UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO ANAMARIJA BALKOVEC MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA Ljubljana, 2022

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

ANAMARIJA BALKOVEC

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA

Ljubljana, 2022

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

ANAMARIJA BALKOVEC

VPLIV PROBIOTIKOV NA POVEČANO PROIZVODNJO PROTITELES PO CEPLJENJU

THE INFLUENCE OF PROBIOTICS ON ENHANCED PRODUCTION OF ANTIBODIES AFTER VACCINATION

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA

Ljubljana, 2022

Magistrsko nalogo sem opravljala na Univerzi v Ljubljani, Fakulteti za farmacijo, Katedri za farmacevtsko biologijo, pod vodstvom mentorja prof. dr. Boruta Štruklja, mag. farm.

ZAHVALA

Hvala prof. dr. Borutu Štruklju, mag. farm. za mentorstvo in strokovno pomoč pri pisanju magistrske naloge.

Hvala mami za vejice, bratu za »the-je« in atiju za pomoč pri uporabi Zotera. Velika zahvala gre družini in prijateljem za vso podporo v času študija. Christian, danke für deine Hilfe und Unterstützung.

IZJAVA

Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom mentorja prof. dr.

Boruta Štruklja, mag. farm.

Anamarija Balkovec

Predsednik komisije: prof. dr. Stanislav Gobec, mag. farm.

Član komisije: izr. prof. dr. Simon Žakelj, mag. farm.

Ljubljana, 2022

VSEBINA

POVZETEK ... i

ABSTRACT ... ii

SEZNAM OKRAJŠAV ... iii

1. UVOD ... 1

1.1 Cepiva ... 1

1.2 Imunski sistem ... 2

1.2.1 Dendritične celice ... 3

1.2.2 Imunoglobulini ... 4

1.3 Probiotiki ... 5

1.3.1 Probiotiki kot adjuvansi v cepivih ... 6

2. NAMEN IN HIPOTEZE ... 7

3. METODE ... 8

3.1 PODATKOVNA BAZA PubMed ... 8

3.2 PODATKOVNA KNJIŽNICA COCHRANE ... 9

3.3 POSTOPEK OVREDNOTENJA DOBLJENIH PODATKOV ... 10

4. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 11

4.1 POZITIVNI VPLIV PROBIOTIKOV NA TVORBO PROTITELES JE ODVISEN OD STAROSTI POSAMEZNIKA ... 14

4.1.1 Otroci, mlajši od enega leta ... 14

4.1.2 Otroci med prvim in osemnajstim letom starosti... 18

4.1.3 Odrasli, mlajši od petinšestdeset let ... 19

4.1.4 Odrasli, starejši od petinšestdeset let ... 23

4.1.5 Vpliv probiotikov je odvisen od starosti... 25

4.2 SPECIFIČNI PROBIOTIČNI SEVI VPLIVAJO NA POVEČAN NASTANEK PROTITELES SKUPINE IgG IN IgA. ... 26

5. SKLEP ... 28

6. LITERATURA ... 29

i

POVZETEK

Cepiva so zelo pomembna v boju proti infekcijskim boleznim. Ker svoj učinek dosežejo z aktivacijo imunskega sistema, je njihova učinkovitost močno odvisna od posameznika.

Predvsem pri starejših ljudeh imajo cepiva slabši učinek, saj funkcija imunskega sistema s starostjo upada. Razlogi za to so različni, najpogosteje se omenja zmanjšano število fagocitnih celic, okvarjeno izražanje receptorjev TLR in molekul poglavitnega tkivnoskladnostnega kompleksa, ter posledično zmanjšana antigen-predstavitvena sposobnost dendritičnih celic.

Znano je, da probiotiki pozitivno vplivajo na zdravje posameznika, nekateri sevi imajo tudi imunološke učinke. Ti so povezani z vplivom probiotikov na delovanje dendritičnih celic, limfocitov T in B, pa tudi na izločanje citokinov. Kot adjuvansi pri cepivih imajo potencial tudi zato, ker njihovo delovanje ni odvisno od mesta aplikacije cepiva.

V okviru magistrske naloge smo pregledali znanstvene članke, ki obravnavajo vpliv probiotikov na odziv po cepljenju. Za iskanje literature smo uporabili podatkovno bazo PubMed in podatkovno knjižnico Cochrane. Osredotočili smo se na klinične študije, ki so na kontrolni in testni skupini primerjale odziv imunskega sistema, natančneje titre nastalih protiteles, pri čemer je testna skupina prejemala probiotik, kontrolna skupina pa placebo.

Preverili smo, ali obstajajo razlike v učinkovitosti probiotikov pri različnih starostnih skupinah, pri čemer smo študije razdelili na tiste, kjer so bili prostovoljci otroci, mlajši od enega leta, otroci, starejši od enega leta, odrasli, stari med osemnajst in petinšestdeset let, in odrasli, starejši od petinšestdeset let. Izkazalo se je, da učinkovitost probiotikov ni enaka pri vseh. Do statistično značilnih razlik je namreč prišlo pri odraslih prostovoljcih, pri otrocih pa ne.

V drugem delu smo preverjali, ali probiotiki povečajo nastajanje imunoglobulinov razredov G in A. Prvi so kazalnik folikularnega odziva v germinalnih centrih, ki je pomemben za nastajanje spominskih limfocitov B in dolgotrajno zaščito. Imunoglobulini A pa so kazalnik odziva sluzničnega imunskega sistema, na katerega adjuvansi, ki jih trenutno uporabljajo v cepivih, nimajo učinka. V delu študij je pri prostovoljcih prišlo do povečanega nastajanja teh dveh razredov imunoglobulinov.

Probiotiki imajo torej velik potencial kot adjuvansi, saj pri odraslih in starejših odraslih povečajo nastajanje protiteles po cepljenju.

Ključne besede: probiotiki, cepljenje, protitelesa

ii

ABSTRACT

Vaccines are important in preventing infectious diseases. Their effect depends on the ability of the vaccinated person’s immune system to develop an immune response. Especially in the elderly the vaccines are not as effective. This is due to the decreasing function of the immune system throughout life. The two main reasons are lower numbers of phagocytic cells, as well as impaired expression of TLR receptors and the cells of the major histocompatibility complex.

It has been known for years that probiotics have a positive effect on people’s health and that some specific strains modulate the immune system. They influence the activity of dendritic cells, lymphocytes T and B, and the secretion of cytokines. Furthermore, their benefits occur, even if they are applied independently of the vaccines.

In the master thesis we reviewed articles on the influence of probiotics on the immune response after vaccination. We used the PubMed database and the Cochrane Library as our sources of clinical studies that compared the responses of the immune system with the emphasis on antibody levels. We focused on the studies that compared test groups, where volunteers received probiotics, and their control groups were given placebo.

The first part of the thesis was focused on the effectiveness of probiotics across all ages;

therefore, we divided the studies according to the age of the volunteers. Our four groups were as follows: infants, children up to eighteen, adults aged eighteen to sixty-five and adults above sixty-five. The results indicated the highest rate of effectiveness among adults and the elderly.

In the second part of the thesis we looked at the ability of probiotics to increase the production of immunoglobulins class G and A. The latter is a sign of the response of the mucosal immune system, which currently used vaccine adjuvants do not activate.

Immunoglobulins of class G are an indicator of the vaccine triggering the follicular response in the germinal centres, which is important for the long-lasting immune response. There has been a significant rise in the production of both immunoglobulin classes in some of the test groups.

The conclusion we draw from our research states, that probiotics have great potential as adjuvants in vaccines, due to their ability to increase antibody production in adults and the elderly, post-vaccination.

Key words: probiotics, vaccination, antibodies

iii

SEZNAM OKRAJŠAV

TLR tollu-podobni ali tolični receptor, angl. Toll-like receptor

MHC poglavitni tkivnoskladnostni kompleks, angl. major histocompatibility complex TCR T-celični receptor

IL interlevkin

Ig imunoglobulin

CFU kolonijske enote, angl. colony forming unit Di-Te-Per davica, tetanus, oslovski kašelj

Hib Haemophilus influenzae tipa B MMR mumps, ošpice, rdečke

GMT geometrična sredina titrov, angl. geometrical mean titer MFI povprečen večkratnik povečanja, angl. mean fold increase

1

1. UVOD

1.1 Cepiva

Cepiva so ena najpomembnejših in najučinkovitejših orodij v boju proti infekcijskim boleznim. Vsako leto preprečijo več kot tri milijone smrti po svetu, z odkrivanjem novih cepiv pa številke še naraščajo.⁽¹⁾ Trenutno obstajajo cepiva za več kot 20 bolezni, med njimi so davica, tetanus, oslovski kašelj, ošpice, rdečke, otroška paraliza, mumps, hepatitis B, sezonska gripa, rumena mrzlica, tuberkuloza, kolera, rotavirusne bolezni.⁽²⁾ Svoj učinek cepiva dosežejo preko aktivacije imunskega sistema, zato je njihova učinkovitost odvisna predvsem od odziva, ki ga sprožijo v cepljenem posamezniku. Problem, s katerim se spopadamo danes, je, da pri nekaterih skupinah ljudi cepiva ne dosegajo tako visoke učinkovitosti kot pri ostalih.

