p10 pa s temno zeleno barvo. Ig je imunoglobulinska domena, DD je domena smrti. N je N-končno s prolinom bogato zaporedje. Pripravljeno po [31].
1.4. Regulirana celična smrt kot odziv na stresne pogoje
Alge so pogosto izpostavljene spremembam v okolju, med katerimi lahko določene drastično vplivajo na njihovo rast, razmnoževanje in preživetje [18]. Dejavnike, na katere se odzovejo alge, lahko razdelimo v dve skupini, in sicer so to abiotski (visoka koncentracija soli, anaerobni pogoji, prisotnost težkih kovin, spremembe temperature, UV-svetloba itn.) ali biotski dejavniki (virusna infekcija, alelopatija) [25][45].
Poznamo različne stresorje, ki pod določenimi pogoji pri C. reinhardtii inducirajo regulirano celično smrt. C. reinhardtii je enocelični organizem, ki se prilagaja na spremembe v okolju in se kot ena celica odziva na različne stresne pogoje [6][25].
1.4.1. Solni stres
Solni stres sodi med glavne abiotske stresorje, ki so jim rastline tekom življenja izpostavljene. Med solni stres uvrščamo ionski in osmotski stres, ki se pojavljata kot odgovor rastlinskih celic na visoke koncentracije soli. Rastline, ki niso prilagojene na zasoljeno okolje, lahko odmrejo ali pa se jim zmanjša učinkovitost fotosinteze, poruši ionsko ravnovesje in zmanjša dostopnost vode celicam [25].
Glavni odziv na solni stres predstavljata povečana koncentracija Ca2+-ionov in nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS, angl. reactive oxygen species). To omogoča regulacijo izražanja genov, potrebnih za odziv na stres. Posredno pa rastlini pomagajo pri prilagajanju na stresne pogoje v okolju. Največkrat pri rastlinskem odgovoru na osmotski
9
stres zasledimo uravnavanje znotrajceličnih ionov, predvsem natrijevih in kalijevih ionov, preko Na+/K+-črpalke [25][46].
Izpostavljenost C. reinhardtii slanemu okolju privede do nekrotične celične smrti, ki jo zasledimo na osnovi sprememb v morfologiji celic. Do nekrotične celične smrti pride zaradi povečanja koncentracije ionov oziroma ionske jakosti, ne pa zaradi osmolarnosti [25]. V približno enako slanem okolju (pri 100 mM NaCl) kot v slanih prsteh opazimo pri algah nastanek skupkov ali palmeloidnih kolonij [46].
1.4.2. Abiotski stres z vodikovim peroksidom
Izpostavljenost vodikovemu peroksidu povzroči nastanek znotrajceličnih reaktivnih kisikovih zvrsti in spremembe v redoks potencialu, kar privede do oksidativnega stresa.
Med reaktivne kisikove zvrsti uvrščamo H2O2, •OH in O2-, ki nastanejo v mitohondrijih, peroksisomih in kloroplastih kot stranski produkti metabolizma, predvsem fotosintetske elektronske verige. V celicah, v katerih sprožimo oksidativni stres, lahko opazimo povečano koncentracijo antioksidantnih encimov (superoksid dismutaza, katalaza, askorbat peroksidaza), peptidov in proteinov (glutation, tioredoksin) kot obrambni mehanizem pri odgovoru na stresne pogoje. Povišane koncentracije ROS uničujejo mitohondrije tako, da jih naluknjajo in posledično s tem pride do depolarizacije membrane, poškodbe DNA in proteinov v mitohondriju [25].
Pri C. reinhardtii visoke koncentracije vodikovega peroksida aktivirajo metabolne poti, ki so vključene v vakuolarno celično smrt. Glavni morfološki znaki, ki so jih opazili, so lestvičenje DNA, spremembe v membranskem potencialu mitohondrijev in povečana proteolitična aktivnost [25]. Povišano metakaspazno aktivnost so opazili, ko so celice C.
reinhardtii izpostavili 2,5 mM in 5mM H2O2 [47].
1.4.3. Izpostavljenost proteaznim inhibitorjem
TLCK (zaviralec tripsinske aktivnosti) in TPCK (zaviralec kimotripsinske aktivnosti) sta proteasomska inhibitorja, ki inducirata nekrotično celično smrt pri C. reinhardtii.
Zaviranje tripsinske oziroma kimotripsinske aktivnosti povzroči nastanek sekundarnih sporočevalcev ROS ter bledenje kulture C. reinhardtii [18].
1.4.4. Izpostavljenost ocetni kislini
Ocetna kislina je prisotna v atmosferi, vodnih ekoloških nišah in anoksičnih okoljih.
Vpliva na kalitev in rast rastlin ter je v odvisnosti od koncentracije v okolju lahko induktor regulirane celične smrti.
