UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
LARA PERŠA
DIPLOMSKO DELO
UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KOZMETOLOGIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
LARA PERŠA
RAZVOJ NANOVLAKEN Z VISOKIM DELEŽEM HITOSANA Z UPORABO ELEKTROSTATSKEGA SUKANJA
DEVELOPMENT OF NANOFIBERS WITH HIGH CONTENT OF CHITOSAN BY ELECTROSPINNING
UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KOZMETOLOGIJA
Ljubljana, 2021
i
Diplomsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani pod mentorstvom doc. dr. Špele Zupančič, mag. farm., ki je posnela slike nanovlaken z vrstično elektronsko mikroskopijo na Kemijskem inštitutu.
ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem svoji mentorici doc. dr. Špeli Zupančič za konstantno razpoložljivost, potrpežljivost ter za vso strokovno pomoč in usmerjanje pri pisanju diplomske naloge.
Največja zahvala gre mojim staršem, ki so me skozi vsa leta študija finančno podpirali in me spodbujali.
IZJAVA
Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr. Špele Zupančič, mag. farm. Diplomska naloga je bila izvedena kot del projekta ARRS J1-9194, ki ga je vodila prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm.
Lara Perša
ii
KAZALO VSEBINE
POVZETEK iv
ABSTRACT v
SEZNAM OKRAJŠAV vi
1 UVOD 1
1.1 NANOVLAKNA 1
1.1.1 Uporaba nanovlaken 2
1.1.2 Hitosan in hitosanska nanovlakna 3
1.2 ELEKTROSTATSKO SUKANJE 5
1.2.1 Parametri elektrostatskega sukanja 7
1.2.1.1 Lastnosti polimerne raztopine 7
1.2.1.2 Procesni parametri 8
1.2.1.3 Dejavniki okolja 10
2 NAMEN DELA 11
3 MATERIALI IN METODE 12
3.1 MATERIALI 12
3.2 NAPRAVE 12
3.3 METODE 13
3.3.1 Priprava polimernih raztopin 13
3.3.2 Elektrostatsko sukanje 15
3.3.3 Vrednotenje nanovlaken 16
4 REZULTATI IN RAZPRAVA 17
4.1 NANOVLAKNA S 50-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA 17
4.2 NANOVLAKNA S 60-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA 18
4.3 NANOVLAKNA S 70-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA 19
4.3.1 Vpliv molekulske mase PEO 20
4.3.2 Vpliv temperature in RH 21
4.3.3 Vpliv dodatka PAS 22
4.4 NANOVLAKNA Z 80-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA 23
4.4.1 Vpliv razdalje med iglo in zbiralom 24
4.4.2 Vpliv temperature in RH 25
4.4.3 Vpliv dodatka PAS 27
4.5 NANOVLAKNA S 90-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA 29
iii
4.5.1 Vpliv dodatka Tweena 20 31
4.5.2 Vpliv dodatka Kolliphorja HS 15 32
4.5.3 Vpliv PAS na premer nanovlaken in pojavnost polimernih madežev 34
5 SKLEP 36
6 VIRI IN LITERATURA 38
iv
POVZETEK
Polimerna nanovlakna predstavljajo enega izmed najsodobnejših nanomaterialov, ki so v zadnjih dveh desetletjih postala osrednji predmet mnogih znanstvenih raziskav. Nanovlakna lahko izdelamo iz številnih polimerov, med katere prištevamo tudi hitosan. Hitosan je naravni polimer, ki izkazuje biokompatibilnost, netoksičnost in biorazgradljivost, zaradi katerih je primeren za uporabo v biomedicinske namene.
Namen diplomske naloge je bil optimizirati postopek elektrostatskega sukanja tako, da bi izdelali visokokakovostna nanovlakna brez vozlov in s čim višjim možnim deležem hitosana. Da bi olajšali nastanek nanovlaken, smo raztopini dodali kopolimer polietilenoksid. Zasnovali smo poskuse, s katerimi smo poglobili naše razumevanje vpliva različnih spremenljivk, kot so sestava raztopine, procesni parametri in dejavniki okolja, na morfologijo in premer izdelanih nanovlaken. Povprečni premer in morfologijo nanovlaken smo vrednotili z vrstično elektronsko mikroskopijo.
Elektrostatsko smo sukali raztopine hitosana in polietilenoksida v masnih razmerjih 50/50, 60/40, 70/30, 80/20 in 90/10. Ugotovili smo, da se s povečevanjem deleža hitosana pojavlja čedalje več prekinitev postopka elektrostatskega sukanja, kar vodi v deformacijo nanovlaken. Nepravilnosti, kot so vozli, zlepljanje vlaken, prekinitve curka in polimerni madeži, so razvidni iz slik, posnetih z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Stabilizacijo curka in neprekinjeno tvorbo vlaken smo dosegli s pripravo raztopine z dodatkom polietilenoksida z molekulsko maso 4 MDa, z dodatkom 0,1–2,0 % (m/m) površinsko aktivnih snovi v polimerno raztopino in s povečanjem napetosti na 25 kV. Ugotovili smo, da je za neprekinjen postopek nujno, da sta temperatura in relativna vlažnost v komori stalna.
Uspešno smo izdelali nanovlakna s povprečnim premerom 59–179 nm. Ker pa na proces elektrostatskega sukanja vplivajo številni znani kot tudi neznani dejavniki, katerih medsebojna povezanost kljub številnim raziskavam še ni popolnoma razjasnjena, je ponovljivost procesa izdelave nanovlaken enakomernih oblik težavna.
Ključne besede: elektrostatsko sukanje, hitosan, nanotehnologija, nanovlakna, polietilenoksid
v
ABSTRACT
Polymer nanofibers present cutting-edge nanomaterials and have in the past two decades become the centre of ongoing scientific research in this field. Nanofibers can be made from many polymers, including chitosan. Chitosan is a natural polymer that exhibits favourable characteristics, such as biocompatibility, non-toxicity and biodegradability, making it suitable for biomedical use. However, the production of chitosan nanofibers can be challenging.
The purpose of the thesis was to optimize the process of electrospinning to produce high- quality, beadless nanofibers with the highest possible chitosan content. To enhance the spinnability of the solution, polyethylene oxide was introduced. We designed experiments to deepen our understanding of the influence of different variables on the morphology and diameter of the nanofibers. The influence of solution properties, processing parameters and ambient conditions were investigated. The average diameter and morphology of the nanofibers were evaluated by scanning electron microscopy.
Chitosan/polyethylene oxide blends with a mass ratio of 50/50, 60/40, 70/30, 80/20 and 90/10 were electrospun. We found that increasing chitosan content leads to more interruptions of the electrospinning process, resulting in deformation of the obtained nanofibers. Formation of undesirable beads, fiber–fiber bonding, jet breakage, and polymer stains could be observed in the SEM images. Jet stabilization and continuous fiber formation were achieved by using polyethylene oxide with a molecular weight of 4 MDa, addition of 0.1–2.0% (m/m) surfactants to the polymer solutions and increase of the voltage to 25 kV.
We found that constant temperature and relative humidity inside the chamber were essential for the continuity of the process. We successfully prepared nanofibers with the average diameter of 59–179 nm. However, since the process of electrospinning is influenced by many known as well as unknown factors, the interconnections of which are yet to be fully clarified, the repeatability of producing uniform nanofibers remains challenging.
Key words: electrospinning, chitosan, nanotechnology, nanofibers, polyethylene oxide
vi
SEZNAM OKRAJŠAV
ECM: zunajcelično ogrodje (angl. extracellular matrix) PAS: površinsko aktivna snov
PEO: polietilenoksid PVA: polivinilalkohol
RH: relativna vlažnost (angl. relative humidity)
SEM: vrstična elektronska mikroskopija (angl. scanning electron microscopy) T: temperatura
ZU: zdravilna učinkovina
1
1 UVOD
1.1 NANOVLAKNA
Nanovlakna predstavljajo zaradi svojih edinstvenih lastnosti enega izmed najbolj zanimivih sodobnih dostavnih sistemov. V zadnjih desetletjih so postala osrednji predmet številnih znanstvenih raziskav, kar potrjuje tudi ogromno število novih raziskav in objav s tega področja (1, 2). Le-te razkrivajo čedalje več možnosti uporabe polimernih nanovlaken pri različnih področjih biomedicine, med drugimi tudi v kozmetični industriji (3).