V boju s črevesnimi patogeni, ki vsako leto povzročijo nekaj sto milijonov primerov diareje in približno 800.000 smrti, predvsem v državah v razvoju, se uporabljajo peroralna cepiva.

Ta imajo v primerjavi s parenteralnimi cepivi nekatere prednosti – enostavnejša proizvodnja in aplikacija, poleg tega izzovejo lokalno imunost v prebavnem traktu ter tako učinkovito ščitijo ne le posameznika, temveč nudijo tudi čredno imunost zaradi manjše možnosti prenosa patogena na druge ljudi. Glavna problema sta nižja imunogenost in učinkovitost prav v državah v razvoju.⁽³⁾ Razlogov za to je več, vključujejo podhranjenost, pomanjkanje mikroelementov, črevesno disbiozo, večjo prevalenco tuberkuloze in okužb s HIV, prisotnost številnih protiteles, ki jih otroci dobijo preko posteljice ali z mlekom in večjo izpostavljenost mikroorganizmom v prvih letih življenja, ki povzroči toleranco na antigene v cepivih.^(3,4)

Po drugi strani se zahodne države spopadajo z vedno večjim deležem starejše populacije, ki je bolj dovzetna za resne zaplete pri infekcijskih boleznih, hkrati pa cepljenje pri njih ni tako učinkovito kot pri mlajših. Funkcija imunskega sistema s starostjo namreč upada, pri tem pa se znižata tako količina nastalih protiteles po cepljenju kot dolžina zaščite.⁽⁵⁾

2

S starostjo povezane spremembe v delovanju imunskega sistema imenujemo imunosenescenca. Pri tem gre za poslabšanje nekaterih mehanizmov imunskega sistema.

Zmanjša se število fagocitnih celic ter njihove sposobnosti fagocitiranja. Okvarjeno je izražanje receptorjev TLR (Toll-like receptors) in molekul poglavitnega tkivnoskladnostnega kompleksa, s tem je zmanjšana antigen-predstavitvena sposobnost dendritičnih celic. Zmanjšano je tudi število naivnih celic T, ki imajo veliko sposobnost aktiviranja ob stiku z antigen-predstavitvenimi celicami. Vse to vodi v slabšo učinkovitost cepljenja.⁽⁶⁾

1.2 Imunski sistem

Imunski sistem delimo na prirojenega (nespecifični) in pridobljenega (specifični). Prirojeni imunski sistem prepoznava s patogeni povezane molekulske strukture, ki so skupne več patogenom. Najpomembnejši receptorji so receptorji TLR in dektinski receptorji. To so enopeptidni nekatalitični receptorji, ki jih izražajo obrambne celice. Imunske celice na nivoju prirojene imunosti so naravne celice ubijalke, bazofilci, eozinofilci, mastociti, nevtrofilci, makrofagi in dendritične celice. Zadnje tri sodijo med fagocitirajoče celice, ki izražajo receptorje TLR. Makrofagi in dendritične celice imajo poleg fagocitne tudi vlogo antigen-predstavitvenih celic.^(7–9)

Pridobljeni imunski sistem se gradi tekom našega življenja ob stikih s patogeni. Antigen- predstavitvene celice – makrofagi, monociti, limfociti B in dendritične celice – razgradijo antigensko molekulo in njene dele predstavijo na svoji površini, vezane na molekule poglavitnega tkivnoskladnostnega kompleksa (major histocompatibility complex – MHC).

Gene zanje najdemo na treh kromosomskih regijah. Molekule prvega razreda, ki se izražajo na vseh telesnih jedrnih celicah, predstavljajo (virusne) antigene limfocitom T CD8+

(citotoksičnim ubijalkam). Proteine na makrofagih, dendritičnih celicah, limfocitih B in monocitih, ki predstavljajo antigene limfocitom T CD4+ (pomagalkam), kodira regija drugega razreda. V tretjem razredu najdemo gene za dejavnike tumorske nekroze in topne proteine komplementa.^(7–9)

Pri pridobljenem imunskem sistemu ločimo dva mehanizma: celični in humoralni odziv.

Celični imunski odziv ščiti pred znotrajceličnimi patogeni (rakave ali z virusi okužene celice, znotrajcelične bakterije). Efektorske celice so limfociti T, pri čemer ločimo celice T pomagalke tipa Th1 in Th2, v vnetnih procesih udeležene podtipe limfocitov T: Th17 in Th22, celice T ubijalke (citotoksične celice T), celice T zaviralke (Treg) in spominske celice

3

T. Citotoksične celice T preko T celičnih receptorjev (TCR) prepoznajo antigene vezane na molekule MHC II. razreda, nato pa celice uničijo s sproščanjem perforinov in grancimov.

Celice T pomagalke prav tako preko TCR prepoznavajo antigene, vendar morajo biti ti vezani na molekule MHC II. razreda na antigen-predstavitvenih celicah. Po aktivaciji izločajo citokine, ki uravnavajo imunski odziv. B-celični dejavnik spodbudi diferenciacijo limfocitov B v plazmatke, interlevkin-2 (IL-2) spodbuja proliferacijo celic T, njihovo diferenciacijo in preživetje, kemokini pa privabijo nevtrofilce in makrofage.^(7–9)

Humoralni imunski odziv omogoča zaščito pred zunajceličnimi patogeni in njihovimi toksini. Ko limfocit B naleti na antigen, ki ga prepozna njegov B celični receptor, se celica aktivira. To vključuje endocitozo antigena in tvorbo receptorjev za IL-2 na površini celice.

Če je v okolici dovolj IL-2, pride do proliferacije in dozorevanja limfocitov B v spominske limfocite B in prek njih v plazmatke, ki tvorijo imunoglobuline G (IgG). Tak odziv je ponavadi prisoten pri sekundarni okužbi. Pri od limfocitov T neodvisni aktivaciji se limfociti B aktivirajo preko premreženja B celičnih receptorjev. Nastajajo kratkožive plazmatke, ki izločajo IgM. Hkrati nastajajo tudi spominske celice B.^(7–9)

Na nivoju črevesne sluznice ima prirojeni imunski sistem poleg zaščitne vloge pred patogenimi organizmi tudi vlogo zagotavljanja signalov, ki izzovejo odziv pridobljenega imunskega sistema. Ključno vlogo pri tem igrajo celice M, makrofagi in dendritične celice.⁽¹⁰⁾ Signal, ki vodi do aktivacije celic T, je povezava T receptorja na površini limfocita T in kompleksa antigen-MHC na površini antigen-predstavitvene celice. V primeru že aktiviranih, efektorskih in spominskih celic T, se celice odzovejo že na majhne količine antigena in brez prisotnosti kostimulacijskih signalov. Naivni limfociti T se aktivirajo samo ob stiku z nefiziološkimi količinami antigenov ali pa potrebujejo veliko količino kostimulacijskih signalov.⁽¹¹⁾

1.2.1 Dendritične celice

Dendritične celice so antigen-predstavitvene celice, ki imajo osrednjo vlogo pri imunskem odzivu na lastne in tuje antigene. V primerjavi z drugimi antigen-predstavitvenimi celicami so mnogo bolj učinkovite, saj antigene zaznajo že v piko- in nanomolarnih koncentracijah.

Stik z antigenom povzroči dozorevanje dendritičnih celic, ki lahko nato sprožijo nastanek celic T pomagalk.^(9,12)

Proces dozorevanja uravnava zajemanje antigenov, njihovo razgradnjo na manjše molekule, predstavitev na površini celice, sproščanje citokinov in življenjsko dobo dendritične celice.

Nezrele dendritične celice učinkovito lovijo antigene, medtem ko dozorevanje poveča

4

sintezo MHC molekul razreda I in II, ter izražanje B7.1 in B7.2, ki sta ključna za kostimulacijo celic T. Dozorevanje dendritičnih celic spodbujajo in uravnavajo citokini, produkti mikroorganizmov in celice T. Dendritične celice, ki izhajajo iz monocitov, in mieloidne dendritične celice izražajo TLR, ki prepoznajo bakterijske lipopolisaharide in peptidoglikan. Aktivacija teh receptorjev sproži dozorevanje celice. Podobno lahko dozorevanje sprožita TNF-α ali IL-1, zavre pa IL-10.^(9,11)

V času homeostaze pride v limfno tkivo le nekaj spontano dozorelih dendritičnih celic, ki sicer sprožijo aktivacijo celic T, vendar pa ta vodi le v toleranco, ne v imunski odziv. V prisotnosti patogenov ali adjuvansov je količina dozorelih dendritičnih celic, ki migrirajo v limfatična tkiva, veliko večja. Poleg tega v vneto tkivo migrirajo monociti, ki jih tja privabijo citokini iz dozorelih dendritičnih celic in iz katerih na mestu vnetja nastajajo nove dendritične celice, kar pomeni dodatno zajemanje antigenov. Limfne vozle preplavijo velike količine dendritičnih celic, ki preko izločanja IL-2 močno stimulirajo celice T. Hkrati tudi celice T stimulirajo dendritične celice in povečujejo izločanje IL-12, ki je pomemben za nastanek celic T pomagalk tipa Th1.⁽¹¹⁾

