BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Janja STOŠICKI
VPLIV SPREMINJANJA POGOJEV GOJENJA V KONTINUIRNEM BIOPROCESU NA RASTNE
PARAMETRE BAKTERIOFAGA T4
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
Ljubljana, 2022
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Janja STOŠICKI
VPLIV SPREMINJANJA POGOJEV GOJENJA V KONTINUIRNEM BIOPROCESU NA RASTNE PARAMETRE BAKTERIOFAGA T4
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
EFFECT OF CHANGING CONDITIONS DURING CONTINUOUS PRODUCTION ON PHAGE PARAMETERS OF PHAGE T4
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2022
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa druge stopnje Biotehnologija. Delo je bilo opravljeno na Fakulteti za kemijo in kemijsko inženirstvo, na Katedri za Polimerno inženirstvo.
Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala prof. dr. Aleša Podgornika.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: prof. dr. Aleš PODGORNIK
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Član: doc. dr. Tomaž ACCETO
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum zagovora:
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 602.3:578.347:602.42:577.152.3: 606:61(043.2)
KG Fag T4, E. coli, latentna perioda, pomnožitveno število, konstanta adsorbcije, fitnes AV STOŠICKI, Janja
SA PODGORNIK, Aleš (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Magistrski študijski program druge stopnje Biotehnologija
LI 2022
IN VPLIV SPREMINJANJA POGOJEV GOJENJA V KONTINUIRNEM BIOPROCESU NA RASTNE PARAMETRE BAKTERIOFAGA T4 TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja)
OP XII, 47, [17] str., 4 pregl., 15 sl., 2 pril., 25 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Bakteriofagi so virusi, ki lahko okužijo in ubijejo bakterijske celice. Kmalu po odkritju so bili uporabljeni za zdravljenje bakterijskih okužb, vendar so takratne študije zaznamovale številne pomanjkljivosti, poleg tega je sledilo odkritje antibiotikov, kar je skupaj večinoma zavrlo razvoj fagne terapije. Zaradi vse pogostejših bakterijskih sevov, odpornih na številne antibiotike, ter boljšega poznavanja biologije bakteriofagov, je preučevanje fagne terapije ponovno v zagonu.
Poleg raziskav je potrebno razviti tudi učinkovite načine proizvodnje bakteriofagov.
Kontinuirni sistemi kot je cellstat se lahko uporabljajo tako za proizvodnjo bakteriofagov, kot tudi za laboratorijsko evolucijo za pridobitev učinkovitejših bakteriofagov za uporabo v zdravljenju in diagnostiki. V sklopu tega magistrskega dela smo uporabili kontinuirni sistem – cellstat, v kateremu smo tekom 14 dni poviševali hitrost razredčevanja bioreaktorju z bakteriofagi. Po vsaki spremembi hitrosti redčenja smo iz sistema izolirali vzorec bakteriofagov, na katerih smo preučevali tri fagne parametre (latentno periodo, pomnožitveno število, konstanto adsorbcije) in izračunali fitnes oziroma hitrost rasti. Te vrednosti smo nato primerjali z vrednostmi, ki so bile določene začetni populaciji bakteriofagov. Z višanjem hitrosti redčenja smo res pridobili bakteriofage z naraščajočim fitnesom, vendar so se pri najvišjih hitrostih redčenja bakteriofagi najverjetneje že začeli spirati iz sistema.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 602.3:578.347:602.42:577.152.3: 606:61(043.2)
CX Phage T4, E. Coli, latent period, burst size, adsorbtion constant, fitnes AU STOŠICKI, Janja
AA PODGORNIK, Aleš (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Biotechnology
PY 2022
TI EFFECT OF CONDITIONS DURING CONTINUOUS PRODUCTION ON PHAGE PARAMETERS OF PHAGE T4
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes)
NO XII, 47, [17] p., 4 tab., 15 fig., 2 ann., 25 ref.
LA sl AL sl/en
AB Bacteriophages are viruses, capable of infecting and lysing bacterial cells. Soon after discovery, they were used for treating bacterial infections, however due to poorly executed studies and discovery of antibiotics, phage therapy was no longer pursued.
Nowadays, because many bacterial strains have become resistant to antibiotics, and we have a better understanding of phage biology, phage therapy is gaining new momentum. In addition to research, effective ways of producing bacteriophages, also need to be developed. Continuous systems, such as cellstat, can be used for production and for laboratory evolution of bacteriophages to obtain more effective bacteriophages to be used for treatment or diagnostics. During our experiments, we used cellstat continuous system in which we increased dilution rate in second bioreactor over a two-week span. After each increase in dillution rate, we isolated phages from the system, determined all phage parameters (latent period, burst size, adsorbtion constant) and calculated fitnes or growth rate for each sample. Obtained values were compared with values for initial phage sample (working bank). With increasing dillution rates, we isolated phages with higher growth rates, however at highest growth rates, phages had started to wash out of the system.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VIII KAZALO SLIK IX
KAZALO PRILOG X
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XI
1 UVOD 1
1.1 CILJI MAGISTRSKIGA DELA 2
1.2 DELOVNE HIPOTEZE 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 BAKTERIJA Escherichia coli 3
2.2 BAKTERIOFAGI 3
2.2.1 Klasifikacija bakteriofagov 3
2.2.2 Življenjski cikel litičnih bakteriofagov 4
2.2.2.1 Adsorbcija bakteriofagov na površino bakterijske celice 4
2.2.2.2 Vbrizganje fagnega genoma v bakterijsko celico 5
2.2.2.3 Preusmeritev celičnega metabolizma 5
2.2.2.4 Morfogeneza novih fagnih delcev 5
2.2.2.5 Liza celice 6
2.2.2.6 Poskus enostopenjske rasti 6
2.2.3 Bakteriofag T4 7
2.2.3.1 Struktura bakteriofaga T4 8
2.2.3.2 Genom bakteriofaga T4 8
2.2.4 Fitnes bakteriofagov 9
2.2.5 Fagna terapija 9
2.2.6 Trening bakteriofagov za povečanje učinkovitosti fagne terapije 10
2.2.6.1 Trening bakteriofagov v šaržnih sistemih 11
2.2.6.2 Trening bakteriofagov v kontinuirnih sistemih 11
2.3 KONTINUIRNI NAČINI GOJENJA BAKTERIJ IN BAKTERIOFAGOV
12
2.3.1 Kemostat 12
2.3.2 Cellstat 12
3 MATERIAL IN METODE 14
3.1 MATERIAL 14
3.1.1 Laboratorijski material 14
3.1.2 Laboratorijska oprema 14
3.1.3 Mikroorganizmi 15
3.1.4 Kemikalije 15
3.2 METODE 15
3.2.1 Priprava gojišč in pufra 15
3.2.1.1 Tekoče gojišče LB 15
3.2.1.2 Trdni LB agar 16
3.2.1.3 Mehki LB agar 16
3.2.1.4 Solno magnezijev (SM) pufer 16
3.2.2 Priprava delovne banke bakterije Escherichia coli 16
3.2.3 Priprava delovne banke bakteriofaga T4 17
3.2.4 Priprava prekonočne kulture 17
3.2.5 Merjenje optične gostote 17
3.2.6 Določevanje koncentracije bakterij 17
3.2.7 Določevanje koncentracije fagov 18
3.2.8 Vezava sistema cellstat 18
3.2.8.1 Spreminjanje pogojev v sistemu cellstat 20
3.2.8.2 Izolacija bakteriofagov 21
8.2.8.2 Šaržno gojenje izoliranih bakteriofagov 21
3.2.9 Določevanje konstante adsorbcije fagov 21
3.2.10 Določevanje latentne periode in pomnožitvenega števila 22
3.2.10.1 Določanje latentne periode 22
3.2.10.2 Določanje pomnožitvenega števila 23
3.2.11 Izračun fitnesa bakteriofagov 24
4 REZULTATI 25
4.1 POSKUSI Z BAKTERIJO 25
4.1.1 Rastna krivulja bakterije Escherichia coli pri šaržnem gojenju 25 4.1.2 Vzpostavitev stacionarne faze rasti bakterije v kontinuirnem sistemu 26
4.2 POSKUSI Z BAKTERIOFAGI 27
4.2.1 Izolacija bakteriofagov 28
4.2.2 Konstanta adsorbcije izoliranih populacij bakteriofagov 29 4.2.3 Latentna perioda in pomnožitveno število izoliranih populacij
bakteriofagov 31
4.2.4 33
5 RAZPRAVA 35
5.1 POSKUSI Z BAKTERIJO 35
5.1.1 Rastna krivulja bakterije Escherichia coli pri šaržnem gojenju 35 5.1.2 Vzpostavitev stacionarne faze rasti bakterije v kontinuirnem sistemu 35
5.2 POSKUSI Z BAKTERIOFAGI 36
5.2.1 Priprava delovne banke bakteriofagov 36
5.2.2 Izolacija bakteriofagov 37
5.2.3 Konstanta adsorbcije izoliranih populacij bakteriofagov 38 5.2.4 Latentna perioda in pomnožitveno število izoliranih populacij
bakteriofagov
39 5.2.5 Izračun fitnesa izoliranih populacij bakteriofagov 40
6 SKLEPI 42
7 POVZETEK 43
8 VIRI 45
ZAHVALA PRILOGE
Izračun fitnesa izoliranih populacij bakteriofagov
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Rezultati določanja koncentracije bakteriofagov, izoliranih iz kontinuirnega sistema, pri različnih konstantah redčenja.
29 Preglednica 2: Rezultati določanja koncentracije šaržno nagojenih bakteriofagov. 29 Preglednica 3: Povzetek rezultatov eksperimentov določanja bakteriofagnih
parametrov in izračunanih fitnesov.