Nanovlakna so trdna vlakna s premerom v nanometrskem območju ter teoretično neomejeno dolžino (1). Številne posebne značilnosti nanovlaken izhajajo prav iz omenjenega majhnega premera, ki se giblje med nekaj deset in 1000 nm. Nanovlakna imajo veliko površino na enoto mase, so porozna, hkrati pa izkazujejo večjo natezno trdnost, togost in prožnost v primerjavi s katerimkoli drugim konstruktom, narejenim iz enakega materiala (1–4). Poleg značilnih mehanskih lastnosti so edinstvena tudi v sposobnosti posnemanja osnovnih gradnikov zunajceličnega ogrodja (ECM, angl. extracellular matrix), kot so kolagenska in elastinska vlakna, in bioadhezije (2, 4–6). Omenjene značilnosti so zelo pomembne pri raziskovanju in uporabi nanovlaken v biomedicini (1–5).
V biomedicini sta ključnega pomena tudi biokompatibilnost in biorazgradljivost uporabljenih materialov (1, 2), kar lahko zagotovimo predvsem z izbiro ustreznih polimerov in topil. Med najpogostejše pomožne snovi za izdelavo nanovlaken prištevamo polimere naravnega in sinteznega izvora (1, 3, 4). Pogosto uporabljani naravni polimeri so alginat, celuloza, hitosan, keratin, kolagen, svila in želatina (1, 3, 4). Večina izmed njih ima sposobnost posnemanja strukture bioloških molekul in lahko vstopa v neposredne interakcije s celicami, kar je ključnega pomena za učinkovitost dostavnih sistemov, narejenih iz njih (2–
4). Po drugi strani pa so lahko različne serije naravnih polimerov v primerjavi s sinteznimi bistveno bolj variabilne. Oviro pri njihovi uporabnosti predstavlja tudi dejstvo, da je težko pripraviti nanovlakna z visokim deležem naravnega polimera, saj so raztopine iz naravnih polimerov izredno težavne za elektrostatsko sukanje zaradi visoke viskoznosti že pri nizkih koncentracijah polimera (7, 8). Posledično pogosto posegamo po sinteznih alternativah, kot so polietilenoksid (PEO), polivinilalkohol (PVA), polikaprolakton in polimlečna kislina (1, 3, 4).
2 1.1.1 Uporaba nanovlaken
Zahvaljujoč tehnološkemu napredku na področju izdelave in poznavanja lastnosti polimernih nanovlaken, se je njihova uporaba v zadnjih letih razširila na različna področja, kot so kemijska, tekstilna, prehrambna, farmacevtska in računalniška industrija (1, 2).
Trenutno je najbolj perspektivno področje uporabe nanovlaken v biomedicini, in sicer v tkivnem inženirstvu za pripravo tkivnih nadomestkov, v farmaciji kot dostavni sistem za nadzorovano sproščanje zdravilnih učinkovin (ZU) in za pripravo sodobnih oblog za celjenje ran (slika 1) (2, 3).
Slika 1: V nanovlakna je možno vgraditi različne sintezne in biološke materiale z elektrostatskim sukanjem. Njihovo možno uporabo so raziskovalci opazili pri številnih terapevtskih področij.
V nanovlakna lahko vgrajujemo ali na njih adsorbiramo najrazličnejše nizkomolekularne ZU (npr. anestetike, antibiotike, antiseptike, antirevmatike, antimikotike), proteine (npr. rastne dejavnike, encime), genetski material (npr. DNA, RNA), žive mikroorganizme (npr.
probiotike) in celice (npr. matične celice, fibroblaste, keratinocite, osteoblaste) (2, 8). Z metodo elektrostatskega sukanja lahko izdelamo enoslojna in dvoslojna nanovlakna, ki omogočajo prirejeno sproščanje vgrajenih učinkovin (1, 4). V primeru enoslojnih nanovlaken lahko na čas sproščanja ZU vplivamo z izbiro enega ali več polimerov, ki so lahko hidrofilni in hidrofobni, ter z vgrajevanjem predhodno pripravljenih nanodostavnih sistemov (npr. nanodelcev, liposomov) (3, 4, 8). Zanimiva pa so tudi dvoslojna nanovlakna, kjer sta pri prečnem prerezu vidni sredica in ovojnica iz različnih materialov (angl. core–
shell nanofibers). Z izbiro ustreznih polimerov za izdelavo ovojnice lahko bistveno vplivamo na profil sproščanja učinkovine iz jedra, hkrati pa zaščitimo ZU pred visoko
3
električno napetostjo in pred drugimi okolijskimi dejavniki, ki lahko zmanjšajo njeno stabilnost (4).
Kljub ogromnemu številu objavljenih znanstvenih del na področju uporabe nanovlaken pa je zaenkrat relativno malo raziskav o njihovi uporabnosti v kozmetologiji. Z metodo elektrostatskega sukanja so pripravili nanovlakna iz različnih biokompatibilnih polimerov z vgrajenimi antioksidanti, vitamini, nanodelci in rastlinskimi izvlečki, ki so primerni za uporabo na koži (3, 11, 12). Azarbayjani je s sodelavci izdelala masko za obraz iz PVA, kolagenskih in β–ciklodekstrinskih nanovlaken z vgrajenimi askorbinsko kislino, retinojsko kislino in zlatimi nanodelci ter proučevala globino prehajanja kozmetično aktivnih sestavin v epidermis. Raziskovalci navajajo, da maska iz nanovlaken predstavlja alternativo klasičnim bombažnim maskam in nudi zaščito vgrajenih kemijsko nestabilnih kozmetično aktivnih sestavin pred oksidacijo, velika specifična površina in poroznost nanovlaken pa omogoča dobro prehajanje kozmetično aktivnih sestavin v višje plasti epidermisa (12).
Sheng s sodelavci je izdelala nanovlakna iz svile z vitaminom E in dosegla 72-urno postopno sproščanje vgrajene kozmetično aktivne sestavine (13). Izsledki raziskav potrjujejo, da imajo nanovlakna izjemen potencial tudi v kozmetologiji, saj predstavljajo dober dostavni sistem za ciljano dostavo kemijsko nestabilnih kozmetično aktivnih sestavin v višje plasti kože.
Pričakujemo, da bodo inovacije na področju izdelave nanovlaken odprle možnosti za njihovo masovno proizvodnjo, kar bo prineslo čedalje več zanimanja večjih kozmetičnih podjetij.
1.1.2 Hitosan in hitosanska nanovlakna
Med naravne polimere, primerne za pripravo nanovlaken, prištevamo tudi hitosan. Hitosan je linearni kationski polimer, ki ga po kemijski sestavi uvrščamo med ogljikove hidrate, natančneje med poliamine. Zgrajen je iz dveh osnovnih monomernih enot: glukozamina in N-acetil glukozamina. Pridobivamo ga iz hitina (slika 2a), drugega najpogostejšega polimera v naravi za celulozo. Hitin najdemo v zunanjem skeletu členonožcev, v celični steni kvasovk in drugih gliv in ter v številnih drugih organizmih iz kraljestva rastlin in živali. Hitin je strukturna makromolekula, katere glavna naloga je mehanska stabilizacija celice pred fizičnim stresom (4, 7, 14–16). Hitosan (slika 2b) pridobivamo v bazičnih pogojih s postopkom delne deacetilacije hitina s koncentriranim natrijevim hidroksidom ali z encimsko hidrolizo. Končni produkt procesa je polkristalinični polimer v obliki belega prahu (14–16).