Germinalni center je del sekundarnega limfatičnega folikla, kjer se razmnožujejo limfociti B. V njem najdemo folikularne dendritične celice. Te nimajo sposobnosti fagocitoze, temveč številne citoplazemske izrastke, ki imajo na svoji površini receptorje za lovljenje kompleksov antigen – protitelo. Te komplekse lahko s svojimi receptorji (membranskimi imunoglobulini) vežejo limfociti B, jih pogoltnejo in na molekulah MHC II. razreda predstavijo celicam T pomagalkam. Nekateri limfociti B se takoj diferencirajo v plazmatke, nekateri pa mutirajo gene za imunoglobulinske receptorje. Folikularne dendritične celice s svojimi imunskimi kompleksi nadzorujejo afiniteto novonastalih receptorjev in limfociti B, ki nimajo zadostne afinitete, propadejo.⁽⁹⁾

1.2.2 Imunoglobulini

Protitelesa ali imunoglobulini so glikoproteini, ki jih proizvajajo limfociti B, njihova poglavitna lastnost je zmožnost vezave na antigene. Protitelesa delimo v pet razredov, in sicer imunoglobuline A, D, E, G in M. Imunoglobulini različnih razredov se med seboj razlikujejo po mestu nahajanja in po nalogah, ki jih opravljajo.^(9,13)

Imunoglobulini A se nahajajo tako v krvi (IgA1), kot v izločkih sluznic v prebavnem in urogenitalnem traktu (IgA2) ter slini. Nastajajo v limfatičnem tkivu v sluznici (mucosa associated lymphatic tissue ali MALT), od koder prehajajo v plast sluzi na sluznici in tvorijo

5

imunološko sluznično pregrado, ki onemogoča vstop mikroorganizmov v epitelijske celice.^(9,14)

Imunoglobulini G predstavljajo veliko večino vseh v krvi prisotnih protiteles. Sestavljeni so iz dveh težkih verig in dveh lahkih verig in imajo dve mesti za vezavo antigenov. Njihove naloge so aglutinacija (zlepljanje celičnih elementov po vezavi protitelesa na antigen), opsonizacija (protitelesa označijo antigen na mikroorganizmih, kar vodi do povečanja učinkovitosti fagocitoze) in nevtralizacija antigenov, kar patogenom onemogoči vezavo na receptorje na gostiteljevih celicah. Poleg tega so odgovorni za aktivacijo sistema komplementa in vezavo toksinov.^(9,15)

Imunoglobulini M so prvi imunoglobulini, ki se po okužbi pojavijo v krvi. Gradi jih pet enot, ki so po zgradbi podobne imunoglobulinom G. Podobno kot IgG tudi IgM nevtralizirajo antigene in povzročijo aglutinacijo, nimajo pa opsonizacijske vloge. Poleg v krvi, jih najdemo tudi na membranah limfocitov B, kjer delujejo kot receptorji, ki v primeru močnega antigenskega signala sprožijo od T limfocitov neodvisno aktivacijo limfocitov B.^(9,16) Imunoglobulini D se nahajajo na membranah limfocitov B, kjer tvorijo receptorje. Po stiku takega receptorja z antigenom, se limfocit B diferencira do plazmatke, ki izloča imunoglobuline M. Redko pride do diferenciacije v plazmatko, ki izloča sekretorne imunoglobuline D, take najdemo predvsem v sluznici nosa in limfnem tkivu žrela in grla.⁽¹⁷⁾ Zadnji razred imunoglobulinov so imunoglobulini E. Najdemo jih predvsem na membranah mastocitov, eozinofilnih in bazofilnih granulocitov. Po vezavi antigenov na imunoglobuline E pride do izločanja mediatorjev anafilaktične reakcije. Glavna funkcija imunoglobulinov E je obramba pred paraziti.^(9,18)

1.3 Probiotiki

Pred približno sto leti je ruski znanstvenik Ilja Mečnikov povezal dolgo življenje bolgarskih kmetov z uživanjem jogurta s probiotiki. S tem se je začelo preučevanje njihovih učinkov in izkazalo se je, da so učinkoviti pri motnjah v prebavnem traktu, kot so z antibiotiki povezana diareja, akutna infekcijska diareja in sindrom razdraženega črevesa. Nekatere študije so pokazale tudi učinkovitost pri atopijskem dermatitisu.⁽¹⁹⁾

Probiotiki so po definiciji Svetovne zdravstvene organizacije in Organizacije združenih narodov za prehrano in kmetijstvo živi mikroorganizmi, ki aplicirani v zadostni količini koristijo zdravju gostitelja.⁽²⁰⁾ Najpogosteje se v ta namen uporabljajo bakterije iz rodov

6

Lactobacillus in Bifidobacterium, zadostna količina pa naj bi bila višja od 1x10⁹ kolonijskih enot živih bakterij (CFU).⁽²¹⁾

Učinek na zdravje lahko probiotiki dosežejo na različne načine. Najbolj razširjeni so sinteza kratkoverižnih maščobnih kislin, kolonizacijska odpornost, regulacija časa črevesnega prehoda, kompetitivno izključevanje patogenov in povečano obnavljanje enterocitov v epiteliju. Manj pogosti mehanizmi, značilni samo za posamezne vrste, so encimska aktivnost, utrditev epitelijske pregrade, sinteza vitaminov, metabolizem žolčnih kislin in encimska aktivnost. Nekateri sevi imajo imunološke, nevrološke ali endokrine učinke. ⁽²²⁾ Bakterije v prebavnem traktu, najsi bodo patogene ali koristne, interagirajo z gastrointestinalnim limfnim sistemom preko receptorjev na specializiranih celicah M ali dendritičnih celicah. Kljub interakciji s celicami črevesne pregrade pa funkcija le-te ostaja neokrnjena, zaradi česar so probiotiki varni za uporabo.^(1,23)

Citokini, ki nastajajo v imunskih celicah črevesnega epitelija, so IL-10, IL-6 in IL-2.

Probiotiki, ki spodbudijo izločanje citokinov iz limfocitov T in makrofagov, lahko tako preko IL-6 vplivajo tudi na limfocite B. IL-6 ima namreč močan učinek na diferenciacijo limfocitov B in izločanje protiteles. Značilnost sluzničnega imunskega odziva je nastajanje sekretornega IgA, ki je pomemben del humoralnega imunskega sistema.⁽²⁴⁾ IgA proizvajajo predvsem plazmatke v lamini propriji, nato jih epitelijske celice prenesejo v lumen črevesa.

Pritrjeni na plast mukusa se vežejo na antigene in onemogočajo prehajanje bakterij preko črevesne bariere ter olajšajo dendritičnim celicam zajemanje antigenov.⁽²³⁾ Poleg nastajanja interlevkinov povzročijo probiotiki tudi povečanje vrednosti interferona γ, ki spodbuja fagocitozno kapaciteto, izražanje MHC I. in II. razreda in stimulira celice T pomagalke.⁽²⁵⁾ 1.3.1 Probiotiki kot adjuvansi v cepivih

Adjuvansi so pomožne snovi v cepivih, ki preko modulacije celičnega in humoralnega imunskega odziva povečajo imunogenost cepiv. Najpogosteje se uporabljajo aluminijeve spojine, ki pa niso tako učinkovite, ko gre za sluznični imunski odziv.^(1,24) Probiotiki imajo zaradi svojega vpliva na populacije dendritičnih celic, limfocitov T in B ter izločanje citokinov in protiteles velik potencial kot adjuvansi. Še ena prednost probiotikov je njihova enostavna uporaba, saj jih ni potrebno aplicirati hkrati ali celo po isti poti kot antigene.⁽¹⁾

7

2. NAMEN IN HIPOTEZE

Učinkovita zaščita organizma pred okužbo s patogenimi mikroorganizmi je cepljenje, pri katerem je poleg celične imunosti pomemben tudi humoralni odziv organizma, torej tvorba protiteles. Na nastanek protiteles vpliva veliko dejavnikov, od aktivnosti posameznih podenot imunskega sistema, starost posameznika, jemanje imunosupresivnih učinkovin oziroma zdravil, ki vplivajo na diferenciacijo in zorenje limfocitov B. Za aktivacijo imunskega sistema uporabljamo različne stimulatorje, ki delujejo predvsem na receptorje na antigen-predstavitvenih celicah ali stimulatorje aktivacije limfocitov B ali T. V znanstveni literaturi je opisan vpliv različnih probiotikov na povečano nastajanje protiteles, vendar doslej še ni bilo narejenega sistematskega pregleda objavljene znanstvene literature.

V okviru magistrske naloge smo se odločili, da bomo naredili skrben sistematski pregled objav ter na osnovi objavljenih rezultatov potrdili ali ovrgli sledeče hipoteze:

Prva hipoteza: pozitivni vpliv probiotikov na tvorbo protiteles je odvisen od starosti posameznika.

Druga hipoteza: specifični probiotični sevi vplivajo na povečan nastanek protiteles skupine IgG in IgA.

