SAŠA MALEŠIČ EMŠ FARMACIJA

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

SAŠA MALEŠIČ

MAGISTRSKA NALOGA

EMŠ FARMACIJA

Ljubljana, 2021

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

SAŠA MALEŠIČ

VPLIV OLANZAPINA NA KONCENTRACIJO KATALITIČNE AKTIVNOSTI ALP V ŽIVALSKEM MODELU PODGAN Z IZBITIM

GENOM ETBR

OLANZAPINE IMPACT ON CATALYTIC ACTIVITY

CONCENTRATION OF ALP IN ETBR GENE KNOCKED-OUT RAT ANIMAL MODEL

Ljubljana, 2021

Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo, Katedri za klinično biokemijo, pod mentorstvom prof. dr. Janje Marc, mag. farm. in somentorstvom asist. dr. Irene Prodan Žitnik, mag. farm.

IZJAVA

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom prof. dr. Janje Marc, mag. farm. in somentorstvom asist. dr. Irene Prodan Žitnik, mag. farm.

Ljubljana, junij 2021 Saša Malešič

Predsednica komisije: prof. dr. Lucija Peterlin Mašič, mag. farm.

Član komisije: izr. prof. dr. Matej Sova, mag. farm

I

KAZALO

KAZALO ... I KAZALO SLIK ... III KAZALO PREGLEDNIC ... IV POVZETEK ... V ABSTRACT ... VI SEZNAM OKRAJŠAV ... VII

1 UVOD ... 1

1.1 BIOLOŠKE OSNOVE ORTODONTSKEGA PREMIKA ZOB ... 1

1.2 KINAZNA SIGNALNA POT ERK/MAPK ... 3

1.2.1 ERK/MAPK SIGNALNA POT IN KOSTNA PREMENA ... 5

1.3 ENDOTELINSKI SISTEM ... 5

1.3.1 ENDOTELINSKI RECEPTORJI ... 5

1.3.2 ENDOTELINSKI SISTEM IN ORTODONTSKI PREMIK ZOB ... 6

1.3.3 VPLIV ENDOTELINSKEGA RECEPTORJA BETA NA AKTIVACIJO SIGNALNIH POTI ... 6

1.4 OLANZAPIN IN KINAZNE SIGNALNE POTI ... 7

1.4.1 VPLIV OLANZAPINA NA ERK/MAPK SIGNALNO POT ... 8

1.5 ALKALNA FOSFATAZA ... 8

1.5.1 PORAZDELITEV IZOENCIMOV ALKALNE FOSFATAZE PO ORGANIH ... 8

1.5.2 DIAGNOSTIČNI POMEN ... 9

1.5.3 KAZALEC KOSTNE PREMENE ... 9

1.5.4 KATALITIČNA AKTIVNOST ... 10

2 NAMEN DELA... 11

3 MATERIALI IN METODE ... 12

3.1 VZORCI ... 12

3.2 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ENDOTELINA 1 V SERUMU Z METODO ELISA ... 14

3.2.1 METODA ... 14

3.2.2 REAGENTI IN KEMKALIJE... 14

3.2.3 PRIBOR IN APARATURE ... 15

3.2.4 PRIPRAVA REAGENTOV ... 16

II

3.2.5 POSTOPEK ... 17

3.2.6 OBDELAVA PODATKOV ... 18

3.2.7 STATISTIČNA ANALIZA ... 18

3.3 MERJENJE KATALITIČNE AKTIVNOSTI ALKALNE FOSFATAZE V SERUMU Z METODO PO IFCC ... 20

3.3.1 METODA ... 20

3.3.2 REAGENTI IN KEMIKALIJE: ... 21

3.3.3 APARATURE IN OPREMA ... 21

3.3.4 PRIPRAVA REAGENTOV ... 21

3.3.5 POSTOPEK ... 22

3.3.6 OBDELAVA PODATKOV ... 23

3.3.7 STATISTIČNA ANALIZA ... 24

3.3.8 DOLOČITEV MOLARNEGA ABSORPCIJSKEGA KOEFICIENTA 4-NITROFENOLA PRI VALOVNI DOLŽINI 450 NM (PRIREDBA IFCC METODE). ... 25

3.3.9 REAGENTI IN KEMIKALIJE ... 26

3.3.10 APARATURE IN OPREMA ... 26

3.3.11 PRIPRAVA REAGENTOV ... 26

3.3.12 POSTOPEK PRIREDBE IFCC METODE IN MERJENJA VPLIVA HEMOLIZE ... 27

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 29

4.1 USTREZNOST ŽIVALSKEGA MODELA ... 29

4.2 VPLIV OLANZAPINA NA KOSTNO TVORBO ... 32

4.2.1 VPLIV OLANZAPINA V POPULACIJI PODGAN Z IZBITIM GENOM ZA ENDOTELINSKI RECEPTOR BETA. ... 32

4.2.2 VPLIV OLANZAPINA V POPULACIJI PODGAN Z GENOM ZA ENDOTELINSKI RECEPTOR BETA. ... 34

4.2.3 PRIMERJAVA KATALITIČNE AKTIVNOSTI ALKALNE FOSFATAZE MED POPULACIJAMA PODGAN Z IN BREZ GENA ZA ENDOTELINSKI RECEPTOR BETA ... 36

4.2.4 VPLIV OLANZAPINA NA KOSTNO TVORBO V ODVISNOSTI OD ENDOTELINSKEGA RECEPTORJA BETA ... 36

4.3 OCENA VPLIVA HEMOLIZE NA MERITVE ALKALNE FOSFATAZE ... 38

4.3.1 DOLOČITEV MEJNE KONCENTRACIJE HEMOGLOBINA ... 40

4.4 PRIREDBA IFCC METODE ... 42

III

5 SKLEP ... 47

6 LITERATURA ... 48

7 PRILOGE ... 53

7.1 REZULTATI ELISA TESTA IN MERITEV DOLOČANJA KATALITIČNE VREDNOSTI ALKALNE FOSFATAZE ... 53

7.2 REZULTATI DOLOČANJA MOLARNEGA EKSTINCIJSKEGA KOEFICIENTA PRI VALOVNI DOLŽINI 450 NM ... 56

7.3 REZULTATI DOLOČANJA MEJNE KONCENTRACIJE HEMOGLOBINA PRI MERJENJU KATALITIČNE AKTIVNOSTI ALKALNE FOSFATAZE ... 57

7.4 REZULTATI STATISTIČNIH TESTOV ... 59

7.4.1 VPLIV OLANZAPINA V POPULACIJI PODGAN Z IZBITIM GENOM ZA ENDOTELINSKI RECEPTOR BETA. ... 59

7.4.2 VPLIV OLANZAPINA V POPULACIJI PODGAN Z IZBITIM GENOM ZA ENDOTELINSKI RECEPTOR BETA ... 61

7.4.3 VPLIV OLANZAPINA NA KOSTNO TVORBO V ODVISNOSTI OD ETB RECEPTORJA ... 62

KAZALO SLIK

Slika 2 : Mikrotitrska plošča s standardi in vzorci po končani encimski reakciji ... 18

Slika 3 : Grafični prikaz koncentracij endotelina 1 v skupinah podgan z bazalnimi pogoji 30 Slika 4 : Grafični prikaz koncentracij endotelina 1 v skupinah podgan, ki so prejemale olanzapin ... 31

Slika 5 : Grafični prikaz koncentracij endotelina 1 v skupinah, ki so imele nameščeno vzmet (levo) in v skupinah, ki so imele nameščeno vzmet in so prejemale olanzapin (desno) ... 31

Slika 6 : Katalitične aktivnosti alkalne fosfataze v skupinah podgan brez gena ETBR... 33

Slika 7: Katalitične aktivnosti alkalne fosfataze v skupinah podgan z genom ETBR ... 34

Slika 8: Katalitične koncentracije alkalne fosfataze (olanzapin : ETBR) ... 37

Slika 9: Stabilnost absorbanc denaturiranega hemoglobina v AMP pufru. [45] ... 39

Slika 10: Absorpcijski spekter hemoglobina in produkta meritve alkalne fosfataze (4- nitrofenol) [45] ... 40

Slika 11 Grafični prikaz izmerjenih absorbanc pri hemoliziranem vzorcu (BA/71/1Z) pri valovni dolžini λ= 405 nm. ... 45

Slika 12 Grafični prikaz izmerjenih absorbanc pri hemoliziranem vzorcu (BA/71/1Z) pri valovni dolžini λ= 450 nm. ... 46

IV

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Signalne molekule udeležene v ortodonstki premik zob ... 3

Preglednica 2 : Razpored vzorcev glede na trajanje ortodontskega premika zob ... 13

Preglednica 3 : Razpored vzorcev v skupine ... 13

Preglednica 4 : Sestava ELISA paketa [41]... 15

Preglednica 5 : Shema priprave standardov ... 16

Preglednica 6 :Merilne točke pri merjenju alkalne fosfataze ... 23

Preglednica 7 : Shema priprave hemoliziranih vzorcev ... 28

Preglednica 8 : Povprečne koncentracije ET-1 po skupinah in rezultati statističnih testov 29 Preglednica 9 : Katalitična aktivnost alkalne fosfataze v populaciji z in brez gena za endotelinski receptor beta ... 36

Preglednica 10 : Rezultati določanja mejne koncentracije hemoglobina pri valovni dolžini 405 nm ... 41

Preglednica 11: Rezultati določanja mejne koncentracije hemoglobina pri valovni dolžini 450 nm ... 41

Preglednica 12 : Izračunani molarni absorpcijski koeficient 4-nitrofenola ... 43

Preglednica 13 : Katalitična aktivnost alkalne fosfataze v kontrolnih vzorcih ... 44