34 Preglednica 4: Povzetek rezultatov eksperimentov določanja konstante adsorbcije. 38
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Življenjski cikel bakteriofaga T4, v bakteriji Escherichia coli (Nester in sod., 2009)
6 Slika 2: Rastna krivulja bakteriofagov med poskusom enostopenjske rasti
(Prescott in Klein, 2002).
7 Slika 3: Zgradba bakteriofaga T4 (Jabrane in sod., 2010). 8 Slika 4: Shematski prikaz vezave kontinuirnega sistema za gojenje bakteriofagov. 20 Slika 5: Shematski prikaz poteka eksperimenta z nižanjem volumna v cellstatu. 21 Slika 6: Rastna krivulja bakterije Escherichia coli med šaržnim gojenjem v
erlenmajerici. Prikazana optična gostota merjena pri valovni dolžini 600 nm in koncentracija celic, v odvisnosti od časa.
26
Slika 7: Prikaz rasti bakterijske kulture v kontinuirnem sistemu preko spremljanja optične gostote pri 600 nm.
27 Slika 8: Prikaz optične gostote bakterijske kulture med gojenjem delovne banke
bakteriofagov ter koncentracija pripravljene delovne banke bakteriofagov.
28 Slika 9: Prikaz optične gostote bakterijske kulture med gojenjem delovne banke
bakteriofagov ter koncentracija pripravljene delovne banke bakteriofagov.
30 Slika 10: Prikaz vrednosti naravnih logaritmov vrednosti koncentracij prostih
bakteriofagov med poskusom določanja konstante adsorbcije.
30 Slika 11: Vrednosti adsorbcijske konstante izoliranih populacij bakteriofagov in
delovne banke.
31 Slika 12: Primer prikaza rezultatov pri določanju latentne periode in
pomnožitvenega števila bakteriofagov. Prikazana je koncentracija vzorcev, tretiranih s kloroformom, in vzorcev brez tretiranja. Prikazana je tudi dolžina latentne periode, ki v tem primeru znaša 15 min.
32
Slika 13: Vrednosti latentne periode in pomnožitvenega števila izoliranih populacij bakteriofagov in delovne banke.
33 Slika 14: Primer numerične rešitve enačbe za določitev fitnesa populacije
bakteriofagov.
33 Slika 15: Vrednosti fitnesa izoliranih populacij bakteriofagov in delovne banke. 34
KAZALO PRILOG
Priloga A: Rezultati meritev konstante adsorbcije bakteriofagov izoliranih pri različnih hitrostih redčenja.
Priloga B: Rezultati meritev latentne periode in pomnožitvenega števila bakteriofagov izoliranih pri različnih hitrostih redčenja.
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ATP Adenozin trifosfat
D Hitrost razredčevanja
DT Hitrost razredčevanja v turbidostatu DC Hitrost razredčevanja v cellstatu DNA Deoksiribonukleinska kislina
bp Bazni par
RNA Ribonukleinska kislina Fag Bakteriofag
OmpC angl. outer membrane protein C – protein C na zunanji bakterijski membrani LPS Lipopolisaharid
Ca2+ Kalcijev ion Mg2+ Magnezijev ion
hmdC hidroksimetildeoksicitidin
tRNA Prenašalna ribonukleinska kislina λ Fitnes oziroma hitrost rasti L Latentna perioda
δ Konstanta adsorbcije b Pomnožitveno število C Koncentracija bakterij
m Hitrost odmiranja bakterijskih celic d Hitrost propadanja prostih fagov
ESKAPE Bakterijske vrste, odporne proti antibiotikom, ki najpogosteje povzročajo hujše infekcije
GMP Dobra proizvodna praksa k Specifična hitrost rasti celic
F Pretok
V Volumen kulture
VT Volumen kulture v turbidostatu
VC Volumen kulture v cellstatu LB Gojišče Luria-Bertani MgSO4 Magnezijev sulfat NaCl Natrijev klorid
Tris Tris(hidroksimetil)aminometan SM Solno magnezijev pufer
rpm Obrati na minuto
PFU angl. plaque forming unit – število bakteriofagov, ki lahko tvorijo plake CFU angl. colony forming unit – število bakterij, ki lahko tvorijo kolonije g angl. Gravitational acceleration – gravitacijski pospešek
OD Optična gostota
MOI angl. multiplicity of infection – razmerje med številom fagov in bakterij X0 Koncentracija bakterijskih celic ob začetku poskusa
PEG Polietilenglikol
UV Ultravijolična svetloba
C1 Koncentracija bakteriofagov v vzorcih obdelanih s kloroformom (koncentracija vseh fagov)
C10 Koncentracija prostih fagov
C2 Novonastali fagi v bakterijskih celicah
C3 Koncentracija bakteriofagov v vzorcih, neobdelanih s kloroformom (število infektivnih centrov)
C4 Število inficiranih bakterij in sproščenih fagov C40 Število inficiranih bakterij
R2 Korelacijski indeks
1 UVOD
Bakterijske viruse, imenovane bakteriofagi, sta odkrila znanstvenika Frederick William Twort leta 1915 ter Felix d'Herelle dve leti kasneje. Tekom odkritja so ugotovili tudi, da so bakteriofagi sposobni okužiti in lizirati bakterijske celice. Posledica tega odkritja so bili prvi začetki zdravljenja bakterijskih okužb z bakterijskimi virusi. Raziskave so bile sicer uspešne, vendar so jih zaznamovale številne pomanjkljivosti, kot so slabo znanje biologije bakteriofagov, nizke zahteve za čistost fagnih lizatov, uporabljenih za zdravljenje ter uporaba napačnih bakteriofagov. Dodatno je to področje za več desetletij zavrlo odkritje antibiotikov. Kljub temu so znanstveniki še naprej preučevali bakteriofage in zato so ti močno pripomogli k razvoju molekularne genetike, evolucijske biologije ter drugih ved.
Tekom preučevanja bakteriofagov so znanstveniki določili klasifikacijo bakteriofagov glede na življenjski cikel, obliko nukleinske kisline ter morfologijo. Natančno poznavanje bakteriofagov je močno pripomoglo k bolj kontroliranim študijam zdravljenja bakterijskih okužb, za katere je dandanes vse več zanimanja, saj so mnogi bakterijski sevi odporni na več vrst antibiotikov in so potrebni alternativni načini njihovega zdravljenja.
Povečano zanimanje za uporabo bakteriofagov v medicini, veterini in agronomiji pomeni, da je potrebno razviti tudi načine za stroškovno učinkovito proizvodnjo bakteriofagnih lizatov. Poleg šaržnega načina se vse bolj uveljavlja tudi kontinuirni način gojenja, saj so stroškovno učinkoviti, omogočajo relativno enostavno kontrolo procesnih parametrov in avtomatizacijo. Cellstat je eden izmed načinov za kontinuirno proizvodnjo in preučevanje bakteriofagov. Sestavljen je iz dveh bioreaktorjev: prvi je turbidostat, kjer poteka namnoževanje bakterijske kulture, ki se kontinuirno dodaja v drugi bioreaktor imenovan cellstat. V cellstatu poteka gojenje bakteriofagov, bakterijske celice pa se v njem ne morejo zadrževati v primeru, če je hitrost redčenja večja od generacijskega časa bakterije. S tem zagotovimo, da tekom gojenja ne poteka koevolucija med fagi in bakterijami, ki bi lahko spremenila lastnosti proizvedenih bakteriofagov.
Kontinuirni način gojenja bakteriofagov je lahko uporabljen tudi za laboratorijsko evolucijo, s katero lahko povečamo fitnes oziroma hitrost rasti začetni populaciji bakteriofagov.
Tovrsten način izboljšanja lastnosti fagov, imenovan tudi trening bakteriofagov, izkorišča kratke generacijske čase tako bakterij, kot tudi bakteriofagov. Trening bakteriofagov je bil vključen tudi v leta 2018 objavljeno strokovno mnenje kot ena izmed treh pomembnih tem na področju fagne terapije. Bakteriofagi, pridobljeni s treningom, bi bili lahko izredno pomembni pri uveljavljanju fagne terapije, če se izboljšane lastnosti ohranijo tekom kliničnih testiranj. To bi poleg boljše učinkovitosti predstavljalo tudi ekonomsko prednost v GMP proizvodnji.
1.1 CILJI MAGISTRSKEGA DELA Cilji magistrskega dela so bili naslednji:
• Vzpostavitev kontinuirnega procesa za gojenje bakterij in bakteriofagov, ki bo omogočal stalno fiziološko stanje bakterije in spreminjajoče pogoje gojenja za bakteriofage.
• Izolacija bakteriofagov pri različnih hitrostih redčenja (D).
• Določitev fagnih parametrov izoliranih bakteriofagov.
• Izračun fitnesa izoliranih bakteriofagov
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Pred začetkom eksperimentalnega dela smo postavili naslednji delovni hipotezi:
• S kontinuirnim sistemom cellstat lahko spremljamo spreminjanje bakteriofagov, brez prisotne koevolucije bakterije.
• Z vse večjimi hitrostmi redčenja kontinuirnega procesa višamo povprečni fitnes bakteriofagne populacije.
2 PREGLED OBJAV
2.1 BAKTERIJA Escherichia coli
V eksperimentalnem delu magistrskega dela smo uporabili bakterijo Escherichia coli, ki je gram negativna paličasta bakterija. Spada v družino Enterobacteriaceae in je del črevesne mikrobiote številnih toplokrvnih organizmov, tudi ljudi. Ecsherichia coli je v večini primerov komenzalna bakterija, obstajajo pa sevi, ki povzročajo bolezni prebavil in sečil (Madigan in sod., 2014; Nester in sod., 2009).