8

3. METODE

3.1 PODATKOVNA BAZA PubMed

Za iskanje znanstvenih člankov smo uporabili bazo PubMed, ki je prosto dostopna baza za iskanje naslovov in povzetkov člankov z zdravstvenega področja, s področja biomedicine in povezanih področij.⁽²⁶⁾ Za iskanje smo uporabili kombinacijo ključnih besed (probiotics OR probiota) AND vaccination AND antibodies. Rezultatov je bilo 325, vendar smo se omejili na članke, ki se nanašajo na človeka, in med filtri izbrali možnost »humans«. Na ta način smo dobili 138 člankov, izmed katerih smo nato na podlagi naslovov in povzetkov izbrali tiste, ki so obravnavali izbrano temo. Zanimale so nas klinične študije, ki so potekale tako, da je testna skupina pred in/ali po cepljenju jemala probiotik, kontrolna pa ustrezen placebo, po cepljenju pa so nato v odvzeti krvi preverjali količino nastalih protiteles. Takih člankov je bilo 22.

V najdenih člankih so se kot uporabljeni probiotiki pojavile bakterije rodu Lactobacillus in Bifidobacterium. Zato smo uporabili še kombinacijo ((bifidobacterium [Title/Abstract]) OR (lactobacillus [Title/Abstract])) AND ((vaccination [Title/Abstract]) OR (vaccine [Title/Abstract])), ki je z uporabo filtra »humans« dala 192 rezultatov, vendar nismo našli nobenega članka, ki ga nismo našli že pri prejšnjem iskanju.

325 najdenih objav v bazi PubMed z uporabo ključnih besed

in funkcijo naprednega iskanja

22 člankov, ki so glede na naslov

in povzetek ustrezali kriterijem 116 člankov, ki glede na naslov in povzetek niso ustrezali kriterijem 187 člankov, ki niso ustrezali

filtru "humans"

9 3.2 PODATKOVNA KNJIŽNICA COCHRANE

Iskanje smo ponovili še v podatkovni knjižnici Cochrane. Le-ta združuje več podatkovnih baz, in sicer bazo s sistematskimi pregledi (Cochrane Database of Systematic Reviews), centralni register kontroliranih študij (Cochrane Central Register of Controlled Trials) in bazo kliničnih odgovorov (Cochrane Clinical Answers).⁽²⁷⁾ Za iskanje smo uporabili enaki kombinaciji ključnih besed kot pri iskanju v bazi PubMed. S ključnimi besedami (probiotics OR probiota) AND vaccination AND antibodies smo dobili 58 zadetkov v kategoriji študij.

Po pregledu vseh naslovov smo izločili tiste, ki smo jih našli že v bazi PubMed, in tiste, ki po naslovu sodeč niso obravnavali vpliva probiotikov na imunski odziv po cepljenju. Ostali so štirje zadetki. Od teh štirih smo enega izločili, ker v študiji niso merili titrov protiteles, temveč količino celic, ki proizvajajo imunoglobuline.

58 objav v knjižnici Cochrane z uporabo

ključnih besed

22 študij, ki smo jih našli že v bazi PubMed

19 objav, ki po naslovu in/ali povzetku sodeč ne ustrezajo vključitvenim

kriterijem

3 objave, ki ustrezajo vključitvenim kriterijem

4 objave, za katere nismo našli strokovnega članka

(študija še poteka) 514 najdenih objav v bazi PubMed z uporabo

ključnih besed in funkcijo naprednega iskanja

0 člankov, ki jih nismo našli s prvim iskanjem in ki ustrezajo

kriterijem 322 člankov, ki niso ustrezali

filtru "humans"

10

Iskanje smo ponovili s ključnimi besedami ((bifidobacterium) OR (lactobacillus)) AND ((vaccination) OR (vaccine)). Zadetkov je bilo 147. Ponovno smo najprej izločili tiste, ki smo jih našli že s prejšnjimi iskanji v obeh bazah, in tiste, ki niso obravnavali učinkov probiotikov na odziv po cepljenju. Našli smo še tri članke.

3.3 POSTOPEK OVREDNOTENJA DOBLJENIH PODATKOV

V bazi PubMed smo prebrali povzetke člankov in na podlagi tega izbrali članke, ki smo jih uporabili v naši razpravi. V bazi Cochrane Library so kot zadetki na voljo le naslovi objav, zato smo morali za članke, ki jih nismo uspeli izločiti že na podlagi naslova, poiskati zadetke na spletu. Za izbranih osemindvajset študij smo nato pridobili celotne članke.

147 objav v knjižnici Cochrane z uporabo

ključnih besed

25 študij, ki smo jih našli že s prejšnjimi iskanji

116 objav, ki po naslovu in/ali povzetku sodeč ne ustrezajo vključitvenim

kriterijem

3 objave, ki ustrezajo vključitvenim kriterijem

4 objave, za katere nismo našli strokovnega članka

(študija še poteka)

11

4. REZULTATI IN RAZPRAVA

Našli smo osemindvajset kliničnih študij, ki so preverjale vpliv probiotikov na nastajanje protiteles po cepljenju. Vse študije so bile randomizirane, kot kontrola je bil v vseh uporabljen placebo. V preglednici so po abecednem vrstnem redu prvega avtorja našteti vsi najdeni članki.

Preglednica I Obravnavane študije

AVTOR, LETO STAROST PROBIOTIK CEPIVO¹

Adler idr., 2019 8 mesecev²

Lactobacillus rhamnosus in Bifidobacterium animalis ssp. lactis

konjugirano pnevmokokno cepivo in cepivo proti toksinu B. pertussis

Akatsu idr., 2013 > 65 let Bifidobacterium longum cepivo proti gripi

Bianchini idr.,

2020 3-18 let Lactobacillus rhamnosus cepivo proti gripi

Batac idr., 2005 11-15

mesecev Bifidobacterium spp.. cepivo proti mumpsu, ošpicam in rdečkam

Boge idr., 2009 > 70 let Lactobacillus paracasei ssp.

paracasei cepivo proti gripi

Bosch idr., 2012 65-85 let Lactobacillus plantarum cepivo proti gripi

Davidson idr.,

2011 18-49 let Lactobacillus rhamnosus intranazalno cepivo proti gripi

de Vrese idr.,

2005 20-30 let

Lactobacillus rhamnosus ali Lactobacillus paracasei ssp.

paracasei

peroralno obnovitveno cepivo proti poliovirusu

1 Otroci so praviloma prejeli več cepiv, vendar so v tabelah navedena le tista, za katera je bil merjen odziv.

2 Pri navedbi starosti v dneh ali mesecih, je navedena starost, pri kateri so začeli z jemanjem probiotika

12

Fonolla idr., 2019 > 65 let Lactobacillus coryniformis cepivo proti gripi

French idr., 2009 18-49 let Lactobacillus fermentum cepivo proti gripi

Isolauri idr., 1995 60-150 dni Lactobacillus casei peroralno cepivo proti rotavirusom

Jespersen idr.,

2015 18-60 let Lactobacillus paracasei ssp.

paracasei cepivo proti gripi

Kukkonen idr.,

2006 novorojenčki

Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium breve, Propionibacterium

freudenreichii ssp. shermanii

cepivo Di-Te-Per, ter proti Hib

Lazarus idr., 2018 35-41 dni Lactobacillus rhamnosus

peroralno rotavirusno cepivo, peroralno cepivo proti poliovirusu

Maruyama idr.,

2016 > 65 let Lactbacillus paracasei cepivo proti gripi

Matsuda idr.,

2011 2-5 let Bifidobacterium breve cepivo proti koleri

Nishihira idr.,

2016 > 20 let Lactobacillus gasseri cepivo proti gripi

Olivares idr.,

2007 22-56 let Lactobacillus fermentum cepivo proti gripi

13 Paineau idr., 2008 18-62 let

Bifidobacterium animalis ssp. lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus acidophilus

peroralno cepivo proti koleri

Perez idr., 2010 9 mesecev do 10 let

Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei

cepivo Di-Te-Per in proti Hib ali cepivo proti pnevmokokom

Redondo idr.,

2017 20-45 let Lactobacillus coryniformis cepivo proti hepatitisu A

Rizzardini idr.,

2012 19-60 let

Bifidobacterium animalis ssp. lactis ali Lactobacillus paracasei ssp. lactis

cepivo proti gripi

Soh idr., 2010 novorojenčki Bifidobacterium longum in

Lactobacillus rhamnosus cepivo proti hepatitisu B

Trachootham idr.,

2017 18-45 let Lactobacillus paracasei cepivo proti gripi

van Puyenbroeck

idr., 2012 > 65 let Lactobacillus casei Shirota cepivo proti gripi

West idr., 2012 4 mesece Lactobacillus paracasei ssp.

paracasei

cepivo Di-Te-Per in proti Hib

Wu idr., 2016 0-7 dni Bifidobacterium longum cepivo proti hepatitisu B, poliovirusu, Di-Te-Per

Youngster idr.,

2011 10 mesecev

Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis

cepivo proti MMR in noricam

14

4.1 POZITIVNI VPLIV PROBIOTIKOV NA TVORBO PROTITELES JE ODVISEN OD STAROSTI POSAMEZNIKA

Kot smo omenili že v uvodu, se funkcija imunskega sistema s starostjo slabša, zato smo preverili, ali so probiotiki pri kateri od starostnih skupin bolj učinkoviti kot pri drugih.

