MAGISTRSKA NALOGA

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

URŠKA VIRANT

MAGISTRSKA NALOGA

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA

Ljubljana, 2021

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

URŠKA VIRANT

RAZVOJ IN VREDNOTENJE BIOADHEZIVNIH NANOVLAKEN ZA BUKALNO UPORABO DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF

BIOADHESIVE NANOFIBERS FOR BUCCAL APPLICATION

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA

Ljubljana, 2021

I

Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo, na Katedri za farmacevtsko tehnologijo, pod mentorstvom izr. prof. dr. Petre Kocbek, mag. farm. in somentorstvom asist. Tanje Potrč, mag. farm. SEM analize je opravila izr. prof. dr. Petra Kocbek, mag. farm., na Kemijskem inštitutu, Ljubljana.

Zahvala

Za vso strokovno pomoč, nasvete in odzivnost se zahvaljujem mentorici, izr. prof. dr. Petri Kocbek, mag. farm..

Prav tako se zahvaljujem somentorici asist. Tanji Potrč, mag. farm. za vso pomoč v laboratoriju, napotke in dosegljivost.

Hvala tudi vam Maja, Erna, Lea, Kaja, Katja in Eva, zaradi vas mi bodo študijska leta za vedno ostala v lepem spominu.

Zahvaljujem se tudi svoji družini, ki je vedno verjela vame in me podpirala na moji študijski poti.

Hvala tudi tebi Matjaž za vso potrpežljivost in spodbudne besede, takrat ko sem jih najbolj potrebovala.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom izr. prof. dr.

Petre Kocbek, mag. farm. in somentorstvom asist. Tanje Potrč, mag. farm.

Urška Virant

Komisija za zagovor magistrskega dela

Predsednik: izr. prof. dr. Žiga Jakopin, mag. farm.

Mentorica: izr. prof. dr. Petra Kocbek, mag. farm.

Somentorica: asist. Tanja Potrč, mag. farm.

Član: doc. dr. Izidor Sosič, mag. farm.

II

Kazalo

POVZETEK ... V ABSTRACT ... VI SEZNAM OKRAJŠAV ... VII

1 UVOD ... 1

1.1 Nanovlakna ... 1

1.2 Dostava zdravilnih učinkovin skozi sluznico ... 4

1.2.1 Bukalna sluznica kot mesto aplikacije dostavnih sistemov s sistemskim delovanjem ... 5

1.3 Bio- in mukoadhezija ... 6

1.3.1 Mehanizem in teorije mukoadhezije... 7

1.3.2 Mukoadhezivni polimeri ... 9

1.3.3 Vrednotenje mukoadhezije ... 10

1.4 Sestava nanovlaken v naši raziskavi ... 12

1.4.1 Polivinilpirolidon ... 12

1.4.2 Eudragit^® RL PO ... 13

1.4.3 Karvedilol ... 13

2 NAMEN DELA ... 15

3 MATERIALI IN METODE ... 16

3.1 Materiali ... 16

3.2 Metode ... 18

3.2.1 Priprava polimernih raztopin za izdelavo nanovlaken ... 18

3.2.2 Elektrostatsko sukanje ... 18

3.2.3 Preučevanje morfoloških lastnosti nanovlaken ... 20

3.2.4 Sproščanje učinkovine ... 20

3.2.5 Test topnosti ... 22

3.2.6 Test vsebnosti karvedilola v nanovlaknih ... 23

III

3.2.7 HPLC analiza ... 23

3.2.8 Reološko vrednotenje mukoadhezije ... 24

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 27

4.1 Izdelava nanovlaken iz polimernih raztopin z elektrostatskim sukanjem in preučevanje njihove morfologije ... 27

4.2 Sproščanje karvedilola ... 30

4.3 Test topnosti ... 35

4.4 Reološko vrednotenje mukoadhezije ... 37

5 SKLEP ... 41

6 LITERATURA ... 42

Kazalo preglednic

Preglednica II: Parametri elektrostatskega sukanja za formulacije NV1, NV2 in NV3... 19

Preglednica III: Parametri elektrostatskega sukanja za formulacije NV4, NV5 in NV6. ... 20

Preglednica IV: Natehte posameznih formulacij nanovlaken in posameznih komponent fizikalnih zmesi za test topnosti. ... 23

Preglednica V: Sestava disperzij polimerov za reološke meritve. ... 25

Preglednica VI: Vsebnost karvedilola v nanovlaknih NV5 glede na teoretično vsebnost. . 33

Kazalo slik

Slika 2: Zgradba sluznice ustne votline (prirejeno po (15)). ... 6

Slika 3: Mukoadhezija po teoriji difuzije. Glikoproteini difundirajo med verige polimera v farmacevtski obliki in obratno, ob tem pride do prepletanja in zagozditve verig (povzeto po (20)). ... 8

Slika 4: Elektronska teorija mukoadhezije. Med negativno nabitimi glikoproteini in pozitivno nabitim polimerom se ustvarijo privlačne sile (prirejeno po (21). ... 8

IV

Slika 5: Razdelitev mukoadhezivnih polimerov glede na izvor, naboj, topnost v vodi in

mehanizem vezave z glikoproteini mukusa (povzeto po (15)). ... 10

Slika 6: Strukturna formula polivinilpirolidona. ... 13

Slika 7: Strukturna formula Eudragita® RL PO. ... 13

Slika 8: Strukturna formula karvedilola. ... 14

Slika 9: Steklen nosilec z vzorcem nanovlaken za test sproščanja... 21

Slika 10: Vzorec raztopine polimera in raztopine zmesi polimera in mucina za reološke meritve. ... 26

Slika 11: SEM slike formulacij nanovlaken NV1, pri večji povečavi (levo) in manjši povečavi (desno). Na sliki so z modro barvo prikazane zadebelitve, z rdečo barvo pa vozli. ... 27

Slika 12: Debelina nanovlaken NV1, NV2, NV3, NV4, NV5 in NV6. ... 28

Slika 13: SEM slike formulacij nanovlaken, NV2, NV3 in NV4 pri večji povečavi (levo) in manjši povečavi (desno). Na sliki so z rdečo barvo prikazani vozli, z rumeno pa razcepitve. ... 29

Slika 14: SEM slike nanovlaken formulacij NV5 in NV6 pri večji povečavi (levo) in manjši povečavi (desno). Na sliki so z rumeno barvo prikazane razcepitve. ... 30

Slika 15: Profili sproščanja karvedilola iz 3 mesece starih nanovlaken NV4, NV5, NV6 – časovni okvir 24 h. ... 31

Slika 16: Profil sproščanja karvedilola iz formulacije nanovlaken NV6 takoj po izdelavi – časovni okvir 48 h. ... 32

Slika 17:Primerjava profilov sproščanja karvedilola iz nanovlaken NV4, NV5 in NV6 takoj po izdelavi in po 3 mesecih shranjevanja – časovni okvir 24 h. ... 33

Slika 18: Ostanek polimernega ogrodja nanovlaken NV6 na steklenih nosilcih po zaključku 48 h testa sproščanja. ... 34

Slika 19: Primerjava koncentracijskih profilov pri raztapljanju nanovlaken s karvedilolom (NV4, NV5, NV6) in fizikalnih zmesi s karvedilololom (FZ1, 24H FZ1, FZ2, 24H FZ2, FZ3, 24H FZ3) – časovni okvir 26h. ... 36

Slika 20: Viskoznostne krivulje polimerne raztopine (oranžna krivulja) in raztopine mucina (modra krivulja) ter njune zmesi (siva krivulja) vzorca F1. ... 38

Slika 21: Viskoznosti posameznih komponent vzorcev in zmesi polimerne disperzije in raztopine mucina, ter izračunan reološki sinergizem pri strižni hitrosti 20 s-1. ... 39

V

POVZETEK

Slaba topnost in nizka hitrost raztapljanja zdravilnih učinkovin sta dva velika izziva v farmacevtski industriji, zato razvijajo številne pristope za njuno izboljšanje, med katere sodijo tudi nanotehnološki pristopi (npr. izdelava nanovlaken). Namen magistrske naloge je bil izdelati bioadhezivna polimerna nanovlakna s podaljšanim sproščanjem karvedilola, ki glede na biofarmacevtski klasifikacijski sistem spada med učinkovine razreda II, za katere je značilna slaba topnost in dobra permeabilnost. Z metodo elektrostatskega sukanja smo izdelali gladka polimerna vlakna s premeri nanometrskih velikosti z nekaj nepravilnostmi v strukturi. Kot osnovni gradnik nanovlaken smo uporabili hidrofilen polimer z bioadhezivnimi lastnostmi, in sicer polivinilpirolidon K90. Za dosego podaljšanega sproščanja smo osnovni formulaciji nanovlaken dodali v vodi netopen polimer Eudragit^® RL PO. Dodali smo ga v različnih deležih. Ugotovili smo, da večji kot je njegov delež v formulaciji, počasneje se karvedilol sprošča. Z izdelavo nanovlaken smo želeli povečati topnost karvedilola, zato smo s testom topnosti preučili, kakšen je vpliv dostavnega sistema na topnost učinkovine v primerjavi z njeno topnostjo v obliki fizikalne zmesi z enako sestavo. Ugotovili smo, da se z vgrajevanjem v nanovlakna na osnovi polivinilpirolidona K90 topnost karvedilola poveča ~ 8-krat, medtem ko se z vgrajevanjem v nanovlakna z dodatkom Eudragita^® RL PO poveča ~ 4-krat. Prav tako smo z nanovlakni uspeli doseči stanje prenasičenja, ki je trajalo ves čas izvajanja testa (26 h). Z reološkimi meritvami smo želeli ovrednotiti bioadhezivnost formulacije nanovlaken, zato smo izvedli klasičen rotacijski test z zveznim spreminjanjem strižne hitrosti. Z njim smo ugotavljali, ali so med komponentami, ki sestavljajo nanovlakna, in komercialno dostopnim mucinom tipa II iz prašičjega želodca kakšne interakcije. Za oba gradnika nanovlaken, tako polivinilpirolidon K90 kot Eudragit^® RL PO, smo ob združitvi z raztopino mucina izračunali pozitiven reološki sinergizem, zato lahko zaključimo, da imata oba polimera mukoadhezivne lastnosti, in sklepamo, da imajo verjetno tudi izdelana nanovlakna mukoadhezivne lastnosti. V nadaljnjih raziskavah bi bilo z ustreznimi metodami smiselno neposredno raziskati mukoadhezivnost nanovlaken ter na podlagi rezultatov optimizirati formulacijo tako, da bi dosegli ustrezno jakost in trajanje adhezije.