4
Poznamo različne vrste hitosana, ki se med seboj razlikujejo v molekulski masi in stopnji deacetiliranja (14). Ti dve glavni značilnosti tega polimera imata odločilni vpliv na njegove fizikalne, kemijske in biološke lastnosti, kot sta topnost ter sposobnost keliranja kovinskih ionov. Stopnja deacetiliranja določa molski delež prostih amino skupin (-NH₂) v polisaharidu, ki se v kisli vodni raztopini protonirajo (NH₃⁺). Zaradi večjega deleža omenjenih amino skupin je hitosan v primerjavi s hitinom bistveno bolje topen v šibko kislih topilih.
Slika 2: Kemijska struktura (a) hitina in (b) hitosana.
Hitosan poleg biokompatibilnosti in biorazgradljivosti izkazuje tudi bioadhezivne, antioksidativne, protiglivne in protimikrobne lastnosti (17–19). Slednji sta predmet številnih raziskav, ki med drugimi odpirajo možnosti za njegovo uporabo v kozmetologiji (11, 18).
Natančen mehanizem protibakterijskega delovanja zaenkrat ni znan, vendar najverjetneje temelji na interakcijah med pozitivno nabitimi funkcionalnimi skupinami hitosana z negativno nabitimi skupinami komponent celične stene bakterij. Močne elektrostatske privlačne sile porušijo integriteto celične stene in privedejo do uhajanja elektrolitov, nastalo osmotsko neravnovesje pa povzroči celično smrt (14, 19, 20). Poznamo dva mehanizma antioksidativnega delovanja hitosana, in sicer odstranjevanje radikalov in vezava v kelatne spojine. Odstranjevanja reaktivnih kisikovih zvrsti temelji na reakciji med vodikom amonijevih ionov (NH₃⁺) in radikali, pri čemer se tvorijo stabilni produkti (14, 15).
Kljub pozitivnim lastnostim hitosana pa je priprava nanovlaken iz tega polimera izredno zahtevna, saj je raztopina hitosana že pri nizkih koncentracijah dodanega polimera zelo viskozna (14, 16, 19). Poleg visoke viskoznosti je izdelava nanovlaken iz raztopine hitosana otežena tudi zaradi rigidnosti polimernih verig, ki v raztopini tvorijo stabilno 3D mrežo iz močnih vodikovih vezi (5, 7, 26, 27). Posledično je pri pripravi polimerne raztopine smiselno
5
hitosan kombinirati z neionskimi polimeri, kot sta PEO (slika 3) in PVA. Z dodatkom PEO izboljšamo viskoelastične lastnosti raztopine, kar olajša proces elektrostatskega sukanja.
Ugotovili so tudi, da PEO s hitosanom tvori vodikove vezi in posledično zmanjša prevodnost raztopine, kar je ugodno za nastanek enakomernega neprekinjenega curka med procesom (5, 26).
Slika 3: Strukturna formula PEO.
Nanovlakna s 100-odstotnim deležem hitosana pa lahko izdelamo tudi z uporabo nekaterih organskih topil, kot je trifluoroocetna kislina, vendar je zaradi hlapnosti, visoke cene in strupenosti te kisline dejanska uporabnost takšnih vlaken v biomedicini omejena (7, 22, 24).
1.2 ELEKTROSTATSKO SUKANJE
Nanovlakna lahko pripravimo z različnimi postopki, kot so vlečenje (angl. drawing), uporaba šablon (angl. templating), fazno ločevanje (angl. phase separation), ekstrakcija (angl. extraction) in samozdruževanje (angl. self-assembly), vendar je od vseh metod elektrostatsko sukanje najbolj obetavna in posledično tudi najbolj raziskana tehnika izdelave (1, 3, 25, 28).
Elektrostatsko sukanje je vsestranska in preprosta metoda za pripravo nanovlaken iz polimernih raztopin ali talin polimerov. Omogoča oblikovanje zelo tankih vlaken velikostnega razreda od nekaj nanometrov do nekaj mikrometrov. S to metodo so do sedaj uspešno pripravili nanovlakna iz več kot 100 različnih vrst polimerov, primernih za nadaljnjo uporabo v aplikativni znanosti. Osnovna gonilna sila elektrostatskega sukanja je elektrostatska sila, ki omogoča tvorbo curka iz polimerne raztopine (1, 3, 22).
Napravo za elektrostatsko sukanje v osnovi sestavljajo štirje elementi (slika 4): brizga, ki je povezana s šobo, črpalka, generator visoke napetosti in zbiralo (1, 4). Za izdelavo enoslojnih nanovlaken uporabljajo šobe z enojno iglo različnih premerov. Poznamo tudi bolj komplekse koaksialne in triaksialne šobe, ki omogočajo izdelavo različnih tipov večslojnih nanovlaken. Črpalka s konstantnim pretokom potiska raztopino polimera skozi šobo.
Generator omogoča tvorbo visoke napetosti in je pripet na šobo. Na konici igle se pojavi
6
kapljica, ki jo zadržijo sile površinske napetosti. Ko dovedene električne sile presežejo površinsko napetost kapljice, pride do deformacije in se oblikuje Taylorjev stožec (angl.
Taylor cone). Kapljica se zaradi povečane gostote naboja začne podaljševati in tanjšati, nastali curek pa se potisne proti nasprotno nabitemu ali ozemljenemu zbiralu. Na tej poti topilo postopoma izhlapeva, pri čemer se tvorijo suha, trdna vlakna. Poleg elektrostatskih privlačnih sil, ki nastanejo zaradi pozitivnega naboja na curku in negativnega naboja na zbiralu, imajo ključno vlogo pri podaljševanju vlaken tudi elektrostatske odbojne sile. Te začnejo naraščati z večanjem napetosti znotraj polimerne raztopine. V primeru, da opisane sile niso v ravnovesju, pride do deformacij pri oblikovanju vlaken, kar se kaže v njihovi neenotni morfologiji (1, 3, 4). Poznamo dve obliki zbiral, kamor se nalagajo strjena nanovlakna. Z izbiro različnih oblik zbiral lahko vplivamo na urejenost nanovlaken.
Nepremično planarno zbiralo običajno predstavlja ravna kovinska plošča, na kateri se vlakna razporedijo naključno, medtem ko rotirajoče zbiralo v obliki valja omogoča vzporedno razporeditev vlaken (28).
Slika 4: Shematski prikaz naprave za elektrostatsko sukanje. Shema a) prikazuje zbiranje naključno urejenih nanovlaken (NV) na planarnem zbiralu, shema b) pa zbiranje vzporedno urejenih NV na rotirajočem zbiralu v obliki valja.
Naprednejše naprave so opremljene tudi z dodatno stekleno komoro z ventilacijsko napravo, ki omogoča nadzor nad pogoji okolja, kot sta temperatura in relativna vlažnost. To bistveno vpliva na ponovljivost samega procesa, saj je med izdelavo nanovlaken ključnega pomena,
7
da sta oba parametra konstantna. Nihanje le-teh vodi v nestabilnosti pri tvorbi curka in povzroči prekinitve, nastala nanovlakna pa so lahko posledično slabše kakovosti (1, 28, 30).
1.2.1 Parametri elektrostatskega sukanja
Kljub temu, da je sam proces elektrostatskega sukanja relativno preprost, na kakovost in značilnosti končnega produkta ter na ponovljivost samega procesa vpliva več parametrov. S spreminjanjem enega ali več parametrov lahko vplivamo na morfologijo in strukturo nanovlaken, da dosežemo želene značilnosti, primerne za točno določen namen njihove uporabe (1, 2, 27).
Parametre razvrstimo v tri skupine. V prvo kategorijo spadajo lastnosti polimerne raztopine, v drugo procesni parametri in v zadnjo prištevamo pogoje okolja. Cilj je najti optimalne vrednosti vseh parametrov, za kar moramo poznati tako lastnosti uporabljenih ZU oziroma kozmetično aktivnih sestavin in pomožnih snovi kot karakteristike samega procesa elektrostatskega sukanja (1, 8).