Za gojenje C. reinhardtii v laboratoriju uporabljamo gojišče TAP s pH 7,0, katerega sestavni del je ocetna kislina, ki predstavlja vir ogljika v gojišču [6][48]. Uporaba gojišča TAP s pH 5,0 povzroči v celicah C. reinhardtii oksidativni stres, ki posledično privede do VCD. Pri tem se upočasni metabolizem, poviša se znotrajcelična koncentracija H2O2,
10
razgrajujejo se fotosintetska barvila ter pride do fragmentacije DNA [12]. Poleg teh morfoloških sprememb je ugotovljeno, da celice C. reinhardtii, ki so izpostavljene povišani koncentraciji ocetne kisline, v okolje sproščajo hlapne organske snovi (angl.
volatile organic compound, VOC).
Povečana koncentracija VOC v okolici celice je znižala koncentracijo celic v okolju in inducirala sintezo encimov, ki so pomembni pri odgovoru na oksidativni stres. Sklepa se lahko, da alge z izločanjem VOC iz celic, obveščajo ostale v okolju, da se pripravijo na stresne pogoje [12]. Tudi višje rastline pri izpostavljenosti abiotskemu (povišanje temperature, soli) ali biotskemu stresu (napad herbivora ali pa infekcija s patogeno bakterijo) sintetizirajo VOC [12][49].
1.4.5. Indukcija RCD s pomočjo UV-svetlobe
Sončna svetloba je ključna za fiziološke in biokemijske procese zelenih alg. Pomembna je predvsem pri fotosintezi, pigmentaciji, aktivaciji ribuloze-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze, pri nastanku osnovnih hranil ter posledično fiksaciji CO2 [10].
UV-svetloba je močen eksogeni agens, ki povzroči spremembe genomske DNA pri vseh organizmih. Najpomembnejši toksični in mutageni produkti izpostavljenosti UV-svetlobi so ciklobutanski pirimidinski dimeri in (6-4) fotoprodukti. Organizmi so razvili različne obrambne mehanizme pred poškodbami DNA, kot so npr. fotoreaktivacija, izrezovanje nukleotidnih parov (angl. nucleotide excision repair) in rekombinacija baznih parov. Če se fotoprodukti ne odstranijo, to vodi do mutacij ali celične smrti [29].
Pri C. reinhardtii UV-svetloba povzroči nastanek ROS, ki negativno vplivajo na delovanje same celice. Obsevanje celic z UV-svetlobo vpliva na transport elektronov na mitohondrijski membrani in posledično inhibira oksidativno fosforilacijo. V celici se začnejo akumulirati za celico koristne molekule kot so lipidi, večkratno nasičene maščobne kisline, karotenoidi, steroli ter polifenoli in flavonoidi, ki celico ščitijo proti UV-svetlobi. Pri krajših valovnih dolžinah UV-svetloba povzroči hitro posedanje kulture alg [50].
Po obsevanju z UV-svetlobo lahko opazimo tako VCD kot nekrozo. Število celic, ki je podvrženo eni ali drugi obliki celične smrti, je odvisno od intenzitete svetlobe, s katero smo celice obsevali.
Pri nižjih intenzitetah opazimo značilnosti vakuolarne celične smrti. In sicer pride do krčenja celic in povečanja volumna vakuole, lestvičenja DNA, do obarvanja jeder pri testu TUNEL ter prisotnosti fosfatidilserina na zunanji membrani [29]. Višje intenzitete UV-sevanja povzročijo nastanek nekroze, pri kateri pride do nabrekanja celic, razgradnje membrane in sprostitve citoplazme v okolje [29].
Ugotovljeno je bilo, da celice, ki rastejo na gojišču celic, ki so bile prej izpostavljene UV- sevanju, bolje preživijo ponovno obsevanje z UV-svetlobo, kot celice, ki rastejo na
11
svežem gojišču. Iz tega sklepamo, da umirajoče celice v okolje sprostijo snovi, ki preostalim celicam iste vrste omogočajo boljše preživetje v stresnih pogojih [29][51].
Mehanizem odziva celic po izpostavljenosti UV-svetlobi niso še znani, vendar so ugotovili, da se pri tem procesu aktivirajo metabolne poti VCD [29].
12
13
2 NAMEN DELA
Tekom diplomske naloge smo želeli vzpostaviti novo metodo za vzbujanje oksidativnega stresa z UV-svetlobo v enocelični zeleni algi Chlamydomonas reinhardtii. Opazovali smo, kako različno dolgi časovni intervali obsevanja z UV-svetlobo vplivajo na rast, preživetje in morfologijo C. reinhardtii. Zanimalo nas je tudi ali bomo pri celicah, ki so bile izpostavljene UV-svetlobi, zaznali lestvičenje DNA in povišano metakaspazam podobno proteolitično aktivnost.
Pred začetkom dela smo si zastavili sledeče hipoteze:
1. Rast celičnih kultur in preživetje celic ob obsevanju z UV-svetlobo upada z daljšanjem časovnega intervala izpostavljenosti stresorju.
2. Pri celicah, ki so bile UV-svetlobi izpostavljene dlje časa, pride do pojava lestvičenja genomske DNA.
3. Pri celicah, ki so bile izspotavljene UV-svetlobi, pod svetlobnim mikroskopom opazimo povečanje vakuol, kar je znak VCD.