Preglednica 14 : Vzorci, ki smo jim merili katalitično aktivnost alkalne fosfataze pri valovni dolžini 450 nm ... 45

V

POVZETEK

Dokazano je, da endotelinski sistem preko celičnih signalnih poti aktivira osteoblastogenezo in s tem kostno tvorbo. Namen magistrske naloge je bil ugotoviti, ali ti učinki potekajo preko beta endotelinskega receptorja (ETB) in ali na te učinke vpliva jemanje antipsihotika olanzapina. Raziskava je bila izvedena na živalskem modelu podgan z izbitim genom za endotelinski receptor (gen ETBR). Pri testnih skupinah podgan je bila kostna premena pospešena z aplikacijo superelastične vzmeti (ortodontski premik zob).Vključenih je bilo 98 podgan, razdeljenih v skupine glede na prisotnost gena ETBR, prejemanje olanzapina in nameščenost ortodontske vzmeti (aktivni premik zob). V serumih podgan smo merili koncentracijo katalitične aktivnosti alkalne fosfataze (ALP), ki je biokemijski označevalec kostne tvorbe. Uporabili smo referenčno kinetično IFCC merilno metodo, katere uporabnost je zelo omejena v primeru prisotne hemolize v vzorcih seruma. S spremembo valovne dolžine, pri kateri se meri absorbanca nastalega produkta, smo uspeli izmeriti katalitično koncentracijo tudi v hemoliziranih vzorcih. Ustreznost živalskega modela smo preverili z merjenjem serumske koncentracije endotelina-1 (ET-1). Slednjo smo merili z uporabo ELISA testa. Koncentracija ET-1 je bila značilno višja v vseh skupinah podgan, ki so imele izbit gen za receptor ETB (ETBR). S tem smo potrdili, da je ETBR odgovoren za klirens ET- 1 iz krvnega obtoka. Med podganami z izbitim genom ETBR in nativnimi podganami nismo ugotovili značilne razlike v katalitični aktivnosti ALP. Znotraj posamezne populacije podgan pa je bila katalitična aktivnost ALP značilno višja v skupinah, ki so prejemale olanzapin, kot v skupinah, ki olanzapina niso prejemale, ne glede na prisotnost gena ETB R.

Rezultati naloge kažejo, da olanzapin zviša kostno tvorbo pri podganah z nameščeno superelastično vzmetjo (ortodontski premik zob), ter da se vpliv endotelina na kostno tvorbo poveča v odsotnosti endotelinskega receptorja beta.

Ključne besede: kostna tvorba, endotelinski receptor beta, olanzapin, alkalna fosfataza

VI

ABSTRACT

The endothelin peptide family promotes osteoblastogenesis and stimulaties bone formation by activating cellular signalling pathways. The aim of this thesis was to determine whether this process is influenced by the endothelin receptor beta (ETB) and the presence of antipsychotic olanzapine. An ETBR gene knockout rat animal model was used in the research. Bone remodelation was accelerated in the experimental groups by the presence of a super elastic coiled spring (orthodontic tooth movement). The research included 98 rats divided into subgroups depending on the presence of the ETBR gene, administration of olanzapine and the placing of the coiled spring between two of the rats molars. The catalytic activity concentrations of alkaline phosphatase (ALP) were measured in rat serums as a bone formation marker. The IFCC kinetic alkaline phosphatase method was used for measuring ALP. The application of the latter turned out to be very limited in the presence of hemolysis in serum samples. We therefore attempted to diminish the interference of hemoglobine by changing the wavelength used to measure the formation of the reaction product 4- nitrophenol. The suitability of the animal model was verified by measuring endothelin-1 (ET-1) concentrations in rat serums. This was measured using an ELISA test. The concentration of ET-1 was significantly higher all ETBR gene knockout groups when compared to the native groups. This result confimed that the ETB receptor is responsible for the majority of ET-1 clearance from the blood stream. There was no significant difference in the ALP catalytic activity between the native and mutant rat populations. However, within populations, the catalytic activity concentration of ALP was significantly higher in groups (ETBR knockout and native) in which olanzapine was administrated, compared to those where it was not, regardless of the presence of the ETBR gene. The results show that olanzapine increases the rate of bone formation in rats that are undergoing active orthodontic tooth movement. It also amplifies bone formation in the absence of ETBR.

Key words: bone formation, endothelin receptor B, olanzapine, alkaline phosphatase

VII

SEZNAM OKRAJŠAV

ALP - alkalna fosfataza

AMP - 2-amino-2-metil-1-propanol AST - aspartat transferaza

BMK - velika mitogensko aktivirana proteinska kinaza BSA - goveji serumski albumin

Cox2 – ciklooksigenaza 2

EDTA - etilen diamin tetraocetna kislina EGF – epidermalni rastni faktor

ELISA - enzyme linked immunosorbent assay /encimsko-imunski test ERK – ekstracelularno regulirana kinaza

ET-1 - endotelin 1 ET-2 - endotelin 2 ET-3 - endotelin 3

ETA - endotelinski receptor alfa ETB - endotelinski receptor beta

HBOC - hemoglobinski kisikovi prenašalci

IFCC –Mednarodna zveza klinične kemije (International Federation of Clinical Chemistry) IL - interlevkin

IU - International Unit / mednarodna enota JNK - C-Jun amino-terminalna kinaza

KOBWT - oznaka podgan z genom za endotelinski receptor beta

VIII

KOETB - oznaka podgan brez gena za endotelinski receptor beta m-CSF - makrofagne kolonije stimulirajoči faktor

MAPK - z mitogenom aktivirana proteinska kinaza MEK - MAP-kinaza kinaza, ki aktivira ERK

MMP - matriksna metaloproteaza NO - dušikov oksid

NOS - sintaza dušikovega oksida OPG - oteoprotegerin

OPZ - ortodontski premik zob PDL - periodontalni ligament PGE2 - prostaglandin E2

p38 - z mitogenom aktivirana proteinska kinazna signalna pot p3 Raf - Raf kinaza (hitro pospešeni fibrosarkom)

RANK - receptor za aktivacijo jedrnega dejavnika-κB

RANKL - ligand za receptor za aktivacijo jedrnega dejavnika-κB

SEM - standard error of the mean /standardna napaka povprečne vrednosti SI - International System of Units/ mednarodni sistem enot

TIMP – zaviralec metaloproteaz TMB - 3-3'-5-5'-tetrametilbenzidin TNF – dejavnik tumorske nekroze

TNFR - receptor tumor nekroznega faktorja VEGF - vaskularni endotelijski rastni faktor

1

1 UVOD

1.1 BIOLOŠKE OSNOVE ORTODONTSKEGA PREMIKA ZOB

Ortodontski premik zob (OPZ) je posledica delovanja ortodontske sile na zobe. Tekom OPZ poteka premena dentalnega in parodontalnega tkiva, kot so dentalna pulpa, periodontalni ligament (PDL), alveolarna kostnina in gingiva [1]. Na področju raziskav kostnega tkiva ga uporabljajo kot model pospešene kostne premene.

Kot pomoč pri opisovanju danega procesa, so raziskovalci definirali dve strani premika zob.

Stran pritiska in stran vleka. Stran pritiska je stran v smeri delovanja sile, oziroma stran v katero premikamo zob. Stran vleka pa je nasprotna stran od strani, v katero se premika zob [2]. Na strani pritiska poteka razgradnja alveolarne kostnine. Na nasprotni strani oziroma strani vleka, pa se formira nova kost. Osteoblasti in osteoklasti, ki tvorijo in resorbirajo kostnino so udeleženi v ta procesa, ki ju s skupnim imenom poimenujemo premena kostnine [3].

Slika 1: Strani pri premiku zob med ortodontskim premikanjem zob [4]

Ortodontski premik zob poteka v več stopnjah. Prva stopnja traja do dva dni po pričetku delovanja sile na zob. V njej poteče hiter premik zoba znotraj PDL. Na strani pritiska pride do kompresijske deformacije ligamentov in sprostitve peridontalnih vlaken, na strani vleka pa so vlakna raztegnjena [2]. Pretok krvi se na strani kompresije (stran pritiska) zmanjša, na strani vleka pa se ohranja oz. poveča. Če se ortodontska sila na zob nadaljuje sprememba v pretoku krvi v nekaj minutah privede do razlik v koncentraciji kisika na strani pritiska in vleka ter posledično kemijskega okolja [4] .Celice v pozobnici začnejo s sproščanjem številnih signalnih molekul kot so rastni dejavniki, presnovki arahidonske kisline in citokini. (npr interlevkin(IL)- 1b) [1]. Na strani pritiska se zaradi vpliva signalnih molekul diferencirajo osteoblasti iz lokalnih prekurzorskih celic. Takoj po aplikaciji sile je v okoliškem tkivu prisotna tudi že

2

majhna količina prekurzorskih celic osteoklastov. Koncentracija teh se poveča v naslednjih 2- 3 dneh z migracijo prekurzorskih celic v PDL, na stran pritiska. Po akumulaciji prekurzorskih celic na strani pritiska nato poteče diferenciacija osteoklastov in njihova polarizacija [3]. Druga stopnja premika traja od 20 do 30 dni po pričetku delovanja sile na zob. Tekom nje se zob skoraj ne premika. V tem času fagocitne celice (makforagi in osteoklasti) odstranjujejo nekrotično tkivo alveolne kostnine, ki nastane zaradi delovanja sile na zob in zmanjšanja pretoka krvi. Sledi tretja t.i. pospeševalna stopnja v kateri se zob premika z naraščajočo hitrostjo in četrta t.i. linearna stopnja, v kateri se zob premika s stalno hitrostjo. V tretji in četrti stopnji, ko poteka večji del premika zob, na strani pritiska osteoklasti razgrajujejo alveolno kostnino, na strani vleka pa zreli osteoblasti tvorijo osteoid, ki sčasoma tvori novo kostnino [2,3,4]. Katabolna premena kostnine oziroma kostna razgradnja je hitrejši proces kot njena tvorba [5]. Razgradnja kostnine na meji s pozobnico je omejujoč dejavnik, ki določa hitrost OPZ [2].