Ključne besede: karvedilol, mukoadhezija, nanovlakna, podaljšano sproščanje, topnost

VI

ABSTRACT

Poor solubility and low dissolution rate of drug substances are two major challenges in the pharmaceutical industry, therefore, many approaches are being developed to improve them, including nanotechnological ones (e.g., nanofiber fabrication). The aim of this Master's thesis was to develop bioadhesive polymer nanofibers with prolonged carvedilol release.

According to the biopharmaceutical classification system, carvedilol belongs to class II drugs with poor solubility and good permeability. By electrospinning we produced smooth thin polymer fibers, with nanosized diameter and with some irregularities in the structure. A hydrophilic polymer with bioadhesive properties, namely polyvinylpyrrolidone K90, was used as a key building block for the production of nanofibers. The water-insoluble polymer Eudragit® RL PO was added to the nanofiber formulation to achieve prolonged drug release.

We added it in different amounts. We have shown that higher amount of Eudragit® RL PO in the formulation results in the slower carvedilol release. By incorporation of carvedilol into nanofibers, we wanted to increase its solubility. We performed the solubility test to examine the effect of the delivery system on the solubility of the active ingredient compared to its solubility in a form of physical mixture with the same composition. The solubility of carvedilol was increased ~ 8-times by polyvinylpyrrolidone K90 nanofiber formulation and

~ 4-times by nanofiber formulation with Eudragit® RL PO. By nanofiber formulation, we achieved also supersaturation state, which lasted throughout the test (26 h). We evaluated the bioadhesive potential of nanofiber formulation by rheological measurements, thus we performed rotational experiments with a controlled shear rate. Rotational experiments were used for investigating of interactions between the polymers and commercially available mucin from porcine stomach (type II). Positive rheological synergism was calculated for both polymers, namely polyvinylpyrrolidone K90 and Eudragit® RL PO when combined with a mucin solution, which indicates mucoadhesive properties of both polymers. Based on the obtained results, we can conclude that nanofibers based on polyvinylpyrrolidone K90 and Eudragita® RL PO also have mucoadhesive properties. In further research, it would be worth to explore the mucoadhesive properties of nanofibers by a suitable direct method and, based on the results obtained, to optimize the formulation in order to achieve adequate strength and duration of adhesion.

Key words: carvedilol, mucoadhesion, nanofibers, prolonged release, solubility

VII

SEZNAM OKRAJŠAV

BCS: biofarmacevtski klasifikacijski sistem (ang. Biopharmaceutics Classification System) FZ: fizikalna zmes

HPLC: tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (ang. High Pressure Liquid Chromatography)

PVP: polivinilpirolidon RV: relativna vlažnost

SEM: vrstična elektronska mikroskopija (ang. Scanning Electron Microscopy) ZU: zdravilna učinkovina/zdravilne učinkovine

1

1 UVOD

1.1 Nanovlakna

Nanovlakna so drobna trdna vlakna izdelana iz različnih polimerov, ki imajo zaradi premera na nanometrski skali izražene edinstvene lastnosti. Njihov premer se giblje od nekaj 10 nm do 1000 nm, medtem ko je njihova dolžina teoretično neomejena. Poleg tega imajo izjemno veliko površino na enoto mase, izkazujejo veliko medfibrilarno poroznost z majhno velikostjo por in omogočajo visoko kapaciteto vgradnje zdravilnih učinkovin (ZU) (1). Za nanovlakna pa sta značilni tudi večja mehanska trdnost in prožnost v primerjavi z istim materialom drugih (makrometrskih) dimenzij in oblik ter dobre adhezivne lastnosti (2, 3).

Za izdelavo nanovlaken z želenimi lastnostmi je ključna izbira ustreznega polimera. Z njim vplivamo na hitrost sproščanja učinkovine, mehanske lastnosti, poroznost, morfologijo, termično stabilnost in bioadhezivnost nanovlaken. Za polimere, ki se uporabljajo v biomedicini, je zaželeno, da so biokompatibilni, biorazgradljivi in nestrupeni. Glede na izvor jih delimo na naravne (npr. alginat, hitosan, želatina, kolagen, hialuronska kislina) in sintezne (npr. polimlečna kislina (PLA), kopolimer mlečne in glikolne kisline (PLGA), polivinilpirolidon (PVP), polivinilalkohol (PVA), polikaprolakton (PCL), polietilenoksid (PEO)). Naravni polimeri v primerjavi s sinteznimi običajno izkazujejo manjšo imunogenost in boljšo biokompatibilnost, vendar je njihova slabost večja variabilnost sestave in možnost delne denaturacije polimerov med procesom elektrostatskega sukanja ter težja izvedba elektrostatskega sukanja. Prednost sinteznih polimerov je nižja cena, manjša variabilnost sestave in s tem boljša ponovljivost procesa izdelave, prav tako pa njihove lastnosti lahko prilagodimo z različnimi modifikacijami strukture tekom sinteze (2–4).

Za izdelavo nanovlaken na laboratorijskem nivoju so v uporabi različne metode, kot so risanje (ang. drawing), uporaba predložnih membran (ang. template sythesis), samosestavljanje (ang. self-assembly), ločevanje faz (ang. phase separation) in elektrostatsko sukanje (ang. electrospinning). Slednja je najpogosteje uporabljena, saj je sodobna, ekonomična in enostopenjska metoda, ki omogoča kontinuirano izdelavo nanovlaken. Prav tako je med naštetimi edina metoda, ki ima potencial za prenos izdelave na industrijski nivo (3). Njena glavna pomanjkljivost je majhna produktivnost, saj v časovni enoti nastane zelo malo produkta (npr. 0,01 – 0,1 g/h) (1, 3, 5). Osnovni princip izdelave nanovlaken z metodo elektrostatskega sukanja je uporaba visoke električne napetosti kot

2

gonilne sile za tvorbo vlaken iz polimerne raztopine ali taline (slika 1). Proces izdelave poteka tako, da najprej pripravimo raztopino ali talino polimera z ustreznimi lastnostmi.

Pripravljeno raztopino/talino nato previdno napolnimo v brizgo, pri čemer pazimo, da v brizgi ni zračnih mehurčkov, kajti ti bi motili izdelavo nanovlaken. Polimerno raztopino/talino črpalka potiska skozi kovinsko iglo majhnega premera, ki je priključena na vir visoke električne napetosti. Na koncu igle nastane viseča kapljica. Ob izpostavitvi visoki električni napetosti v raztopino uvedemo električni naboj. S tem se ustvarijo odbojne sile v polimerni raztopini/talini in privlačne sile z nasprotno nabitim zbiralom. Zaradi tega se kapljica oblikuje v Taylorjev stožec. Ko sile električne napetosti presežejo sile površinske napetosti polimerne raztopine, se iz vrha Taylorjevega stožca tvori nabit curek, ki pospešeno potuje proti zbiralu. Na poti do zbirala je curek podvržen številnim nestabilnostim, zato se tanjša in razteguje, kar vodi v večanje njegove površine. Hkrati izhlapeva topilo, zaradi česar se na zbiralu nalagajo trdna suha nanovlakna. Cilj elektrostatskega sukanja je nastanek gladkih vlaken z ustreznim premerom in brez strukturnih nepravilnosti. Na lastnosti produkta vpliva več parametrov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: parametri polimerne raztopine ali taline, procesni parametri in dejavniki okolja. Med parametre polimerne raztopine sodijo vrsta polimera, njegova molekulska masa in koncentracija, viskoznost, površinska napetost in prevodnost polimerne raztopine ter izbrano topilo. Električna napetost, razdalja med konico igle in zbiralom, premer igle, pretok skozi iglo in geometrija zbirala so procesni parametri. Parametra okolja pa sta temperatura in vlažnost okolja v katerem poteka proces elektrostatskega sukanja (2, 4).

Slika 1: Shema naprave in procesa elektrostatskega sukanja (prirejeno po (4)).

3

Zaradi možnosti uporabe v različne namene, relativno enostavne in cenovno dostopne izdelave se nanovlakna raziskujejo za uporabo na različnih področjih, kot so elektronika, fotonika, izdelava zaščitnih oblek, filtracija zraka, farmacija, biomedicina in še številna druga. V farmaciji in biomedicini so nanovlakna zanimiva predvsem za izdelavo oblog za celjenje ran, tkivnih nadomestkov in dostavnih sistemov s prirejenim sproščanjem ZU ter dostavnih sistemov za vnos slabo topnih ZU (2, 4).