Bakterija E.coli ima 2 µm dolgo in 0,25–1 µm široko celico, ki se lahko aktivno premika z bički. Krožni genom sestavlja DNA dolga približno 5 Mbp, ki kodira vsaj 4000 genov, natančna dolžina genoma in število genov, je odvisno od seva. Zaradi enostavnega gojenja in kratkega podvojitvenega časa (20–40 min) je bakterija Escherichia coli izredno pogost modelni organizem. Optimalni pogoji za rast so 37 °C in pH 7 ter prisotnost kisika, lahko pa raste tudi brez kisika, saj je fakultativni anaerob. Bakterija E. coli igra ključno vlogo v znanosti in industriji, kjer se uporablja za preučevanje evolucijskih procesov, molekularne genetike, razvoj cepiv, proizvodnjo rekombinantnih proteinov, biogoriv itd. (Madigan in sod., 2014; Nester in sod., 2009).
2.2 BAKTERIOFAGI
Bakteriofagi so virusi, ki lahko okužijo in lizirajo bakterijske ali arhejske celice. So najbolj pogosti organizmi na svetu, ocene o njihovem številu nihajo med 1030 in 1032. Igrajo ključno vlogo pri reguliranju mikrobnih populacij v vseh ekosistemih, v katerih se nahajajo (Kutter in Sulakvelitze, 2005).
Bakteriofage sta neodvisno odkrila dva znanstvenika, Frederick Twort leta 1915 in Felix d'Herelle dve leti kasneje. Glede na njihovo sposobnost liziranja bakterijskih celic so kmalu pomislili, da bi bili lahko uporabni za zdravljenje bakterijskih okužb pri ljudeh. Vendar so slabo zasnovane klinične študije in predvsem odkritje antibiotikov to področje zavrli za več desetletij. Kljub temu so imeli bakteriofagi pomembno vlogo v razvoju številnih znanstvenih ved, kot so molekularna biologija, bakterijska genetika in evolucijska biologija (Nobrega in sod., 2015).
2.2.1 Klasifikacija bakteriofagov
Vsak bakteriofag je sestavljen iz nukleinske kisline znotraj proteinske ali lipoproteinske ovojnice. Glede na vrsto nukleinske kisline jih delimo na DNA ali RNA fage. Poleg tega je lahko nukleinska kislina enoverižna ali dvoverižna (Madigan in sod., 2014).
Fage lahko delimo tudi glede na njihov življenjski cikel, in sicer na litične in temperirane fage. Litični bakteriofagi se vežejo na steno bakterijske celice in vanjo vbrizgajo svoj genom,
s čimer preusmerijo večino celičnega metabolizma v proizvodnjo novih fagnih delcev.
Bakterijsko celico nato lizirajo, pri čemer se v okolico sprostijo novonastali bakteriofagi.
Temperirani fagi pa imajo poleg litičnega tudi lizogeni cikel, pri katerem pride bodisi do integracije bakteriofagnega genoma v genom bakterije, bodisi se genom bakteriofaga zadrži v celici izven bakterijskega kromosoma. V obeh primerih se genom faga podvaja skupaj z bakterijo, dokler ne preide v litični cikel. Po prehodu v litični cikel, se začnejo bakteriofagi znotraj celice razmnoževati in jo lizirajo (Carter in Saunders, 2007).
Poleg vrste nukleinske kisline in življenjskega cikla lahko fage delimo tudi glede na njihovo morfologijo. Večina danes poznanih fagov je sestavljenih iz glave in repa ter jih uvrščamo v skupino Caudovirales. Te lahko nadaljnje delimo v tri različne družine glede na morfologijo repa. Približno 60 % fagov ima dolge ter fleksibilne repe in jih uvrščamo v družino Siphoviridae. Fage s fleksibilnimi, kontraktilnimi repi, kot je bakteriofag T4, ki smo ga uporabili pri naših eksperimentih, uvrščamo v družino Myoviridae. Najmanjšo družino, Podoviridae, pa predstavljajo fagi s kratkimi repi. Bakteriofage, ki v svoji strukturi nimajo repa, delimo v 10 različnih družin, vsaka izmed njih pa ima relativno malo pripadnikov (Carter in Saunders, 2007;Kutter in Sulakvelitze, 2005).
2.2.2 Življenjski cikel litičnih bakteriofagov
Življenjski cikel litičnih bakteriofagov je sestavljen iz petih glavnih korakov. Začne se z adsorbcijo fagov na površino bakterijske celice, nadaljuje z vbrizganjem fagnega genoma v celico in posledično preusmeritev celičnega metabolizma v proizvodnjo fagnih delcev.
Zadnja dva koraka predstavljata morfogenezo novih fagnih delcev ter lizo bakterijske celice (Kutter in Sulakvelitze, 2005). Življenjski cikel bakteriofaga T4 je prikazan na sliki 1.
2.2.2.1 Adsorbcija bakteriofagov na površino bakterijske celice
Prvi korak življenjskega cikla bakteriofagov je adsorbcija na površino bakterijske celice.
Fagi se na bakterijah vežejo le na specifične receptorje, ker pomeni, da lahko vsak fag okuži le določene bakterije, ki imajo zanj ustrezne receptorje. V primeru bakteriofaga T4 poteka vezava na površino v dveh stopnjah. V prvi stopnji se mora T4 fag z vsaj tremi dolgimi repnimi fibrilami vezati na receptorje OmpC na steni celice. Ta vezava je relativno šibka in zato reverzibilna, sproži pa signal do bazne plošče, ki zato spremeni obliko iz heksagonalne v zvezdno. Bazna plošča v zvezdni konformaciji se lahko nato s trni ireverzibilno veže na heptozne ostanke na LPS (Kutter in Sulakvelitze, 2005; Moody, 1973).
Uspešnost in hitrost adsorbcije je odvisna od številnih parametrov, kot so prisotnost različnih snovi ali fiziološko stanje gostitelja. Npr. receptor, na katerega se veže bakteriofag lambda, je pri bakterijah izražen le v prisotnosti sladkorja maltoza. Številni drugi fagi za uspešno adsorbcijo potrebujejo dvovalentne ione, kot sta Ca2+ in Mg2+ (Carter in Saunders, 2007;
Kutter in Sulakvelitze, 2005).
Bakterije pogosto pridobijo odpornost proti bakteriofagu ravno na stopnji adsorbcije, preko izgube ali spremembe receptorjev na površini celice. Bakteriofagi lahko nato sicer pridobijo sposobnost prepoznave novega ali spremenjenega receptorja, vendar je ta pojav manj pogost kot pridobitev rezistence s strani bakterije (Hancock in Reeves, 1974).
2.2.2.2 Vbrizganje fagnega genoma v bakterijsko celico
Fagni genom se po vezavi faga na površino celice sprosti v gostiteljsko celico preko repa.
Prenos genoma je mogoč, ker ima konica repa encimske mehanizme, ki omogočajo penetracijo plasti peptidoglikanov in bakterijske celične membrane. Takoj, ko fagni genom vstopi v bakterijsko celico, lahko postane tarča gostiteljevih endonukleaz in restrikcijskih encimov. Bakteriofagi so v odgovor na gostiteljeve obrambne mehanizme razvili številne prilagoditve. Mnogi svoj genom takoj po prenosu v bakterijsko celico cirkularizirajo ali zaščitijo konce linearnega genoma. Poleg tega nekateri fagi, kot sta T7 in T4, inhibirajo bakterijske nukleaze. Tretja oblika obrambe je uporaba nenavadnih nukleotidov, kot je, v primeru faga T4, hidroksimetildeoksicitidin (hmdC), ki ga bakterijski obrambni sistemi ne prepoznajo (Kutter in Sulakvelitze, 2005; Madigan in sod., 2014).
2.2.2.3 Preusmeritev celičnega metabolizma
Prvi korak preusmeritve metabolizma vključuje prepoznavo močnih fagnih promotorjev z gostiteljevo RNA polimerazo, kar povzroči transkripcijo t. i. zgodnjih genov. Vloga produktov, ki jih kodirajo zgodnji geni, je zaščita fagnega genoma in prestrukturiranje bakterijske celice za namen proizvodnje novih fagnih delcev. Sledi transkripcija srednjih genov, katerih produkti vodijo v sintezo nove fagne DNA. Kot zadnji se prepišejo pozni geni, ki kodirajo ostale komponente fagnih delcev (Madigan in sod., 2014; Prescott in Klein, 2002).
2.2.2.4 Morfogeneza novih fagnih delcev
Različne komponente fagnih delcev (DNA, kapsida, rep) se sintetizirajo posebej in šele nato povežejo skupaj. DNA se zapakira v že sestavljeno proteinsko ovojnico, imenovano prokapsida, s pomočjo motorčka, sestavljenega iz encima terminaze, ki omogoča razrez DNA in portalnega proteina, ki oblikuje odprtino skozi katerega se DNA zapakira v prokapsido. Pakiranje DNA v prokapsido omogoča hidroliza molekule ATP (Feiss and Rao, 2011). Sinteza fagnega repa se prične s sestavljanjem bazne plošče iz 15 različnih proteinov.
Na sestavljeno bazno ploščo se nato pritrdi cev in okoli nje plašč. Na koncu se na fag pritrdijo še dolge repne fibrile (Prescott in Klein, 2002).