Variabilnost mehansko-biološkega odgovora na ortodontsko silo med posamezniki, je možna posledica razlik v konstituciji peridontalnega ligamenta (PDL), koncentraciji osteoblastnih in osteoklastnih prekurzorskih celic v PDL-ju, genetskih dejavnikov in vzorcu izražanja proteinov [6].

Aplikacija sile na zob aktivira tudi diferenciacijo osteoklastov v kostnem mozgu. Ti nastanejo iz hematopoetskih matičnih celic, natančneje iz prekurzorjev makrofagne linije. Ti osteoklasti razgrajujejo hialinizirano tkivo v zgodnji stopnji OPZ. Neposredno resorpcijo kostnine pa najverjetneje izvajajo osteoklasti, ki se razvijejo iz prekurzorjev v PDL-ju [7].

Pomembne molekule udeležene v diferenciacijo osteoklastov so dejavnik tumorske nekroze (TNF), receptor dejavnika tumorske nekroze (TNFR), osteoprotegerin (OPG), receptor za aktivacijo jedrnega dejavnika-κB (RANK), in RANK ligand (RANKL). [8] RANKL se veže na receptor za aktivacijo jedrnega dejavnika κβ (RANK), ki je prisoten na predhodnikih osteoklastov in sproži njihovo diferenciacijo. Nasprotno deluje osteoprotegerin, OPG, ki ga tvorijo osteoblasti. Ta tekmuje z RANK za vezavo RANKL in tako zavira osteoklastogenezo [9].

Med OPZ se poveča tudi izražanje citokinov. Prisotne so povišane količine dejavnika tumorske nekroze-α (TNFα), interlevkina 1β (IL-1β), interlevkina-6 (IL-6), interlevkina-10 (IL-10) in drugih citokinov v različnih stopnjah OPZ. TNF, IL-1 β in IL-6 so vnetni citokini, ki spodbujajo resorpcijo kostnine tudi tako, da povečajo izražanje RANKL-a (preglednica 1) [2].

3

Preglednica 1: Signalne molekule udeležene v ortodonstki premik zob Stran pritiska Stran vleka

Povišanje Cox2→ PGE2 → RANKL*

m-CSF**

TNFα ***

MMP□

eNOS◦ → NO IL-1β

IL-10→ OPG TGFβ TIMP iNOS→NO

Upad OPG (osteoprotegerin) RANKL

Rezultat ↑osteoklasti

↑razgradnja

↓tvorba

↓osteoklasti

↓razgradnja

↑tvorba

*ligand za receptor za aktivacijo jedrnega dejvnika- κB; ** makrofagne kolonije stimulirajoči faktor; *** tumor nekrozni faktor; □matriksna metaloproteaza; ◦ dušikov oksid sintaza

Števile signalne poti so povezane s pritiskom in vlekom zaradi ortosontske sile. Specifični signalni faktorji so bolj ali manj izraženi glede na smer ortodontske sile. Rezultat izražanja signalnih faktorjev je kostna razgradnja na strani pritiska in kostna tvorba na strani vleka.

1.2 KINAZNA SIGNALNA POT ERK/MAPK

ERK/MAPK sgnalna pot, natančneje Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK je signalna kaskadna pot udeležena v reguliranje številnih temeljnih celičnih procesov, kot so celična proliferacija, preživetje celice, diferenciacija, apoptoza, metabolizem in motiliteta. Je ena izmed prvh opisanih poti, ki kaže, kako zunajcelične molekule kot so rastni faktorji in hormoni generirajo signal, katerega produkt je izražanje genov v celičnem jedru [10].

Z mitogenom aktivirane proteinske kinaze (MAPK) sestavlja družina proteinskih kinaz katerih funkcija in regulacija se je ohranila tekom evolucije vse od enoceličarjev do kompleksnih organizmov, kot je človek [11]. So encimi, ki kovalentno vežejo fosfatno skupino na amnokislinski ostanek serina, treonina ali tirozina specifičnega proteina v celici. Fosforilacija proteinov kontrolira njihovo encimsko aktivnost, interakcije z drugimi encimi in molekulami, lokacijo v celici, nagnjenost k proteazni degradaciji [12].

4

Do danes so opisane 4 podskupine mitogensko aktiviranih proteinskih kinaz (MAPK). Gre za verižne poti celičnega sporočanja pri katerih kinaze s fosforilacijo prenašajo zunajcelične signale v celično jedro. Te podskupine so ERK1/2, JNK, p38 in BMK (ERK5).[12]

Ekstracelularno regulirane kinaze (ERK1/2) so udeležene v nadzoru celične delitve. Zaviralci teh encimov so preučevani kot potencialne protirakave učinkovine. C-Jun amino-terminalne kinaze (JNK) so kritični regulatorji transkripcije. JNK kaskadna pot je udeležena v razvoju številnih nevrodegenerativih bolezni, kot so Alzheimereva bolezen, Parkinsonova bolezen in amiotrofna lateralna skleroza (ALS). Vključena je tudi v patologijo diabetesa, vnetja in večih vrst raka. Njihove zaviralce raziskujejo v kontekstu zdravljenja revmatoidnega artristisa [11].

Proteinske kinaze p38 aktivirajo vnetni citokini in okoliški stres, udelžene so v regulaciji celičnega imunskega odgovora, zorenja celic, regulaciji kontrolnih točk v celičnem ciklu in apopoze [13]. Kaskadna pot p38 je proučevana kot možna terapevtska tarča za zdravljenje vnetij in avtoimunskih bolezni [11,13]. BMK/ERK5 kinazna pot je manj proučena od ostalih.

Povezana je z regulacijo fizioloških procesov v celici, kot so proliferacija, angiogeneza, imunski in stresni odziv. ERK5 pot je povezana z določenimi patologijami raka [13].

ERK1 in ERK2 kinazna signalna pot je pogosto udeležena v regulaciji mejoze, mitoze in postmiotskih funkcij v diferenciirani celici. Prvi korak v aktivaciji ERK/MAPK signalne poti je vezava liganda oziroma mitogena na receptor na površini celične membrane. Med mitogene, ki sprožijo MAPK signalno pot uvrščamo številne molekule od rastnih faktorjev (EGF, PDGF, VEGF), citokinov, virusnih infekcij, ligandov za heterotrimetrični gvaninski nukleotid vezujoč z G proteinom povezan receptor do karcinogenov [11]. Receptor na katerega se vežejo je transmembranski receptor vrste tirozinske kinaze. Vezava mitogena sproži verižni prenos signala preko zaporednih aktivacij 3-5 proteinskih kinaz v notranjosti celice. Med njimi so MAP3K, MAP2K, MAPK, ERK/MAPK. Kaskadna pot se večinoma prične z indukcijo majhnih Gproteinov Ras (majhna GTP-aza).Ti proteini prenesejo signal z aktivacijo Raf kinaz (MAP3K). MAP3K nivo v signalni poti vključi dodatne kinaze, kot so c-Mos, TPL-2, in MEKK1, ki prispevajo k aktivaciji ERK proteinov.[12] Aktivirana Raf kinaza v naslednjem koraku aktivira oz. fosforilira MEK, ta nadaljuje verižni prenos signala s fosforilacijo in aktivacijo ERK1/2 [10].

Končni cilj signalne poti je aktivacija tarčnih transkripcijskih faktorjev, transkripcijskih supresorjev in proteinov za remodelacijo kromatina [13]. Indukcija genov povzroči celično- specifičen odgovor kot je sprememba proliferacije, apoptoze in metabolizma [12].

5

1.2.1 ERK/MAPK SIGNALNA POT IN KOSTNA PREMENA

Rziskave so pokazale, da je MAPK signalna pot udeležena v proliferaciji in diferenciaciji številnih celičnih sistemov med njimi tudi osteoblastov. Predvsem ERK/MAPK pot se je izkazala za ključno ne le za njihovo rast in diferenciacijo ampak tudi adhezijo, prenos, migracijo. Povečano delovanje mitogensko aktiviranih proteinskih kinaz (MAPK) v mezenhimskih celicah poveča obseg osteoblastne diferencacije in inhibira diferenciacijo hondrocitov [14]. Po drugi strani inaktivacija ERK1 in ERK2 v osteohondroprogenitornih celicah zavre diferenciacijo osteoblastov in povzroči ektopično hondrogeno diferenciacijo v področju tvorbe kostnine [5,16]. Inakivacija ERK1 in ERK2 zmanjša ekspresijo Dmp1 (dentinski matriks protein 1) [16]. Posledica inaktivacije ERK1/ERK2 je tudi signifikantno zmanjšanje ekspresije RANKL, kar povzroči upočasntev nastajanja osteoklastov [14].

MAPK signalna pot ima pomembno vlogo v kontroli ekspresije osteoblastno-specifičnih genov. Pomemben substrat za MAPK in mediator MAPK odgovora je jedrski transkripcijski faktor Runx-2. ERK/MAPK signalna pot regulira osteoblastno aktvnost preko aktivacije in fosforilacje Runx-2 [15].

1.3 ENDOTELINSKI SISTEM

Endotelinski sistem sestavlja družina treh peptidov endotelin-1 (ET-1), endotelin-2 (ET-2), endotelin-3 (ET-3) in njihovih receptorjev. So ubikvitarni regulatorji, ki delujejo na parakrin in avtokrin način. Pri sesalcih izkazujejo številne fiziološke funkcije [17].