4. Metakaspazam podobna proteolitična aktivnost je pri celicah, ki so bile dlje časa izpostavljene UV-svetlobi, večja v primerjavi s kontrolnimi celicami.
14
15
3 MATERIALI
3.1. Reagenti
3.1.1. Kemikalije
Pri laboratorijskem delu smo uporabljali naslednje reagente, ki so zbrane v tabeli 1.
Tabela 1: Seznam uporabljenih kemikalij.
Kemikalija Proizvajalec Kemikalija Proizvajalec
agar Fluka izoamil alkohol Merck
agaroza Sigma KCl VWR Chemicals
bromfenol modro Sigma-Aldrich K2HPO4 Sigma-Aldrich CaCl2 × 2 H2O Sigma KH2PO4 Fisher Scientific
CHAPS Sigma-Aldrich kloroform Honeywell
CoCl2 × 6 H2O Sigma ksilencianol Merck
Coomasie brilliant blue G-250
Molekula ledocetna kislina Gram-Mol
CuSO4 × 5 H2O Sigma MES Sigma-Aldrich
DTT Thermo Scientific metanol Honeywell
eritrozin Sigma MgSO4 Fluka
etidijev bromid Sigma MnCl2 × 4 H2O Sigma etilni alkohol
99,9%
EPC Na2HPO4 Fisher Scientific
fenol Sigma NaCl Gram-Mol
FeSO4 × 7 H2O Sigma-Aldrich (NH4)6Mo7O24 × 4 H2O
Merck
glicerol Fisher Scientific NH4Cl Fisher Scientific
H3BO3 Sigma ocetna kislina Gram-Mol
H3PO4 Sigma Tris Sigma
HCl Sigma Z-FR-AMC Peptide Institute
HEPES EMD Chemicals ZnSO4 × 7 H2O Sigma-Aldrich
Za imobilizacijo celic smo uporabili jodovo tinkturo (0,25g elemntarnega joda v 100 ml 95% EtOH [48].
3.1.2. Pufri
Pri delu smo uporabljali različne pufre. Njihov namen in sestava sta zbrana v tabeli 2.
16
Tabela 2: Seznam uporabljenih pufrov in njihova sestava.
Pufer Sestava
6 × nanašalni pufer za AGE
10 mM Tris/HCl, 60 mM EDTA, 60% (v/v) glicerol, 0,03
% (w/v) ksilencianol, 0,03 % (w/v) bromfenolmodro, pH 7,6
pufer TAE 40 mM Tris, 20 mM ocetna kislina, 1mM EDTA, pH 8,0 pufer za izolacijo
genomske DNA
50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 20 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1% SDS
pufer PBS za spiranje celic
25 mM Na2HPO4, 100 mM NaCl, pH 7,4
lizirni pufer za resuspendiranje celic
50 mM HEPES, pH 7,5, 20 % glicerol, 0,3 % CHAPS, 1 mM EDTA
reakcijski pufer pH 6,5 za encimski test
20 mM MES, pH 6,5, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 µM Z-FR-AMC
reakcijski pufer pH 8,0 za encimski test
20 mM HEPES, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM CaCl2, 10 µM Z-FR-AMC
pufer TE 10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8,0
3.1.3. Zmesi organskih topil
Prisotnost neželenih proteinov v celičnem lizatu smo odstranili pri postopku izolacije DNA z uporabo dveh različnih zmesi organskih topil: 25:24:1 (v/v/v) fenol/klooroform/izoamil alkohol in 24:1 (v/v) kloroform/izoamil alkohol.
3.1.4. Encimi
Pri izolaciji genomske DNA iz celičnih lizatov smo odstranili prisotne molekule RNA z uporabo RNaze (Roche Diagnostics), ki je bila izolirana iz goveje trebušne slinavke.
RNaza je prečiščena tako, da ne vsebuje DNaz, ki bi razgradile genomsko DNA celic.
3.1.5. Reagentska barvila
Po izpostavljanju UV-svetlobi smo v celicah kvantificirali preživelost celic s testom CAVA. Pri testu CAVA smo uporabljali reagent CAVA , ki vsebuje 0,1 mg/ml raztopine eritrozina v dH2O.
Za določanje celokupne koncentracije proteinov v celičnih lizatih smo uporabljali 5 × Bradfordov reagent. Pripravili smo ga tako, da smo 100 mg Coomassie Brilliant Blue raztopili v 50 ml 95 % etanola. Z magnetnim mešalom smo dobro premešali in dodali 100 ml 85 % ortofosforne kisline in 50 ml dH2O.
3.1.6. Standard velikosti
Po izvedbi agarozne gelske elektroforeze smo določili velikosti fragmentov genomske DNA s pomočjo standarda velikosti GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
17
Standard velikosti vsebuje linearizirane fragmente DNA v velikosti med 250 in 10 000 bp (slika 2).
Slika 2: Standard velikosti pri ločevanju fragmentov DNA, GeneRuler 1 kb DNA Ladder [52].
3.2. Laboratorijska oprema
Tekom laboratorijskega dela smo uporabljali naslednje naprave, ki so zbrane v tabeli 3.
Tabela 3: Seznam uporabljenih naprav.