Študije so bile narejene na prostovoljcih zelo različnih starosti, ki smo jih razdelili v štiri skupine.

4.1.1 Otroci, mlajši od enega leta

Med pregledanimi študijami jih je bilo na otrocih, mlajših od enega leta narejenih devet. V treh so otroci prejeli kombinacijo probiotikov in v šestih posamezen probiotičen sev. Otroke so glede na njihovo starost cepili s cepivi iz nabora standardnih (obveznih) cepiv.

Študija Adler Sørensen in kolegov je vključevala 290 otrok, starih osem mesecev. Testna skupina je šest mesecev prejemala kombinacijo Lactobacillus rhamnosus in Bifidobacterium animalis ssp. lactis 2x10⁹ CFU. Odvzeta sta bila dva vzorca krvi, eden pred začetkom jemanja probiotika oziroma placeba in eden na koncu šestmesečnega obdobja. Otroci so prejeli konjugirano pnevmokokno cepivo in cepivo proti toksinu B. pertussis pri starosti dvanajst mesecev. Izvedli so meritev specifičnih protiteles IgG proti serotipom S.

pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F in IgG proti toksinu B. pertussis.

Razlika v spremembi titra med prvo in drugo meritvijo med testno in kontrolno skupino ni bila statistično značilna (p = 0,525). Enako velja za odziv na toksin B. pertussis (p = 0,340).⁽²⁸⁾

Študijo Bataca in kolegov je končalo 54 otrok, starih med enajst in petnajst mesecev. Testna skupina je jemala probiotično formulo z Bifidobacteria spp, kontrolna pa enako formulo brez probiotika. Pred začetkom hranjenja z eno od teh dveh formul so otrokom vzeli kri. Po enem mesecu so bili vsi cepljeni s cepivom proti mumpsu, ošpicam in rdečkam. En mesec po cepljenju so jim vzeli končni vzorec krvi. V vzorcih so merili titer protiteles proti mumpsu, ošpicam in rdečkam. Primerjali so povprečno razliko med drugim in prvim vzorcem, vendar med skupinama ni bilo statistično značilne razlike, čeprav je bila razlika višja pri otrocih, ki so prejemali probiotično formulo (p = 0,072 za ošpice, p = 0,43 za mumps in p = 0,37 za rdečke).⁽²⁹⁾

Študija, ki so jo izvedli Isolauri in kolegi, je bila opravljena z otroki, starimi med šestdeset in sto petdeset dni. Testna skupina je prejemala Lactobacillus casei GG v količini 5x10¹⁰ CFU dvakrat dnevno. Prvi odmerek sta obe skupini dobili na dan cepljenja, nato pa so jemanje nadaljevali še pet dni po cepljenju. Otroci so prejeli odmerek peroralnega cepiva

15

proti rotavirusu. Vzorec krvi so jim odvzeli pred cepljenjem in trideset dni po cepljenju.

Serokonverzija za IgA je bila pri testni skupini statistično značilno višja (p = 0,05), medtem ko za IgM in IgG razlika ni bila statistično značilna, čeprav so bile vrednosti v testni skupini višje (p = 0,15 za IgM in p = 0,51 za IgG). Enako velja za GMT (geometrična sredina titrov) (p = 0,19 za IgM, p = 0,10 za IgA in IgG).⁽³⁰⁾

Kukkonen in kolegi so študijo začeli še pred rojstvom otrok. V testni skupini so mame štiri tedne pred pričakovanim datumom poroda začele dvakrat dnevno jemati probiotike Lactobacillus rhamnosus (dva različna seva) 5x10⁹ CFU, Bifidobacterium breve 2x10⁸ CFU in Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii 2x10⁹ CFU. Novorojenčki so prejemali eno kapsulo dnevno z istimi probiotiki in dodatno še 20 kapljic sladkornega sirupa z galaktooligosaharidi šest mesecev po rojstvu. Po finski nacionalni cepilni shemi so nato prejeli cepivo proti davici, tetanusu in oslovskemu kašlju pri starosti tri, štiri in pet mesecev, pri starosti štiri mesece pa še cepivo proti Haemophilus influenzae. Pri starosti šest mesecev, vsaj štirinajst dni po cepljenju, so otrokom odvzeli kri. Merili so toksin-nevtralizirajoča IgG protitelesa proti davici in tetanusu in protitelesa IgG proti kapsularnemu polisaharidu H.

influenzae. Prva so izmerili pri 74 otrocih, druga pa pri 61 otrocih. Med obema skupinama v primeru protiteles proti toksinu davice in tetanusa ni bilo razlik, v primeru protiteles proti Hib so bile koncentracije sicer višje pri testni skupini, vendar razlika ni bila statistično značilna. Statistično značilno višji je bil delež otrok z zaščitnim titrom protiteles proti Hib (p = 0,020).⁽³¹⁾

Lazarus in kolegi so novorojenčke stare med petintrideset in enainštirideset dni razdelili v štiri skupine, ki so prejele bodisi probiotik (Lactobacillus rhamnosus 1x10¹⁰ CFU) + cink (cinkov sulfat), probiotik + placebo, placebo + cink, placebo + placebo. Pri starosti šest in deset tednov so prejeli peroralno rotavirusno cepivo in ostala cepiva po naslednji shemi:

tuberkulozno in trivalentno peroralno cepivo proti poliovirusu ob rojstvu, slednje nato še pri šestih, desetih in štirinajstih tednih starosti. Petvalentno cepivo proti davici, tetanusu in oslovskemu kašlju, proti hepatitisu B in Haemophilus influenzae tipa B pri šestih, desetih in štirinajstih tednih. Otrokom so ob prvem odmerku cepiva in osemindvajset dni po drugem odmerku odvzeli vzorec krvi, tik pred vsakim odmerkom ter štiri in sedem dni po vsakem odmerku pa tudi vzorec blata. Primarni izidi so bili serokonverzija pri starosti štirinajst tednov (serumski anti-VP6 IgA ≥ 20 U/ml pri seronegativnem izvidu pri šestih tednih starosti oziroma 4-kratno povečanje pri ostalih), sekundarni izidi pa GMT in serokonverzija na poliovirus serotip 3 pri štirinajstih tednih starosti. 551 otrok je končalo študijo po protokolu.

16

Razlika v odstotku otrok, pri katerih je prišlo do serokonverzije na rotavirus je bila med skupino, ki je prejemala cink in probiotik, ter med skupino, ki je prejemala oba placeba, statistično značilna (p = 0,04). Razlika med otroki, ki so prejeli probiotik, in otroki, ki so prejeli probiotični placebo (neodvisno od cinka), je bila velika, vendar ne statistično značilna (p = 0,066). Pri reakciji na cepivo proti poliovirusu ni bilo statistično značilne razlike med skupinami.⁽³²⁾

Soh in kolegi so vključili otroke pred dopolnjenim šestim mesecem starosti. Po protokolu je študijo dokončalo 244 otrok. Testna skupina je prejemala vsaj 9,26g formule s probiotikom Bifidobacterium longum v količini 1x10⁷ CFU/g in Lactobacillus rhamnosus LPR 2x10⁷ CFU/g, torej celokupno vsaj 2,8x10⁸ CFU probiotika dnevno. Pri starosti nič, ena in šest mesecev so prejeli cepivo proti hepatitisu B. Prva dva odmerka sta bila enaka pri vseh, tretji pa se je razlikoval odvisno od sheme v cepilnem centru. Nekateri so tudi pri tretjem odmerku prejeli monovalentno cepivo, nekateri pa šestvalentno cepivo (kombinacija s cepivom proti davici, tetanusu in oslovskemu kašlju). Pri enem letu starosti so vsem odvzeli kri. Pri otrocih, ki so prejemali placebo, je bila razlika med otroki, cepljenimi po shemi A (tretji odmerek šestvalentno cepivo) in shemi B opazna, vendar ne statistično značilna (p = 0,076), medtem ko je bila razlika pri otrocih, ki so prejemali probiotik, majhna (p = 0,575). Če primerjamo otroke, cepljene po shemi A, je razlika med testno in kontrolno skupino spet močno opazna, čeprav ne statistično značilna (p = 0,069), medtem ko pri otrocih, cepljenih po shemi B, te razlike skorajda ni (p = 0,996).⁽³³⁾

West je s kolegi opravila študijo s 171 otroki v četrtem mesecu starosti, ki so nato do trinajstega meseca starosti prejemali probiotik ali placebo. Testna skupina je prejela vsaj en odmerek Lactobacillus paracasei ssp. paracasei v količini 1x10⁸ CFU dnevno. Otroci so bili cepljeni s cepivom proti davici, tetanusu in oslovskemu kašlju, proti poliovirusu in Haemophilus influenzae tipa B po nacionalni cepilni strategiji pri treh, pet in pol in dvanajstih mesecih. V odvzetih vzorcih krvi so spremljali odziv na toksin davice in tetanusa, ter polisaharidni antigen H. influenzae. Med obema skupinama ni bilo statistično značilnih razlik. Nato so otroke razdelili na dojene manj kot šest mesecev in dojene šest mesecev ali več, ter tudi glede na kolonizacijo s probiotikom (probiotik prisoten v vseh treh odvzetih vzorcih blata). Ko so trajanje dojenja obravnavali kot kontinuirano spremenljivko, so bili titri protiteles proti toksinu davice statistično značilno višji pri otrocih, ki so imeli v vseh vzorcih blata prisoten probiotik (p = 0,024), in pri vseh otrocih iz testne skupine (p = 0,048).