1.3.1 ENDOTELINSKI RECEPTORJI

Endotelini se vežejo na dva tipa receptorjev: endotelinski receptor alfa (ETA) in endotelinski recepor beta (ETB). Strukturno gre za transmembranske z G-proteinom sklopljene receptorje s sedmimi transmembranskimi domenami [18,19]. Receptor ETA izkazuje visoko afiniteto do ET-1 in ET-2 in se primarno nahaja v mišičnih celicah. Receptor ETB pa izkazuje enako afiniteto do vseh treh družin endotelinov (ET-1, ET-2 in ET-3), nahaja se v endoteliju, epiteliju, na endokrinih in živčnih celicah [18].

Oba podtipa endotelinskih receptorjev ETA in ETB sta pomembna mediatorja pri vazokonstrikciji v gladkomišičnih celicah. Preko vezave endotelinov na receptor ETA, le ta deluje kot močan vazokonstriktor. Nasprotno preko vezave na receptor ETB slednji povzroči vazodilatacijo. Endotelinski sistem, natančneje ET-1, posledično je pomemben dejavnik v razvoju vaskularnih bolezni [17].

6

Receptor ETB je v endotelinskih celicah odgovoren tudi za očistek ET-1 [18]. Pri klirensu ET- 1 sta opisani dve poti: prva poteka z razgradnjo v lizosomih preko receptorja ETB, druga preko katabolizma s pomočjo ekstracelularnega CD10 in endopeptidaze [11,24,21]. Receptor ETB je odgovoren za izločanje ET-1 skozi pljuča v in vivo pogojih.[20] Po intravenozni aplikaciji se ET-1 hitro odstrani iz obtoka in se primarno kopiči v pljučih, ledvicah in jetrih. Distribucija ET-1 v tkiva je inhibirana po aplikaciji antagonistov ETB ne pa pri uporabi antagonistov ETA. Plazemska ET-1 koncentracija je povišana med blokado receptorja ETB in v transgenih podganah brez receptorja ETB [17]. Največjo gostoto receptorjev ETB najdemo v pljučih, saj le te predstavljajo ~50% endotelija celotnega ožilja. Glede na visoko količino krvi v njih, pljuča predstavljajo najbolj učinkovito mesto izločanja ET-1 iz krvnega obtoka. V enkratnem obtoku krvi skozi njih se iz krvi odstrani ~60% ET-1. Izločanje iz krvnega obtoka poteka tudi v jetrih in ledvicah [20].

1.3.2 ENDOTELINSKI SISTEM IN ORTODONTSKI PREMIK ZOB

Endotelinski sistem je vključen v preoblikovanje kosti med OPZ pri podganah, kar kaže, da bi lahko bila oba receptorja ETA in ETB vključena v proces linearne faze OPZ. Oba podtipa receptorjev sta prisotna tudi v celicah osteoblastov in osteoblastom podobnim celicam [3].

ET-1 spodbuja proliferacjo in zavira apoptozo osteoblastov. Poleg tega ET-1 spodbuja diferenciacijo in delovanje osteoblastov in tvorbo zunajceličnega kostnega matriksa [3]. Vpliv ET-1 na resorpcijo kosti je po drugi strani manj pojasnen. Na osteoklaste lahko vpliva direktno ali pa indirektno preko vpliva na osteoklastom sorodne celice (iz osteoklastne celične vrste).

Pri direktnem vplivu so pokazali, da se ET-1 veže na osteoklastni receptor in zavira osteoklastno resorpcijo kosti in celično motiliteto [3,19, 22]. Posredno ET-1 poveča sintezo in izločanje prostaglandinov in s tem od prostaglandinov poogojene kostne resorpcije [3]. Pomen ET-1 pri patologiji oseoblastnih metastaz in določitev osteoblastnih signalnih poti, ki jih sproži ET-1 in vitro, kaže na to, da je lokalna os ET-1 bistvenega pomena za normalen razvoj in preoblikovanje kosti [3,19, 22].

1.3.3 VPLIV ENDOTELINSKEGA RECEPTORJA BETA NA AKTIVACIJO SIGNALNIH POTI

Endotelinski sistem preko vezave ET-1 in ET-3 na endotelinska receptorja ETA in ETB vpliva na številne signalne poti, med njimi z mitogenom aktivirano proteinsko kinazo (MAPK), fosfatidil inozitol 3- kinazo (PI3-K), in proteinsko kinazo B (PKB). Predlagan je bil tudi vpliv endotelinskega sistema na aktivacijo od kalcija in kalmodulina odvisne proteinske kinaze

7

(CaMK), proteinske kinaze C (PKC). ET-1 z vezavo na receptor preko receptorskih in nereceptorskih tirozinskih kinaz aktivira MAPK, PI3-K/PKB signalne poti. Aktivacija kinaznih signalnih poti prenese zunajcelični signal do celičnega jedra, kjer deluje na transkripcjo in izražanje genov. Končni rezultat je vpliv na regulacijo celične hipertrofije, rast, proliferacijo, adhezijo in celično preživetje [23].

Druga študija (Bagnato et.al., 2004) [24] na mišjih melanomskih celicah je pokazala, da je s sprecifično vezavo endotelinov na receptor ETB spodbudujeno delovanje fokalne adhezijske kinaze (FAK) in ekstracelularno reguliane kinaze 1/2 (ERK1/2), ki je del MAPK signalne poti.

V raziskavi je bilo ugotovljeno, da antagonistično delovanje na receptorju ETB s peroralnim nepeptidnim antagonistom A-192621 zmanjša fosforilacijo ERK1/2 in proliferacijo in rast melanomskih celic na živalskem modelu miši. Poleg tega aktivacija receptorja ETB poveča ekspresijo integrinov αvβ3 in α2β1 in matriksnih metaloproteinaz MMP-2 in MMP-9 ter vpliva na delovanje matriksne metaloproteaze 1 (MMP1, membranski tip) in sekrecijo tkivnih zaviralcev MMP-2 [24].

1.4 OLANZAPIN IN KINAZNE SIGNALNE POTI

Olanzapin je atipični antipsihotik, antimanik in stabilizator razpoloženja, ki se uporablja pri zdravljenju shizofrenije in bipolarnih motenj. Veže se na številne receptorje: serotoninske 5-HT2A/2C, 5-HT3, 5-HT6; dopaminske D1, D2, D3, D4, D5, holinergične muskarinske receptorje M1, M5 M3, adrenergična receptorja α2 in β3 in histamski receptor H1 [30].

Pri vezavi na serotoninske, dopaminske in holinergične receptorje olanzapin izkazuje antagonistično delovanje. V in vitro pogojih ima večjo afiniteto do serotoninskih 5-HT2, kot do dopaminskih receptorjev D2 in večjo serotoninsko (5-HT) kot dopaminsko (D) aktivnost v modelih in vivo [25].

Po peroralni aplikaciji se olanzapin dobro absorbira, maksimalno plazemsko koncentracijo dosega v 5 do 8 urah. Delež vezave olanzapina na beljakovine v plazmi je okoli 93%, pri koncentracijah od 7 do 1000 ng/mL. Veže se predvsem na albumin in in α1-kisli glikoprotein.

Presnova olanzapina poteka v jetrih. Je substrat za citokroma CYP1A2 IN CYP2D6, pod vplivom katerih nastajajo fiziološko aktivni N-demetilni in »-hidroksimetilni metaboliti.

Večinski delež farmakološke aktivnost izvira iz nemetaboliziranega olanzapina [25].

8

1.4.1 VPLIV OLANZAPINA NA ERK/MAPK SIGNALNO POT

Olanzapin je mitogen, ki stimulira kinazno signalno pot ERK/MAPK. Tretiranje celične linije PC12 z olanzapinom je vodilo v aktivacijo večih kinaznih signalnih poti: Akt/ proteinnska kinaza B (PKB), zunajcelično regulirana kinaza ERK (ERK1 in ERK2) in z mitogenom aktivirana proteinska kinaza (MAPK) p38. Pri vseh omenjenih signalnih poteh se je pod vplivom olanzapina povečal obseg fosforilacije kinaz [27]. Raziskave so pokazale, da dolgotrajna izpostavljenost olanzapinu poveča obseg fosforilacije z zunajceličnim signalom uravnavane kinaze 1 in 2 (ERK1 in ERK2), v prefrontalnem korteksu podgan [26].

Vezava olanzapina na receptorja 5HT 2A in D2 zavre njuno delovanje in poveča sproščanje dopamina prefrontalnemu delu možganske skorje podgan, preko povečanja vezave na receptor 5-HT1A. Preko tega procesa povezujejo delovanje olanzapina na spodbuditev signalne poti ERK/MAPK [28].

Zdravljenje z antagonisti receptorjev 5-HT2A kot je olanzapin povzroči upad v gostoti 5-HT2A

vezavnih mest, brez spremembe v afiniteti (kD) v frontalnem korteksu podgan in v celičnih kulturah. Antagonisti receptorjev 5-HT2A povzročijo njihovo internalizacijo oz redistribucijo iz plazemske membrane v celično notranjost v in vivo pogojih in v celičnih kulturah.

Internalizacija številnih receptorjev vključujoč serotoninskega 5-HT1A in muskarinskega M1

vodi v aktivacijo transdukcijskih signalnih poti [29].

1.5 ALKALNA FOSFATAZA

Alkalna fosfataza (ALP) je družina membransko vezanih encimov (glikoproteini), ki katalizirajo hidrolizo fosfatnih monoestrov v bazičnem pH-ju. Funkcionalno tako ALP uvrščamo v skupino hidrolaz (Koda: EC 3.1.3.1). Lahko jih razdelimo v več skupin oz.

izoencimov, glede na mesto izražanja. Te tkivno specifične skupine so intestinalna ALP, placentarna ALP, ALP zarodnih celic, jetrna ALP, ledvična ALP, kostna ALP [31].