Naprava Proizvajalec Naprava Proizvajalec
magnetno mešalo FB15045
Fisher Scientific spektrofotometer UV-1600PC
VWR
mikrocentrifugirka PicoFuge
Stratagene stresalnik 222DS Labnet
namizna centrifuga 5425
Eppendorf stresalnik Orbit LS
Labnet
naprava za slikanje gelov MiniBIS Pro
DNR Bio-Imaging Systems
tehtnica PL83-S Mettler Toledo
pH meter Mettler Toledo vibracijski stresalnik Vibromix 10
Tehtnica
spektrofluorometer LS-50B
Luminescence Spectrometer
PerkinElmer UV sijalke HSN 30W ofr G13
Osram
18 spektrofotometer
NanoDrop 2000c
Thermo Scientific napajalnik za AGE Power Pack P25
Biometra
3.3. Gojišča
Celično kulturo C. reinhardtii smo gojili v gojišču TAP. Gojišče TAP smo pripravili po receptu navedenem v tabeli 4. Pripravili smo 3 l gojišča TAP in ga razdelili v alikvote po 400 ml. Alikvote smo pred uporabo avtoklavirali. Pri eksperimentalnem delu smo uporabljali tekoča kot tudi trdna gojišča. Trdna gojišča so služila za ohranjanje sevov.
Tekoče kulture smo pripravili s precepljanjem C. reinhardtii iz plošče v svež medij TAP.
Za titracijo gojišča TAP pri umerjanju na pH 7,0 smo uporabili HCl.
Tabela 4: Sestava gojišča TAP.
Gojišče TAP Količina za 1 l Količina za 3 l
1 M Tris 20 ml 60 ml
ledoocetna kislina 1 ml 3 ml
Hunterjevi elementi v sledovih 1 ml 3 ml
fosfatni pufer II 10 ml 30 ml
raztopina A 10 ml 30 ml
Za pripravo trdnega gojišča TAP smo pred avtoklaviranjem 600 ml gojišča TAP dodali 4,6 g agarja.
Za pripravo 1 l založne raztopine Hunterjevih elementov v sledovih smo uporabili kemikalije navedene v tabeli 5.
Tabela 5: Sestava Hunterjevih elementov v sledovih.
Kemikalija Masa za 1 l
EDTA 50 g
ZnSO4 × 7 H2O 22 g
H3BO3 11.4 g
MnCl2 × 4 H2O 5.06 g
CoCl2 × 6 H2O 1.61 g
CuSO4 × 5 H2O 1.57 g
(NH4)6Mo7O24 × 4 H2O 1.10 g
FeSO4 × 7 H2O 4.99 g
Za pripravo 100 ml fosfatnega pufra smo zatehtali 10.8 g K2HPO4 in 5.6 g KH2PO4 ter do končnega volumna dopolnili z dH2O.
Za pripravo 500 ml založne raztopine A smo uporabili kemikalije navedene v tabeli 6.
19 Tabela 6: Sestava raztopine A.
Kemikalija Masa za 500 ml
NH4Cl 20.0 g
MgSO4 × 7 H2O 5.0 g
CaCl2 × 2 H2O 2.5 g
3.4. Sev
Pri laboratorijskem delu smo uporabljali sev Chlamydomonas reinhardtii CC-4533 cw mt- [Jonikas CMJ030] pridobljen od Princenton University.
20
21
4 METODE
4.1. Gojenje celične kulture C. reinhardtii
Celične kulture C. reinhardtii smo vzdrževali s precepljanjem na trdnem gojišču.
Petrijevke, ki so vsebovale kulture C. reinhardtii, smo zavarovali s parafinskim trakom, da bi preprečili stik celične kulture z okolico in izhlapevanje kultur. Kulture smo inkubirali pod belo lučjo pri sobni temperaturi.
Tekoče kulture C. reinhardtii smo pripravili tako, da smo kolonije C. reinhardtii s trdnega gojišča z ezo sterilno prenesli v 25 ml tekočega gojišča TAP. Erlenmajerice smo vedno zaprli z aluminijastim pokrovom, da bi preprečili stik z okolico. Erlenmajerico smo dali stresat na stresalnik pri sobni temperaturi pod belo svetlobo. Za vsak poskus smo celice C. reinhardtii gojili do ustrezne optične gostote tako, da smo izhodne kulture redčili na osnovi podatkov iz rastne krivulje.
4.2. Obsevanje celic z UV-svetlobo
Za eksperimente, kjer smo celice obsevali z UV-svetlobo (UV-C), smo pripravili po 30 ml tekoče kulture C. reinhardtii, ki smo jo v laminarju aseptično prenesli iz erlenmajeric v čiste, sterilne petrijevke in jih obsevali z UV-svetlobo. Preverjali smo, kako različno dolgi časovni intervali obsevanja z UV-svetlobo vplivajo na celice C. reinhardtii. Časi obsevanja so se med različnimi poskusi razlikovali in so prikazani v tabeli 7.