Glede na vrsto polimera (hidrofilen, hidrofoben), morfologijo in strukturo nanovlaken (enoslojna, večslojna) lahko dosežemo takojšnje, zakasnelo, pulzirajoče ali podaljšano sproščanje ZU iz nanovlaken. Dostavni sistemi na osnovi nanovlaken s podaljšanim sproščanjem sproščajo ZU skozi daljše časovno obdobje. Njihove glavne prednosti pred dostavnimi sistemi s takojšnjim sproščanjem so manjša nihanja plazemskih koncentracij ZU po aplikaciji takšnega dostavnega sistema, manj pogosto odmerjanje zdravila, potrebni so manjši odmerki ZU za doseganje terapevtskega učinka, manj stranskih učinkov ter večja sprejemljivost s strani pacientov. Podaljšano sproščanje lahko dosežemo z izdelavo večslojnih ali ogrodnih nanovlaken iz enega ali več polimerov (6).

Ker sta slaba topnost in nizka hitrost raztapljanja ZU dva velika izziva v farmacevtski industriji, razvijajo številne nove pristope za njuno izboljšanje. Med obetavne sodobne pristope sodijo tudi nanotehnološki pristopi. Princip povečanja topnosti ZU z vgradnjo v nanovlakna temelji na povečanju specifične površine in veliki poroznosti mreže nanovlaken.

Hkrati se lahko ZU v nanovlakna vgradi v amorfni obliki, saj je pretvorba iz polimerne raztopine/taline v trdna vlakna hitra, zato ZU nima časa kristalizirati. Predpogoj, da se lahko ZU v amorfni obliki vgradi v nanovlakna, je, da je v polimerni raztopini za izdelavo nanovlaken raztopljena. Topnost ZU pa lahko še dodatno povečamo z dodatkom pomožnih snovi, kot so ciklodekstrini ali solubilizatorji, v nanovlakna (7). Nanovlakna izdelana iz bioadhezivnih polimerov poleg vsega naštetega odlikuje tudi dobra adhezivnost, zato so primerna za izdelavo mukoadhezivnih dostavnih sistemov, ki omogočajo tesen stik s sluznico in s tem daljši čas zadrževanja na mestu absorpcije ter posledično večjo biološko uporabnost (8, 9).

Kljub temu da nanovlakna kažejo velik potencial kot sodobni dostavni sistem, pa se raziskovalci soočajo s številnimi izzivi, ki so povezani z vgradnjo ZU, njeno stabilnostjo, doseganjem želenega profila sproščanja, zaostankom topil in povečanjem proizvodnje na industrijski nivo (7).

4

1.2 Dostava zdravilnih učinkovin skozi sluznico

Čeprav je danes peroralni vnos najpogostejši način aplikacije zdravil, so omejitve te poti vnosa, kot so

- ostri in spremenljivi pogoji v prebavnem traktu, ki vplivajo na topnost in stabilnost ZU,

- encimska razgradnja ZU,

- ozko absorpcijsko okno za nekatere ZU in

- predsistemski metabolizem in s tem povezana majhna biološka uporabnost nekaterih ZU,

razlog za vse večji pomen drugih načinov aplikacije ZU, s katerimi lahko dosežemo sistemski učinek. Absorpcija ZU skozi nosno, očesno, rektalno, vaginalno ali ustno sluznico omogoča dostavo ZU neposredno v sistemski krvni obtok, brez predhodnega predsistemskega metabolizma. Zaradi svoje neinvazivnosti in lahke dostopnosti mesta za aplikacijo je s strani bolnikov najbolje sprejeta oralna uporaba oz. aplikacija na sluznico ustne votline. Še posebej je primerna za pediatrično in geriatrično populacijo bolnikov oz.

za vse paciente, ki imajo težave s požiranjem (10). Z aplikacijo zdravila v ustno votlino lahko dosežemo bodisi lokalno bodisi sistemsko delovanje. Absorpcijo ZU v sistemski krvi obtok lahko dosežemo z aplikacijo farmacevtske oblike na bukalno in sublingvalno sluznico. Med oralne farmacevtske oblike, namenjene dostavi ZU skozi ustno sluznico, prištevamo raztopine za grgranje, raztopine za izpiranje ust, oralne raztopine, emulzije in suspenzije (npr. raztopine, emulzije in suspenzije za dlesni in zobe), poltrdne oralne farmacevtske oblike (npr. geli in paste za dlesni, zobe ali ustno sluznico), oralne kapljice, oralna pršila (npr. pršila za usta in žrelo in podjezična pršila), mehke, trde in stisnjene pastile, podjezične in bukalne tablete, oralne kapsule, orodisperzibilne filme ter mukoadhezivne farmacevtske oblike (11). Delimo jih na tekoče, poltrdne in trdne farmacevtske oblike. Lahko so namenjene hitremu delovanju ali pa sproščanju učinkovine skozi daljše časovno obdobje.

Pri slednjih se za doseganje daljšega časa zadrževanja na mestu absorpcije dodajo formulaciji mukoadhezivni polimeri, ki omogočajo pritrditev farmacevtske oblike na ustno sluznico. Z daljšim časom zadrževanja se lahko absorbira več ZU, kar vodi v večjo biološko uporabnost. Zaradi tega pa lahko za doseganje enakega terapevtskega učinka zmanjšamo celokupni odmerek ZU in s tem tudi možnost pojava neželenih učinkov (12–16).

5

Mehanizem prehoda ZU skozi sluznico je najpogosteje pasivna difuzija, ki je lahko paracelularna ali transcelularna. Paracelularna pot (absorpcija med celicami) je značilna za majhne hidrofilne molekule. Medtem ko je transcelularna pot, ki poteka skozi celice, značilna za majhne lipofilne molekule. Da lahko ZU vgradimo v dostavni sistem namenjen oralni transmukozni dostavi, mora ustrezati določenim kriterijem, ki so povezani z molekulsko maso, potentnostjo/učinkovitostjo in z njo povezano velikostjo odmerka ter vodotopnostjo učinkovine. Idealne so ZU s čim manjšo molekulsko maso (zgornja meja 800 Da) in čim manjšim terapevtskim odmerkom, saj lahko zaradi majhne absorpcijske površine v formulacijo vgradimo le nekaj mg ZU. Prav tako mora biti ZU dobro topna v vodi ter njena vrednost log P nad 2 (10).

1.2.1 Bukalna sluznica kot mesto aplikacije dostavnih sistemov s sistemskim delovanjem

Ustno sluznico lahko razdelimo na bukalno (lično), sublingvalno (podjezično), gingivalno (dlesni) in palatalno (trdo nebo), ki se med seboj razlikujejo v debelini, poroženelosti zgornjih plasti epitelija in možnosti sistemske absorpcije ZU. V grobem je sluznica sestavljena iz treh plasti, kar prikazuje slika 2: epitelija na zunanji strani, lamine proprie z vezivnim tkivom, ki je z epitelijem ločena z bazalno membrano ter submukozne plasti s krvnimi žilami in živci. Čeprav je v splošnem ustna sluznica manj prepustna od črevesne in predstavlja veliko manjšo površino za absorpcijo, njena bogata prekrvljenost omogoča učinkovito absorpcijo ZU. Ker sublingvalna in bukalna sluznica nista poroženeli, sta bolj prepustni od ostalih delov ustne sluznice. Omogočata absorpcijo ZU neposredno v sistemski krvni obtok in posledično hiter učinek. Kljub temu da je sublingvalna sluznica nekoliko prepustnejša in tanjša kot bukalna, je aplikacija farmacevtskih oblik na bukalno sluznico lažja in prisotnost farmacevtske oblike na tem mestu za bolnika manj moteča. Sublingvalna sluznica je zaradi govorjenja in premikanja jezika bolj gibljiva, kar lahko povzroči hitrejšo odstranitev farmacevtske oblike. Za mukoadhezivne formulacije, ki se dlje časa zadržujejo na sluznici, je tako aplikacija na bukalno sluznico boljša izbira (15–17).

6

Najpogosteje uporabljene mukoadhezivne farmacevtske oblike za uporabo v ustni votlini so tablete, obliži, filmi in geli, ki se zaradi svojih bioadhezivnih lastnosti prilepijo na ustno sluznico. Farmacevtske oblike morajo ustrezati določenim kriterijem, kot so

- Velikost – biti morajo dovolj majhne, da jih lahko apliciramo na želeno mesto.

- Nabrekanje – nabrekanje polimerov je pomembno za proces mukoadhezije, vendar če je nabrekanje preveliko, lahko farmacevtska oblika postane moteča za pacienta.

- Prilagodljivost – bolj so zaželene fleksibilne farmacevtske oblike, ki se prilagodijo površini ustne sluznice.

- Draženje – na mestu aplikacije ne smejo povzročati draženja (9, 18).

Tablete so v primerjavi s filmi z vidika prilagodljivosti sluznici manj primerne. Geli pa se zaradi svoje konsistence na mestu absorpcije zadržijo le krajši čas. Zato se raziskovalci v zadnjem času bolj osredotočajo v raziskovanje in izdelavo filmov za oralno aplikacijo.

Zaradi prednosti, ki jih imajo nanovlakna, in dejstva, da jih lahko oblikujemo v tanek, fleksibilen in adheziven film, imajo zelo velik potencial za izdelavo dostavnih sistemov s sistemskim delovanjem za uporabo v ustih (11, 17).

1.3 Bio- in mukoadhezija

Bioadhezija je definirana kot medsebojna adhezija/vezava dveh komponent, od katerih je vsaj ena komponenta biološka. V farmacevtskem terminološkem slovarju je opredeljena kot sposobnost snovi, farmacevtskih oblik ali medicinskih pripomočkov, da se za določen čas prilepijo na tkivo (19). Če gre za adhezijo na sluznico (mukozo), temu pravimo mukoadhezija. Z bioadhezijo farmacevtske oblike lahko dosežemo daljši čas zadrževanja

Slika 2: Zgradba sluznice ustne votline (prirejeno po (15)).