1.2.1.1 Lastnosti polimerne raztopine
Preden se lotimo izvedbe elektrostatskega sukanja, moramo izbrati polimer z želenimi lastnostmi in topilo ali zmes topil, v katerem se polimer popolnoma raztaplja. Polimer s svojo kemijsko sestavo in molekulsko maso, topilo ter koncentracija polimera v polimerni raztopini značilno vplivajo na njeno viskoznost, površinsko napetost, dielektrično konstanto in prevodnost (1, 4, 24).
Topilo ali zmes topil igra pri procesu elektrostatskega sukanja veliko vlogo. Za uporabo v medicini in kozmetologiji je pomembno, da je topilo kemično inertno in biokompatibilno.
Hlapnost in parni tlak topila določata hitrost izhlapevanja in s tem tudi hitrost strjevanja curka ter tvorbo nanovlaken. Če je izbrano topilo preveč hlapno, se lahko kapljica na igli še pred oblikovanjem Taylorjevega stožca zasuši, kar vodi v številne prekinitve in prepreči tvorbo enakomernih vlaken. Po drugi strani pa mora biti topilo dovolj hlapno, da iz curka izhlapi vso topilo, saj se sicer na zbiralu zberejo mokra vlakna, kar je vidno v zlitju vlaken na presečiščih ali tvorbi polimernega filma. Dielektrična konstanta topila vpliva na jakost elektrostatičnega odboja na površini curka, kar je ključnega pomena za nastanek nanovlaken.
Čim višja je dielektrična konstanta, tem večjo napetost moramo uporabiti, da tvorimo stabilen in kontinuiran curek (1, 3, 4, 7, 8, 31).
Pozorni moramo biti tudi na površinsko napetost polimerne raztopine. Znanstveni izsledki kažejo na to, da previsoka površinska napetost otežuje proces elektrostatskega sukanja, saj
8
lahko prihaja do prekinitev v obliki kapljanja ali do zasušitve kapljice na igli. Rezultat so nanovlakna neenakomernih premerov in oblik s številnimi zadebelitvami v obliki vozlov.
Kontinuiran polimerni curek se namreč lahko tvori le, ko dovedemo dovolj električne napetosti, da presežemo površinsko napetost polimerne raztopine. Površinsko napetost raztopine lahko znižamo z uporabo nižje koncentracije dodanega polimera in z dodatkom površinsko aktivnih snovi (PAS) (1, 22, 32, 33).
Za izdelavo kakovostnih nanovlaken sta odločilnega pomena tudi koncentracija in električna prevodnost polimerne raztopine. Pri višji koncentraciji prihaja do večjega prepletanja polimernih verig, kar je ugodno za nastanek enakomernega curka in nanovlaken enakomernih oblik. S povečevanjem koncentracije se sorazmerno povečuje tudi viskoznost raztopine in premer nastalih nanovlaken, hkrati pa se zmanjšuje pojavnost vozlov (1, 31, 33).
Lastnosti polimera in polimerne raztopine vplivajo na pojavnost vozlov ter na debelino in obliko nanovlaken. Na podlagi predhodnih raziskav lahko trdimo sledeče:
− Na pojavnost vozlov bistveno vplivajo molekulska masa in koncentracija polimera, viskoznost in površinska napetost polimerne raztopine ter hlapnost topila. Višja kot je molekulska masa uporabljenega polimera ali koncentracija polimerne raztopine in bolj kot je raztopina viskozna, manjša je pojavnost vozlov. Številčnost vozlov lahko zmanjšamo tudi z nižjo površinsko napetostjo in z uporabo bolj hlapnih topil (1, 3, 5, 29–32).
− Na debelino nanovlaken vplivajo koncentracija, viskoznost in prevodnost polimerne raztopine. Višja kot je koncentracija polimera v raztopini, večja kot je njena viskoznost in manjša kot je električna prevodnost, večji premer nanovlaken lahko pričakujemo (1, 3, 5, 34).
− Na obliko nanovlaken vpliva hitrost izhlapevanja topila. Neustrezno sušena nanovlakna med procesom dobijo ploščato obliko, medtem ko ustrezno sušenje vodi v vlakna z okroglim prerezom. Poleg nepravilnosti v morfologiji posameznih vlaken lahko opazimo tudi njihovo medsebojno zlepljanje (1, 4, 32).
1.2.1.2 Procesni parametri
Uspešnost oblikovanja vlaken želenih dimenzij je v veliki meri odvisna tudi od izbranih procesnih parametrov, kamor prištevamo dovedeno električno napetost, hitrost pretoka polimerne raztopine in razdaljo med konico igle ter zbiralom.
9
Domnevno imata najpomembnejšo vlogo med naštetimi spremenljivkami napetost in posledično električno polje, ki se tvori med konico igle in zbiralom. Napetost igra ključno vlogo pri oblikovanju Taylorjevega stožca in posledično pri oblikovanju nabitega curka. Dovedena napetost namreč neposredno določa količino naboja na curku in posledično jakost elektrostatskega odboja med naboji, kar privede do oblikovanja vlaken. Številne raziskave kažejo na to, da napetost odločilno vpliva na premer in oblikovanje vozlov.
Načeloma velja, da previsoka ali prenizka dovedena napetost povzroči tvorbo vozlov.
Običajno uporabimo napetosti od 10 do 30 kV, pri čemer točno vrednost določimo eksperimentalno glede na obnašanje polimerne raztopine (1, 3, 4, 7, 31). Optimalno vrednost najlažje definiramo na podlagi opazovanja kapljice na konici igle, kar prikazuje slika 5. Pri nizki električni napetosti se Taylorjev stožec tvori na dnu viseče kapljice. Povečevanje električne napetosti korelira s postopnim zmanjševanjem kapljice, dokler le-ta popolnoma ne izgine in je na vrhu kapilare viden le Taylorjev stožec. Pri visoki napetosti se curek tvori že znotraj igle (1, 31, 32).
Slika 5: Shematski prikaz vpliva napetosti na oblikovanje curka iz polimerne raztopine.
Naslednji pomemben parameter je razdalja med iglo in zbiralom. S spremembo razdalje lahko neposredno vplivamo na čas potovanja curka in na optimalno raztezanje vlaken.
Razdaljo praviloma izbiramo med 10 in 20 cm. Običajno velja, da večja kot je razdalja, tanjša so dobljena vlakna. Če je razdalja prekratka, je proces raztegovanja polimernih verig oviran, kar se kaže v pojavnosti vozlov. Za oblikovanje vlaken pravilnih oblik je bistvenega pomena, da se na zbiralo odlagajo v celoti posušena vlakna. Zaželeno je popolno izhlapevanje topila, kar lahko dosežemo bodisi s prilagajanjem razdalje med iglo in zbiralom bodisi z reguliranjem pretoka polimerne raztopine (1, 4, 7, 17, 20).
10
Nastavljen pretok raztopine polimera neposredno vpliva na debelino nastalega curka in posledično tudi na premer posušenih vlaken. Povečanje hitrosti pretoka polimerne raztopine vodi do nastanka debelejših vlaken, saj se s pretokom sorazmerno povečuje količina polimera v curku, obenem pa pretok ne sme biti premajhen, sicer ni omogočen nastanek Taylorjevega stožca in se kapljica zasuši na konici igle. Kombinacija prenizke napetosti in neustrezne hitrosti pretoka polimerne raztopine privede do nestabilnosti, ki se kaže v obliki kapljajočega ali pulzirajočega curka. Pomembno je, da najdemo optimalno vrednost, ki omogoča popolno izhlapevanje topila in oblikovanje čim tanjših vlaken enakomernih oblik (1, 4, 24).