Po obsevanju z UV-svetlobo smo vzorce iz petrijevk prenesli v nove, sveže erlenmajerice z aluminijastim pokrovom, da bi preprečile stik z okolico in posledično s tem kontaminacijo vzorcev. Erlenmajerice, ki so vsebovale naše obsevane vzorce smo, dali na stresalnik in jih inkubirali pod belo lučjo pri sobni temperaturi.
Tabela 7: Prikaz različnih časovnih izpostavljenosti tekoče kulture UV-svetlobi.
Vzorci obsevani z UV-svetlobo
Prvi eksperiment 0 s 1 s 5 s 10 s 20 s
Drugi eksperiment 0 min 1 min 1,5 min 5 min 10 min 20 min
Tretji eksperiment 0 min 5 min
4.3. Merjenje optične gostote pri valovni dolžini 740 nm
Z merjenjem optične gostote lahko na podlagi umeritvene krivulje ocenimo število celic v preiskovanem vzorcu. Optično gostoto bakterijskih kultur spremljamo pri valovni dolžini 600 nm, vendar ta valovna dolžina za merjenje optične gostote C. reinhardtii ni primerna. C. reinhardtii je namreč fotosintetski mikroorganizem, ki vsebuje zeleno barvilo – klorofil. Absorpcijski vrh klorofila je pri valovni dolžini približno 680 nm, zato optično gostoto C. reinhardtii merimo pri valovni dolžini 740 nm. Tako se izognemo
22
interferenci klorofila. Merjenje OD smo izvajali tako, da smo v plastične kivete, z dolžino optične poti 1 cm, odpipetirali po 1 ml tekoče kulture C. reinhardtii. Vzorec smo tik pred merjenjem dobro premešali s pipeto in nato izmerili A740. Za slepo meritev smo uporabili dH2O.
4.4. Opazovanje celic s svetlobnim mikroskopom
Morfološke spremembe pri C. reinhardtii po obsevanju z UV-svetlobo smo opazovali s svetlobnim mikroskopom pri največji ločljivosti (1000 × povečava). Opazovali smo povečanje volumna vakuol in posledično zmanjšanje volumna citoplazme, kar so glavne značilnosti, ki se pojavijo pri vakuolarni celični smrti. Za mikroskopiranje smo zbirali po 1 ml celičnih kultur, odvzetih tri ure po obsevanju z UV-svetlobo. Celice smo pred mikroskopiranjem skoncentrirali s centrifugiranjem (2 min, 3000 × g), pelet resuspedirali v manjšem volumnu (100 µl) in na objektno steklo prenesli 10 µl tako pripravljenih vzorcev. V primerih, kjer smo želeli celice prešteti, smo 1 ml vzorca dodali 10 µl jodove tinkture, ki celice imobilizira.
4.5. Izolacija genomske DNA in analiza z agarozno gelsko elektroforezo
4.5.1. Izolacija genomske DNA
Tekom dela smo DNA iz različnih vzorcev izolirali dvakrat, vendar je bil postopek izolacije v obeh primerih enak. Po 25 ml celične kulture smo, ob določenih časovnih točkah, prenesli v 50 ml centrifugirke in vzorec centrifugirali 10 min pri 3000 rpm.
Supernatant smo odstranili, pelet pa shranili pri -20 °C.
Shranjene pelete smo tik pred izolacijo DNA resuspendirali v 400 µl pufra za izolacijo genomske DNA, ki vsebuje tudi detegent NaDS. V digestoriju smo v vsak vzorec dodali še 400 µl zmesi organskih topil fenol/kloroform/izoamil alkohol 25:24:1 (v/v). Vzorce smo 1-2 minuti mešali na namiznem vibracijskem mešalu pri najvišji moči. Pri tem se proteini s fenolom oborijo, lipidi pa, zaradi prisotnosti detergenta, raztopijo. Zatem smo vzorce centrifugirali na najvišji vrtilni hitrosti 5 minut. Po centrifugiranju so se v centrifugirkah oblikovale 3 faze. V spodnji (organski) fazi so bili prisotni lipidi in klorofil.
Zato je bila ta faza intenzivno zeleno obarvana. V vmesni fazi so bili prisotni oborjeni proteini z drugimi nečistočami. Ta faza je bila rjavkasto-belo obarvana. V zgornji, vodni fazi sta bili prisotni DNA in RNA. Zgornjo fazo smo previdno odpipetirali v novo, svežo mikrocentrifugirko tako, da vmesne faze nismo prenesli. V vsako mikrocentrifugirko smo znova dodali 400 µl zmesi fenol/kloroform/izoamil alkohola. Ponovno smo vzorce dobro premešali z vibracijskim mešalom in jih centrifugirali 5 min pri največji vrtilni hitrosti.
Po drugem centrifugiranju smo zgornjo (vodno) fazo prenesli v novo mikrocentrifugirko.