Pri otrocih, pri katerih je bil probiotik prisoten v vseh vzorcih blata in ki so bili hkrati dojeni

17

manj kot šest mesecev, so bile vrednosti protiteles proti toksinu davice statistično značilno višje štiri tedne po drugem odmerku cepiva (p = 0,018) in tudi tik pred tretjim (p = 0,048).

Vpliv probiotika je bil torej opaznejši pri otrocih, dojenih manj kot šest mesecev, kot pri tistih, ki so bili dojeni šest ali več mesecev. Pri protitelesih proti polisaharidnemu antigenu H. influenzae je bil titer pred drugim odmerkom, štiri tedne po drugem odmerku in pred tretjim prav tako statistično značilno višji (p < 0,001, p = 0,024, p = 0,040), vendar razlika po tretjem odmerku ni bila več statistično značilna.⁽³⁴⁾

Wu in kolegi so v študijo vključili 264 otrok, starih do sedem dni, katerih mame so se odločile, da jih ne bodo dojile. Testna skupina je prejela formulo z dodanim probiotikom Bifidobacterium longum v količini 1x10⁷ CFU/g, kontrolna pa navadno formulo. Od šestega meseca dalje so vsi otroci prejemali standardno formulo. Otroci so prejeli standardna cepiva in pri starosti sedem in enajst mesecev so jim odvzeli kri in izmerili titer protiteles proti hepatitisu B, poliovirusu in proti toksinu davice in tetanusa ter proti oslovskemu kašlju. Med obema skupinama ni bilo statistično značilnih razlik.⁽³⁵⁾

Youngster s kolegi je študijo opravil z otroki, starimi deset mesecev. Po protokolu je študijo končalo 42 otrok. Testna skupina je od desetega do petnajstega meseca starosti jemala kombinacijo Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, vsakega od probiotikov v količini 3x10⁹ CFU. Pri starosti dvanajst mesecev so vsi prejeli odmerek cepiva proti mumpsu, ošpicam, rdečkam in noricam ter obnovitveni odmerek proti poliovirusu, oslovskemu kašlju, davici in tetanusu. Tri mesece po cepljenju so otrokom odvzeli kri in izmerili titer IgG proti mumpsu, ošpicam, rdečkam in noricam. Med obema skupinama ni bilo statistično značilnih razlik v številu otrok znotraj skupine, pri katerih je prišlo do zaščitnih titrov protiteles, je bil pa v testni skupini viden trend k višjim vrednosti.⁽³⁶⁾

Študije so se precej razlikovale glede na uporabljen probiotik oziroma kombinacijo probiotikov ter cepiva. Na podlagi rezultatov lahko sklepamo, da probiotiki pri dojenčkih nimajo velikega vpliva na imunski odziv po cepljenju. Šest študij ni pokazalo niti ene statistično značilne razlike med testno in kontrolno skupino.(28,29,32,33,35,36) Tudi v treh študijah, kjer je bila za nekaj parametrov razlika med testno in kontrolno skupino statistično značilna, je bilo še vedno več parametrov, kjer razlika ni bila statistično značilna.^(30,31,34) V dveh primerih se je izkazalo, da bi lahko imeli probiotiki vlogo pri izenačevanju rezultatov cepljenja, ko otroci niso cepljeni po isti shemi ali pa ko obstajajo med njimi bistvene razlike pri hranjenju, na primer v dolžini dojenja.^(33,34)

18 4.1.2 Otroci med prvim in osemnajstim letom starosti

Študij izvedenih na tej starostni skupini je bilo najmanj – le tri. V dveh primerih je bil uporabljen en probiotični sev, v enem pa kombinacija probiotikov.

Bianchini je s kolegi izvedla študijo na 79 otrocih z diabetesom tipa 1, ki so bili predtem vsaj enkrat cepljeni z inaktiviranim trivalentnim cepivom proti gripi. Otroci so bili stari med tri in osemnajst let. Testna skupina je tri mesece pred in tri mesece po cepljenju prejemala pet kapljic formulacije s probiotikom Lactobacillus rhamnosus v količini 1x10⁹ CFU/ggt dvakrat dnevno, kontrolna pa enako količino formulacije brez probiotika. Po treh mesecih so bili vsi cepljeni proti gripi. Vzorci krvi so bili odvzeti pred cepljenjem in 90±7 dni po cepljenju. Izmerili so titer hemaglutinacijo zavirajočih protiteles proti vsakemu od sevov.

Rezultati so pokazali, da jemanje probiotikov pred in po cepljenju ni povzročilo statistično značilnega povečanja nastajanja protiteles. V deležu posameznikov s serozaščitnim titrom med skupinama ni bilo statistično značilnih razlik za noben sev, prav tako ni bilo razlike med deleži posameznikov, pri katerih je prišlo do serokonverzije.⁽³⁷⁾

Matsuda in kolegi so izvedli študijo, ki je vključevala 128 otrok, starih od dve do pet let, ki so jih nato razdelili v podskupine glede na starost. Testna skupina je prejemala Bifidobacteirum breve v količini 4x10⁹ CFU. Z jemanjem so pričeli štirinajsti dan in ga jemali do dvainštiridesetega dne. Enaindvajseti in petintrideseti dan sta obe skupini prejeli peroralno cepivo proti koleri. Štirinajsti, osemindvajseti in dvainštirideseti dan so otrokom odvzeli kri ter vzorec blata. Izmerili so IgG in IgA specifične za liposaharid Vibria cholerae in za podenoto B toksina kolere (CTB) v blatu in serumu. V kontrolni skupini je bil statistično značilno višji delež otrok s serumskim CTB-specifičnim IgA, tako za vse otroke (p = 0,016), kot tudi v podskupini 24-36 mesecev (p = 0,027). Prav tako je bil v kontrolni skupini statistično značilno višji delež otrok s serumskim LPS-specifičnim IgA v starostni skupini 24-36 mesecev (p = 0,007) ter s CTB-specifičnim IgA (p = 0,026) v blatu v starostni skupini 26-36 mesecev. V testni skupini je bil statistično značilno višji delež otrok s serumskim LPS-specifičnim IgA v starostni skupini 37-48 mesecev (p = 0,042) ter s CTB- specifičnim IgA v blatu v starostni skupini 49-60 mesecev (p = 0,027). Študija ni potrdila, da bi imelo jemanje probiotika pomemben učinek na imunski odziv.⁽³⁸⁾

V študiji Pereza in kolegov je 162 otrok, starih devet mesecev do deset let, je vsaj štiri mesece prejemalo kombinacijo probiotikov (Streptococcus thermophilus 95x10⁸ CFU, Lactobacillus acidophilus 95x10⁶ CFU in Lactobacillus casei 95x10⁶ CFU, oligofruktozo 950mg in inulin 240mg) ali placebo (S. thermophilus 95x10⁸ CFU). Otroci so pri starosti

19

osemnajst mesecev dobili četrti odmerek cepiva proti davici, tetanusu, oslovskemu kašlju in Haemophilus influenzae tipa B, otroci, starejši od osemnajst mesecev, pa odmerek 23- valentnega cepiva proti pnevmokokom. Po vsaj štirih mesecih jemanja probiotika so odvzeli končni vzorec krvi (30-40 dni po cepljenju). Za bazalno meritev so vzeli meritev protiteles proti tetanusu v vzorcu, odvzetem ob prvem obisku, oziroma v vzorcu, odvzetem tik pred cepljenjem za protitelesa proti pnevmokokom. Med testno in kontrolno skupino ni bilo v nobenem vzorcu statistično značilnih razlik v titrih protiteles.⁽³⁹⁾

4.1.3 Odrasli, mlajši od petinšestdeset let

Našli smo deset študij, ki so bile izvedene na odraslih osebah, mlajših od petinšestdeset let.

V vseh primerih je bil pri testni skupni uporabljen en probiotični sev, nekatere študije pa so paralelno primerjale dva ali več sevov s kontrolnimi skupinami.

Davidson in kolegi so opravili študijo z 42 zdravimi odraslimi med osemnajstim in devetinštiridesetim letom. Testna skupina je osemindvajset dni po cepljenju prejemala Lactobacillus rhamnosus 1x10¹⁰ CFU. Na dan cepljenja so prostovoljcem odvzeli kri, nato pa so intranazalno prejeli LAIV (live attenuated influenza vaccine). Vzorec krvi so nato odvzeli še 14., 28. in 56. dan po cepljenju. Po protokolu je študijo končalo 39 prostovoljcev.

Statistično značilna je bila razlika v serozaščiti za sev H3N2 28. dan po cepljenju (p = 0,048), 56. dan pa ne več (p = 0,36).⁽⁴⁰⁾

Študija de Vreseja in kolegov je bila izvedena na 66 moških med dvajsetim in tridesetim letom starosti. Testni skupini sta pet tednov prejemali probiotika Lactobacillus rhamnosus ali Lactobacillus paracasei ssp. paracasei v količini 1x10¹⁰ CFU v 100g kislega mleka.