1.2.1.3 Dejavniki okolja
Med ključne dejavnike okolja, s katerimi vplivamo na uspešnost procesa in na strukturo nanovlaken, prištevamo temperaturo in relativno vlažnost (RH). Oba parametra namreč neposredno vplivata na obnašanje polimerne raztopine med procesom in posledično na hitrost strjevanja curka (1, 31).
Vpliv RH na sam proces je v veliki meri odvisen od izbranega topila v polimerni raztopini.
Hidrofilna topila pri nizkih vrednostih RH hitreje izhlapevajo, nastala nanovlakna pa so debelejša. RH vpliva tudi na poroznost vlaken, pripravljenih iz polimernih raztopin z organskimi topili, saj pri visoki RH vodna para v zraku prodre v curek in s kondenzacijo povzroča pojavnost večjih por (1, 4, 30).
Temperatura okolja je vzajemno povezana s hitrostjo izhlapevanja topila ter z viskoznostjo polimerne raztopine. Z višanjem temperature se viskoznost in površinska napetost raztopine sorazmerno zmanjšujeta, kar je ugodno za oblikovanje tanjših vlaken. Po drugi strani pa se z višanjem temperature povečuje hitrost izhlapevanja topila, kar omogoča hitrejše strjevanje nanovlaken. Gledano v celoti ima torej temperatura dva nasprotujoča si učinka na premer nanovlaken (1, 3, 33).
Opisani parametri so med seboj odvisni, zato je za uspešnost procesa ključnega pomena, da jih obravnavamo kot celoto. Kljub ogromnemu številu opravljenih raziskav na temo parametrov elektrostatskega sukanja, pa je razumevanje njihove medsebojne odvisnosti še vedno kompleksno in v določeni meri neraziskano.
11
2 NAMEN DELA
Polimerna nanovlakna, ki posnemajo strukturo in funkcijo zunajceličnega ogrodja, so zaradi svojih številnih izjemnih lastnosti v zadnjem desetletju postala predmet zanimanja svetovne biomedicinske znanosti. Namen našega eksperimentalnega dela bo optimizirati proces izdelave nanovlaken iz bioadhezivnega hitosana z metodo elektrostatskega sukanja. Priprava nanovlaken iz raztopine čistega hitosana je zaradi specifičnih lastnosti tega naravnega polimera izredno težavna, zato bomo raztopini dodajali kopolimer PEO in različne PAS.
Obliko in specifične strukturne lastnosti izdelanih nanovlaken bomo proučevali s SEM.
Spremenljivke, ki jih bomo proučevali, so prikazane v preglednici I.
Preglednica I: Proučevane spremenljivke procesa elektrostatskega sukanja.
PARAMETRI RAZTOPINE masno razmerje hitosan/PEO molekulska masa PEO dodatek PAS
PROCESNI PARAMETRI električna napetost pretok
razdalja med konico igle in zbiralom DEJAVNIKI OKOLJA temperatura
RH
Cilji diplomske naloge so:
− Opredeliti ključne vplive lastnosti raztopine, parametre procesa elektrostatskega sukanja in dejavnike okolja na morfologijo nastalih nanovlaken.
− Identificirati pogoje, ki omogočajo stabilen ter neprekinjen proces izdelave nanovlaken s čim višjim deležem hitosana.
− Proučevati vpliv PAS na morfološke lastnosti nanovlaken.
− Izdelati hitosanska nanovlakna visoke kakovosti, ki so potencialno primerna za uporabo v farmacevtske in kozmetične namene. Bistvene značilnosti takšnih nanovlaken so biokompatibilnost z biološkimi makromolekulami in biorazgradljivost.
12
3 MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI
Polimeri za izdelavo nanovlaken:
− Hitosan z nizko molekulsko maso, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemčija
− PEO (900 kDa), Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemčija
− PEO (2 MDa), Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemčija
− PEO (4 MDa), Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemčija Topila za izdelavo polimerne raztopine:
− ocetna kislina, Merck KGaA, Nemčija
− prečiščena voda, pripravljena na UL, Fakulteti za farmacijo
Površinsko aktivne snovi:
− Tween 20, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemčija
− Kolliphor HS 15, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemčija
3.2 NAPRAVE
− Analitska tehtnica Excellence Plus, Mettler, Toledo, Švica
− Brizge Chirana Luer Lock, 5 ml, Chirana T.Injecta, Slovaška
− Digitalna tehtnica Sartorius M−pact AX224, Sartorius, Nemčija
− Magnetno mešalo IKA WERKE, Nemčija
− Naprava za elektrostatsko sukanje, Fluidnatek LE100, BioInicia SL, Španija
− Plastične epruvete z zamaškom 2 mL in 15 mL Polavtomatske pipete Brand 100−1000 μl, Nemčija
− Stekleni inventar: bučke, čaše, epruvete, viale, merilni valji
− Svetlobni mikroskop Olympus CX41, Japonska
− Ultrazvočna kadička Sonis 4; Iskra Pio, Slovenija
− Vrstični elektronski mikroskop Supra35 VP, Carl Zeiss, Nemčija
13 3.3 METODE
3.3.1 Priprava polimernih raztopin
Kot topilo za izdelavo nanovlaken smo uporabili 3-odstotno (v/v) vodno raztopino ocetne kisline, ki smo jo pripravili iz koncentrirane ocetne kisline (100 %). Koncentrirano ocetno kislino smo v ustreznem razmerju razredčili s prečiščeno vodo.
Pripravili smo 4-odstotno (m/m) polimerno raztopino z različnim razmerjem posameznih polimerov, pri čemer smo uporabili hitosan in PEO z različnimi molekulskimi masami (900 kDa, 2 MDa in 4 MDa). Pri vseh vzorcih smo kot topilo uporabili 3-odstotno (v/v) ocetno kislino, razen v primeru raztopine iz čistega PEO, kjer smo polimer raztopili v prečiščeni vodi. V stekleno vialo smo natehtali ustrezno količino 3-odstotne (v/v) ocetne kisline in dodali vnaprej natehtane prahove polimerov. Vialo smo nato zaprli s pokrovčkom in postavili na mešalo. Mešanje raztopine smo izvajali 24 h pri sobni temperaturi z uporabo magnetnega mešala, da smo zagotovili popolno raztapljanje polimerov v topilu. V primeru raztopin z dodanimi PAS smo pripravili raztopine z masnim deležem 0,1–2,0 (m/m) PAS glede na polimerno raztopino. Natehtano PAS smo dodali v homogeno raztopino tik pred izvajanjem elektrostatskega sukanja in mešali 10 min. Natančna predstavitev pripravljenih raztopin je predstavljena v preglednici II.
14
Preglednica II: Sestava proučevanih 4-odstotnih (m/m) polimernih raztopin. Pri vseh vzorcih smo kot topilo uporabili 3- odstotno (v/v) ocetno kislino, razen v primeru raztopine iz čistega PEO, kjer smo polimer raztopili v prečiščeni vodi.