7

ZU na mesu absorpcije, prav tako pa lahko povečamo absorpcijo ZU zaradi večje koncentracije raztopljene ZU na mestu absorpcije (20).

Mukus je kompleksna, viskozna tekočina, ki jo izločajo čašaste celice sluznice. Njegova naloga je zaščita in lubrikacija epitelija. Prisoten je lahko kot gelska plast na površini epitelija ali kot raztopina v ustni votlini. Običajno je sestavljen iz vode (~ 95 %), glikoproteinov (< 5 %), lipidov, beljakovin in anorganskih soli. Glikoproteini oz. mucini so visoko glikozilirani proteini, ki so odgovorni za viskozne, elastične in gelske lastnosti mukusa ter njegovo sposobnost mukoadhezije. Strukturo glikoproteinov najlažje razložimo, če si predstavljamo krtačo za steklenice, kjer držalo krtače predstavlja linearno proteinsko jedro, nanj pa so zelo na gosto kovalentno vezane sladkorne verige. Zaradi prisotnosti sialične kisline in sulfatnih skupin je naboj mukusa pri fiziološkem pH negativen. Debelina gelske plasti mukusa je odvisna od sluznice. Najtanjša plast mukusa, manj kot 1 μm, je v ustni votlini, najdebelejša pa je v tankem in debelem črevesu, kjer znaša tudi do 450 μm (20).

1.3.1 Mehanizem in teorije mukoadhezije

Proces mukoadhezije poteka v dveh fazah. Prva faza je kontaktna faza, v kateri pride do tvorbe stika med farmacevtsko obliko in površino sluznice. V tej fazi pride do močenja in nabrekanja mukoadhezivnega polimera, ki ga vsebuje farmacevtska oblika. Naslednji korak je utrditev, kjer pride do prepletanja verig glikoproteinov mukusa s polimeri iz farmacevtske oblike in s tem do tvorbe močnejših povezav med njimi, kar omogoča dalj časa trajajočo adhezijo. Ker je proces mukoadhezije kompleksen pojav, obstaja več teorij, ki ga pojasnjujejo in se med seboj dopolnjujejo (20). Največkrat uporabljene teorije za razlago so teorija močenja, teorija difuzije, teorija preloma, elektrostatska teorija in adsorpcijska teorija (16, 20, 21)

Teorija močenja se uporablja za opisovanje adhezije tekočih in nizkoviskoznih formulacij.

Ta teorija predpostavlja, da se adheziven material razprostre po površini in penetrira v morfološke nepravilnosti sluznice. Adhezivnost tekočih formulacij lahko ovrednotimo z merjenjem stičnega kota. Manjši kot je stični kot mukoadhezivne formulacije s sluznico, večja je afiniteta do površine sluznice oz. mukoadhezija (20, 21).

Teorija difuzije (slika 3) razlaga mukoadhezijo kot posledico prepletanja verig polimerov in mucinov. Sila adhezije se povečuje z obsegom in globino medsebojne penetracije polimernih

8

verig. Dejavniki, ki vplivajo na mukoadhezijo, so molekulska masa polimera, koncentracija polimera in mucina, difuzijski koeficient polimera, fleksibilnost in mobilnost polimernih verig ter stični čas. Pomembna je tudi podobnost v kemijski strukturi obeh komponent, saj večja kot je podobnost, močnejša je interakcija med njima. Raziskovalci navajajo, da je kritična molekulska masa mukoadhezivnega polimera, da pride do prepletanja z glikoproteini mukusa, vsaj 100 kDa (18, 20, 22).

Pri teoriji preloma merimo silo, ki je potrebna za ločitev dveh med seboj adheriranih površin.

Ta teorija predpostavlja, da do preloma pride na stiku obeh površin. Raziskovalci pa so dokazali, da se lahko prelom zgodi tudi znotraj šibkejšega materiala kot posledica prešibkih kohezijskih sil, to pa rezultira v izmerjeni lažno manjši mukoadheziji (21) .

Elektronska teorija pravi, da je mukoadhezija posledica nasprotnih nabojev med polimeri v farmacevtski obliki in mukusom (slika 4). Na njuni medfazi se ustvari električni dvosloj, kar povzroči nastanek privlačnih sil med obema slojema (16, 20).

Glikoproteini

Slika 3: Mukoadhezija po teoriji difuzije. Glikoproteini difundirajo med verige polimera v farmacevtski obliki in obratno, ob tem pride do prepletanja in zagozditve verig (povzeto po (20)).

Mukoadhezivni polimer

Glikoproteini

Preplet in zagozditev verig ter tvorba interakcij med mukoadhezivnim polimerom in glikoproteini.

Mukoadhezivni polimer

Slika 4: Elektronska teorija mukoadhezije. Med negativno nabitimi glikoproteini in pozitivno nabitim polimerom se ustvarijo privlačne sile (prirejeno po (21).

9

Adsorpcijska teorija opisuje adhezijo farmacevtske oblike na sluznico kot posledico primarnih (kovalentnih ali ionskih) in/ali sekundarnih (van der Waalsovih, vodikovih vezi, hidrofobnih interakcij) povezav. Čeprav so primarne vezi močnejše, so nezaželene, saj so ireverzibilne hkrati pa lahko poškodujejo sluznico (16, 20).

1.3.2 Mukoadhezivni polimeri

Mukoadhezivne polimere lahko delimo glede na njihov izvor (naravni, polsintezni in sintezni), naboj (kationski, anionski in neionski), mehanizem adhezije na sluznico oz. tvorbo vezi in topnost, kar prikazuje slika 5 (18). Njihov potencial za mukoadhezijo je odraz številnih dejavnikov, in sicer

- Hidrofilnosti – mukoadhezivni polimeri imajo v strukturi številne hidrofilne funkcionalne skupine (hiroksilne, karboksilne, aminske, tiolne), ki omogočajo tvorbo vodikovih vezi in nabrekanje. Nabrekli polimeri imajo fleksibilnejše verige, kar omogoči lažjo penetracijo med verige mukusa.

- Molekulske mase polimera – večja kot je molekulska masa polimera, večja je možnost prepletanja polimernih verig in mukusa.

- Fleksibilnosti polimernih verig – rigidne verige imajo omejeno mobilnost, zato težje penetrirajo med verige mukusa.

- Premreženosti – premreženost polimera vpliva na mobilnost verig in njegovo nabrekanje. Bolj je polimer premrežen, manjša je mobilnost verig.

- Konformacije – polimeri z linearno konformacijo izkazujejo boljšo adhezijo v primerjavi s polimeri s spiralno konformacijo, ki imajo funkcionalne skupine težje dostopne ali nedostopne.

- Koncentracije polimera – za trdne farmacevtske oblike velja, da večja kot je koncentracija mukoadhezivnega polimera na mestu aplikacije, boljša je adhezija.

- pH mikrookolja – le-ta lahko vpliva na mukoadhezijo, če ima polimer v strukturi prisotne ionizirajoče skupine (23–25).

10

Idealen mukoadheziven polimer je netoksičen, biorazgradljiv, ustrezno nabreka in tvori z mukusom sekundarne interakcije. Po aplikaciji se mora hitro adherirati in zagotavljati ravno prav močno adhezijo. Na mestu adhezije ne sme povzročati draženja. Na jakost mukoadhezije lahko vplivamo tudi z jakostjo in trajanjem pritiska formulacije na sluznico med aplikacijo (25).

1.3.3 Vrednotenje mukoadhezije

Metode, ki se uporabljajo za vrednotenje mukoadhezije, lahko razdelimo na neposredne in posredne. Od izbire metode pa je odvisno, kateri parameter bo pokazatelj mukoadhezivnih lastnosti polimera oz. formulacije. Neposredne metode merijo silo ali čas, ki je potreben za odstranitev formulacije od substrata (npr. sluznice, komercialno dostopnega mucina).

Posredne metode pa merijo lastnosti polimera oz. formulacije (hidrofilnost, viskoznost), ki vplivajo na proces adhezije (16). Metode za vrednotenje mukoadhezije so ključnega pomena, saj nam dobljeni rezultati pomagajo razumeti mehanizem in določiti moč adhezije. Prav tako so pomembne za nadaljnji razvoj mukoadhezivnih farmacevtskih oblik. Kljub temu da so

Slika 5: Razdelitev mukoadhezivnih polimerov glede na izvor, naboj, topnost v vodi in mehanizem vezave z glikoproteini mukusa (povzeto po (15)).

11

mukoadhezivne farmacevtske oblike zelo zanimive in obetavne, do danes še ni razvite standardizirane metode za vrednotenje njihovih mukoadhezivnih lastnosti, kar povzroča težave pri interpretaciji in primerjavi rezultatov, pridobljenih s pomočjo različnih metod (20).

1.3.3.1 Reološke meritve

Vrednotenje reoloških lastnosti je eden izmed posrednih pristopov vrednotenja mukoadhezivnosti. Prva, ki sta ta pristop uporabila za določevanje mukoadhezivnih lastnosti polimerov, sta bila Hassan in Gallo (26). Predpostavila sta, da se energija fizikalnih in kemijskih vezi, ki nastanejo pri interakciji med polimerom in mucinom, pretvori v mehansko energijo ali delo. Delo pa povzroči prerazporeditev makromulekul, kar se odraža v spremembi viskoznosti zmesi mukoadhezivnega polimera in mucina, ki jo lahko pripišemo mukoadheziji. Torej, v kolikor polimer izkazuje mukoadhezivne lastnosti, pride do povečanja viskoznosti zmesi polimera in mucina, v primerjavi z vsoto viskoznosti posameznih komponent. To povečanje viskoznosti je posledica dodatnih interakcij (zagozditev verig, vodikovih vezi, van der Waalsovih vezi, elektrostatskih interakcij, kovalentnih vezi), ki se ustvarijo med komponentama (26). Za preučevanje mukoadhezije, sta viskoznost sistema polimer-mucin razdelila na različne komponente, kar prikazuje enačba 1.