Vodni fazi smo dodali 2 µl RNaze brez DNaz in vzorce 30 min stresali pri sobni temperaturi. Po 30-minutni inkubaciji smo mikrocentrifugirke prenesli v digestorij in jim dodali 400 µl zmesi kloroform/izoamil alkohol 24:1 (v/v). Vzorce smo ponovno 1-2 minuti mešali na vibracijskem mešalu, nato pa centrifugirali 5 minut pri največji vrtilni
23
hitrosti. Ta korak smo ponovili dvakrat. Po zadnjem centrifugiranju smo zgornjo (vodno) fazo ponovno prenesli v novo mikrocentrifugirko ter dodali 1 ml 99,9 % etanola. Vzorce smo nato premešali z obračanjem in jih inkubirali 30 minut v zmrzovalniku pri -20 °C, da se je genomska DNA oborila.
Vzorce smo iz zamrzovalnika prenesli v ohlajeno centrifugo in jih 20 min centrifugirali pri 20 000 × g in 4 °C. Po centrifugiranju smo lahko opazili belo usedlino. Pazljivo smo odstanili supernatant, nato pa oborjeno genomsko DNA sprali z dodatkom 1 ml 70 % EtOH. Vzorce smo premešali z večkratnim pipetiranjem raztopine. Pri tem se je genomska DNA odstranila od dna mikrocentrifugirke, ni pa se popolnoma raztopila.
Vzorce smo zatem ponovno 10 min centrifugirali pri 4 °C in 20 000 × g. Supernatant smo še zadnjič previdno odstranili, nato pa smo oborjeno genomsko DNA posušili na zraku.
To smo storili tako, da smo odprte mikrocentrifugirke najmanj 30 min pustili pri sobni temperaturi. Oborjeno DNA smo zatem previdno, s počasnim pipetiranjem, resuspendirali v 50 ul pufra TE.
Koncentracijo genomske DNA v vsakem vzorcu smo določili z napravo NanoDrop (tabela 8). Na osnovi izmerjenih koncentracij DNA smo izračunali volumen raztopine, ki ga potrebujemo za nanos določene količine DNA na agarozno gelsko elektroforezo. Na gel smo nanašali po 4 µg genomske DNA. V odvisnosti od izračunanega volumna vzorca, smo v mešanico dodali še ustrezen volumen dH2O ter 4 µl 6 × nanašalnega pufra (tabela 9).
Tabela 8: Izmerjene koncentracije genomske DNA v vzorcih, ki so bili obsevani z UV-svetlobo. Vzorci so bili odvzeti šest ur po izpostavljenosti UV-svetlobi.
Čas obsevanja vzorcev z UV-svetlobo Koncentracija DNA [µg/ml]
0 min 4852,4
0,5 min 4467,3
1 min 3880,2
5 min 1724,3
10 min 566
20 min 297,7
Tabela 9: Dodane komponente pri prvem eksperimentu za mešanico, nanešeno v žepke agaroznega gela.
Vzorci (UV+/-)
Volumen vzorca [µl]
Volumen dH2O [µl]
Volumen 6 ×
nanašalnega pufra [µl]
Končni volumen [µl]
0 min 0,8 14,2 5 20
0,5 min 0,9 14,1 5 20
1 min 1 14 5 20
5 min 2,3 12,7 5 20
24
10 min 7,1 7,9 5 20
20 min 13,4 1,6 5 20
4.5.2. Izvedba agarozne gelske elektroforeze
Z agarozno gelsko elektroforezo (AGE) lahko molekule DNA ločujemo na osnovi njihove velikosti. Metoda temelji na hitrosti potovanja različno velikih molekul DNA v električnem polju na agaroznem gelu. Pri tem krajše molekule DNA skozi agarozni gel potujejo hitreje kot daljše molekule DNA.
Za pripravo 1 % agaroznega gela smo v erlenmajerico zatehtali 0,9 g agaroze in dodali 90 ml pufra TAE. Agarozo smo raztopili s segrevanjem v mikrovalovni pečici 1,5 – 2,5 minute. Ko se je agaroza raztopila, smo mešanico ohladili pod hladno vodo do temperature približno 60 °C. Zatem smo dodali 4 µl etidijevega bromida iz založne raztopine (koncentracija 1 mg/ml), raztopino dobro premešali in jo vlili v elektroforezno kadičko. Na koncu smo vstavili glavniček, s katerim smo v gelu oblikovali žepke.
Mešanico za gel smo pustili, da se strdi pri sobnih pogojih.
Strjen agarozni gel smo po odstranitvi glavnička prelili s pufrom TAE. V prvi žepek smo nanesli standard velikosti, v ostale žepke pa pripravljene vzorce DNA. Nato smo elektroforezno kadičko prekrili s pokrovom s katodnim in anodnim priključkom. Tako pripravljeno kadičko smo priklopili na vir napetosti. Ločevanje vzorcev je potekalo pri enosmerni napetosti, ki se je razlikovala glede na velikost gela in je znašala približno 10 V/cm gela. Po poteku elektroforeze smo gel prenesli v napravo za slikanje gelov. Naprava vsebuje UV žarnico, ki osvetljuje gel z valovno dolžino 312 nm. Pri tej valovni dolžini opazujemo fluorescenco interkaliranega etidijevega bromida med bazne pare DNA. Na osnovi pridobljene slike lahko na podlagi velikostnega standarda odčitamo velikosti molekul DNA, ki so prisotne v našem vzorcu.