Delež hitosana [%] Delež PEO [%] MM PEO PAS Količina PAS [(m/m) %]
0 100 900 kDa / /
10 90 900 kDa / /
50 50 900 kDa / /
50 50 4 MDa / /
60 40 900 kDa / /
60 40 2 MDa / /
60 40 4 MDa / /
70 30 900 kDa / /
70 30 2 MDa / /
70 30 4 MDa / /
70 30 4 MDa Tween 20 0,1
80 20 4 MDa / /
80 20 4 MDa Tween 20 0,1
90 10 4 MDa / /
90 10 4 MDa Tween 20 0,1
90 10 4 MDa Tween 20 1,0
90 10 4 MDa Tween 20 2,0
90 10 4 MDa Kolliphor HS 15 0,5
90 10 4 MDa Kolliphor HS 15 1,0
90 10 4 MDa Kolliphor HS 15 2,0
15 3.3.2 Elektrostatsko sukanje
Postopek elektrostatskega sukanja smo izvajali na napravi Fluidnatek LE-100. Najprej smo znotraj komore s pomočjo vijaka na nosilcu prilagodili razdaljo med kovinsko iglo in zbiralom na 15 cm ali 20 cm. Na kovinsko mizico smo napeli aluminijasto folijo, ki je služila kot zbiralna površina za nastala nanovlakna. Šobo smo sestavili tako, da smo združili kovinski nosilni del, iglo s premerom 0,9 mm, tesnilo in vijak. Preden smo nanjo priključili brizgo, smo šobo trikrat sprali z istim topilom, kot smo ga uporabili za pripravo polimerne raztopine. Šobo smo fiksirali v napravo, nato smo naravnali in izostrili vgrajeno mikrokamero, s katero smo kasneje spremljali tvorbo Taylorjevega stožca in curka na konici igle. Vrata komore smo zaprli, vključili napravo in na digitalnem zaslonu nastavili želeno temperaturo in RH. V našem primeru smo elektrostatsko sukanje izvajali pri temperaturnem območju 37−44 °C in 11−16 % RH.
Polimerno raztopino smo napolnili v 5-mililitrsko brizgo in pazili, da vanjo nismo vnesli zračnih mehurčkov, ki bi motili pretok in s tem proces elektrostatskega sukanja. V primeru, da je bilo zračnih mehurčkov veliko, smo raztopino predhodno sonicirali 15 minut z uporabo ultrazvočne kopeli. Iz brizge smo iztisnili ves zrak in jo vpeli v črpalko ter jo preko cevke povezali s šobo. Na fiksirano šobo smo pripeli vir visoke električne napetosti, ki je služila kot gonilo za tvorbo nanovlaken. Na digitalnem zaslonu naprave smo nastavili premik šobe v smeri x in y osi zbirala, da bi omogočili čim bolj enakomerno zbiranje vzorca. S pomočjo vgrajenega časovnika smo spremljali in merili čas zbiranja vzorcev. V programu naprave smo izbrali želen pretok, ki ga nadzoruje vgrajena črpalka s potiskom na bat brizge. V našem primeru smo uporabili vrednosti med 0,5 mL/h in 3,0 mL/h. Poleg pretoka smo v programu določili tudi pozitivno električno napetost na šobi (med 15 kV in 25 kV) in negativno električno napetost na zbiralu (med −5 kV in −10 kV). Vrata komore smo ponovno zaprli in pričeli z elektrostatskim sukanjem, in sicer tako, da smo vključili generator električne napetosti. Postopek smo pričeli z napetostjo 15 kV, ki smo jo postopoma povečevali do pojava Taylorjevega stožca. V primeru zasušitve vzorca na iglo smo proces prekinili in s papirnato brisačo odstranili zasušen polimerni film s konice igle. Z odprtjem vrat komore se proces elektrostatskega sukanja avtomatsko ustavi, kar zagotavlja varnost pri delu z visokimi napetostmi.
16
Preden smo pričeli z zbiranjem vzorcev za analizo s SEM, smo z namenom proučevanja obnašanja polimerne raztopine preskusili različne nastavitve naprave za elektrostatsko sukanje. Spreminjali smo razdaljo med iglo in zbiralom, hitrost pretoka, napetost in pogoje okolja ter iskali takšno kombinacijo nastavitev, pri katerih smo opažali najbolj enakomerno in neprekinjeno tvorbo vlaken. Vzorce smo zbirali 30–60 min.
V sklopu raziskave smo želeli proučiti vpliv posameznih spremenljivk, zato je bil naš cilj preizkusiti čim več različnih nastavitev, da bi dobili čim boljši vpogled v obnašanje preiskovane raztopine.
3.3.3 Vrednotenje nanovlaken
V začetni fazi smo za proučevanje morfologije nanovlaken uporabili optični mikroskop, da smo okvirno ocenili uspešnost procesa. Vzorec smo zbrali na objektno stekelce, ki smo ga položili na pritrjeno kovinsko zbiralo. V primeru vidnih polimernih madežev, večjih vozlov, prekinitev, vrtincev ali drugih morfoloških nepravilnosti smo prilagodili proučevane parametre. Ko smo bili zadovoljni z izgledom vzorca pri majhni povečavi, smo se lotili vrednotenja morfologije nanovlaken s SEM.
Vzorce za SEM smo pripravili tako, da smo iz aluminijaste folije s plastjo posušenih nanovlaken izrezali kvadratke približne velikosti 5 x 5 mm, ki smo jih nato s karbonskim lepilnim trakom prilepili na nosilec. Slike smo posneli s SEM z uporabo sekundarnega detektorja pri pospeševalni napetosti 1 kV. S pomočjo slik visoke ločljivosti smo ovrednotili njihove velikost, obliko, poroznost, ureditev in površinske lastnosti. Slike smo analizirali s programom ImageJ. Za vsak vzorec smo opravili 100 meritev vsaj 50 naključno izbranih nanovlaken in nato izračunali povprečni premer. Rezultat smo podali kot povprečje in standardni odklon vseh meritev.
17
4 REZULTATI IN RAZPRAVA
4.1 NANOVLAKNA S 50-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA
Preden smo se lotili eksperimentalnega dela, smo pregledali več raziskav na temo elektrostatskega sukanja raztopin hitosana (7, 10, 21, 22, 24–27, 30, 34). Glede na izsledke raziskav smo se odločili za pripravo raztopine polimerov v 3-odstotni (v/v) ocetni kislini (30). Pri izbiri topila smo bili pozorni na njegovo toksičnost in inertnost, saj je bil naš cilj pripraviti nanovlakna, ki so primerna za uporabo v farmacevtske namene.
Nanovlakna s 50-odstotnim deležem hitosana smo pripravili iz raztopine polimerov hitosana in nizkomolekularnega PEO z molekulsko maso 900 kDa v masnem razmerju 1 : 1.
Raztopino smo elektrostatsko sukali pri napetosti 20 kV na igli in −5 kV na zbiralu, temperaturi 37 °C in 16-odstotni RH. Tekom procesa smo preizkušali različne pretoke od 200 μL/h do 600 μL/h in s pomočjo kamere opazovali tvorbo Taylorjevega stožca in enakomernega curka. Najmanj prekinitev smo opazili pri pretoku 250 μL/h, ki smo ga izbrali za zbiranje vzorca. Slika 6 prikazuje izdelana nanovlakna pri različnih povečavah.
Med procesom je prihajalo do občasnih prekinitev, kapljanja in posledično nastanka polimernih madežev. Ko kaplja polimerne raztopine pade na mrežo nanovlaken, pri čemer topilo ne izhlapi, ampak raztaplja nastala nanovlakna, to povzroči neželene morfološke spremembe, vidne kot polimerne madeže (slika 6). Na nanovlaknih je bila gladka, vidnih pa je bilo nekaj manjših vozlov. Povprečni premer izdelanih nanovlaken je bil 134 ± 46 nm.
18
Slika 6: SEM-slike nanovlaken s 50-odstotnim deležem hitosana pri različnih povečavah.
4.2 NANOVLAKNA S 60-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA
Polimerno raztopino smo pripravili iz hitosana in PEO z molekulsko maso 900 kDa. Pretok smo nastavili na 300 μL/h, na iglo pa smo dovajali napetost 20 kV, na zbiralo pa −5 kV.
Temperaturo smo nastavili na 37 °C, RH pa na 16 %, vendar smo med samim procesom opazili, da je prihajalo do nihanja v temperaturi (37−40 °C) in RH (14−18 %). To je vplivalo na uspešnost tvorbe enakomernega curka. Pri višjih temperaturah smo zabeležili več prekinitev, kapljanja in pršenja curka v različne smeri. Kljub temu so nastala nanovlakna relativno enakomerne velikosti s povprečnim premerom 105 ± 50 nm, kar je razvidno iz slike 7. Polimerni madeži so vidni na sliki z najmanjšo povečavo.