2.2.2.5 Liza celice
Zadnji korak življenjskega cikla bakteriofagov je liza bakterijske celice in sprostitev novonastalih fagov v okolico. Celična liza je natančno regulirana, saj se mora zgoditi v trenutku, ko je v celici že dovolj novo sintetiziranih fagov, hkrati pa je še dovolj možnosti za nadaljnje okužbe celic v okolici. Večina bakteriofagov potrebuje dve komponenti za uspešno lizo celic. Prva je lizin, encim, ki je sposoben prekiniti vezi v peptidoglikanski ovojnici, druga pa holin, ki v pravem trenutku ustvari pore v celični membrani, da lahko lizin doseže peptidoglikanski sloj (Kutter in Sulakvelitze, 2005).
Slika 1: Življenjski cikel bakteriofaga T4, v bakteriji Escherichia coli (Nester in sod., 2009)
2.2.2.6 Poskus enostopenjske rasti
Poskus enostopenjske rasti sta leta 1939 uvedla znanstvenika Max Delbrück in Emory Elis.
Bistvo poskusa enostopenjske rasti je preučevanje življenjskega cikla bakteriofagov, saj pride do sinhronizacije razmnoževanja velike fagne populacije. V prvem delu poskusa enostopenjske rasti v bakterijsko kulturo dodamo bakteriofage, ki se adsorbirajo na bakterijske celice. V naslednjem koraku mešanico razredčimo do te mere, da se novonastali fagi po lizi celice ne adsorbirajo nemudoma na nove bakterije.
Slika 2: Rastna krivulja bakteriofagov med poskusom enostopenjske rasti (Prescott in Klein, 2002).
S spremljanjem števila bakteriofagov po času dobimo rastno krivuljo bakteriofagov z značilnimi fazami kot je prikazano na Sliki 2. Modra krivulja predstavlja celotno število bakteriofagov, rdeča pa število prostih fagov. Prvi del krivulje predstavlja latentno periodo, med katero ne pride do spremembe v koncentraciji prostih bakteriofagov. Latentna perioda predstavlja čas, ki je potreben za proizvodnjo novih fagov in lizo celice. Prvi del latentne periode je faza eklipse, med katero prihaja do sinteze fagne DNA in proteinov, zato z metodo štetja plakov še ne moremo zaznati naraščanja koncentracije bakteriofagov, tudi v primeru, ko celice liziramo s kloroformom. V drugem delu latentne periode so v celicah že zreli fagi, ki pa še niso lizirali celice, zato jih lahko detektiramo le preko lize bakterijskih celic s kloroformom. Naslednja faza rastne krivulje je faza rasti, med katero pride do lize bakterijskih celic in s tem sprostitve zrelih fagov v okolico. Po hitremu naraščanju števila prostih bakteriofagov pride do platoja, kjer se število ustali. Iz rastne krivulje po končanem eksperimentu lahko določimo namnožitveno število, ki ga uporabimo za izračun števila bakteriofagov, nastalih v eni bakterijski celici, oziroma pomnožitveno število. Poleg pomnožitvenega števila lahko s krivulje odčitamo tudi trajanje latentne periode (Clokie in Kropinski, 2009; Prescott in Klein, 2002).
2.2.3 Bakteriofag T4
Bakteriofag T4, ki smo ga uporabili pri izvedbi tega magistrskega dela, je klasičen litičen fag, katerega gostitelj je bakterija Escherichia coli. Je eden izmed sedmih fagov (T1-7), ki so bili predlagani kot modelni organizmi za študije vseh bakteriofagov. Izmed njih je ravno
T4 najbolj intenzivno raziskan. Spada v družino Myoviridae, družino morfološko kompleksnih bakteriofagov z repi (Madigan in sod., 2014).
2.2.3.1 Struktura bakteriofaga T4
Brenner in sod. so že leta 1959 z uporabo elektronskega mikroskopa posneli prve posnetke bakteriofaga T4 (Brenner in sod., 1959). Kasneje, leta 2003, so s pomočjo krioelektronskega mikroskopa pridobili posnetke višje ločljivosti, kar je omogočilo natančnejše študije strukture bakteriofaga T4. Kot je prikazano na sliki 3 je sestavljen iz 85 nm široke in 115 nm dolge kapside ikozaedrične oblike ter 100 nm dolgega kontraktilnega repa. Rep bakteriofaga je sestavljen iz cevi, obdane s plaščem. Na distalnem delu repa je heksagonalna bazna plošča, na katero je vezanih šest 145 nm dolgih repnih fibril, ki so odgovorne za prepoznavo receptorskih molekul na gostiteljski celici. Pod bazno ploščo imajo bakteriofagi T4 tudi šest kratkih repnih fibril oziroma trnov, ki služijo ireverzibilni vezavi na površino bakterijske celice (Kutter in Sulakvelitze, 2005; Yap in Rossmann, 2014).
Slika 3: Zgradba bakteriofaga T4 (Jabrane in sod., 2010).
2.2.3.2 Genom bakteriofaga T4
Genom bakteriofaga T4, prvič v celoti sekvenciran leta 2003, predstavlja 168 903 bp dolga, dvoverižna DNA, ki ima določene posebnosti. Ena izmed njih je, da T4 fagi kodirajo nekaj lastnih tRNA molekul, kljub temu da fagi načeloma ne kodirajo lastnih komponent, potrebnih za translacijo. Poleg tega je DNA bakteriofagov T4 cirkularno permutirana, kar pomeni, da imajo posamezni fagi enak set genov, vendar se ti nahajajo v različnem vrstnem redu. Do tega pojava pride, ker se v bakterijski celici več fagnih genomov, s komplementarnimi konci, poveže skupaj v t. i. konkatemero, ki se nato začne pakirati v kapsido. Endonukleaza odreže konkatemero, ko je kapsida polna in ne na neki specifični lokaciji. Tretja posebnost DNA faga T4 je, da namesto citozina vsebuje modificirano bazo
5-hidroksimetil-citozin. Zaradi te modifikacije je fagni genom zaščiten, saj bakterijski restrikcijski encimi ne prepoznajo modificirane baze (Madigan in sod., 2014).
2.2.4 Fitnes bakteriofagov
Fitnes je v ekologiji uporabljen kot mera za razmnoževalno uspešnost, bodisi določenega genotipa bodisi fenotipa. Fitnes je določen s produktom naslednjih komponent: preživetje do spolne zrelosti, sposobnost najti in pritegniti partnerja ter plodnost in rodnost (Peacock, 2011).
Fitnes bakteriofagov predstavlja hitrost rasti bakteriofagov, torej povečanje števila bakteriofagov v mediju v nekem časovnem obdobju. Fitnes bakteriofagov pri konstantni koncentraciji bakterij lahko opišemo s spodnjo enačbo, v kateri λ predstavlja fitnes oz. hitrost rasti fagne populacije, L predstavlja latentno periodo, δ konstanto adsorbcije, b pomnožitveno število, C koncentracijo bakterij, m hitrost odmiranja bakteriofagov ter d hitrost propadanja bakterijskih celic (Nabergoj in sod., 2018).
λ = −m + δ * C(b * e−L* (d+λ) −1) … (1)
Določanje fitnesa bakteriofagov je zanimivo tudi kot prva ocena uspešnosti določenega bakteriofaga za zdravljenje bakterijskih okužb. Zaradi velikega števila fagov v okolju je namreč težko napovedati, kateri bodo najbolj učinkoviti za uporabo v fagni terapiji. Najbolj pogost princip za izbiro primernih kandidatov je in vivo testiranje, vendar je tovrstno testiranje zamudno predvsem zaradi števila fagov, ki jih je potrebno testirati. Lindbeg in sod.
2014 so pokazali, da obstaja statistično signifikantna korelacija med hitrostjo rasti oz.
fitnesom ter učinkovitostjo bakteriofagov pri zdravljenju bakterijskih okužb.
2.2.5 Fagna terapija
Fagna terapija je definirana kot administracija bakteriofagov pacientom z namenom uničevanja patogenih bakterij. Začetki fagne terapije segajo v leto 1917, ko je d´Herelle ugotovil, da so bakterije občutljive na okužbo z ultramikroskopskimi agensi, ki jih je poimenoval bakteriofagi. V dvajsetih letih 19. stoletja so se začele prve študije fagne terapije za zdravljenje bakterijskih okužb, kot so kolera, bubonska kuga, kožne infekcije in konjuktivitis. Kljub relativni učinkovitosti bakteriofagov so te študije zaznamovale številne pomanjkljivosti, kot so odsotnost primernih kontrol in slaba čistost fagnih lizatov. Te pomanjkljivosti so, skupaj z odkritjem antibiotikov, razvoj fagne terapije zavrli za več desetletij. Sledila je tako imenovala zlata doba antibiotikov, ki je trajala od štiridesetih do sedemdesetih let 19. stoletja. V tem času so odkrili in registrirali več kot 40 antimikrobnih spojin (Altamirano in Barr, 2019; Viertel in sod., 2014).
Dandanes, manj kot stoletje po odkritju antibiotikov, se soočamo s pojavom odpornosti bakterij proti številnim antibiotikom. Odpornost je sicer naravni pojav, ki je bil prisoten že pred klinično in industrijsko uporabo antibiotikov, vendar pa smo ljudje s prekomerno uporabo močno pripomogli k porastu odpornosti. Posledica prekomerne uporabe je namreč tudi povečana koncentracija antibiotikov v okolju, kar pomeni stalno izpostavljenost mikrobnih združb različnim antibiotikom in posledično pospešeno evolucijo genov, ki povzročajo rezistenco. Bakterijske vrste, odporne na antibiotike, ki najpogosteje povzročajo hujše infekcije, uvrščamo v tako imenovano ESKAPE skupino. Skupina je dobila ime po vrstah bakterij, ki jih uvršamo vanjo (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa in Enterobacter spp) ter njihovi sposobnosti, da uidejo (angl. escape) protimikrobnemu delovanju antibiotikov. Zadnje štiri izmed naštetih bakterij je Svetovna zdravstvena organizacija uvrstila kot prioriteto pri iskanju novih protimikrobnih spojin (Altamirano in Barr, 2019; Viertel in sod., 2014).