η_𝑚𝑖𝑥 = η_𝑝+ η_𝑚+ η_𝑏 Enačba 1

ηmix predstavlja viskoznost sistema oz. zmesi polimerne disperzije in raztopine mucina, ηp

je viskoznost polimerne disperzije in ηm viskoznost raztopine mucina. ηb se imenuje reološki sinergizem in predstavlja prispevek bioadhezije. Za relavantnost rezultatov je pomembno, da meritve izvedemo pod enakimi pogoji za vse vzorce: enaka koncentracija polimera in mucina v vseh vzorcih (torej enaka koncentracija polimera v polimerni disperziji in zmesi polimerne disperzije in raztopine mucina ter enaka koncentracija mucina v raztopini mucina in zmesi polimerne disperzije in raztopine mucina), temperatura, čas meritve in strižna hitrost (18, 22).

Raziskovalci so najprej za reološko vrednotenje uporabljali Brookfieldov viskozimeter, katerega slabost je destruktivnost metode, saj pride do porušitve strukture mucina in

12

polimera (20). Da bi se izognili porušitvi strukture, se sedaj pogosteje uporabljajo viskozimetri, s katerimi lahko opravimo oscilacijski test. Z oscilacijskim testom, in sicer s pomočjo amplitudnega in frekvenčnega testa, določimo elastični G' in plastični G'' modul.

Poleg tega so nekateri raziskovalci z oscilacijskim testom ugotavljali vrsto interakcij med polimerom in mucinom: če je G′ > G″ nakazuje na sekundarne interakcije, če G′ ≤ G″ naj bi prišlo med polimerom in mucinom do prepletanja in zagozditve verig (27–29).

Pri tej metodi se kot substrat uporablja postrgan mukus z živalskih sluznic ali komercialno dostopni mucini v obliki praška, ki se pred meritvijo raztopi v izbranem topilu (npr. voda, fosfatni pufer, simuliran črevesni sok) v ustrezni koncentraciji. Čeprav so komercialno dostopni mucini bolj praktični za uporabo kot postrgan mukus z živalskih sluznic in je njihova variabilnost med serijami manjša, niso najboljši model ponazarjanja in vivo pogojev.

Eden izmed razlogov je ta, da pri procesu izolacije in čiščenja pride do njihove fragmentacije in rekonstrukcija primarne oblike za to ni več mogoča. To pa se odraža v spremenjenih fizikalno - kemijskih lastnostih. Ne glede na to, pa so številne raziskave pokazale, da interakcije med komercialno dostopnimi mucini in mukoadhezivnimi polimeri obstajajo (30, 31).

Kljub temu da je ta metoda priljubljena zaradi svoje enostavnosti, pa raziskovalci menijo, da kot edina metoda ni primerna za vrednotenje mukoadhezije, saj lahko številni dejavniki vplivajo na rezultate meritev. Med najpogosteje izpostavljenimi so vrsta mucina, koncentracija mucina in polimera (20).

1.4 Sestava nanovlaken v naši raziskavi

1.4.1 Polivinilpirolidon

Polivinilpirolidon (PVP), katerega strukturna formula je prikazana na sliki 6, je sintezni hidrofilni polimer. Obstaja več vrst PVP z različnimi K vrednostmi, ki označujejo povprečno molekulsko maso polimera. Povprečna molekulska masa PVP K90 je okoli 1.000.000 g/mol.

Pri sobni temperaturi je v obliki belega ali skoraj belega praška. Je linearen polimer, ki nastane s polimerizacijo monomera N–vinilpirolidona. Je topen v vodi ter različnih organskih topilih. Amfifilen značaj mu dajeta nepolaren vinilni del in polaren pirolidonski obroč, s katerim lahko tvori vodikove vezi z donorji protonov. V farmaciji se široko uporablja, ker je netoksičen, biokompatibilen in biorazgradljiv. Uporablja se v že uveljavljenih farmacevtskih oblikah kot tudi v sodobnih dostavnih sistemih, v katerih ima

13

različne funkcije. V tabletah, kapsulah, zrncih, peletah se uporablja predvsem kot vezivo. V suspenzijah se ga lahko uporablja kot stabilizator. Uporablja se tudi kot solubilizator z namenom povečanja topnosti slabo topnih ZU. Ena izmed njegovih vlog je tudi prekrivanje neprijetnega okusa. V transdermalnih in mukoadhezivnih dostavnih sistemih se PVP dodaja zaradi adhezivnih lastnosti. V nanovlaknih, ki predstavljajo sodoben nanodostavni sistem, pa PVP omogoča njihov nastanek in predstavlja ogrodje, v katerega je vgrajena ZU (32–34).

1.4.2 Eudragit^® RL PO

Eudragit^® RL PO (slika 7) je biološko nerazgradljiv kationski sintezni polimer, ki je netopen v vodi. Je kopolimer estrov akrilne in metakrilne kisline z majhno vsebnostjo kvarternih amonijevih skupin, zaradi katerih polimer v vodi nabreka ter postane permeabilen. Pri sobni temperaturi je v obliki belih zrnc z rahlim vonjem po amonijaku. V farmacevtske oblike se dodaja za doseganje prirejenega sproščanja (35, 36).

1.4.3 Karvedilol

Karvedilol (slika 8) je neselektivni zaviralec adrenergičnih receptorjev β in α1. Nahaja se v obliki racemata. S (-) enantiomer deluje tako na α1 kot tudi na β receptorje, medtem ko R (+)

Slika 6: Strukturna formula polivinilpirolidona.

Slika 7: Strukturna formula Eudragita® RL PO.

14

enantiomer deluje le na α1 receptorje. Poleg vazodilatornega delovanja ima tudi antioksidativni in antiproliferativni učinek. Zdravila s karvedilolom se predpisujejo pri povišanem krvnem tlaku, za zdravljenje kronične angine pektoris, kroničnega srčnega popuščanja in za zdravljenje po miokardnem infarktu (37).

Karvedilol se nahaja v obliki belega kristaliničnega praška. Je lipofilna ZU, njegova log P vrednost je 3,8. Topen je v diklorometanu, dimetilsulfoksidu in metanolu. Zmerno topen je v etanolu in izopropanolu, praktično netopen pa je v vodi (38). Ker ima v svoji strukturi prisotno sekundarno aminsko skupino, ga uvrščamo med šibke baze (pKa = 7,8). Njegova topnost je odvisna od pH medija, in sicer je slabše topen v nevtralnem in alkalnem mediju.

Pri sobnih pogojih in pH medija > 9 je njegova topnost manjša od 1 µg/mL, pri pH 7,4 pa znaša približno 9 µg/mL, najbolj topen pa je pri pH 5, ko se raztopi okoli 100 µg/mL učinkovine. Pri nižjih pH vrednostih medija je njegova topnost omejena s topnostjo nastale protonirane oblike, ki je pri nižjih pH vrednostih slabše topna. Glede na biofarmacevtski klasifikacijskem sistem (BCS) karvedilol uvrščamo v skupino II, v katero sodijo slabo topne, a dobro permeabilne ZU. Po peroralni aplikaciji je njegova biološka uporabnost majhna (25- 35 %), kar ni le posledica slabe topnosti, ampak tudi obsežnega predsistemskega metabolizma (37, 39, 40).

V tej magistrski nalogi smo karvedilol uporabili kot modelno slabo topno ZU, ki smo jo vgradili v polimerna nanovlakna.

Slika 8: Strukturna formula karvedilola.

15

2 NAMEN DELA

Namen magistrske naloge je izdelati bioadhezivna polimerna nanovlakna s podaljšanim sproščanjem vgrajene slabo topne ZU. Kot modelno učinkovino bomo uporabili karvedilol, ki glede na BCS spada med učinkovine razreda II, za katere je značilna slaba topnost in dobra permeabilnost. Z metodo elektrostatskega sukanja želimo izdelati gladka polimerna nanovlakna, brez nepravilnosti v strukturi in s premerom na nanometerskem nivoju. S tem želimo izboljšati topnost karvedilola. Kot osnovni gradnik nanovlaken bomo uporabili hidrofilni polimer z bioadhezivnimi lastnostmi, in sicer PVP K90. Za dosego podaljšanega sproščanja bomo osnovni formulaciji dodali v vodi netopen polimer Eudragit^® RL PO.

Dodali ga bomo v različnih deležih, s čimer bomo ugotavljali, ali delež Eudragit^® RL PO v formulaciji vpliva na hitrost sproščanja ZU. Morfologijo in premer nanovlaken bomo proučili z vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM). S testom sproščanja bomo ugotavljali hitrost sproščanja karvedilola iz nanovlaken in s tem ovrednotili vpliv dodanega Eudragita^® RL PO na sproščanje. Ker si želimo, da z izdelavo nanovlaken povečamo topnost karvedilola, bomo s testom topnosti ugotovili, ali nam bo to uspelo. Tako bomo proučili, kakšen je vpliv dostavnega sistema na topnost modelne učinkovine v primerjavi z njeno topnostjo v fizikalni zmesi z enako sestavo. Mukoadhezivne lastnosti polimerov bomo ocenili na podlagi reoloških meritev. Izvedli bomo klasičen rotacijski test pri zveznem spreminjanju strižne hitrosti. Z njim bomo ugotavljali, ali so med komponentami, ki sestavljajo nanovlakna, in komercialno dostopnim mucinom iz prašičjega želodca (tip II) kakšne interakcije. Če bomo zaznali povečanje viskoznosti zmesi napram vsoti viskoznosti posameznih komponent, bo to pokazatelj interakcij in s tem mukoadhezije.