19
Slika 7: SEM-slike nanovlaken s 60-odstotnim deležem hitosana pri različnih povečavah.
4.3 NANOVLAKNA S 70-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA
V tem delu diplomske naloge smo se osredotočili na proučevanje vpliva treh različnih spremenljivk. Zanimal nas je vpliv molekulske mase PEO, dodatka PAS in učinka okolijskih dejavnikov. Povzeli smo ugotovitve o vplivu procesnih parametrov iz prejšnjih vzorcev z nižjo vsebnostjo hitosana in jih z manjšimi variacijami uporabili tudi za nadaljnje vzorce.
Natančne vrednosti parametrov in rezultati so zbrani v preglednici III.
20
Preglednica III: Parametri elektrostatskega sukanja in povprečni premer nanovlaken za posamezen vzorec s 70-odstotnim deležem hitosana.
Napetost [kV]
Molekulska masa PEO
Masni delež PAS v polimerni
raztopini
T
[°C] RH [%] Pretok
[μL/h] na šobi na zbiralu Povprečni premer ±
SD [nm]
900 kDa / 37 17 250 20 −5 59 ± 31
2 MDa / 37 15 250 18 −5 61 ± 40
4 MDa / 38 15 200 19 −5 146 ± 39
4 MDa / 44 11 200 21 −5 156 ± 54
4 MDa 0,1 % (m/m)
Tween 20 44 11 150 20 −5 85 ± 49
4.3.1 Vpliv molekulske mase PEO
Prvi parameter, ki smo ga podrobneje proučili, je vpliv molekulske mase dodanega PEO na morfologijo nanovlaken. Za pripravo raztopin smo uporabili PEO z molekulskimi masami 900 kDa, 2 MDa in 4 MDa, kar je prikazano v preglednici III (prvi trije vzorci). Ugotovili smo, da se je povprečni premer nanovlaken povečeval z večanjem molekulske mase PEO z 900 kDa na 4 MDa (preglednica III). Iz SEM slik 8a in 8b je razvidna pojavnost vozlov, zadebelitev in zlepljanje vlaken, medtem ko so nanovlakna na sliki 8c enakomernih oblik in brez vozlov.
21
Slika 8: SEM-slike nanovlaken s 70-odstotnim deležem hitosana pri uporabi PEO z različno molekulsko maso: (a) 900 kDa, (b) 2 MDa in (c) 4 MDa pri večji in manjši povečavi, pripravljenih pri temperaturi ~37 °C.
4.3.2 Vpliv temperature in RH
V naslednjem sklopu raziskave smo želeli presoditi vpliv pogojev okolja na morfologijo nanovlaken. Na podlagi ugotovitev o vplivu molekulske mase PEO na obliko nanovlaken smo se odločili za uporabo visokomolekularnega PEO z molekulsko maso 4 MDa. En vzorec smo elektrostatsko sukali pri 38 °C in 15-odstotni RH, drugega pa pri 44 °C in 11-odstotni RH. Pri povišani temperaturi smo pri enakih procesnih pogojih opazili več prekinitev in kapljanja, zato smo z namenom stabilizacije curka napetost povišali z 19 na 21 kV.
Morfologija nanovlaken je prikazana na sliki 9. V obeh primerih smo uspeli izdelati nanovlakna brez vozlov in drugih večjih nepravilnosti. Pri nižji temperaturi je bila debelina nanovlaken 146 ± 39 nm, pri višji temperaturi pa 156 ± 54 nm. Na podlagi meritev
22
povprečnih premerov nanovlaken smo ugotovili, da so vlakna, pripravljena pri nižji temperaturi in RH, nekoliko tanjša in bolj enakomernih oblik.
Slika 9: SEM-slike nanovlaken s 70-odstotnim deležem hitosana, pripravljene pri (a) 38 °C in 15-odstotni RH in (b) 44 °C in 11-odstotni RH.
4.3.3 Vpliv dodatka PAS
Z dodatkom PAS zmanjšamo površinsko napetost polimerne raztopine (14). Na podlagi poznavanja te teorije smo sklepali, da bodo nanovlakna z dodano PAS tanjša in pojavnost vozlov bo manjša.
Z dodatkom 0,1-odstotnega (m/m) Tweena 20 smo pri razmeroma enakih pogojih izdelali tanjša nanovlakna (premer 85 ± 49 nm) v primerjavi z raztopino brez dodane PAS (premer 156 ± 54 nm). V nasprotju z našimi pričakovanji so izdelana nanovlakna izkazovala številne morfološke nepravilnosti, kar je razvidno iz slike 10. Opazili smo pojavnost večjih in manjših vozlov ter zlepljanje posameznih vlaken, ki so bila hkrati nepravilnih oblik.
23
Slika 10: SEM-slike nanovlaken s 70-odstotnim deležem hitosana, ki so bila pripravljena (a) brez dodane PAS in (b) z dodatkom 0,1-odstotnega (m/m) Tweena 20.
4.4 NANOVLAKNA Z 80-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA
Pri povečanju deleža hitosana v polimerni raztopini na 80 % smo opazili porast viskoznosti vzorcev, kar je vplivalo na obnašanje raztopine pri procesu elektrostatskega sukanja. Imeli smo čedalje več težav pri vzpostavitvi stabilnega kontinuiranega curka. Med procesom je prihajalo do pogostejših prekinitev in kapljanja raztopine, kar je značilno vplivalo na kakovost izdelanih nanovlaken.
Pripravili smo pet polimernih raztopin iz hitosana in PEO z molekulsko maso 4 MDa v razmerju 8 : 2. Proučevali smo vpliv razdalje med konico igle in zbiralom, dejavnikov okolja in dodatka PAS. Uporabljeni procesni parametri za posamezen vzorec so zbrani v preglednici IV.
24
Preglednica IV: Parametri elektrostatskega sukanja, povprečni premer nanovlaken za posamezen vzorec z 80 % deležem hitosana.
Napetost [kV]
Masni delež PAS v polimerni
raztopini
Razdalja zbiralo/igla
cm
T
°C RH
% Pretok
[μL/h] na šobi na zbiralu
Povprečni premer ±
SD [nm]
/ 15 38 16 250 20 −5 134 ± 25
/ 20 38 16 250 19 −5 146 ± 39
/ 15 44 11 150 19 −5 166 ± 74
0,1-odstotni (m/m) Tween
20
15 38 16 150 22 −5 87 ± 47
0,1-odstotni (m/m) Tween
20
15 44 11 150 22 −5 97 ± 31
4.4.1 Vpliv razdalje med iglo in zbiralom
V tem sklopu raziskave smo preverjali vpliv razdalje med iglo in zbiralom na morfologijo izdelanih nanovlaken. Polimerni raztopini smo elektrostatsko sukali pri razmeroma enakih pogojih, ki so zabeleženi v preglednici IV. V primeru prvega vzorca smo pri 15-centimetrski razdalji dobili nanovlakna s povprečnim premerom 134 ± 25 nm. Drugi vzorec smo elektrostatsko sukali na razdalji 20 cm, povprečni premer izdelanih nanovlaken pa je bil 146
± 39 nm. V našem primeru se je z večanjem razdalje med šobo in zbiralom povečal premer izdelanih vlaken. Morfologija obeh vzorcev je prikazana na sliki 11 in je med seboj primerljiva.
25
Slika 11: SEM-slike nanovlaken z 80-odstotnim deležem hitosana, ki so bila pripravljena na (a) razdalji 15 cm, (b) razdalji 20 cm.