1.5.1 PORAZDELITEV IZOENCIMOV ALKALNE FOSFATAZE PO ORGANIH

Placentarna ALP je termostabilni izoencim prisoten v visokih koncentracijah v placenti. Nizke koncentracije placentarne ALP lahko detektiramo v normalnem serumu. Intestinalna ALP je delno termostabilni izoencim, prisoten v intestinalnem tkivu. ALP zarodnih celic je termostabilen izoencim prisoten v zarodnih celicah, embrionalnih celicah in neoplastičnem tkivu. Jetrna/ledvična/kostna ALP pa so izoencimi občutljivi na temperaturno spremembo, ki so izraženi v različnih tkivih, v najvišjih koncentracijah pa jih najdemo v jetrih, ledvicah in

9

kosteh. Jetrno ledvično in kostno ALP lahko med seboj razločimo zaradi razlik v elektroforezni mobilnosti in termostabilnosti, kar pa je posledica razlik v posttranslacijskih modifikacijah [31].

1.5.2 DIAGNOSTIČNI POMEN

Aktivnost ALP v serumu je pogosto merjen kazalec v rutinski diagnostiki. Povišane vrednosti serumske ALP korelirajo s prisotnostjo jetrnih, kostnih in drugih bolezni. Pri zdravih posameznikih predstavlja polovico izmerjene aktivnosti serumske ALP kostni izoencim. ALP je fiziološko povišana pri otrocih in nosečnicah. Pri otrocih je povišanje posledica večje koncentracije kostne ALP. Ta je povezana z višjo osteoblastno aktivnostjo pri rasti kosti. Pri nosečnicah pa je vrednost višja na račun placentrane ALP [31].

Visoka katalitična aktivnost ALP je lahko znak obstrukcije žolčnih izvodil, poškodbe hepatocitov, bolezni kosti (Pagetova bolezen, zlomi kosti), bolezni, ki zmanjša koncentracijo kalcija v krvi (hiperparatiroidizem, pomanjkanje vitamina D). ALP je povišana tudi pri nezdravljeni celiakiji [31]. Znižanje katalitične aktivnosti ALP je manj pogosto od povišanja.

Vzrokov za znižanje je več. Med njimi so hipofosfatemija, postmenopavzalne ženske, ki prejemajo hormonsko nadomestno zdravljenje pri osteopotrozi, moški z nedavno operacijo na srcu, huda anemija, uporaba peroralnih kontraceptivov [31].

Referenčne vrednosti:

Pričakovana vrednost ALP je po IFCC metodi (merjeno pri 37 C) : ŽENSKE ( 18-49 let) : 0,55-1,65 µkat/L oz. 33-98 IU/L.

MOŠKI (≥ 20 let) : 0,72- 1,92 µkat/L oz. 43-115 IU/L [32]

1.5.3 KAZALEC KOSTNE PREMENE

Kostna alkalna fosfataza je izoencim vključen v procese mineralizacie kosti in kalcifikacije hrustanca. Encimi ALP sprostijo fosfatne ione iz organskih fosfatnih estrov. Lokalna supersaturacija fosfatnih ionov naj bi povzročila precipitacijo kalcijevih fosfatnih soli [34].

Kostna ALP hidrolizira tudi anorganski pirofosfat (PPi), ki je zaviralec kalcinacije. znižanja znotrajcelične koncentracije PPi promovira kalcinacijo [33].

V veliko višjih koncentracijah kot v kostnem matriksu, se kostna ALP nahaja v peridontalnem ligamentu (PDL) [35]. ALP večinoma nastaja v nevtrofilcih v gingivalni cervikalni tekočini, tvorijo ga tudi druge celice udeležene v kostno modelacijo, kot so fibroblasti, osteoblasti in

10

osteoklasti [34]. Koncentracija katalitične aktivnosti ALP se uveljavljeno uporablja kot kazalec osteoblastne aktivnosti v kostnem tkivu in celičnih kulturah [35].

V klinični študiji, izvedeni na ljudeh (Fahrani et.al., 2015) [34] so izmerili največjo aktivnosti ALP v gingivalni cervikalni tekočini na 14. in 28. dan po pričetku OPZ. Povišanje aktivnosti ALP so potrdili v gingivalni cervikalni tekočini odvzeti na strani pritiska, kot tudi gingivalni cervikalni tekočini odvzeti na strani vleka. Pri primerjavi koncentracije aktivnosti ALP ob 14.

in 28. dnevu na strani pritiska in vleka, pa je bila le ta značilno večja na strani vleka [34]. To je najverjetneje posledica veliko večjega obsega kostne formacije v primerjavi s kostno resorpcijo na strani vleka[1,2,3].

Tudi v drugih študijah so potrdili vzročno korelacijo med remodeliranjem alveolarne kostnine in povečanjem koncentracje aktivnosti ALP. Časovno so maksimum koncentracije aktivnosti ALP določili med 10 dnevom in tremi tedni OPZ [36,37,38]. Razlike v tem, po kakšnem času OPZ-ja je zabeležena maksimalna koncentracija aktivnosti ALP med študijami, so pripisali razlikam v količini sile aplicirane na zob in razlikam v trajanju študij. Vse študije pa so pokazale, da je maksimum aktivnosti ALP med OPZ ne nastopi takoj po apliciranju sile na zob, temveč s časovnim zamikom. Slednje je v skladu s teorijo, ki razlaga časovni potek ortodontskega premika zob. Ta pravi, da aplikaciji sile na zob sledi faza razgradnje alveolne kostnine na strani pritiska (večja osteoklastna aktivnost) in šele po nej faza izgradnje kostnine na strani vleka (večja osteoblastna aktivnost) [12,36].

1.5.4 KATALITIČNA AKTIVNOST

Količino encima oz. katalizatorja v vzorcu lahko izrazimo kot število osnovnih enot, koncentracijo substance, maso in s katalitičnim učinkom oziroma t.i. katalitično aktivnostjo. V večini primerov je zaradi pomanjkanja potrebnih informacij ali zaradi praktičnih razlogov izbrana zadnja možnost [39].

V tem primeru se za določanje encima v vzorcu uporabi primerna katalizirana kemijska reakcija, pod optimiziranimi pogoji. Pri reakciji se uporabi zelo visoka, presežna količina substrata glede na količino encima. S tem je dosežen 0. kinetični red reakcije, kar pomeni konstanto hitrost nastajanja produkta. Ta pa je proporcionalen koncentraciji encima (katalizatorja) v reakcijski zmesi [39].

Enota katalitične aktivnosti

11

Mednarodni sistem enot definira encimsko enoto oz. mednarodno enoto za encimsko aktivnost (U oz. IU) kot količino encima, ki katalizira pretvorbo 1 µmola substrata v produkt v eni minuti pri specifičnih analiznih pogojih (pH, temperatura, koencim, koncentracija substrata itd) [40].

1 IU= 1 µmol min^-1

Katal pa je definiran kot količina encima, ki pretvori en mol substrata v produkt v eni sekundi pri specifičnih analiznih pogojih (pH, temperatura, koencim, koncentracija substrata itd.).

Enota katal je od leta 1999 uradna SI enota encimske aktivnosti [40].

1 kat = 1 mol s^-1

2 NAMEN DELA

Namen magistrske naloge je ovrednotiti vpliv atipičnega antipsohotika olanzapina na preoblikovanje kosti na živalskem modelu podgane z izbitim genom ETBR. Preveriti želimo, ali prisotnost olanzapina, preko spodbujanja celičnih signalnih poti, značilno vpliva na obseg že aktivne kostne remodelacije z ortodontskim premikom zob. Dokazano je, da je v mehanizem kostne remodelacije vključen tudi endotelinski sistem. Na živalskem modelu podgane z izbitim genom bomo ocenili, kako vpliva endotelinski receptor beta (ETBR) na aktivnost osteoblastov ter v nadaljevanju, če te učinke modificira dodajanje olanzapina. V raziskavo bomo vključili podgane z in brez gena za endotelinski receptor beta (gen ETBR). Pri testnih skupinah podgan bo kostna premena pospešena z aplikacijo superelastične vzmeti (ortodontski premik zob).

Kontrolne skupine vzmeti ne bodo imele nameščene. Kot kazalec kostne gradnje bomo merili katalitično aktivnost ALP. Med seboj bomo nato primerjali skupine podgan, ki so ali niso prejemale olanzapin, so ali niso imele prisotnega gena ETBR, so ali niso imele nameščene vzmeti.

Preverili bomo dve hipotezi:

-H1: Olanzapin zviša kostno tvorbo pri podganah z in brez ortodontskega premika zob

Pričakujemo, da bo kazalec kostne tvorbe ALP pri podganah, ki so prejemale olanzapin višja tako pri normalni kot pri pospešeni kostni remodelaciji (pri ortodontskem premiku zob).

-H2: Vpliv olanzapina na kostno tvorbo se ojača v odsotnosti endotelinskega receptorja

12

Pričakujemo, da bo katalitična aktivnost ALP značilno višja pri podganah, ki so prejemale olanzapin in niso imele gena ETBR, v primerjavi s podganami, ki so imele gen ETBR, in so prejemale olanzapin.

Katalitično aktivnost ALP bomo v vzorcih določali z IFCC referenčno metodo merjenja ALP pri 37˚C. Koncentracijo ET-1 pa s komercialno dostopnim ELISA testom ab 133030 Endothelin 1 ELISA Kit, Abcam.