Poleg krize, ki jo je povzročila odpornost bakterij proti antibiotikom, je k ponovnemu zanimanju za fagno terapijo pripomoglo tudi večje razumevanje biologije, genetike, imunologije in farmakologije bakteriofagov. Uveljavile so se tudi minimalne regulatorne zahteve za terapevtsko uporabo fagov. Med njimi je obvezna uporaba bakteriofagov, ki imajo striktno litični življenjski cikel, potrditev antimikrobnega delovanja na tarčno bakterijo in primerna čistost fagnih lizatov (Altamirano in Barr, 2019; Viertel in sod., 2014).
2.2.6 Trening bakteriofagov za povečanje učinkovitosti fagne terapije
Kljub številnim vzpodbudnim študijam mora fagna terapija premagati še številne ovire. Med njimi so tudi odpornost bakterij proti bakteriofagom ali slaba učinkovitost uporabljenih bakteriofagov. Uspešnost terapije je mogoče povečati na več načinov, en izmed njih je kombinacijska terapija z antibiotiki, drugi je uporaba mešanice različnih bakteriofagov, imenovane bakteriofagni koktejl. Z uporabo koktejla namreč razširimo število bakterij, na katere bakteriofagi delujejo in zmanjšamo pojav rezistence s strani bakterij, saj bi morale postati rezistentne proti različnim bakteriofagom (Betts in sod., 2013). Tretji način za povečanje uspešnosti fagne terapije je t. i. trening bakteriofagov. To je eksperimentalni pristop za razvoj fagov, ki izkorišča kratke generacijske čase tako bakterij, kot tudi bakteriofagov (Holtzman in sod., 2020).
Trening bakteriofagov lahko poteka na različne načine, vsi pa deloma izvirajo iz t. i.
Appelmansovih eksperimentov iz leta 1921. Namen teh eksperimentov je bil sicer natančneje določiti koncentracijo bakteriofagov tako, da je bakterijski kulturi dodal serijske redčitve začetnega vzorca bakteriofagov. Po inkubaciji je koncentracijo bakteriofagov izračunal iz zadnje redčitve, kjer je še bila opazna liza bakterijskih celic. Eksperimente je ponovil, le da je tokrat začetni vzorec tretiral s 50-odstotnim etanolom ali 5-odstotnim fenolom, ki naj ne bi vplivala na stabilnost bakteriofagov v vzorcu. Vendar je opazil, da je
le določen delež odporen na tretiranje z etanolom ali fenolom, saj je bila v tem primeru liza bakterijske kulture opazna pri nižjih redčitvah. Na ta način je pokazal, da so v začetni populaciji bakteriofagov prisotne subpopulacije z različnimi lastnostmi, v tem primeru odpornost na etanol ali fenol. Na podoben način smo pri naših eksperimentih želeli s povečevanjem hitrosti redčenja v kontinuirnem sistemu izolirati bakteriofage z večjim fitnesom, saj bi se le ti lahko razmnoževali dovolj hitro, da se ne bi sprali iz sistema (Burrowes in sod., 2019).
Trening bakteriofagov je bil vključen tudi v leta 2018 objavljeno strokovno mnenje kot ena izmed treh pomembnih tem na področju fagne terapije. S treningom pridobljeni bakteriofagi bi bili lahko izredno pomembni pri uveljavljanju fagne terapije, če se izboljšane lastnosti ohranijo med predkliničnimi in kliničnimi testiranji. To bi poleg boljše učinkovitosti predstavljalo tudi ekonomsko prednost v GMP proizvodnji (Rohde in sod., 2018).
2.2.6.1 Trening bakteriofagov v šaržnih sistemih
Trening bakteriofagov lahko poteka šaržno, z zaporednim gojenjem, pri čemer s fagi iz predhodne generacije vedno inficiramo začetno bakterijsko kulturo. Betts in sod. 2013 so na ta način gojili 4 različne bakteriofage specifične za bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Po prvem gojenju bakteriofagov so izolirali še bakterijo, ki je postala odporna na 2 izmed začetnih bakteriofagov. Učinkovitost bakteriofagov so ocenjevali kot delež zmanjšanja koncentracije bakterij po inkubaciji z bakteriofagi. Dva izmed začetnih bakteriofagov sta začetno bakterijsko kulturo zmanjšala za 80 %, odporno bakterijsko kulturo pa le za 20 %.
Bakteriofagi, izolirani po 6 zaporednih pasažah, pa so za 100 % zmanjšali koncentracijo tako začetne bakterije kot tudi odporne. Rezultati nakazujejo, da se z adaptacijo bakteriofagov na določeno bakterijo poveča njihova učinkovitost.
2.2.6.2 Trening bakteriofagov v kontinuirnih sistemih
Drugi način za adaptacijo bakteriofagov na bakterije je uporaba kontinuirnih sistemov gojenja, kot je cellstat. V literaturi sicer nismo zasledili reference, v kateri bi trening bakteriofagov v kontinuirnem sistemu uporabili za namen izboljšanja njihovih lastnosti za uporabo v fagni terapiji. Holtzman in sod. 2020 pa so s fagnim treningom z uporabo kontinuirnega sistema uspeli pridobiti bakteriofag, ki prepozna le en specifičen LPS receptor na površini bakterijske celice. Začetni bakteriofag je napreč prepoznal več različnih receptorjev, kar je sicer zaželeno za uporabo v fagni terapiji, omejuje pa uporabo takšnega bakteriofaga v diagnostiki. Pridobitev bakteriofaga, ki je prepoznal le en receptor, so dosegli z gojenjem na mešanici bakterijskih sevov z različnimi molekulami LPS na površini, od katerih pa se je bakteriofag lahko razmnoževal le na enem sevu. Ostale bakterije so bile gensko spremenjene na način, da se je fag lahko vezal na površino celice in vbrizgal genom v celico, v njej pa se nato ni mogel razmnoževati. S tem načinom selekcije so pridobili
bakteriofag, ki je prepoznal le še LPS receptor na površini celice, v kateri se je lahko razmnoževal.
2.3 KONTINUIRNI NAČINI GOJENJA BAKTERIJ IN BAKTERIOFAGOV
Zaradi povečanega zanimanja za uporabo bakteriofagov v medicini je potrebno razviti učinkovite načine proizvodnje bakteriofagov. V farmaciji sicer še vedno prevladuje šaržni način gojenja, vendar se vse bolj uveljavljajo tudi kontinuirni sistemi. Ti namreč omogočajo enostavno kontrolo okoljskih in fizioloških pogojev ter relativno enostavno avtomatizacijo (Nabergoj in sod., 2018).
2.3.1 Kemostat
Eden izmed kontinuirnih sistemov, uporabljen za gojenje bakterij, je kemostat. Kemostat je bioreaktor, v katerega se z enakim pretokom dodaja sveže gojišče in izteka izrabljeno gojišče z mikroorganizmi, kar omogoča, da se v bioreaktorju ohranja stalen volumen. Sistem omogoča enostavno uravnavanje rasti bakterijske kulture s spreminjanjem pretoka in s sestavo dodanega svežega gojišča. Poleg enostavne kontrole rasti bakterijske kulture je prednost kemostata, v primerjavi s šaržnimi sistemi, doseganje stacionarnega stanja. V stacionarnem stanju se ohranja konstantno koncentracijo bakterijskih celic v eksponentni fazi rasti. Dosega stacionarnega stanja je pomembna tako v raziskavah, kjer omogoča večjo ponovljivost eksperimentov, kot tudi v industriji, kjer omogoča večjo produktivnost bakterijske kulture pri npr. proizvodnji raznih biomolekul (Ziv in sod., 2013).
Kljub mnogim prednostim kemostat ni najbolj primeren za kontinuirno proizvodnjo bakteriofagov. Bakterije in bakteriofagi so v kemostatu namreč podvrženi koevoluciji, kar onemogoča razvoj robustnega procesa (Nabergoj in sod., 2018). V izogib pojavu koevolucije so Husimi in sod. leta 1981 razvili dvoreaktorski kontinuirni sistem imenovan cellstat.
2.3.2 Cellstat
Cellstat je sestavljen iz dveh bioreaktorjev – turbidostata in cellstata. Turbidostat zagotavlja stalen dotok gostiteljskih celic s konstantnim fiziološkim stanjem v cellstat. Za turbidostat velja spodnja enačba, v kateri kpredstavlja specifično hitrost rasti celic, D predstavlja hitrost razredčevanja, F pretok in V predstavlja volumen kulture (Husimi, 1989).
k = DT = F / VT … (2)
Cellstat je drugi bioreaktor, kjer poteka gojenje bakteriofagov. Za študije mutacij bakteriofagov je načrtovan na način, da je stopnja redčenja večja kot stopnja redčenja v turbidostatu (Husimi, 1989).
k < DC = F / VC … (3)
Z izpolnitvijo tega pogoja zagotovimo, da se gostiteljske celice ne zadržujejo v cellstatu, saj je njihov generacijski čas daljši od časa zadrževanja v bioreaktorju. Bakteriofagi pa se pri teh pogojih ne izperejoiz sistema, saj imajo višjo hitrost rasti kot bakterije. Na ta način preprečimo pojav koevolucije bakteriofagov in bakterijskih celic in lahko preučujemo le evolucijo fagov pri konstantnem fiziološkem stanju gostitelja (Husimi, 1989).