16

3 MATERIALI IN METODE

3.1 Materiali

Kemikalije

Acetonitril, J.T.Baker, Avantor Performance Materials, Poljska Bidestilirana voda, pripravljena na Fakulteti za farmacijo Dinatrijev hidrogen fosfat, Merck KgaA, Darmstadt, Nemčija Eudragit^® RL PO, Evonic Industries, Nemčija

Etanol 96 % (V/V), Pharmachem Sušnik Jožef, Slovenija Kalijev dihidrogen fosfat, Merck KgaA, Darmstadt, Nemčija Kalijev klorid, Merck KgaA, Darmstadt, Nemčija

Karvedilol, Krka d.d., Slovenija

Mucin iz prašičjega želodca, tip II, LOT 14H0072, Sigma Aldrich St. Louis, ZDA Metanol, EMPARTA®, Merck KgaA, Darmstadt, Nemčija

Natrijev klorid , Merck KgaA, Darmstadt, Nemčija

Ortofosforna kislina 85 %, Merck KgaA, Darmstadt, Nemčija

Polietilenoksid (PEO), Mr 400.000 g/mol, Sigma Aldrich chemie GmbH, Steinheim, Nemčija

Polivinilpirolidon K90,(PVP K90), BASF SE, Ludwigshafen, Nemčija Prečiščena voda, pripravljena na Fakulteti za farmacijo

Laboratorijska oprema

Analitska tehtnica, Mettler Toledo AG24, Scherzenbach, Švica Analitska tehtnica, Mettler Toledo XS205, Scherzenbach, Švica Filtri 0,45 µm, R 25mm, Lab logistic Group GmbH, Labware, ZDA Filtri 10 μm, Full Flow Filter, Agilent Technologies, ZDA

17 HPLC Agilent 1100, Švica

Injekcijske brizge 5 mL BD Discordit ™ II Becton Dickinson S.A., Španija Injekcijske brizge 10 mL BD Discordit ™ II Becton Dickinson S.A., Španija Injekcijske brizge 20 mL BD Discordit ™ II Becton Dickinson S.A., Španija Injekcijske igle G22 0,7 x 50 TIK d.o.o., Kobarid, Slovenija

Kovinska igla z notranjim premerom 0,8 mm Linari Engineering s.r.l., Italija Laboratorijski film, Parafilm® M Bemis Company Inc., ZDA

Kolona za HPLC BetaBasic™ C8 (3 µm, 150 mm x 4,6 mm), Thermoscientific, ZDA Magnetno mešalo Ika® RCT basic, Nemčija

Magnetno mešalo 10 mestno Ika® RCT basic, Nemčija Naprava za elektrostatsko sukanje:

- generator visoke napetosti, model HVG-P50-R-EU, Linari Engineering s.r.l., Italija - črpalka, model R-99, Razel Scientific, ZDA

- planarno zbiralo

- plastična brizga 20 mL, B. Braun

- kovinska igla, premer 0,8 mm, Linari Engineering s.r.l., Italija

Naprava za vrednotenje sproščanja z vesli (naprava II) VanKel VK 7010, ZDA

Ostali inventar: čaše, erlenmajerice, kapalke, steklene palčke, merilni valj, merilne in polnilne pipete, merilne bučke, čolnički, spatule, žličke

pH meter, S220 Seven Compact pH/ion, Mettler Toledo, Scherzenbach, Švica

Reometer z nastavljivo strižno hitrostjo Physica MCR 301, Anton Paar® , Avstrija, nastavek CP50-2, D = 49,961 mm, 2,001°

Viale 1,5 mL Lab Logistic Group GmbH, Nemčija

18

3.2 Metode

3.2.1 Priprava polimernih raztopin za izdelavo nanovlaken

Polimerne raztopine za izdelavo nanovlaken smo pripravili tako, da smo v 50 mL erlenmajerico z obrusom natehtali ustrezno količino 96 % (V/V) etanola in dodali magnetek (preglednica I). Nato smo na tehtalne čolničke natehtali ustrezno maso polimerov (PVP K90, Eudragit^® RL PO) in ZU tako, da je delež ZU predstavljal 5, 10 ali 20 % (m/m) glede na maso polimerov (preglednica I). Natehtane sestavine smo kvantitativno prenesli v erlenmajerico z etanolom, jo pokrili s steklenim zamaškom in zatesnili s parafilmom. Vzorce smo postavili na magnetno mešalo in jih pustili mešati pri sobni temperaturi čez noč ( 24 h), da so se vse sestavine raztopile.

Preglednica I: Sestava polimernih raztopin za izdelavo nanovlaken.

Oznaka formulacije/

Sestava formulacije

NV1 NV2 NV3 NV4 NV5 NV6

PVP K90 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g

Eudragit^® RL PO / / / / 0,5 g 1,0 g

Karvedilol / 0,1 g 0,2 g 0,4 g 0,5 g 0,6 g

Etanol 96 % (V/V) 18,0 g 17,9 g 17,8 g 17,6 g 17 g 16,4 g

3.2.2 Elektrostatsko sukanje

Iz pripravljenih etanolnih raztopin polimerov, katerih postopek priprave je opisan v poglavju 3.2.1, smo s postopkom elektrostatskega sukanja izdelali nanovlakna. Raztopine, ki smo jih čez noč pustili mešati, smo odstavili z mešala. Nato smo približno 10 mL raztopine nalili v 20 mL plastično brizgo. Na brizgo smo namestili kovinsko iglo s premerom 0,8 mm in iz brizge iztisnili vse zračne mehurčke. Nato smo brizgo vpeli na črpalko, ki potiska bat brizge in na ta način zagotavlja konstanten pretok polimerne raztopine skozi kovinsko iglo.

Kovinsko iglo smo povezali še z izvorom visoke električne napetosti in na ustrezno razdaljo postavili ozemljeno planarno zbiralo, ovito z aluminijasto folijo. S tem smo ob vklopu vira električne napetosti povzročili nastanek električnega polja med konico igle in zbiralom, kar omogoča potovanje polimerne raztopine proti zbiralu in nastanek nanovlaken. Elektrostatsko

19

sukanje smo izvajali v komori pri sobni temperaturi (20 °C–25 °C) in relativni vlažnosti 26–

44 %.

Glede na to, da so imele polimerne raztopine različno sestavo, smo za čim bolj optimalno morfologijo vseh vzorcev nanovlaken prilagajali pogoje eletrostatskega sukanja. Spreminjali smo razdaljo med konico igle in zbiralom (13 – 17 cm), električno napetost ( 13 kV – 17 kV) in pretok polimerne raztopine skozi kovinsko iglo (1,06 mL/h in 1,56 mL/h). Optimizirani pogoji elektrostatskega sukanja so predstavljeni v preglednicah II in III.

Preglednica II: Parametri elektrostatskega sukanja za formulacije NV1, NV2 in NV3.

Formulacija/

Parametri NV1 NV2 NV3

Notranji premer kovinske igle

(mm)

0,8 0,8 0,8

Razdalja med zbiralom in konico igle (cm)

17 17 17

Električna

napetost (kV) 15 17 17

Pretok (mL/h) 1,56 1,56 1,56

Čas sukanja

(min) 5 5 5

20

Preglednica III: Parametri elektrostatskega sukanja za formulacije NV4, NV5 in NV6.

Formulacija/

Parametri NV4 NV5 NV6

Notranji premer kovinske igle

(mm)

0,8 0,8 0,8

Razdalja med zbiralom in konico igle (cm)

15 17 15

Električna

napetost (kV) 15 17 15

Pretok (mL/h) 1,56 1,06 1,06

Čas elektrostatskega

sukanja (min)

Za SEM analizo

Za test sproščanja,

topnosti in vsebnosti

Za SEM analizo

Za test sproščanja,

topnosti in vsebnosti

Za SEM analizo

Za test sproščanja,

topnosti in vsebnosti

5 180 5 180 5 180

3.2.3 Preučevanje morfoloških lastnosti nanovlaken

Morfološke lastnost izdelanih polimernih nanovlaken smo preučili z vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM). Vzorce smo pripravili tako, da smo izrezali majhne kvadratke aluminijastih folij, na katerih so bila zbrana nanovlakna, in jih s pomočjo obojestranskega prevodnega lepilnega traka pritrdili na kovinske nosilce za SEM analizo. Slike smo posneli pri pospeševalni napetosti 1 kV z uporabo detektorja za sekundarne elektrone. Z uporabo programa ImageJ 1.44p (NIH, ZDA) smo na podlagi analize 30 naključno izbranih nanovlaken na reprezentativnih SEM slikah določili povprečno debelino nanovlaken posamezne formulacije ter njeno standardno deviacijo.

3.2.4 Sproščanje učinkovine Priprava medija za sproščanje

Medij smo pripravili tako, da smo merilno bučko z volumnom 1 L do treh četrtin napolnili s prečiščeno vodo. V njo smo kvantitativno prenesli predhodno natehtane kemikalije, in sicer

21

8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 in 0,24 g KH2PO4 ter jih raztopili med mešanjem.

Po potrebi smo z 0,1 M NaOH uravnali pH na 7,4 ± 0,05. Nato smo vsebino bučke s prečiščeno vodo dopolnili do oznake 1 L. Tako pripravljen pufer smo uporabljali kot medij pri testu sproščanja, testu topnosti, testu vsebnosti ter pri vseh redčitvah vzorcev.