Na meritve katalitične aktivnosti ALP vpliva prisotnost hemoglobina v vzorcih seruma, ki je močno povečana v hemoliziranih vzorcih. Pri teh vzorcih bomo skušali metodo optimizirati in zmeriti ALP tudi v hemoliziranih vzorcih seruma.

Pri tem bomo določali, kakšna je mejna koncentracija hemoglobina v serumu, ki moti uporabljeno meritev ALP-ja. Določili bomo pri kateri koncentraciji Hb začne motiti meritev pri predpisani valovni dolžini, kot tudi pri novi valovni dolžini, ki smo jo priredili, da bi zmanjšali interferenco Hb.

3

MATERIALI IN METODE 3.1 VZORCI

Vzorce za analizo smo prejeli od Medicinske Fakultete v Ljubljani, Katedre za čeljustno in zobno ortopedijo. Vzorci so bili serumi podgan, ki so bile del raziskave o vplivu receptorja ETB na ortodontski premik zob. Poskusne živali so bile razvrščene v osem skupin. Na podlagi teh smo lahko med seboj primerjali podgane z ali brez endotelinskega receptorja ETB; podgane, ki so imele nameščeno superelastično vlečno vzmet s podganami brez vzmeti in podgane, ki so oz. niso prejemale olanzapin (peroralno 2 mg/kg/dan).

Pri skupini podgan brez receptorja ETB, je šlo za tako imenovane Knock-out rats (ETB.KO - /-), oziroma gensko spremenjene podgane brez gena ETBR (oznaka vzorcev: KOETB). Druga skupina pa so bile t.i. Wild tipe rats (ETB-WT +/+) oz. podgane z receptorjem ETB (oznaka vzorcev: KOBWT). Podgane so bile dobavljene v laboratoriju Mashasi Yangisawe, PhD, Howard Hughes Medical Institute (University of Texas southwestern Medical Centre, Dallas, Texas, ZDA) in vzgojene na Medicinski fakulteti, UL.

Posamezne skupine podgan so bile žrtvovane ob različnih časovnih točkah tekom trajanja poskusa. Preglednici 2 in 3 prikazujeta razporeditev vzorcev v skupine.

13

Preglednica 2 : Razpored vzorcev glede na trajanje ortodontskega premika zob

KOBWT KOETB

dan 0

brez vzmeti

N=7

brez vzmeti

N=7 brez olanzapina brez olanzapina

dan 21

brez vzmeti

N=7

brez vzmeti

N=7 z olanzapinom z olanzapinom

dan 35

z vzmetjo

N=11

z vzmetjo

N=12 brez olanzapina brez olanzapina

brez vzmeti

N=7

brez vzmeti

N=5 brez olanzapina brez olanzapina

dan 56

z vzmetjo

N=7

z vzmetjo

N=7 z olanzapinom z olanzapinom

brez vzmeti

N=9

brez vzmeti

N=12 z olanzapinom z olanzapinom

N* : število osebkov v skupini

Preglednica 3 : Razpored vzorcev v skupine

Spremenljivke v skupini

Oznaka vzorcev v skupini

Število

vzorcev Dan OPZ

1

KOBWT brez olanzapina brez vzmeti

82/BA/*Z 7 dan 0 50/BA/*Z 7 dan 35

2

KOBWT z olanzapinom brez vzmeti

73/BA/*Z 7 dan 21 71/BA/*Z 5 dan 56 61/BA/*Z 4 dan 56 3

KOBWT brez olanzapina z vzmetjo

13/ZA/*Z 6 dan 35

70/ZA/*Z 5 dan 35

4

KOBWT z olanzapinom z vzmetjo

72/ZA/*Z 7 dan 56

5

KOETB brez olanzapina brez vzmeti

123/BA/*M 7 dan 0 10/BA/*M 5 dan 35

6

KOETB z olanzapinom brez vzmeti

122/BA/*M 7 dan 21 102/BA/*M 8 dan 56 88/BA/*M 4 dan 56

14 7

KOETB brez olanzapina z vzmetjo

14/ZA/*M 5 dan 35

11/ZA/*M 7 dan 35

8 KOETB z olanzapinom z vzmetjo

105/ZA/*M 7 dan 56

Skupno smo analizirali 98 vzorcev. 48 vzorcev je od KOBWT tipa podgan, 50 vzorcev pa od KOETB tipa podgan. Vsak vzorec, ki smo ga prejeli naj bi imel duplikat – dve epruveti seruma iste podgane. Eno epruveto smo namenili meritvi ALP, drugo pa določanju ET-1. V nekaj primerih vzorec ni imel duplikata. Pri teh smo se odločili, da v odtaljenem vzorcu najprej določimo ALP, nato pa še ET-1. Na Medicinski fakulteti so vzorce hranili zamrznjene pri -20

⁰C, na FFA smo jih nekaj tednov hranili pri temperaturi -80 ⁰C.

3.2 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ENDOTELINA 1 V SERUMU Z METODO ELISA

3.2.1 METODA

Za določanje ET-1 v podganjih serumih smo uporabili komercialno dostopen ELISA test proizvajalca Abcam, ab133030 ENDOTHELIN 1 ELISA Kit.

ELISA test, ki smo ga uporabili, uvrščamo v t.i. sendvič ELISA test. Pri tej obliki je antigen (ET-1) ujet med dvema primarnima protitelesoma. Dno vdolbin mikrotitrske plošče je prevlečeno s primarnim monoklonskim protitelesom, specifičnim za ET-1. Ko v vdolbine dodamo vzorec t.j. podganji serum , nastane kompleks protitelo-ET-1. Nanj po spiranju vežemo drugo primarno protitelo specifično za ET-1. Slednje je konjugirano z encimom hrenova peroksidaza (HRP). Končni kompleks protitelo-ET-1-protitelo ovrednotimo z dodatkom TMB substrata. Nastane obarvan produkt, kateremu izmerimo absorbanco.

3.2.2 REAGENTI IN KEMKALIJE

V Abcam, ab133030 ENDOTHELIN 1 ELISA Kit paketu so bili priloženi reagenti navedeni v preglednici 4:

15 Preglednica 4 : Sestava ELISA paketa [41]

Reagent Količina

Temperatura shranjevanja 1 Mikrotitrska plošča s 96 vdolbinami,

prekrita z mišjm monoklonskim protitelesom za ET-1

96 vdolbin

+4⁰C

2 Reagenčni pufer 17

(Assay Buffer 17) 100 mL +4⁰C

3 Standardna raztopina ET-1 (Stock Standard Solution)

250 µL +4⁰C

4 20% koncentrat pufra za izpiranje (20X Wash Buffer Concentrate)

100 mL +4⁰C

5 Koncentrat ET-1 primarnih protiteles (Endotheln-1 Antibody Concentrate)

100 µL +4⁰C

6 Topilo za ET-1 primarna protitelesa (Antibody Diluent)

10 mL +4⁰C

7 TMB substrat (TMB Substrate) 10 mL +4⁰C

8 STOP raztopina 2 (Stop Solution 2) 10 mL +4⁰C

3.2.3 PRIBOR IN APARATURE

 Spektrofotometrični čitalec mikrotitrskih plošč Safire (Tecan, Mannedorf, Švica)

 Centrifuga

 mikropipete

 Multikanalna pipeta Eppendorf (10-100 µL)

 Plastični nastavki za pipete

 Eppendorf epruvete

 Ročno mešalo Vibromix 114

16 3.2.4 PRIPRAVA REAGENTOV

Pufer za spiranje

100 ml pufra za spiranje (20X Wash Buffer Concentrate, ab133030 Kit) smo razredčili z destilirano vodo v razmerju 1:20. 100 ml pufra v 1900 ml destilirane vode.

Et-1 protitelesa

Raztopino ET-1 protiteles, smo pripravljali svežo, kolikor smo je potrebovali v tistem dnevu.

Koncentrat ET-1 protiteles (Endothelin-1 Antibody Concentrate, ab133030 Kit) smo razredčili po naslednjem ključu: 10 µL koncentrata ET-1 protitelesa v 1 mL topila za protitelo (Antibody Diluent, ab133030 Kit) (redčitev 1:100). Tako pripravljena protitelesa so morala biti porabljena v 8 urah.

Standardne raztopine

Pri vsakem ELISA testu smo pripravili sveže standarde. Uporabili smo standardno raztopino ET-1 (Stock standard solution, koncentracija 1000 pg/ml, ab133030 Kit). Redčili smo jo s priloženim reagenčnim pufrom (Assay Buffer 17, ab133030 Kit).

1. V prvem koraku smo označili 9 mikroepruvet s številkami 1-9.

2. V epruvete 2-9 smo dodali 250 µL reagenčnega pufra.

3. Standard 1 smo pripravili tako, da smo zmešali 50 µL Stock standard solution (1000pg/ml) v 450 µL reagenčnega pufra.

4. Standard 2 so pripravili tako, da smo v epruveto 2 prenesli 250 µL standarda 1.

5. Standard 3 smo pripravili tako, da smo v epruveto 3 prenesli 250 µL standarda 2.

6. Postopek smo ponovili pri epruvetah 4-8. (preglednica 5)

7. Standard 9 je vseboval samo reagenčni pufer (Assay Buffer 17)- slepa kontrola.

Preglednica 5 : Shema priprave standardov Standard

#

Volumen topljenca (µL) Volumen topila (µL)- Assay Buffer 17

Začetna koncentracija ET-1 (pg/mL)

Končna koncentracija ET-1 (pg/mL) 1 50 µL Stock Standard

solution

450 1000 100

17

2 250 µL standard #1 250 100 50

3 250 µL standard #2 250 50 25

4 250 µL standard #3 250 25 12,50

5 250 µL standard #4 250 12.50 6,25

6 250 µL standard #5 250 6,25 3,13

7 250 µL standard #6 250 3,13 1,56

8 250 µL standard #7 250 1,56 0,78

9 / 250 / 0

3.2.5 POSTOPEK

1. Pripravili smo potrebne reagente.

2. Pred pričetkom testa smo vse materiale in reagente ekvilibrirali na sobno temperaturo.

3. Mikrotitrska plošča prevlečena z ET-1 antigenom (ab133030 ET-1 ELISA Kit) je bila pripravljena za takojšno uporabo, brez potrebe po spiranju vdolbinic pred dodatkom reagentov.