Cellstat je bil v preteklosti že uporabljen za učinkovito proizvodnjo in raziskave evolucije bakteriofagov (Nabergoj in sod., 2018). V našem primeru smo ga uporabili za poskus, pri katerem smo v drugem bioreaktorju povečevali hitrost redčenja, s čimer smo želeli izolirati bakteriofage z višjim fitnesom od začetne populacije bakteriofagov.
3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL
Za izvedbo poskusov smo uporabili naslednji laboratorijski material in opremo.
3.1.1 Laboratorijski material
• Laboratorijska halja
• Laboratorijske rokavice
• Laboratorijska očala
• Plastične petrijevke premera 90 mm
• Avtomatske pipete
• Nastavki za avtomatske pipete
• 25 ml serološke pipete
• 1,5 ml, 2 ml in 50 ml centrifugirke
• 20 ml steklene epruvete s plastičnimi pokrovi
• Stojala za centrifugirke in epruvete
• Steklene 100 ml erlenmajerice
• 500 ml, 1000 ml, 2000 ml in 5000 ml steklenice
• 50 ml, 100 ml, 500 ml in 1000 ml merilne valje
• Steklene 10 ml in 30 ml bioreaktorje
• Magnet (za mešanje)
• Cevke, za črpanje medija, ki niso občutljive na visoko temperaturo
• Cepilne zanke
• Mikrotiterske plošče
• 70-odstotni etanol za razkuževanje rok in delovnih površin
• Papirnate brisače, vato in aluminijasto folijo za izdelavo čepov
• Filtre za brizge s porami velikosti 0,22 µm
• 5 ml brizge za enkratno uporabo 3.1.2 Laboratorijska oprema
• Digestorij
• Plinski gorilnik
• Laminarij
• Avtoklav
• Računalnik
• Programska oprema: Windows 7, Microsoft Office 2007, Tecan control
• Spektrofotometer Tecan
• Tehtnica
• Centrifuga
• Inkubator s stresalnikom
• Vodna kopel
• Hladilnik
• Zamrzovalna skrinja na –20 °C in –80 °C
• pH meter
• Vrtinčnik
• Peristaltične črpalke
• Magnetno mešalo
• Štoparica
• Zračna črpalka
• Pipetor
3.1.3 Mikroorganizmi
Pri poskusih smo uporabili bakterijo Escherichia coli sev K12 MG1655 (DSM 18039) in bakteriofag T4 DSM 4505.
3.1.4 Kemikalije
• Gojišče Lennox LB: NaCl, 5 g/L, Tryptone, 10 g/L, Yeast Extract, 5 g/L (Sigma L3022)
• Tehnični agar, primeren za uporabo v mikrobiologiji (Fluka 05040)
• Natrijev klorid (Sigma 31434)
• Želatina (Fluka 48723)
• Magnezijev sulfat (Sigma M2643)
• Tris (Merck 1.08387.0500)
• 80-odstotni glicerol
• Kloroform 3.2 METODE
3.2.1 Priprava gojišč in pufra 3.2.1.1 Tekoče gojišče LB
Tekoče gojišče Luria-Bertani (LB) smo pripravili iz gojišča LB, tako da je koncentracija bujona 20 g/l. Za pripravo 800 ml gojišča smo torej zatehtali 16 g gojišča LB, v merilnem valju dotočili deionizirano vodo do oznake 800 ml in dobro premešali. Tako pripravljeno gojišče smo prelili v 1000 ml steklenico in ga sterilizirali v avtoklavu, 20 min pri temperaturi
121 °C in tlaku 1,2 bar. Po sterilizaciji smo gojišče ohladili na sobno temperaturo in v laminariju razdelili v 50 ml sterilne centifugirke. Gojišče smo hranili v hladilniku pri temperaturi 4 °C.
3.2.1.2 Trdni LB agar
Trdno gojišče LB je sestavljeno iz gojišča LB (20 g/l) in agarja (1,2 %). Za pripravo 800 ml trdnega LB gojišča smo zatehtali 16 g gojišča in 9,6 g agarja, v merilnem valju dotočili deionizirano vodo do oznake 800 ml in dobro premešali. Pripravljeno gojišče smo prelili v 1000 ml steklenico in ga sterilizirali v avtoklavu, 20 min pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bar. Po sterilizaciji smo steklenico z gojiščem prenesli v vodno kopel s temperaturo 55 °C.
Nato smo ob ognju gojišče razlili v petrijevke s premerom 90 mm in pustili na sobni temperaturi, dokler se gojišče ni strdilo. Na glavo obrnjene plošče smo hranili v hladilniku pri 4 °C.
3.2.1.3 Mehki LB agar
Priprava mehkega agarja LB je podobna pripravi trdnega gojišča, le da je tu koncentracija agarja v gojišču nižja (0,7 %). Po sterilizaciji v avtoklavu smo steklenico z gojiščem ohladili v vodni kopeli pri temperaturi 55 °C. Nato smo ob ognju razdelili po 5 ml gojišča v sterilne steklene epruvete. Napolnjene epruvete smo hranili v vodni kopeli na 55 °C največ en teden.
3.2.1.4 Solno magnezijev (SM) pufer
Za pripravo 500 ml pufra SM smo zatehtali 2,9 g NaCl in 0,5 g želatine ter odpipetirali 2 ml 2 M raztopine MgSO4 in 25 ml 1 M pufra Tris s pH vrednostjo 7,5. Nato smo v merilnem valju dolili deionizirano vodo do oznake 500 ml. Pripravljen pufer smo prelili v 1000 ml steklenico in ga avtoklavirali pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bar. Po sterilizaciji smo pufer ohladili na sobno temperaturo in nato v laminariju razdelili v 50 ml centrifugirke. Pufer smo hranili v hladilniku na 4 °C.
3.2.2 Priprava delovne banke bakterije E. coli
Delovno banko bakterije E. coli smo pripravili iz založne banke, ki je shranjena v skrinji pri –80 °C. Ob ognju smo s sterilno cepilno zanko zajeli bakterijsko kulturo iz založne banke in jo razmazali do posameznih kolonij na ploščo s trdnim LB agarjem. Ploščo smo nato inkubirali 24 ur pri temperaturi 37 °C. Nato smo v sterilno erlenmajerico prenesli 50 ml tekočega gojišča LB. V to gojišče smo s sterilno cepilno zanko prenesli eno kolonijo s plošče.
Erlenmajerico smo inkubirali v stresalniku 24 ur pri temperaturi 37 °C in 200 obratih na minuto. V sterilne centifugirke smo odpipetirali po 250 µl 80 % glicerola in 750 µl bakterijske kulture tako, da je bila končna koncentracija glicerola 20 %. Centrifugirke smo hranili v skrinji pri temperaturi –80 °C.
3.2.3 Priprava delovne banke bakteriofaga T4
Delovno banko bakteriofaga T4 smo pripravili iz založne banke. Najprej smo v erlenmajerico sterilno dodali 100 ml tekočega gojišča LB, ki smo ga predhodno segreli na 37 °C. V gojišče smo dodali 5-odstotni vcepek (5 ml) prekonočne bakterijske kulture.
Erlenmajerico smo pokrili s sterilno aluminijasto folijo in inkubirali na stresalniku pri 220 rpm in temperaturi 37 °C. Bakterijsko kulturo smo tako šaržno gojili do dosežene optične gostote 0,2, saj je takrat dosežena eksponentna faza rasti. V tej fazi smo bakterijsko kulturo inficirali s fagom iz založne banke, in sicer smo dodali 50 µl faga s koncentracijo 4E+09 PFU/ml, da smo dosegli MOI = 0,1. Po dodatku bakteriofagov smo erlenmajerico inkubirali še približno 5,5 ur oziroma, dokler se vrednosti optične gostote niso ustalile. Nato smo vsebino erlenmajerice razdelili med dve sterilni 50-ml centrifugirki in centrifugirali 10 min pri 10 000 g. Supernatant smo potem prelili v sveži centrifugirki in ponovili centrifugiranje. Supernatant smo na koncu še filtrirali skozi filter s porami velikosti 0,22 µm.
Tako pripravljeni delovni banki smo določili še koncentracijo fagov z metodo štetja plakov in jo shranili v hladilniku na 4 °C.
3.2.4 Priprava prekonočne kulture
Prekonočno kulturo bakterije smo vedno pripravili vsaj en dan pred poskusi. V sterilno erlenmajerico smo dodali 50 ml tekočega gojišča LB in 50 µl bakterijske kulture iz delovne banke. Erlenmajerico smo pokrili s sterilno aluminijasto folijo in jo inkubirali preko noči v stresalniku na 200 rpm in temperaturi 37 °C. Naslednji dan smo bakterijsko kulturo prestavili v hladilnik na 4 °C, kjer smo jo hranili do enega tedna. Bakterijo shranjeno v hladilniku smo uporabljali pri določanju koncentracije bakteriofagov.
3.2.5 Merjenje optične gostote
Med eksperimenti in pripravo založnih bank je bilo pogosto potrebno spremljati rast bakterijske kulture z merjenjem optične gostote. Meritve smo izvajali s pomočjo spektrofotometra, s katerim smo merili vrednosti OD pri valovni dolžini 600 nm. Vsako meritev smo izvedli v treh ponovitvah, tako smo vedno nanesli 200 µl vzorca v tri luknjice na mikrotiterski plošči. Vrednost optične gostote smo izračunali iz povprečja treh tehničnih ponovitev, od katere smo nato odšteli še vrednost optične gostote čistega gojišča.