Priprava vzorcev

Vzorce nanovlaken za test sproščanja smo pripravili tako, da smo iz aluminijaste folije z nanovlakni s skalpelom izrezali pravokotnike, s katerih smo s pomočjo pincete odstranili nanovlakna in jih prenesli na tehtalni čolniček. Natančno smo natehtali 25-31 mg posameznega vzorca. Nato pa smo vzorec nanovlaken previdno in čim bolj enakomerno navili na steklene palčke dolge 8 cm in s premerom 0,5 cm, ki so služile kot nosilci naših vzorcev (slika 9). Oba konca nosilcev smo pustili prazna, da smo lahko s pinceto prijeli palčke na koncih in jih previdno prenesli v posode z vesli, ki smo jo predhodno napolnili z medijem za sproščanje.

Izvedba testa sproščanja

Sproščanje karvedilola iz polimernih nanovlaken, ki so vsebovale 20 % (m/m) učinkovine glede na maso polimerov, smo vrednotili takoj po izdelavi nanovlaken in po treh mesecih shranjevanja pri sobnih pogojih. Preskus smo izvedli v 3 paralelah. Test smo izvedli z uporabo naprave z vesli (naprava II), pri katerem smo zaradi uporabe steklenih nosilcev morali položaj vesel prilagoditi glede na farmakopejske predpise (41). Tako so bila vesla v naših preskusih oddaljena 6,5 cm od spodnjega roba steklene posode. Volumen medija je bil 900 mL, temperatura 37,0 ± 0,5 °C in hitrost vesel 50 obratov/min. Vzorčili smo v naslednjih časovnih točkah: 5, 10, 20, 30, 60, 180 in 1440 min. V kolikor se v tem času še ni sprostila vsa ZU smo test sproščanja podaljšali in vzorčili še po 30 in 48 urah. Odvzem vzorcev je

Slika 9: Steklen nosilec z vzorcem nanovlaken za test sproščanja.

22

potekal ročno, in sicer tako, da smo s plastično 10 mL brizgo, na katero smo predhodno namestili filter z velikostjo por 10 μm, ob robu steklene posode odvzeli vzorec. Po odvzemu vzorca smo na brizgi zamenjali filter z velikostjo por 10 μm s filtrom z velikostjo por 0,45 μm, skozi katerega smo prefiltrirali vzorec tako, da smo prvih nekaj kapljic filtrata zavrgli nato pa smo s filtratom napolnili vialo za HPLC analizo, s katero smo določili koncentracijo karvedilola v vzorcih. Odvzeti volumen vzorca smo takoj po odvzemu vzorca nadomestili s svežim medijem.

3.2.5 Test topnosti

Proučevali smo vpliv formulacije na topnost karvedilola v pufru s pH 7,4. Primerjali smo topnost učinkovine v fizikalnih zmeseh in topnost učinkovine v nanovlaknih. Test smo izvedli tako, da smo v 50 mL erlenmajerice s polnilno pipeto odmerili 50 mL medija za sproščanje, katerega priprava je opisana v poglavju 3.2.4, in dodali magnetek. Količino nanovlaken in fizikalne zmesi za test smo določili tako, da je bila teoretična vsebnost karvedilola v mediju za raztapljanje 90 μg/mL. Količine natehtanih vzorcev so prikazane v preglednici IV. Postopek priprave vzorcev nanovlaken je bil enak kot je opisan v poglavju 3.2.4, le da smo zaradi manjše velikosti erlenmajerice nanovlakna navili na krajše in tanjše nosilce (dolge 5,5 cm in s premerom 0,4 cm). Steklene nosilce z nanovlakni smo poševno položili v erlenmajerice napolnjene z medijem in dodanim magnetkom. Erlenmajerice smo nato zaprli s steklenimi zamaški. Fizikalne zmesi smo pripravili tako, da so imele enako kvalitativno in kvantitativno sestavo kot nanovlakna. Na tehtalne čolničke smo natehtali vse sestavine, vključno s karvedilolom in jih kvantitativno prenesli v erlenmajerico napolnjeno s 50 mL medija ter začeli s testom topnosti. Poleg tega smo pripravili tudi predraztopine pomožnih snovi, pri katerih smo na tehtalne čolničke natehtali ustrezne količine polimerov (PVP in Eudragit^® RL PO) in jih kvantitativno prenesli v erlenmajerico napolnjeno s 50 mL medija ter jih na magnetnem mešalu mešali 24 ur. Nato smo dodali še karvedilol ter pričeli s testom topnosti. V časovnih točkah 0,5, 1, 2, 4, 24 in 26 h smo s 5 mL plastično brizgo odvzeli 5 mL vzorca. To smo storili tako, da smo sprva na brizgo namestili 10 µm filter in odvzeli vzorec, nato smo ta filter zamenjali z 0,45 µm filtrom, skozi katerega smo prefiltrirali vzorce v viale. Pri tem smo prvih nekaj kapljic filtrata zavrgli. Da so bila nanovlakna popolnoma omočena v času izvajanja testa, smo po 2 h testa začeli dodajati enako količino svežega medija kot je bilo odvzetega vzorca. Vzorce smo redčili z medijem tako, da je bila koncentracija učinkovine znotraj koncentracijskega območja umeritvene premice. S HPLC

23

analizo smo določili koncentracijo karvedilola v vzorcih. Vse preizkuse smo izvedli v 3 paralelah.

Preglednica IV: Natehte posameznih formulacij nanovlaken in posameznih komponent fizikalnih zmesi za test topnosti.

Formulacija

NV4 NV5 NV6 FZ 1/24h FZ 1

FZ 2/24h FZ 2

FZ 3 /24h FZ

3

Natehta formulacije NV (mg) 27 27 27 27 27 27

Količina karvedilola v fizikalni

zmesi (mg) 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5

Količina PVP v fizikalni zmesi

(mg) 22,5 18 13,5 22,5 18 13,5

Količina Eudragit^® RL PO v

fizikalni zmesi (mg) / 4,5 9 / 4,5 9

Teoretična vsebnost karvedilola v

mediju za raztapljanje (μg/mL) 90 90 90 90 90 90

3.2.6 Test vsebnosti karvedilola v nanovlaknih

Vsebnosti ZU v nanovlaknih smo preverili v sveže pripravljenih nanovlaknih NV5 (PVP:Eudragit^® RLPO = 4:1), saj se pri testu sproščanja v 24 h ni sprostila vsa ZU. Izvedli smo ga tako, da smo 1 L bučke do treh četrtin napolnili s PBS pufrom s pH 7,4 in dodali magnetek. Nato smo natančno natehtali 10 – 15 mg vzorca nanovlaken in ga s pinceto previdno potopili v medij med mešanjem na magnetnem mešalu ter bučko dopolnili s pufrom do oznake 1 L. V časovnih točkah 24, 48 in 72 h smo odvzeli vzorec s 5 mL brizgo, na katero smo imeli nameščeno iglo. Iglo smo po vzorčenju zamenjali z 0,45 µm filtrom, skozi katerega smo prefiltrirali vzorce v viale za analizo HPLC. Pri tem smo prvih nekaj kapljic filtrata zavrgli. Odvzeti volumen vzorca smo takoj po odvzemu vzorca nadomestili s svežim medijem. Poskuse smo izvajali v treh paralelah.

3.2.7 HPLC analiza

Za HPLC analizo smo uporabili kolono Beta Basic C8 (3 µm, 150 mm x 4,6 mm; Thermo Scientific). Kot mobilno fazo smo uporabili mešanico 0,02 M raztopine kalijevega dihidrogenfosfata, katere pH smo z ortofosforno kislino uravnali na 2, ter acetonitrila v

24

volumskem razmerju 6,5 : 3,5. Pretok mobilne faze je bil 1,0 mL/min, temperatura kolone 35 °C, volumen injiciranja 20 µL in čas analize 9 min. Učinkovino pa smo detektirali z

»diode array« detektorjem pri valovni dolžini 241 nm (metoda povzeta po (10)).

3.2.7.1 Priprava umeritvene krivulje

Osnovno raztopino karvedilola smo pripravili tako, da smo natančno natehtali približno 15 mg karvedilola in ga kvantitativno prenesli v 1 L merilno bučko. Natehto smo si zapisali, da smo jo uporabili pri izračunu dejanskih koncentracij. Nato smo v bučko dodali 20 mL metanola, da se je karvedilol popolnoma raztopil, in dopolnili bučko do oznake 1 L s fosfatnim pufrom (poglavje 3.2.4) ter dobro premešali. Osnovno raztopino smo nato filtrirali skozi 0,45 µm filter, pri čemer smo prvih 20 mL filtrata zavrgli in s tem nasičili filter z učinkovino. Pripravili smo serijo redčitev filtrirane osnovne raztopine karvedilola v koncentracijskem območju 1,54 - 11,63 µg/mL. Umeritveno krivuljo smo pripravili na osnovi dveh nateht in sedmih redčitev vsake osnovne raztopine.

3.2.8 Reološko vrednotenje mukoadhezije

3.2.8.1 Priprava vzorcev mucina

Za pripravo vzorcev mucina smo uporabili komercialno dostopen prašičji mucin. V vseh poskusih smo uporabljali mucin iz iste serije. Pripravili smo 20 % (m/m) raztopino mucina v prečiščeni vodi. Na tehtalne čolničke smo natehtali ustrezno količino mucina, ki smo ga postopoma ob konstantnem mešanju na magnetnem mešalu, stresali v predpisano količino prečiščene vode. Mešali smo toliko časa, dokler nismo dobili homogene raztopine. Nastale raztopine so bile rjave barve z značilnim vonjem po mucinu. Vse pripravljene vzorce smo dobro zatesnili s parafilmom in prekrili z aluminijasto folijo ter jih pustili 2 dni v hladilniku pri 4 °C, da so se ustrezno hidrirali (metoda povzeta po (42)).