4. V prvem koraku smo v vdolbinice mikrotitrske plošče nanesli 100 µL raztopin standardov (standard 1-9) in 100 µL vzorcev (supernatanta seruma). Vse standarde in vzorce smo na mikrotitrsko ploščo nanašali v duplikatih.

5. Mikrotitrsko ploščo smo prekrili in jo pustili inkubirati 1 uro pri sobni temperaturi.

6. Po 1 uri smo mikrotitrsko ploščo izpraznili in jo sprali z dodatkom 400 µL pufra za spiranje v vsako vdolbino. Postopek spiranja smo ponovili še štirikrat (skupno 5 spiranj).

7. Po zadnjem izpiranju smo s ploščico močno udarili ob papirnato brisačo na delovnem pultu, da smo vdolbinice osušili..

8. V vsako vdolbinico smo dodali 100 µL raztopine ET-1 protiteles.

9. Mikrotitrsko ploščo smo prekrili in jo pustili inkubirati 30 minut pri sobni temperaturi.

10. Po 30 minutah smo vdolbinice izpraznili in ponovili korak spiranja.

11. V izprane vdolbinice smo dodali 100 µL raztopine TMB substrata (TMB Substrate, ab133030 ET-1 ELISA Kit ).

18

12. Mikrotitrsko ploščo smo prekrili in inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi.

13. Po 30 minutah smo v vsako vdolbinico dodali raztopino za ustavitev encimske reakcije (Stop Solution, ab133030 ET-1 ELISA Kit) .

14. Absorbance produkta smo izmerili s spektrofotometrom Tecan SAFIRE II v roku 10 minut.

15. Meritve smo opravili pri valovni dolžini 450 nm, z korekcijo med 570 nm in 590 nm.

Slika 2 : Mikrotitrska plošča s standardi in vzorci po končani encimski reakciji .

3.2.6 OBDELAVA PODATKOV

Za obdelavo podatkov (absorbance) smo uporabili računalniški software program Magellan^TM. Program je :

 od izmerjenih absorbanc vzorcev odštel absorbanco slepega vzorca,

 izračunal enačbo standardne krivulje

 s pomočjo standardne krivulje izračunal koncentracije ET-1 v vzorcih (enote: pg/mL)

Kot rezultat smo uporabili povprečno vrednost dveh meritev istega vzorca. (Average single concentration).

3.2.7 STATISTIČNA ANALIZA

Izračunali smo povprečne vrednosti

𝑥̅

19

𝑥̅ =

𝑛 ^[42]

enačba 1 Razpršenost podatkov smo opredelili s standardno napako aritmetične sredine oz. povprečne vrednosti (SEM standard error of the mean). Ta je standardni odklon vzorčne porazdelitve aritmetičnih sredin in meri natančnost vzorčne ocene aritmetične sredine.

Je ocena kako daleč je povprečna vrednost vzorca od populacijske povprečne vrednosti, med tem ko je standardni odklon vzorca ocena koliko posamezne vrednosti v vzorcu razlikujejo od vzorčnega povprečja.

Formula za izračun standardne napake aritmetične sredine

𝑆𝐸𝑀 =

√𝑛

enačba 2 Kjer je:

SD.. standardni odklon n.. število spremenljivk

Da smo se odločili kateri statistični test je najbolj primeren za analizo razlik med posameznimi skupinami smo najprej naredili test normalnosti porazdelitve podatkov. To smo izvedli s Shapiro-Wilk testom. Gre za statistični test, s katerim se preveri predpostavko normalne distribucije v parametričnih testih. Ničelna hipoteza predpostavi, da podatki niso statistično značilno drugačni od normalne distribucije. Kot interval zaupanja smo uporabili standardnih 95%. (α= 0,05)

Če s Shapiro Wilk testom nismo uspeli zavreči ničelne hipoteze (p > 0,05), smo predpostavili normano distribucijo podatkov (podatki niso statistični značilno drugačni od normalne distribucije). V tem primeru smo za analizo razlik med KOETB in KOBWT skupinami uporabili parametrični neodvisni t-test.

V nekaj primerih smo ničelno hipotezo lahko zavrgli (p < 0,05). Predpostavili smo nenormano distribucijo (podatki so statistično značilno drugačni od normalne distribucije). V tem primeru je za analizo razlik potrebno uporabiti neparametrični test. Izbrali smo Man-Whitneyev-U-test.

20

Pri parametričnih in neparametričnh testh smo med seboj primerjali isto odvisno spremenljivko (koncentracija ET-1) v dveh skupinah (KOETB in KOBWT). Tip podgane (KOETB ali KOBWT), prisotnost olanzapina, in vzmeti, smo obravnavali kot neodvisno kategorno spremenljivko, koncentracijo ET-1 pa odvisno kontinuirano spremenljivko.

Ugotavljali smo, ali so razlike med skupinami naključne (velja ničelna hipoteza H0) ali statistično značilne (privzamemo alternativno hipotezo H1).

Hipoteze:

H

: µ

= µ

H

= µ

µ

Pri vseh testih smo uporabili 95% interval zaupanja, kar pomeni, da za potrditev statistično značilne razlike med skupinama oz. zavrnitev H0, iščemo stopnjo značilnosti oz. p vrednost manjšo ali enako 0,05.

p ≤ 0,05 statistično značilna razlika med skupinama p ≥ 0,05 ni razlike med skupinama

Vse statistične teste smo izvedli z uporabo računalniškega programa SPSS (IBM SPSS Statistic Data Editor).

3.3 MERJENJE KATALITIČNE AKTIVNOSTI ALKALNE FOSFATAZE V SERUMU Z METODO PO IFCC

3.3.1 METODA

K metodam določanja encimov prištevamo dvotočkovne metode in kinetične metode.

Dvotočkovne metode so zastarele, manj zanesljive, lahko so celo subjektivne, zato se jih v praksi poslužujemo manj kot kinetičnih metod. Slednje temeljijo na spremljanju spremembe koncentracije substrata ali produkta na časovno enoto. (1 U/L = 0,01666 µkat/L oz. 1 µkat/L = 60 x U/L) [43].

Skupno katalitčno aktikvnost ALP izoencimov v podganjih serumih smo izmerili po referenčni standardizirani metodi odobreni s strani IFCC-International Federation of Clinical Chemistry (Mednarodno združenje za klinično kemijo in laboratorijsko medicino). Gre za kinetični način merjenja aktivnosti encima ALP, pri 37 ⁰C z uporabo AMP (2-amino-2metil-1-propanola) kot akceptorja fosfatne skupine. Metoda je in vitro test za kvantitativno določanje encimov v serumu. Analize se izvajajo na spektrofotometričnem analizatorju, ki omogoča merjenje absorbanc pri fiksni valovni dolžini, s potjo žarka 1 cm, ob definiranih časovnih točkah.

21

ALP izoencimi v bazičnem pH-ju katalizirajo hidrolizo organskih monofosfatnih estrov. Prost fosfatni ion se prenese iz molekule darovalca na molekulo prejemnika. Končni produkt dotične reakcije je alkohol, oz. fenol, z znanim absorpcijskim maksimumom.

Točna reakcija, ki je potekla med reagenti, ki smo jih uporabili:

4-nitrofenolfosfat + AMP → AMP-fosfat + 4-nitrofenol [44]

Pri reagenčnih pH pogojih (pH=10,4) je uporabljeni substrat, 4-nitrofenolfosfat, brezbarvna spojna. Produkt encimske reakcije 4-nitrofenol, pa je intenzivno rumene barve, njegov absorpcijski maksimum je pri valovni dolžini 405 nm [44].

3.3.2 REAGENTI IN KEMIKALIJE:

 REAGENT A: 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP) 0,4 mol/L, cinkov sulfat 1,2 mmol/L, N-hidroksietiletilendiamintriocetna kislina 2,5 mmol/L, magnezijev acetat 2,5 mmol/L, pH=10,4 (ALP Assay Kit, BioSystems Reagents & Instruments)

 REAGENT B: 4-nitrofenilfosfat 60 mmol/L (ALP Assay Kit, BioSystems Reagents &

Instruments )

 Kontrolni vzorec Preci Control Clin Chem Multi 2 (Ref :05117291, Cobas)

 Destilirana voda za izpiranje 3.3.3 APARATURE IN OPREMA

 Mikrocentrifuga

 Čitalec sprektrofotometer za kiveto, termostabilen pri 37⁰C,

 Kiveta (pot žarka1cm)

 Mikropipete

 Nastavki za mikropipete 3.3.4 PRIPRAVA REAGENTOV Delovni reagent

Pred pričetkom merjenja katalitične aktivnosti ALP smo pripravili t.i. delovni reagent. Ta je sestavljen iz reagenta A in reagenta B. Slednja smo zmešali v razmerju 4:1 (80 mL reagenta A + 20 mL reagenta B).

Delovni reagent je sestavljen iz 4-nitrofenilfosfata (donor fosfatne skupine) in 2-amino-2- metil-1-propanola oz. AMP (akceptor fosfatne skupine). pH je s pufrom uravnan na 10,4.

22

Tako pripravljen reagent je stabilen 2 meseca pri temeperaturi 2-8 ⁰C.