3.2.6 Določevanje koncentracije bakterij
Koncentracijo bakterij smo določili s kultivacijsko metodo štetja kolonij na ploščah s trdnim gojiščem LB. Najprej smo pripravili redčitveno vrsto vzorca s faktorjem redčenja 10. V mikrocentrifugirke smo odpipetirali po 450 µl tekočega gojišča LB in v prvo dodali 50 µl vzorca bakterije ter premešali na vrtinčniku. Iz te mikrocentrifugirke smo nato prenesli 50 µl v naslednjo, jo zopet premešali in postopek ponavljali do dosežene željene razredčitve
vzorca. Zaradi velikega števila vzorcev smo uporabljali metodo nanašanja kapljic z volumnom 10 µl na ploščo s trdnim gojiščem LB. Na ta način smo lahko na vsako ploščo nanesli do 8 redčitev (za vsako po 3 kapljice). Plošče smo pustili odprte v laminariju, dokler se kapljice niso posušile, in jih nato inkubirali 24 ur na temperaturi 37 C. Naslednji dan smo prešteli število kolonij na ploščah, pri čemer smo upoštevali, da so števne kapljice, kjer je zraslo med 3 in 30 kolonij. Koncentracijo bakterij smo izračunali s pomočjo spodnje enačbe.
CFU/ml = število preštetih kolonij*redčitev/volumen kapljice … (4)
3.2.7 Določevanje koncentracije fagov
Koncentracijo bakteriofagov smo določili z metodo štetja plakov. Uporabili smo plošče s trdnim LB agarjem, na katere pa smo morali razliti še mehki LB agar, v katerega smo dodali bakterije. V epruveto s 5 ml mehkega LB agarja smo tako dodali 100 µl prekonočne bakterijske kulture, premešali na vrtinčniku in razlili po površini trdnega gojišča. Plošče smo nato pustili odprte nekaj minut, da se je mehki agar strdil in da je s površine izhlapela voda, ki bi oteževala nanašanje kapljic. Vzorce bakteriofagov smo redčili na enak način kot vzorce bakterij. Zaradi velikega števila vzorcev smo ponovno uporabili metodo nanašanja kapljic po 10 µl. Na posamezno ploščo smo nanesli do 8 redčitev, za vsako po 3 kapljice. Plošče smo pustili odprte v laminariju približno 10 min oziroma dokler se kapljice niso posušile.
Nato smo jih inkubirali 24 ur na temperaturi 37 °C. Naslednji dan smo prešteli število plakov na ploščah, pri čemer smo upoštevali, da so števne kapljice, kjer je zraslo med 3 in 30 plakov.
Koncentracijo plakov smo izračunali s pomočjo spodnje enačbe.
PFU/ml = število preštetih plakov*redčitev/volumen kapljice … (5)
3.2.8 Vezava sistema cellstat
Kot opisano v poglavju 2.2 Cellstat je cellstat sistem za kontinuirno gojenje bakteriofagov, ki je sestavljen iz dveh bioreaktorjev. V našem primeru smo uporabljali bioreaktorje volumna 30 in 10 ml. Pred vezavo sistema smo v bioreaktorje položili magnetno mešalo, jih pokrili z aluminijasto folijo in avtoklavirali 20 min pri temperaturi 121 °C ter tlaku 1,2 bar.
Za vsak bioreaktor je bilo potrebno avtoklavirati tudi plastični čep z dvema kapilarama – eno za dotok medija in drugo, ki je predstavljala iztok. Poleg bioreaktorjev smo pripravili tudi večjo steklenico s tekočim gojiščem LB. Količino potrebnega gojišča smo izračunali s pomočjo spodnje enačbe.
Vgojišča = pretok(ml/min)*čas prečrpavanja(min) … (6)
V steklenico smo potopili cevko za prečrpavanje medija in cevko za dotok sterilnega navlaženega zraka. Iz vate, papirnatih brisačk in aluminijaste folije smo izdelali preprost
čep, s katerim smo zatesnili steklenico. Cevke smo navili okrog steklenice z gojiščem in jo avtoklavirali pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bara. Čas sterilizacije je bil odvisen od volumna gojišča. Po sterilizaciji smo steklenico prenesli v posodo z ledom, da se je gojišče ohladilo. Med tem smo v 30 ml bioreaktor prenesli 26 ml tekočega gojišča LB, segretega na 37 °C. Bioreaktor, ki omogoča merjenje optične gostote, smo prenesli v inkubator, segret na 37 °C in opremljen z magnetnim mešalom. Naredili smo 10 meritev optične gostote gojišča.
Povprečje teh meritev predstavlja ozadje, ki smo ga nato odšteli od vseh nadaljnjih meritev.
V bioreaktor z gojiščem smo nato odpipetirali 600 µl prekonočne bakterijske kulture in bioreaktor vrnili v inkubator. Bakterijsko kulturo smo tako gojili do dosežene eksponentne faze rasti. Rast smo spremljali preko meritev optične gostote, gojenje pa je običajno potekalo 90 min. Med gojenjem smo v inkubator namestili ohlajeno steklenico s tekočim gojiščem.
Dotok zraka v sistem smo zagotovili preko prepihavanja tekočega gojišča z navlaženim zrakom, preko sterilnega filtra s porami velikosti 0,22 µm. Pripravili smo tudi drugi bioreaktor s pufrom SM in koncentracijo bakteriofagov 5E+06PFU/ml.
Ko je bakterijska kultura dosegla eksponentno fazo rasti, smo povezali celotni sistem. Cevko za dotok medija smo vpeli v peristaltično črpalko in jo povezali s prvim bioreaktorjem, v katerem poteka gojenje bakterijskih celic. Ta bioreaktor smo nato preko kapilare povezali z drugim bioreaktorjem, v katerem poteka gojenje bakteriofagov. Shema končnega sistema je prikazana na Sliki 4.
Slika 4: Shematski prikaz vezave kontinuirnega sistema za gojenje bakteriofagov.
3.2.8.1 Spreminjanje pogojev v sistemu cellstat
Pogoje v sistemu smo spreminjali z nižanjem volumna v drugem bioreaktorju, kjer je potekalo gojenje bakteriofagov. Nižanje volumna smo dosegli z zamenjavo čepov, s katerim je bil zaprt bioreaktor. Vsak naslednji čep je imel namreč daljšo kapilaro za iztok, saj se nivo tekočine v bioreaktorju ustali glede na to, do kod sega ta kapilara. Z nižanjem volumna smo lahko spreminjali hitrost razredčevanja v tem bioreaktorju, medtem ko so pogoji v prvem bioreaktorju ostali nespremenjeni. Na sliki 5 je shematsko prikazan potek eksperimenta v cellstatu z nižanjem volumna in posledično višanjem hitrosti redčenja. Vezavo sistema in izolacijo bakteriofagov, smo želeli večkrat ponoviti, vendar zaradi tehničnih ovir in pogostih kontaminacij prvega bioreaktorja, nismo nikoli ponovili izolacije vzorcev v točno enakem zaporednju, kot je prikazano na shemi spodaj, smo pa trikrat večkrat ponovili preučevanje fagnih parametrov na teh izoliranih vzorcih.
Slika 5: Shematski prikaz poteka eksperimenta z nižanjem volumna v cellstatu.
3.2.8.2 Izolacija bakteriofagov
Da smo lahko določili fagne parametre za bakteriofage pri vsakem setu parametrov, je bilo potrebno le-te izolirati iz sistema. Izolacijo smo vedno izvedli 24 ur po nižanju volumna. Na iztoku smo v sterilno mikrocentrifugirko zbrali 2 ml tekočine, ki smo jo nato centrifugirali in filtrirali skozi filter z velikostjo por 0,22 µm. Izolirani populaciji bakteriofagov smo z metodo štetja plakov določili še koncentracijo in jo shranili v hladilniku na 4 °C.
3.2.8.2.1 Šaržno gojenje izoliranih bakteriofagov
Določene populacije izoliranih bakteriofagov smo pred izvedbo poskusov gojili šaržno.
Gojenje je potekalo na enak način kot priprava delovne banke bakteriofagov, ki je opisana v poglavju 3.2.3 Priprava delovne banke bakteriofaga T4. Šaržno nagojenim bakteriofagom smo z metodo štetja plakov določili še koncentracijo in jih shranili v hladilniku na 4 °C.
3.2.9 Določevanje konstante adsorbcije fagov
Konstanto adsorbcije fagov na bakterijske celice smo določali preko števila prostih oziroma nevezanih fagov. Število prostih fagov smo spremljali od trenutka infekcije v 1- oziroma 1,5-minutnih intervalih do 11 minut, saj se adsorbcija bakteriofaga T4 običajno zgodi v prvih 10 minutah po infekciji.
Pred izvedbo poskusa smo si pripravili mikrocentrifugirke za vzorčenje, v katere smo odpipetirali 950 µl pufra SM in dve kapljici kloroforma. Za vsak vzorec smo pripravili še 4 mikrocentrifugirke s 450 µl pufra SM za redčitveno vrsto. Pripravili smo še prazno mikrocentrifugirko za vzorčenje bakterijske kulture in 7 mikrocentrifugirk s 450 µl gojišča LB za redčitveno vrsto. Pripravili smo tudi ustrezno število epruvet z mehkim agarjem in plošč s trdnim LB agarjem.
Za izvedbo poskusa smo vedno potrebovali bakterijsko kulturo v enakem fiziološkem stanju, da smo zagotovili ponovljive pogoje. Bakterijsko kulturo za poskuse smo zato vedno gojili v kemostatu z delovnim volumnom 25 ml in pretokom 0,4 ml/min. Ob iztoku kemostata smo v mikrocentrifugirko zbrali 1,5 ml bakterijske kulture. 1 ml kulture smo sterilno prenesli v drugo mikrocentrifugirko in ji dodali ustrezen volumen bakteriofagov iz delovne banke.