3.2.8.2 Priprava vzorcev polimerov

Pripravili smo 20 g polimernih disperzij, katerih sestava je podana v preglednici V. Vzorce smo pripravili tako, da smo sestavine posameznega vzorca natehtali na tehtalne čolničke in jih ob konstantnem mešanju na magnetnem mešalu postopoma stresali v ustrezno količino prečiščene vode. Mešali smo toliko časa, dokler nismo dobili homogene disperzije.

25

Preglednica V: Sestava disperzij polimerov za reološke meritve.

Sestava formulacije/

oznaka formulacije

PVP (g) Eudragit^® RL PO (g)

Karvedilol (g) Prečiščena voda (g)

F1 2,0 / / 18,0

F2 2,0 0,5 / 17,5

F3 2,0 1,0 / 17,0

F4 2,0 0,5 0,5 17,0

3.2.8.3 Priprava zmesi mucinov s polimeri

Za analizo reološkega sinergizma je potrebno vzorce polimernih disperzij združiti z raztopino mucina, da nastopijo potencialne medsebojne interakcije, ki se odražajo v spremembi viskoznosti. Za izračun reološkega sinergizma sistema po enačbi 1 potrebujemo 3 različne vzorce:

1. Zmes polimerne disperzije in raztopine mucina

(ta vzorec definira viskoznost sistema (ηmix ) v enačbi 1)

2. Vodno disperzijo polimera z enako koncentracijo kot v disperziji zmesi z mucinom (ta vzorec definira viskoznost polimerne disperzije (ηp) v enačbi 1)

3. Vodno raztopino mucina z enako koncentracijo kot v disperziji zmesi s polimerom (ta vzorec definira viskoznost raztopine mucina (ηm) v enačbi 1)

Ker se v literaturi najpogosteje pojavljajo 4 % koncentracije mucina v združenem vzorcu polimera in mucina (43–45), smo združili disperzije polimera in mucina v masnem razmerju 80:20, da je bila koncentracija mucina v združenem vzorcu 4 %. Vzorce disperzij smo združili pri sobni temperaturi tako, da smo v manjši plastičen lonček s pokrovčkom, v katerega smo dodalimagnetek, natehtali 8 g vzorca polimerne disperzije in 2 g raztopine mucina (slika 10). Ko smo pripravljali vzorce, ki so definirali ηp, smo raztopino mucina zamenjali s prečiščeno vodo. Torej smo združili vodno disperzijo polimera s prečiščeno vodo v masnem razmerju 80:20. Ko pa smo pripravljali vzorce, ki so definirali ηm, smo disperzijo polimera zamenjali s prečiščeno vodo, tako da smo združili vodno raztopino mucina s prečiščeno vodo v masnem razmerju 20:80. Zmes obeh raztopin smo na magnetnem mešalu

26

mešali 20 min, nato pa smo jo neprodušno zaprli in jo pred reološkimi meritvami shranili za 1 dan v hladilniku pri 4 °C.

3.2.8.4 Reološke meritve

Za vrednotenje mukoadhezivnih lastnosti smo uporabili reometer Anton Paar® Physica MCR 301 z merilnim sistemom stožec - ploščica CP50-2 (2r = 49,961 mm, kot 2,001 °).

Izvedli smo klasičen rotacijski test pri zveznem spreminjanju strižne hitrosti od 1 do 100 s^-1 pri temperaturi 25 °C. Analiza je trajala 200 s. Test je potekal tako, da smo pripravljene vzorce vzeli iz hladilnika in jih 5 min mešali pri sobni temperaturi na magnetnem mešalu.

Nato smo jih s pomočjo kapalke previdno nanesli na ploščo, da smo zapolnili ves prostor med sistemom stožec - ploščica. Ko smo sistem združili, smo odvečno količino vzorca ob straneh sistema odstranili s spatulo in vzorec pustili stati še 3 min, da se je ogrel na sobno temperaturo, potem pa izvedli meritev. Viskoznost vzorcev smo odčitali pri strižni hitrosti 20 s^-1.

Slika 10: Vzorec raztopine polimera in raztopine zmesi polimera in mucina za reološke meritve.

27

4 REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1 Izdelava nanovlaken iz polimernih raztopin z elektrostatskim sukanjem in preučevanje njihove morfologije

Raziskovalno delo smo začeli z izdelavo nanovlaken iz PVP K90 brez vgrajenega karvedilola (poglavje 3.2.2, preglednica II, formulacija NV1). Iz slike 11, ki prikazuje morfologijo nanovlaken formulacije NV1 vidimo, da so nanovlakna naključno razporejena, njihova površina je gladka in brez por. Kljub temu pa vidimo, da so v strukturi prisotne manjše zadebelitve oz. zametki zlivanja stikov nanovlaken (na sliki 11 označeno z modro barvo) in vozli (na sliki 11 označeno z rdečo barvo), ki so verjetno odraz ne povsem optimalnih pogojev elektrostatskega sukanja. S pomočjo uporabe programa ImageJ 1.44p smo ugotovili, da so pri izbranih pogojih elektrostatskega sukanja nastala tanka, vendar nehomogena nanovlakna, kar kaže velika standardna deviacija debeline nanovlaken (slika 12).

NV1

Slika 11: SEM slike formulacij nanovlaken NV1, pri večji povečavi (levo) in manjši povečavi (desno). Na sliki so z modro barvo prikazane zadebelitve, z rdečo barvo pa vozli.

28

Po izdelavi nanovlaken iz PVP K90 smo poskušali v nanovlakna vgraditi čim več karvedilola (5, 10 in 20 % (m/m) glede na maso PVP K90). Ena izmed omejitev farmacevtskih oblik za bukalno uporabo je njihova velikost, ki mora biti dovolj majhna, da so primerne za aplikacijo na bukalno sluznico. Slika 13 prikazuje morfologijo nanovlaken z različnim deležem vgrajene ZU (NV2, NV3 in NV4). Pri vseh vzorcih vidimo, da so nanovlakna naključno razporejena, njihova površina je gladka in brez por. Prav tako na njihovi površini nismo zasledili kristalnih struktur, iz česar lahko sklepamo, da se je karvedilol vgradil v nanovlakna. Kljub temu pa vidimo, da so tudi v njihovi v strukturi prisotne določene nepravilnosti. Pri formulacijah nanovlaken NV2 in NV4 vidimo prisotnost vozlov (na sliki 13 označeno z rdečo barvo). Prav tako vidimo, da so se posamezna nanovlakna pri formulaciji NV4 razcepila (na sliki 13 označeno z rumeno barvo). Analiza debeline nanovlaken z ZU je pokazala, da so nastala tanka, vendar nehomogena nanovlakna, saj je standardna deviacija debeline velika (slika 12). Na podlagi analize premerov nanovlaken z ZU in brez nje lahko zaključimo, da delež ZU v formulaciji ne vpliva na premer nanovlaken, saj se premer nanovlaken ni sorazmerno povečeval z večanjem deleža ZU v formulaciji, ampak je med formulacijami nihal.

220 178 178 190

261 285

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

NV1 NV2 NV3 NV4 NV5 NV6

Povprečni premer nanovlaken (nm)

Formuacija Slika 12: Debelina nanovlaken NV1, NV2, NV3, NV4, NV5 in NV6.

29

Pri analizi premerov nanovlaken formulacij NV5 in NV6, v kateri smo dodali različni količini Eudragita^® RL PO, smo ugotovili večje premere v primerjavi s premerom nanovlaken brez dodanega Eudragita^® RL PO. Povprečna debelina nanovlaken formulacije NV5 je bila 261 ± 152 nm, NV6 pa 285 ± 192 nm. Na podlagi dobljenih rezultatov lahko zaključimo, da Eudragit^® RL PO vpliva na premer nanovlaken, saj večji kot je njegov delež, večji je premer nanovlaken. Prav tako smo pri obeh formulacijah ugotovili veliko standardno

Slika 13: SEM slike formulacij nanovlaken, NV2, NV3 in NV4 pri večji povečavi (levo) in manjši povečavi (desno). Na sliki so z rdečo barvo prikazani vozli, z rumeno pa razcepitve.

NV2

NV3

NV4

30

deviacijo debeline nanovlaken (slika 12), kar je odraz neenakomernosti debeline nanovlaken in se jasno vidi tudi na sliki 14. Površina nanovlaken je bila gladka in brez por, vendar po dodatku Eudragita^® RL PO vlakna več niso bila tako iztegnjena, kot je vidno pri nanovlaknih formulacije NV4 na sliki 13. Prav tako so bolj opazne razcepitve vlaken in nastanek nitk, ponekod pa opazimo tudi nastanek mrežastih razcepitev (na sliki 14 označeno z rumeno).

Naštete nepravilnosti so bolj izražene pri formulaciji NV6.

4.2 Sproščanje karvedilola

Po uspešni izdelavi nanovlaken smo vrednotili hitrost sproščanja karvedilola iz nanovlaken.

Izhajali smo iz nanovlaken iz hidrofilnega polimera PVP K90 (NV4), pri katerih smo pričakovali takojšnje sproščanje učinkovine. Za upočasnitev sproščanja smo v osnovno formulacijo dodali v vodi netopen polimer Eudragit^® RL PO. Dodali smo ga v dveh različnih masnih razmerjih, in sicer v formulaciji NV5 je bilo razmerje PVP K90:Eudragit^® RL PO=4:1, v formulaciji NV6 pa PVP K90:Eudragit^® RL PO=2:1. V obeh formulacijah je bila

Slika 14: SEM slike nanovlaken formulacij NV5 in NV6 pri večji povečavi (levo) in manjši povečavi (desno). Na sliki so z rumeno barvo prikazane razcepitve.

NV5

NV6