Osmi dan študije so prostovoljci prejeli obnovitveni odmerek peroralnega cepiva proti poliovirusu. Vzorce krvi so jim vzeli štiri tedne pred cepljenjem, tik pred cepljenjem, dva, štiri in sedem dni po cepljenju. Izmerili so titre nevtralizacijskih protiteles proti serotipom 1, 2 in 3 v serumu in izvedli še prilagojen ELISA test za meritev titrov IgG, IgA in IgM. V primerjavi s placebom je Lactobacillus rhamnosus statistično značilno povečal titer nevtralizirajočih protiteles proti serotipu 1 (p = 0,048) in 2 (p = 0,014), Lactobacillus paracasei ssp. paracasei pa proti serotipu 3 (p = 0,011). Tudi med obema probiotikoma je bila statistično značilna razlika v povečanju titra protiteles proti serotipu 2 (p = 0,0051). V titrih imunoglobulinov je bila statistično značilna razlika med L. rhamnosus in placebom pri IgA proti serotipu 1 (p = 0,036), ter med L. paracasei ssp. paracasei in placebom pri IgM proti serotipu 2 (p = 0,040). Med probiotikoma je bila razlika statistično značilna pri IgM proti serotipu 2 (p = 0,047).⁽⁴¹⁾

20

V študiji Frencha in Pennyja je sodelovalo 47 odraslih prostovoljcev, starih med osemnajst in devetinštirideset let. Razdeljeni so bili v testno skupino, ki je dva tedna pred in štiri tedne po cepljenju prejemala liofiliziran Lactobacillus fermentum v količini 1x10⁹ CFU, ter kontrolno skupino, ki je prejemala placebo. Po dveh tednih jemanja probiotika oziroma placeba so bili cepljeni s parenteralnim cepivom proti gripi. Pred cepljenjem in štiri tedne po cepljenju so vsem vzeli vzorec krvi. Primarni izid je bil titer HAI protiteles štiri tedne po cepljenju, sekundarni izid pa zdravstveno stanje po cepljenju, vključno s stranskimi učinki.

Prostovoljci so v ta namen ob cepljenju dobili vprašalnik. Med skupinama pred cepljenjem ni bilo statistično značilne razlike v titru HAI protiteles proti sevu H1N1 (p = 0,668). Štiri tedne po cepljenju je bila mediana titrov HAI protiteles proti sevu H1N1 v obeh skupinah višja od mediane pred cepljenjem, poleg tega pa je bila v testni skupini mediana statistično značilno višja od mediane v kontrolni skupini (p = 0,038). Primerjali so tudi mediani razlik med titrom pred in po cepljenju, tudi v tem primeru je bila ta statistično značilno višja pri testni skupini (p = 0,022). Delež prostovoljcev, kjer ni prišlo do serokonverzije, je bil v testni skupini 5,5%, pri kontrolni pa 28%. Pri sevih H3N2 in FLU B med skupinama ni bilo statistično značilnih razlik, čeprav je imela testna skupina višje povprečne titre, mediana pa je bila pri sevu H3N2 višja pri kontrolni skupini. Med skupinama ni bilo statistično značilne razlike v deležu prostovoljcev, ki niso zabeležili nobenih simptomov (p = 0,359), je pa bilo povprečno število dni s simptomi pri testni skupini statistično značilno nižje (p = 0.027).

Izračunali so tudi delež dni brez zabeleženih simptomov od vseh možnih dni (št.

prostovoljcev x 28 dni). V drugem, tretjem in četrtem tednu je bil ta delež statistično značilno višji pri testni skupini (p = 0,024).⁽⁴²⁾

Jespersen in kolegi so izvedli študijo na zdravih odraslih prostovoljcih, starih med osemnajst in šestdeset let, 1066 sodelujočih je študijo končalo po protokolu. Testna skupina je tri tedne pred in tri tedne po cepljenju proti gripi prejemala mlečni napitek s probiotikom Lactobacillus paracasei ssp. paracasei (vsaj 1x10⁹ CFU). Primarni izid je bil titer hemaglutinacijo zavirajočih protiteles 21. dan po cepljenju ≥ 40. Sekundarni izidi so bili:

serokonverzija, za influenco A specifični IgA v slini, celokupni za influenco A specifični serumski IgG, ter podtipa IgG1 in IgG3. Med testno in kontrolno skupino ni bilo statistično značilnih razlik v nobenem parametru.⁽⁴³⁾

Nishihira in kolegi so študijo izvedli na odraslih ljudeh, starih več kot dvajset let. Testna skupina je jemala tekoči jogurt, ki je vseboval Lactobacillus gasseri v količini 1x10⁹ CFU/100g, kontrolna skupina pa tekoči jogurt brez probiotika. Jemanje je trajalo šestnajst

21

tednov. Pred začetkom jemanja so vsem prostovoljcem vzeli kri. Po štirih tednih so bili cepljeni s cepivom proti gripi. Vzorce krvi so nato vzeli še četrti, sedmi, enajsti in šestnajsti teden. V vzorcih so merili titer hemaglutinacijo zavirajočih protiteles. Prostovoljcem so pred začetkom jemanja, sedmi in šestnajsti teden raziskave vzeli tudi vzorec sline, v katerem so merili količino IgA. Titri HAI proti sevu A/H1N1 v sedmem in enajstem tednu ter proti sevu B v četrtem in enajstem tednu so bili v testni skupini statistično značilno višji (p < 0,05).

Stopnja serozaščite proti sevu B je bila v enajstem tednu statistično značilno višja v testni skupini (p < 0,05). V stopnji serokonverzije med skupinama ni bilo razlik. Med skupinama je bila statistično značilna tudi razlika v celokupni koncentraciji IgG v sedmem in šestnajstem tednu (p < 0,05). Prostovoljce so nato razdelili v dve podskupini glede na to, ali so imeli pred začetkom jemanja tekočega jogurta koncentracijo IgG pod ali nad mediano (1209 mg/dL). V primeru nižje koncentracije, je bila koncentracija v tednih sedem in šestnajst statistično značilno višja v testni skupini. Primerjava med skupinama je pokazala tudi statistično značilno višje nivoje IgA v slini v testni skupini v sedmem tednu (p <

0,05).⁽⁴³⁾

Študija Olivares in kolegov je bila izvedena na 50 zdravih odraslih prostovoljcih, starih med dvaindvajset in šestinpetdeset let. Testna skupina je osemindvajset dni prejemala 1x10¹⁰ CFU Lactobacillus fermentum. Na štirinajsti dan študije sta obe skupini prejeli inaktivirano trivalentno cepivo proti gripi. Pred začetkom študije, tik pred cepljenjem in po osemindvajsetih dneh so vsem prostovoljcem vzeli kri. Izmerili so celokupne IgA, IgG in IgM koncentracije, ter specifične imunoglobuline. Statistično značilne razlike med skupinama so bile v primeru celokupnih IgG in IgM ter specifičnega IgA (p < 0,05).⁽⁴⁴⁾ V študiji Paineauja in kolegov so sodelovali odrasli, stari med osemnajst in dvainšestdeset let. Razdeljeni so bili v osem skupin, sedem jih je prejelo probiotik v količini 1x10¹⁰ CFU (v vsaki devet prostovoljcev), ena skupina (dvajset prostovoljcev) pa placebo. Vse skupine so prejele odmerek peroralnega cepiva proti koleri. Uporabljeni probiotiki so bili:

Bifidobacterium lactis (Bi-07 in Bi-04), Lactobacillus acidophilus (La-14 in NCFM), Lactobacillus plantarum (Lp-115), Lactobacillus paracasei (Lpc-37) in Lactobacillus salivarius (Ls-33). Probiotik oziroma placebo so prejemali enaindvajset dni; sedmi in štirinajsti dan so prejeli odmerek peroralnega cepiva proti koleri. Vsem so pred začetkom študije, enaindvajseti in osemindvajseti dan vzeli vzorec krvi in vzorec sline ter izmerili količino IgA, IgG in IgM. Meritve na enaindvajseti dan so nakazovale vpliv probiotikov na imunski odziv (p < 0,1), pri Bifidobacterium lactis Bl-04 in Lactobacillus acidophilus La-14

22

je bila razlika za IgG med testno in kontrolno skupino tudi statistično značilna (p = 0,01).

Osemindvajseti dan po cepljenju med skupinami ni bilo statistično značilnih razlik v spremembi titrov.⁽⁴⁵⁾

Redondo in kolegi so zdrave odrasle, stare med dvajset in petinštirideset let, razdelili v tri skupine. Prva skupina je dva tedna pred cepljenjem jemala kapsulo z Lactobacillus coryniformis 3x10⁹ CFU, štiri tedne po cepljenju pa kapsulo s placebom (maltodekstrin).

Druga skupina je dva tedna pred in štiri tedne po cepljenju jemala probiotik, tretja pa tekom vseh šestih tednov placebo. Po prvih dveh tednih jemanja probiotika ali placeba so vse prostovoljce cepili s cepivom proti hepatitisu A. Študijo je končalo 123 prostovoljcev.