Volumen bakteriofagov smo določili tako, da je bilo razmerje med številom fagov in bakterij oziroma MOI 0,1. Pri nizkih vrednosti MOI je namreč, glede na Poissonovo porazdelitev, nizka verjetnost infekcije ene bakterijske celice z dvema ali več fagi hkrati. Takoj ko smo dodali bakteriofage, smo pričeli meriti čas. Mikrocentrifugirko smo inkubirali v inkubatorju, na 37° C, brez stresanja. Vsako minuto oziroma minuto in pol smo vzeli 50 µl vzorca in ga prenesli v ustrezno mikrocentrifugirko z 950 µl pufra SM in kloroformom, jo takoj premešali na vrtinčniku in postavili na led. Z dodatkom kloroforma, 20-kratno redčitvijo in nizko temperaturo smo zaustavili nadaljnjo adsorbcijo, tako da smo vzorčke lahko obdelali po končanem poskusu.
Po končanem poskusu smo vsak vzorec še naprej redčili v redčitveni vrsti s faktorjem 10.
Koncentracijo prostih fagov smo določili z metodo štetja plakov.
Poleg poskusa smo vedno pripravili tudi kontrolo, pri kateri smo enak volumen delovne banke bakteriofagov odpipetirali v 1 ml gojišča LB namesto bakterijskih celic. Tako pripravljenim bakteriofagom smo določili koncentracijo z metodo štetja plakov. Na ta način smo pridobili točno informacijo o začetni koncentraciji bakteriofagov. Začetno koncentracijo bakterij smo določili iz kulture ki smo jo zbrali na iztoku iz kemostata. Iz teh dveh podatkov smo lahko po poskusu določili dejanski MOI.
Dan po izvedenem poskusu smo prešteli število plakov na posameznih ploščah in določili koncentracijo prostih fagov za posamezen časovni interval. Te vrednosti smo logaritmirali z naravnim logaritmom in grafično prikazali v odvisnosti od časa. Točke na diagramu smo povezali z interpolacijsko premico. Vrednost konstante adsorbcije smo določili iz naklona
te premice in koncentracije bakterijskih celic ob začetku poskusa. Poskuse določanja konstante adsorbcije, smo ponovili trikrat za vsako izolirano populacijo bakteriofagov.
δ = - k/X0 … (7)
3.2.10 Določevanje latentne periode in pomnožitvenega števila 3.2.10.1 Določanje latentne periode
Latentno dobo in pomnožitveno število izoliranih bakteriofagov smo določili preko poskusov enostopenjske rasti. V okviru tega smo najprej izvedli adsorbcijo bakteriofagov na bakterijske celice, nato smo inficirane celice prenesli v bakterijsko kulturo v eksponentni fazi rasti in spremljali število prostih in celokupnih bakteriofagov v sistemu.
Pred izvedbo poskusa smo pripravili mikrocentrifugirke za vzorčenje. Za vsak vzorec smo pripravili dva seta mikrocentrifugirk: prvi set za redčitveno vrsto neobdelanega vzorca, s katerim smo določili koncentracijo celokupnih fagov, in drugi set za redčitveno vrsto vzorca obdelanega s kloroformom, s katerim smo določili koncentracijo prostih fagov. V vse mikrocentrifugirke smo odpipetirali 450 µl pufra SM, v prvo mikrocentrifugirko v drugem setu pa smo dodali še kapljico kloroforma. Pripravili smo tudi ustrezno število epruvet z mehkim agarjem in plošč s trdnim LB agarjem.
Pri teh poskusih smo potrebovali bakterijsko kulturo s stalnim fiziološkim stanjem, ki smo jo gojili v kemostatu z delovnim volumnom 25 ml in pretokom 0,4 ml/min. Na iztoku iz kemostata smo zbrali 1,5 ml bakterijske kulture. 1 ml kulture smo dodali ustrezen volumen fagov, da smo dosegli MOI 0,1, preostanek kulture pa smo uporabili za določitev začetne koncentracije celic. Iz kemostata smo odvzeli še 5 ml bakterijske kulture in jo prenesli v sterilen stekleni bioreaktor z magnetnim mešalom.
Ob dodatku fagov v bakterijsko kulturo smo mikrocentrifugirko prestavili v inkubator na 37°C in pričeli meriti čas. Prvih 5 min je potekala adsorbcija, nato pa smo del vzorca prenesli v bioreaktor s 5 ml bakterijske kulture, tako da je bila končna koncentracija fagov približno 104 PFU/ml. Bioreaktor smo postavili v inkubator na 37 °C in nastavili mešanje s 350 obrati na minuto. Prvi vzorec smo vzeli takoj po dodatku fagov, nato pa smo vzorčili še 60 min v 5 min intervalih. Pri vsakem vzorčenju smo odvzeli 150 µl vzorca. 50 µl smo prenesli v centrifugirko s 450 µl pufra SM in kloroformom, premešali na vrtinčniku in postavili na led.
Iz preostalega dela vzorca pa smo takoj pripravili redčitveno vrsto in kapljice določenih redčitev takoj nanesli na plošče. S kloroformom obdelane vzorce smo redčili in nanesli na plošče po končanem vzorčenju.
Tudi pri določanju latentne dobe in pomnožitvenega števila smo določili začetno koncentracijo bakterij in bakteriofagov na enak način kot pri določanju konstante adsorbcije.
Iz teh podatkov smo izračunali dejanski MOI pri poskusu.
Naslednji dan smo prešteli število plakov na ploščah in izračunali koncentracije prostih in celokupnih fagov za vsako časovno točko. Koncentracije fagov smo grafično prikazali v odvisnosti od časa. Latentno dobo smo ocenili iz diagrama. Za določitev pomnožitvenega števila pa so bili potrebni še izračuni.
3.2.10.2 Določanje pomnožitvenega števila
Koncentracije bakteriofagov v vzorcih, obdelanih s kloroformom (C1), predstavljajo proste fage (C10) in novonastale v bakterijskih celicah (C2). Pri tem je število novonastalih fagov enako razliki med C1 in C10. Med fazo eklipse v celicah še ni novonastalih fagov, zato je C1 enak C10. Koncentracije bakteriofagov v neobdelanih vzorcih (C3) pa predstavljajo skupno število infektivnih centrov. C10 predstavlja ozadje pri vseh vzorcih. Ko od števila infektivnih centrov (C3) odštejemo ozadje (C10), dobimo število inficiranih bakterij in sproščenih fagov (C4). Med latentno dobo je C4 enak številu inficiranih bakterij (C40), saj se novonastali fagi še niso sprostili iz celic. Pomnožitveno število smo dobili tako, da smo končno število sproščenih novonastalih fagov (C4) delili s številom inficiranih celic (C40).
Poskuse določanja latentne periode in pomnožitvenega števila, smo ponovili trikrat za vsako izolirano populacijo bakteriofagov.
3.2.11 Izračun fitnesa bakteriofagov
Iz pridobljenih podatkov o fagnih parametrih za posamezno populacijo izoliranih fagov smo izračunali še fitnes oziroma hitrost rasti bakteriofagov. Enačba nima analitične rešitve, zato jo je potrebno rešiti numerično za vsak set podatkov, z metodo bisekcije. Metoda bisekcije, je postopek računanja približkov realnih ničel polinomov. S to metodo ničlo omejimo na dovolj majhen interval in s tem določimo njen približek.
λ = δ * C(b * e−L * ⋅λ −1) … (8)
Enačba izhaja iz enačbe za izračun fitnesa bakteriofagov v poglavju 2.2.4 Fitnes bakteriofagov, le da smo v našem primeru pri izračunih nismo upoštevali faktorjev m in d, ki predstavljata hitrost odmiranja bakterijskih celic in prostih bakteriofagov, saj sta v okviru naših eksperimentov, ki so trajali le po eno uro, zanemarljiva.
4 REZULTATI
4.1 POSKUSI Z BAKTERIJO
Pred začetkom poskusov v kontinuirnem sistemu smo naredili rastno krivuljo bakterije E.
coli. Uporabili smo bakterijo iz delovne banke, ki smo jo pripravili pred začetkom poskusov.
4.1.1 Rastna krivulja bakterije Escherichia coli pri šaržnem gojenju
Rastno krivuljo bakterije smo določili zato, da smo pridobili podatke o hitrosti rasti bakterije pri pogojih, kakršne smo uporabili pri nadaljnjih eksperimentih. Za določanje rastne krivulje smo uporabili delovno banko bakterijskega seva K-12, ki smo jo pripravili pred eksperimenti. Dan pred eksperimentom smo pripravili prekonočno kulturo bakterije, kot je opisano v poglavju 3.2.4 Priprava prekonočne kulture. Naslednji dan smo prenesli 50 mL gojišča LB v 250 mL erlenmajerico z utori in le-to postavili v inkubator s temperaturo 37
°C. Ko se je gojišče segrelo na 37 °C, smo vzeli vzorec gojišča, ki smo ga uporabljali pri meritvah optične gostote pri valovni dolžini 600 nm. Nato smo v ogreto LB gojišče dodali 1 mL prekonočne kulture bakterije, kar je predstavljalo 2-odstotni vcepek. Takoj smo vzeli prvi vzorec pri času 0 in nato dodatni vzorec vsakih 30 min do časa 6,5 h. Zadnji vzorec smo vzeli naslednji dan, po 22 h šaržnega gojenja. Bakterijsko rast med šaržnim gojenjem v erlenmajerici smo spremljali preko merjenja optične gostote pri valovni dolžini 600 nm in preko določanja koncentracije bakterij s kultivacijsko metodo štetja kolonij na agarskih ploščah.