Kontrolni vzorec

Kontrolni vzorec Preci Control Clin Chem Multi 2 smo pripravili tako, da smo v stekleničko vzorca (ta je vsebovala liofiliziran humani serum in nekaterimi dodanimi biološkimi analiti znanih koncentracij) dodali 5,0 mL bidestilirane vode. Rekonstituirano raztopino smo 30 minut občasno nežno mešali z obračanjem stekleničke na glavo. Pri tem smo pazili, da z mešanem nismo ustvarjali mehurčkov. Pred uporabo smo kontrolni vzorec termostatirali na delovno temperaturo 37 ⁰C. Rekonstituiran kontrolni vzorec je stabilen 2 meseca pri temperaturi 2-8 ⁰C.

Uporabljen kontrolni vzorec je primeren za kontrolo kakovosti pri številnih laboratorijskih meritvah. Seznam analitov in njihovih točnih koncentracij je naveden v specifikacijskem listu kontrolnega vzorca.

3.3.5 POSTOPEK

 Pred pričetkom meritev smo pripravili delovni reagent in ga termostatirali na delovno temperaturo 37⁰C. Vzorce podganjih serumov smo odtalili.

 Spektrofotometer smo termostatirali na delovno temperaturo 37 ⁰C.

 Odtaljene vzorce smo centrifugirali z mikrocentrifugo (3 min, 3000 obratov). Ta korak smo naredili, ker nekaj vzorcev serumov ni bilo povsem bistrih (prisotne nečistote).

 V kiveto smo reagente pipetirali v naslednjem razmerju:

1. Vzorec (supernatant) 2. Delovni reagent

20 µL 1,0 mL

 Kiveto smo takoj vstavili v spektrofotometer in pričeli z merjenjem absorbanc pri valovni dolžini 405 nm.

 Najprej smo izmerili katalitično aktivnost kontrolnega vzorca, nato smo pomerili še naše vzorce.

 Po vsaki meritvi smo kiveto 3 x sprali z destilirano vodo.

Metoda ima definirane 4 merilne točke

23

Preglednica 6 :Merilne točke pri merjenju alkalne fosfataze Zaporedna meritev Čas poteka reakcije

1. meritev (A0) 0. MINUT 2. meritev (A1) 1. MINUTA 3. meritev (A2) 2. MINUTA 4. meritev (A3) 3. MINUTA

Vsakemu vzorcu smo meritev naredili dvakrat.

3.3.6 OBDELAVA PODATKOV

Po vsaki meritvi smo izračunali razlike med zaporednimi absorbancami ΔA1= A1-A0

ΔA2= A2-A1

ΔA1= A3-A2

In povprečje razlik absorbanc na minuto: ΔA/min

=

3

:

𝑚ⅈ𝑛

x

𝛴 x 𝑙 x 𝑣_𝑠

= U/L

Pri čemer je:

 ΔA/min....povprečje razlik absorbanc na minuto

 𝓔...molarni absorpcijski koeficient 4-nitrofenola pri 405 nm (18450 M^-1 cm^-1)

 l....pot svetlobe skoz kiveto (1 cm)

 Vt...skupni reakcijski volumen (1,02 mL)

 Vs....volumen vzorca (0,02 mL)

 U/L ..mednarodna enota

Rezultate smo podali v enotah µkat/L. Pri izračunih smo zato uporabili pretvorbo med encimsko enoto U/L in enoto µkat/L.

24 1U= 1µmol/min = 1/60 µmol/s

1 µkat = 1µmol/s

1U = 60 x 1 µkat oz. 1 µkat = 1/60 x IU ~ 0,01667 x IU

Za pretvorbo v delovno enoto µkat/L smo zato osnovno enačbo delili s 60.

Δ𝐴

𝑚ⅈ𝑛

x

𝛴 x 𝑙 x 𝑣_𝑠 x 60

= 𝜇𝑘𝑎𝑡/𝐿

enačba 5 Analitična občutljivost

Spodnja meja detekcije ALP je 1.0 U/L = 0,017 µkat /L. Slednja predstavlja najnižjo vrednost ALP različno od nič, ki se jo z uporabljeno metodo še lahko izmeri [44].

Točnost

Točnost merilne metode smo preverjali z uporabo kontrolnih vzorcev PreciControl Clin Chem.

Ti imajo znano katalitično aktivnost. Za posamezno metodo imajo definiran merilni interval oz. dovoljeno mejo odstopanja izmerjene vrednosti od dejanske, da ima meritev zadovoljivo natančnost. V primeru uporabljenega kontrolnega vzorca je katalitična aktivnost ALP 3,67 µkat/L merilni interval pa je 3,01-4.33 µkat/L. Napaka, ki jo kontrolni vzorec dopušča je ̴ 18

%.[47].

Interferenca

V protokolu metode je definirano sledeče:

•Lipidemija (trigliceridi < 10 g/L) in bilirubin (< 20 mg/dL) ne motita meritve.

•Hemoglobin (>2,5 g/L) moti meritev [44].

3.3.7 STATISTIČNA ANALIZA

Skupinam smo določili povprečne vrednosti katalitične aktivnosti ALP in standardno napako povprečne vrednosti (SEM). Enačbe v poglavju 3.2.7.

Ali se rezultati v skupinah porazdeljujejo normalno smo preverili z uporabo Shapiro-Wilk testa.

Tudi tukaj je bil interval zaupanja postavljen pri 95% (α = 0,05)

25

Za ugotavljanje statistično značilnih razlik med skupinama smo uporabili enosmerni ANOVA test. Med seboj smo primerjali isto odvisno spremenljivko (katalitična aktivnost ALP) v štirih skupinah (dve testni in dve kontrolni skupini). Za točno določitev značilnih razlik med posameznimi skupinami smo uporabili Tukeyev post hoc test.

Ugotavljali smo, ali so razlike med skupinami naključne (velja ničelna hipoteza H0) ali statistično značilne (privzamemo alternativno hipotezo H1).

Tako kot v poglavju 3.2.7 smo uporabili 95% interval zaupanja. Za potrditev statistično značilne razlike med skupinama oz. zavrnitev H0, iščemo stopnjo značilnosti oz. p vrednost manjšo ali enako 0,05.

3.3.8 DOLOČITEV MOLARNEGA ABSORPCIJSKEGA KOEFICIENTA 4-NITROFENOLA PRI VALOVNI DOLŽINI 450 NM (PRIREDBA IFCC METODE).

Za določitev molarnega absorpcijskega koeficienta 4-nitrofenola smo uporabili princip Beer- Lambertovega zakona, po katerem sta si koncentracija analita v vzorcu (Canalit) in molarni absorpcijski koeficient analita (𝓔analit ). pri določeni valovni dolžini merjenja, in dolžini poti žarka skozi vzorec, obratno sorazmerna. Pri encimski kinetiki količin ne izražamo v koncentracijah, temveč v katalitičnih aktivnostih. Razmerje z molarnim absorpcijskim koeficientom je enako.

Enačba:Beer-Lambertov zakon [46]

A= C x l x 𝓔 enačba 6 A...absorbanca analita

C... koncentracija analita

l...dolžina poti žarka skozi vzorec (običajno 1 cm) 𝓔...molarni absorpcijski koeficient analita

Enačbo za izračun smo izpeljali iz splošne formule za izračun katalitične aktivnosti ALP, ki je podana v IFCC protokolu. Za izračun 𝓔450nm smo potrebovali podatke o molarnem absorpcijskem koeficientu 4–nitrofenola pri 405nm (𝓔405nm) in spremembah absorpcij 4-nitrofenola s časom pri 405 nm in 450 nm (ΔA/min405nm in ΔA/min450nm).

26 Izpeljava enačbe:

ΔA

mⅈn 405nm x v_t x 10⁶

Σ405 x l x v_s x 60= ΔA

mⅈn 450 nm x v_t x 10⁶

Σ450 x l x v_s x 60

ℰ450𝑛𝑚 =𝛥𝐴/𝑚𝑖𝑛 405𝑛𝑚

𝛥𝐴/𝑚𝑖𝑛 405𝑛𝑚 x ℰ405𝑛𝑚 enačbi 7 in 8

3.3.9 REAGENTI IN KEMIKALIJE

 REAGENT A: 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP) 0,4 mol/L, cinkov sulfat 1,2 mmol/L, N-hidroksietiletilendiamintriocetna kislina 2,5 mmol/L, magnezijev acetat 2,5 mmol/L, pH=10,4 (ALP Assay Kit, BioSystems Reagents & Instruments)

 REAGENT B: 4-nitrofenilfosfat 60 mmol/L (ALP Assay Kit, BioSystems Reagents &

Instruments )

 Kontrolni vzorec Preci Control Clin Chem Multi 2 (Ref: 05117216, Cobas)

 Kontrolni vzorec Preci Control Clin Chem Multi 1 (Ref: 05947626, Cobas)

 Destilirana voda (za izpiranje)

 Sveže odvzeta polna kri z antikoagulantom EDTA (odvzeta v ADRIA LAB d.o.o.

Diagnostični laboratorij Šestova ulica 2,1000 Ljubljana)

 Fiziološka raztopina (0,9 % NaCl)

 Bidestilirana voda (za pripravo hemolizata) 3.3.10 APARATURE IN OPREMA

 Mikrocentrifuga

 Čitalec sprektrofotometer za kiveto, termostabilen pri 37 ⁰C,

 Kiveta (pot žarka1cm)

 Mikropipete

 Nastavki za mikropipete

 Centrifuga

 Vibracijski stresalnik

3.3.11 PRIPRAVA REAGENTOV Delovni reagent

Delovni reagent za meritev ALP smo pripravili po postopku opisanem v poglavju 3.3.4.