4.6. Test CAVA
Test CAVA je kolorimetrična metoda, s katero lahko določimo delež umrlih celic C.
reinhardtii. Eritrozin ne more prehajati membran celic, razen, če je ta poškodovana, kar pa se zgodi ko celica umre. Zato se, v primeru ko so celice žive, v celoti nahaja v supernatantu, ko celice umrejo pa se ga več veže v celice in zato ga je v supernatantu manj.
Z merjenjem absorbance pri valovni dolžini 526 nm smo določili delež celic, ki niso sposobne absorpcije eritrozina in posledično ugotovili delež preživelosti pri C.
reinhardtii. Bolj poškodovane celice bodo zaradi manjše intaktnosti vezale eritrozin, kar se odraža v nižji vrednosti A526 v primerjavi z vzorcem živih celic.
25
Za določitev preživelosti celic smo 25 ml stresiranih celic prenesli v 50 ml centrifugirke in jih centrifugirali 10 min pri 3000 rpm. Supernatant smo odstranili, pelet pa resuspendirali v 1 ml pufra PBS. Po resuspendiranju smo celice prenesli v 1,5 ml centrifugirko ter jih centrifugirali 2 minuti pri 3000 rpm. S tem korakom smo celice sprali.
Po centrifugiranju smo odstranili supernatant. Pelet smo ponovno resuspendirali v 600 µl pufra PBS. Celicam smo dodali še 400 µl reagenta CAVA in centrifugirke 10 min stresali pri sobni temperaturi. Pripravili smo tudi slepo probo, ki je vsebovala 600 µl pufra PBS in 400 µl reagenta CAVA ter jo dali stresati na stresalnik. Po stresanju smo celice centrifugirali še 2 minuti pri 3000 rpm. Po stresanju smo celice ponovno centrifugirali 2 minuti pri 3000 rpm. Po centrifugiranju smo dobili supernatant, s katerim smo določali preživelost celic v tekoči kulturi C. reinhardtii. Supernatant smo prenesli v novo, svežo, 1,5 ml centrifugirko, pelet pa smo shranili pri -20 °C za kasnejšo izolacijo DNA.
Pri vzorcih, ki so bili dlje časa obsevani z UV-svetlobo, smo opazili svetlejši supernatant.
Že na osnovi tega smo lahko sklepali, da so bile te celice bolj poškodovane.
Supernatantom, ki smo jih dobili po centrifugiranju, smo izmerili absorbanco na spektrofotometru pri valovni dolžini 526 nm. Za merjenje absorbance smo uporabili plastične kivete, ki imajo dolžino optične poti 1 cm. Za nastavitev ničle na spektrofotometru smo uporabili dH2O. Preživelost celic smo podali kot razmerje med absorbanco vzorca in absorbanco slepe probe.
4.7. Encimski test
Proteaze so encimi, ki razgrajujejo proteine na manjše peptide. Z namenom določitve metakaspazam podobne aktivnosti tekom oksidativnega stresa smo kot substrat uporabili Z-FR-AMC, ki razpade po delovanju proteaz na fluorescentno molekulo AMC. Z merjenjem fluorescence smo kvantitativno določili, ali v primeru oksidativnega stresa je proteolitična aktivnost višja, nižja ali enaka netretiranimi celicami.
4.7.1. Priprava topne frakcije celic C. reinhardtii
Topne frakcije smo pripravili tako, da smo 25 ml suspenzije celic odpipetirali v 50 ml centrifugirko. Vzorce smo centrifugirali 3 minute pri 3000 rpm ter pelete shranili pri -20
°C, dokler jih nismo potrebovali za izvedbo encimskega testa.
Vzorcem smo dodali 250 µl lizirnega pufra in jih odtalili med 30 min inkubacijo na ledu.
Celice smo resuspendirali z občasnim vorteksiranjem. Nato smo vzorce prestavili v sveže ohlajene mikrocentrifugirke in jih vorteksirali 10-krat po 10 s. Po vorteksiranju smo vzorce centrifugirali 10 min pri 10 000 rpm pri temperaturi 4 °C. Supernatant smo prelili v novo ohlajeno mikrocentrifugirko. Končno koncentracijo proteinov v vzorcih smo določili z Bradfordovo metodo.
26 4.7.2. Bradfordova metoda
Z Bradfordovo metodo lahko določimo koncentracijo vseh proteinov v kompleksnejših vzorcih, na primer v celičnih lizatih, kjer koncentracije ne moremo določiti z merjenjem absorbance pri 280 nm. Temelji na vezavi barvila Coomassie brilliant blue G250 na protein v kislih pogojih. Po vezavi barvila na protein se absorbcijski maksimum barvila premakne iz 490 na 595 nm. Koncentracijo proteinov v vzorcu lahko izračunamo na podlagi umeritvene krivulje iz absorbance izmerjene pri 595 nm.
Vzorce smo pripravili tako, da smo v mikrocentrifugirke odpipetirali 200 µl 5 × Bradfordovega reagenta, 795 µl dH2O in 5 µl proteinske frakcije vzorcev. Slepo probo smo pripravili tako, da smo odpipetirali 200 µl Bradfordovega reagenta in 800 µl dH2O.