Primarni izidi so bili titri specifičnih protiteles, vključno z IgG in IgM. Sekundarni pa stopnja serokonverzije, količine serumskih imunoglobulinov (IgA, IgE, IgG in IgM), podvrste limfocitov in proizvodnja citokinov. Primerjava med skupinami ni pokazala statistično značilnih razlik v deležih podtipov limfocitov, ali med nivoji plazemskih imunoglobulinov.

Med prvo in tretjo skupino je bila po šestih tednih statistično značilna razlika v vrednosti specifičnih protiteles proti virusu hepatitisa A (p = 0.017). Količina protiteles je bila pri prvi skupini v primerjavi s kontrolno 39% višja, pri drugi pa 14,8% višja. V stopnji serokonverzije med skupinami ni bilo statistično značilnih razlik: 97.3% v kontrolni, 92,3%

v prvi in 97.4% v drugi skupini.⁽⁴⁶⁾

Študija Rizzardinija in kolegov je vključevala 221 zdravih odraslih v starosti med dvajset in šestdeset let. Testna skupina je dva tedna pred in štiri tedne po cepljenju proti gripi prejemala Bifidobacterium animalis ssp. lactis (vsaj 1x10⁹ CFU) v obliki kapsul (54 prostovoljcev) oziroma Lactobacillus paracasei ssp. paracasei (vsaj 1x10⁹ CFU) v mlečnem napitku (59 prostovoljcev), kontrolna skupina pa ustrezen placebo. Po šestih tednih so jim odvzeli končni vzorec krvi. Pri obeh testnih skupinah (v primerjavi z ustrezno kontrolno skupino) je bila sprememba titrov statistično značilno večja za celokupni specifični IgG (p = 0,01 za L.

paracasei in p < 0,001 za B. animalis) ter dodatno za podrazreda IgG1 in IgG3 (p < 0,001 za vse primerjave). Primerjali so tudi povprečen večkratnik povečanja titrov (mean fold increase, MFI). Za specifični IgG je bil le-ta večji za testno skupino, ki je jemala B. animalis (p = 0,016), ter za specifična IgG1 in IgG3 za obe testni skupini (p < 0,001 za vse primerjave). Pri specifičnem IgA v slini je bil MFI prav tako statistično značilno višji za obe testni skupini (p = 0,017 za B. animalis ssp. lactis; p = 0,035 za L. paracasei ssp. paracasei).

Pri celokupnih imunoglobulinih sta bila sprememba titra in MFI statistično značilna za IgG, IgG1 in IgG3 za obe testni skupini (p < 0,001 za vse primerjave). Enako velja za celokupni

23

IgG v slini (p < 0,001 za spremembo titra, p = 0,006 za MFI pri L. paracasei in p = 0,001 za B. animalis), pri testni skupini, ki je jemala B. animalis pa tudi za IgA v slini (p = 0,046 za spremembo titra in p = 0,005 za MFI).⁽⁴⁷⁾

Trachootham in kolegi so študijo izvedli na 60 zdravih odraslih prostovoljcih, starih med osemnajst in petinštirideset let. Testna skupina je šest tednov uživala fermentiran mlečni izdelek, ki je vseboval Lactobacillus paracasei 431, kontrolna skupina pa enak izdelek brez probiotika. Po dveh tednih so vse cepili s cepivom proti gripi. Vzorce krvi so odvzeli pred začetkom jemanja mlečnega izdelka ter dva, štiri in šest tednov po cepljenju. Izmerili so titer hemaglutinacijo zavirajočih protiteles in titre IgG in IgM proti influenci A. Testna skupina je imela statistično značilno višji delež serokonverzije (72% proti 55%, p < 0.05 za H1N1;

100% proti 67%, p < 0.0001 za H3N2). Med skupinama pa ni bilo statistično značilne razlike v titrih HAI, čeprav so bile vrednosti višje pri testni skupini (p = 0,1716 za H1N1, p = 0,0897 za H3N2 in p = 0,1192 za Flu-B). Prav tako ni bilo statistično značilnih razlik v nivojih imunoglobulinov.⁽⁴⁸⁾

V devetih od desetih študij je imel probiotik vsaj na en parameter statistično značilen učinek.

V eni študiji je sicer prišlo le do statistično značilno višjega deleža serokonverzije pri testni skupini, v vseh ostalih pa je bilo statistično značilno višjih več preiskovanih parametrov.

4.1.4 Odrasli, starejši od petinšestdeset let

V starostni skupini nad petinšestdeset let je bilo opravljenih šest študij. V vseh so starostnike cepili s cepivom proti gripi.

Akatsu in kolegi so izvedli študijo na 45 bolnišničnih pacientih, starejših od petinšestdeset let in hranjenih preko enteralne cevke. Testna skupina je dvanajst tednov dvakrat dnevno prejemala Bifidobacterium longum v količini 5x10¹⁰ CFU. Po štirih tednih so vse udeležence cepili proti gripi. V tednih nič, štiri, šest, osem, dvanajst in šestnajst so vsem odvzeli kri.

Nivo IgG in IgA je bil v kontrolni skupini povišan v dvanajstem tednu, v testni skupini pa se je povečeval od četrtega oziroma šestega tedna. Med skupinama ni bilo statistično značilnih razlik v porastu titrov imunoglobulinov od tedna nič, vendar pa so bile vrednosti za IgA višje v testni skupini. Med skupinama prav tako ni bilo statistično značilnih razlik v spremembah nivojev protiteles proti posameznim sevom gripe. V šestem tednu je bilo število pacientov s titrom protiteles proti sevu A/H1N1, višjim ali enakim 20, statistično značilno višje v testni skupini, vendar pa v višini titrov protiteles med skupinama ni bilo statistično značilne razlike.⁽⁴⁹⁾

24

Študija Bogeja in kolegov je bila izvedena na 222 zdravih prostovoljcih, starih vsaj sedemdeset let. Testna skupina je vsak dan zaužila dve steklenički s 100g fermentiranega mlečnega izdelka z Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, kontrolna pa enak mlečni izdelek brez probiotika. Jemanje je trajalo trinajst tednov. Po štirih tednih so vse cepili z inaktiviranim cepivom proti gripi. Titri protiteles so bili za vse tri seve do devet tednov po cepljenju višji pri testni skupini, za sev B so bili ves čas jemanja probiotika tudi statistično značilno višji (p = 0,02). Odstotek serozaščite je bil za sev H1N1 tri tedne po cepljenju višji pri testni skupini (p = 0,045). Med skupinama je bila statistično značilna razlika v serokonverziji za sev B tretji, šesti in deveti teden po cepljenju (p = 0,050; p = 0,006, p = 0,017). Pet mesecev po cepljenju je bila statistično značilna razlika v serokonverziji za sev B in sev H3N2 (p = 0,016; p = 0,031).⁽⁵⁰⁾

Bosch in kolegi so študijo izvedli na 60 odraslih med petinšestdesetim in petinosemdesetim letom starosti. Ena testna skupina je prejela Lactobacillus plantarum v količini 5x10⁹ CFU dnevno, druga pa 5x10⁸ CFU dnevno. Tri do štiri mesece po cepljenju proti gripi so začeli z jemanjem probiotika oziroma placeba, ki so ga nato jemali tri mesece. Vzorca krvi so jim odvzeli pred začetkom jemanja probiotika ali placeba ter po treh mesecih in izmerili nivoje specifičnih imunoglobulinov. Pri specifičnih IgG je bila razlika pri višjem odmerku probiotika (p = 0,023), pri IgA pa pri obeh testnih skupinah (p = 0,008 pri višjem odmerku;

p = 0,039 pri nižjem odmerku). Za specifične IgM med skupinami ni bilo razlik, v skupini, ki je jemala višje odmerke probiotika, je bil viden trend v smeri višjih vrednosti (p = 0,054).⁽⁵¹⁾

V študiji Fonollaja in kolegov so sodelovali oskrbovanci domov za starejše, starejši od petinšestdeset let, končalo jo je 83 sodelujočih. Testna skupina je dva tedna prejemala Lactobacillus coryniformis v količini 3x10⁹ CFU. Petnajsti dan so bil vsi cepljeni s trivalentnim cepivom proti gripi. Primarni izid je bil odstotek serokonverzije, torej odstotek prostovoljcev, pri katerih je bil titer hemaglutinacijo zavirajočih protiteles višji od 1:40 ali vsaj štirikratno povečan, sekundarni izid pa incidenca gripi podobnih obolenj. Vzorce krvi so odvzeli pred začetkom jemanja probiotika ali placeba, tik pred cepljenjem in na 42. in 70.

dan. Razlika med testno in kontrolno skupino je bila statistično značilna po obeh kriterijih za serokonverzijo (p = 0,036; p = 0,012).⁽⁵²⁾

Maruyama in kolegi so študijo izvedli na prebivalcih domov za starejše, starejših od petinšestdeset let. Testna skupina je šest tednov prejemala neživ probiotik Lactobacillus paracasei (toplotno obdelan). Tretji teden sta bili obe skupini cepljeni s sezonskim cepivom