4.7.3. Merjenje proteolitične aktivnosti
Encimski test smo izvedli v Greiner mikrotitrskih ploščah s 96 vdolbinicami. Meritve smo izvajali v triplikatih. Vsak triplikat je vseboval 5 µl topne frakcije lizata in 95 µl reakcijskega pufra, ki je poleg sintetičnega substrata vseboval še reducent DTT in ione Ca2+, potrebne za delovanje proteaze. Proteolitično aktivnost smo spremljali pri pH 6,5 in 8,0. Mikrotitrsko ploščo smo ovili z aluminijsko folijo, jo postavili na stresalnik in inkubirali v temi 1 h pri 25 °C. Fluorescenco smo opazovali s spektrofluorimetrom, ki ima filter za ekscitacijsko valovno dolžino pri 383 nm in emisijsko valovno dolžino pri 455 nm.
27
5 REZULTATI IN RAZPRAVA
V okviru raziskovalnega dela smo želeli vzpostaviti metodo za vzbujanje procesa regulirane celične smrti v C. reinhardtii z obsevanjem z UV-svetlobo. V ta namen smo želeli najprej ugotoviti, kako dolgo moramo celice obsevati z UV-svetlobo, da v njih opazimo želene spremembe. Pri prvem eksperimentu smo si izbrali krajše časovne intervale (0−20 s) obsevanja in spremljali celično rast ter preživetje celic. Krajši časovni intervali izpostavljenosti UV-svetlobi niso privedli do značilne razlike v celični rasti zato smo čase inkubacije pod UV-svetlobo pri drugem poskusu podaljšali. Pri tem poskusu smo poleg sprememb v celični rasti spremljali tudi morfologijo celic s svetlobnim mikroskopom in spremembe na nivoju DNA. V zadnjem eksperimentu smo opazovali celice, ki smo jih z UV-svetlobo obsevali 5 minut. Poleg celične rasti, morfoloških sprememb in nukleazne aktivnosti, smo v celicah preverjali tudi proteolitično aktivnost celic na sintetični substrat Z-FR-AMC. Potek dela je shematsko prikazan na sliki 3.
Slika 3: Shematski prikaz izvajanja poskusov pri opravljanju diplomske naloge.
5.1. Analiza rasti celic po krajših intervalih obsevanja z UV-svetlobo
Optična gostota celic je dober pokazatelj sprememb v populaciji in rasti celične kulture.
Omogoča nam, da na zelo enostaven način, hitro ocenimo gostoto celic prisotnih v kulturi.
28
Rast celične kulture smo zato spremljali z merjenjem optične gostote pri valovni dolžini 740 nm. Izhodni kulturi celic smo zato pred začetkom izvajanja poskusa določili optično gostoto celic, ki je znašala A740 = 0,229, kar ustreza približno 2 × 106 celic. S tem smo se prepričali, da so bile celice v logaritemski fazi rasti. Ker smo želeli celice obsevati ravno toliko, da bi se sprožili mehanizmi, ki jih želimo opazovati, ne pa tako intenzivno, da bi celice ubili na nereguliran način, smo pri načrtovanju prvega poskusa izbrali krajše časovne intervale izpostavljenosti UV-svetlobi. Časovni intervali, ki smo jih izbrali za obsevanje so: 0 s (kontrolni vzorec), 1 s, 5 s, 10 s in 20 s. Pričakovali smo, da bomo opazili upad celične rasti v vzorcih, v katerih smo uspešno sprožili mehanizme regulirane celične smrti, ki jih želimo raziskovati. Pojava upadanja celične rasti nismo opazili (slika 4).
Slika 4: Rast celic v odvisnosti od časa, ki je minil po obsevanju z UV-svetlobo. Na y-osi so podane izmerjene vrednosti absorbance pri 740 nm. Na x-osi so prikazani časovni intervali, pri katerih smo odvzemali vzorce, ki so bili obsevani z UV-svetlobo. S črnimi štirikotniki so prikazane meritve kontrolnega vzorca. Meritve vzorcev, ki so bili različno dolgo obsevani z UV-svetlobo, so predstavljene s štirimi različnimi barvami in oblikami.
Na prvi pogled sicer izgleda, da do počasnejše rasti celic pride pri vseh obsevanih vzorcih, vendar je to predvsem posledica različnih začetnih koncentracij. Kljub temu, da smo pri eksperimentu celice vzorčili iz ene, homogene kulture, se začetne koncentracije razlikujejo zaradi hitrega posedanja celic na dno petrijevk ter napak pri odvzemu vzorcev (slika 5). Predvidevamo, da so razlike na račun posedanja celic v petrijevkah najpomembnejši razlog pri razlikah v merjenju absorbance. Zavedati se je potrebno, da so rezultati odvisni od natančnega pipetiranja in hitrosti mešanja celične kulture pred odvzemanjem vzorcev za merjenje števila gostote celic.
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
0 5 10 15 20 25 30
Absorbanca pri 740 nm
Čas [h]
kontrola 1s 5s 10s 20s