4.4.2 Vpliv temperature in RH
Znano je, da temperatura in RH vplivata na viskoznost polimerne raztopine in na hitrost izhlapevanja topila (1). Z namenom preverjanja vpliva ambientalnih parametrov na premer nanovlaken smo pripravili štiri vzorce in jih obravnavali v parih. Dva vzorca, ki sta na sliki 12 označena z a in c, smo elektrostatsko sukali pri 38 °C in 15-odstotni RH. Preostala dva vzorca, ki sta na sliki 12 označena z b in d, smo izdelali pri 44 °C in 11-odstotni RH. Opazili smo, da so nanovlakna pri 38 °C tanjša kot nanovolakna pri 44 °C. Pri 44 °C smo imeli več težav pri stabilizaciji pulzirajočega curka, kar se odraža v morfologiji nanovlaken na sliki 12b. Vidimo, da so vlakna različnih premerov, opazno je tudi zlepljanje. Težavo bi najverjetneje lahko odpravili s povečanjem napetosti, vendar smo skušali ohraniti čim bolj enotne pogoje. Isti trend vpliva temperature je viden v primeru nanovlaken brez PAS in z dodano PAS.
26
Slika 12: SEM-slike nanovlaken z 80-odstotnim deležem hitosana – prikaz vpliva okolijskih dejavnikov in dodanih PAS.
(a) brez PAS, 38 °C, 15 % RH, (b) brez PAS, 44 °C, 11 % RH, (c) s PAS, 38 °C, 15 % RH, (d) s PAS, 44 °C, 11 % RH.
27
Slika 13: Vpliv temperature in RH na premer nanovlaken z 80-odstotnim deležem hitosana.
4.4.3 Vpliv dodatka PAS
Z dodatkom PAS znižamo površinsko napetost raztopine, da olajšamo nastanek curka.
Pripravili smo dve raztopini z 0,1-odstotnim (m/m) masnim deležem Tweena 20 glede na polimerno raztopino in ju elektrostatsko sukali pri pogojih, navedenih v preglednici IV. Pri procesu elektrostatskega sukanja raztopin z dodano PAS smo opazili manj prekinitev in kapljanja. Sklepali smo, da bodo nastala nanovlakna zaradi stabilizacije curka bolj enakomernih velikosti.
Naše ugotovitve o vplivu PAS na povprečni premer nanovlaken so vidne na sliki 13. Jasno je razvidno, da smo pri enakih procesnih in ambientalnih pogojih z dodatkom PAS dosegli tvorbo nanovlaken z manjšim povprečnim premerom, kar smo tudi pričakovali. Morfologijo nanovlaken smo ovrednotili na podlagi SEM slik, prikazanih na slikah 12c in 12d. Z izjemo nekaj manjših vozlov in zadebelitev je s slik razvidno, da so vlakna relativno enakomernih velikosti. Slika 14 prikazuje iste vzorce pri najmanjši povečavi, s katerih smo lahko razbrali vpliv dodatka PAS na pojavnost polimernih madežev. Jasnega trenda nismo zaznali, saj smo pri vzorcu na sliki 14c opazili povečano število madežev, medtem ko smo z dodatkom iste količine PAS pri vzorcu na sliki 14d polimerne madeže povsem odpravili. Z vidika številčnosti madežev in enotne oblike vlaken se je najbolje obnesel vzorec z dodano PAS, ki smo ga elektrostatsko sukali pri 44 °C in 11-odstotni RH.
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225
38 °C, 15 % RH 44 °C, 11% RH
POVPREČNI PREMER [NM]
brez PAS s PAS
28
Slika 14: SEM-slike nanovlaken z 80-odstotnim deležem hitosana – prikaz polimernih madežev. (a) brez PAS, 38 °C, 15
% RH, (b) brez PAS, 44 °C, 11 % RH, (c) s PAS, 38 °C, 15 % RH, (d) s PAS, 44 °C, 11 % RH.
29
4.5 NANOVLAKNA S 90-ODSTOTNIM DELEŽEM HITOSANA
S povečanjem deleža hitosana na 90 % smo pri izdelavi nanovlaken naleteli na več težav.
Med procesom elektrostatskega sukanja je prihajalo do kapljanja, pršenja, zasušitve kapljice na konici igle in sočasne tvorbe več curkov hkrati. Imeli smo tudi težavo pri oblikovanju in vzdrževanju Taylorjevega stožca, saj se je pri povečani napetosti curek tvoril že znotraj igle.
Da bi dosegli enakomeren curek brez prekinitev, smo se odločili za povečanje napetosti na 25 kV in za dodatek PAS. Preizkusili smo vpliv dveh neionskih PAS: Tweena 20 in Kolliphorja HS 15. Specifikacije raztopin in pogojev, pri katerih smo jih elektrostatsko sukali, smo zabeležili v preglednici V. Za pripravo vzorcev smo uporabili visokomolekularni PEO z molekulsko maso 4 MDa, s katerim smo v prejšnjih fazah raziskave pripravili nanovlakna najboljše kakovosti.
Preglednica V: Parametri elektrostatskega sukanja in povprečni premer nanovlaken za posamezen vzorec z 90-odstotnim deležem hitosana.
Napetost [kV]
Masni delež PAS v polimerni
raztopini T
[°C] RH
[%] Pretok
[μL/h] na šobi na
zbiralu Povprečni premer ±
SD [nm]
/ 44 11 150 25 −10 65 ± 70
0,1-odstotni (m/m) Tween 20 44 11 150 25 −10 79 ± 39
1,0-odstotni (m/m) Tween 20 43 12 250 25 −10 179 ± 82
2,0-odstotni (m/m) Tween 20 43 12 275 25 −10 160 ± 80
0,5-odstotni (m/m)
Kolliphor HS 15 43 12 250 25 −10 159 ± 53
1,0-odstotni (m/m)
Kolliphor HS 15 43 12 250 25 −10 96 ± 30
2,0-odstotni (m/m)
Kolliphor HS 15 43 12 250 25 −10 104 ± 43
V začetnih fazah raziskave smo skušali elektrostatsko sukati raztopine pri temperaturi 38 °C in 15-odstotni RH. Medtem ko so se omenjeni ambientalni pogoji pri raztopinah z manjšim
30
deležem hitosana dobro obnesli, iz raztopin z 90-odstotnim deležem hitosana nikakor nismo mogli tvoriti vlaken. Da bi ustavili kapljanje in tvorili enakomeren curek, smo poskušali povečati napetost in sočasno zmanjšati pretok. Testirali smo več različnih kombinacij procesnih pogojev, vendar pri nobeni nismo uspeli preprečiti pogostih prekinitev in kapljanja raztopine. S povečanjem temperature na 44−43 °C in znižanjem RH v prostoru na 11−12 %, smo uspeli stabilizirati proces, zato smo vse vzorce pripravili pri omenjenih pogojih.
Najprej smo pripravili nanovlakna z 90-odstotnim deležem hitosana brez dodatka PAS, ki so nam je služila kot referenca za oceno vpliva PAS na morfologijo nanovlaken. Izdelana nanovlakna s povprečnim premerom 65 ± 70 nm so prikazana na sliki 15. Velik standardni odklon v povprečnem premeru je pokazatelj neenotne oblike izdelanih vlaken. Nanovlakna so bila zaradi številnih vozlov, zadebelitev in drugih morfoloških nepravilnosti opazno slabe kakovosti.
Slika 15: SEM-sliki nanovlaken z 90-odstotnim deležem hitosana brez dodatka PAS.
31 4.5.1 Vpliv dodatka Tweena 20
Proučevanja vpliva Tweena 20 na morfologijo hitosanskih nanovlaken smo se lotili s pripravo treh polimernih raztopin z različnim deležem PAS. Elektrostatsko sukanje vseh treh vzorcev je potekalo pri temperaturi 43 °C, 12-odstotni RH in napetosti 25 kV na igli ter −10 kV na zbiralu. Od procesnih parametrov smo prilagajali le pretok, s katerim smo uspešno stabilizirali curek.
Vzorci nanovlaken so prikazani na sliki 16. V primerjavi z vzorcem brez dodane PAS, smo z dodatkom Tweena 20 uspeli tvoriti enakomernejša nanovlakna. Pri raztopini z 0,1 % (m/m) Tweena 20 je vidnih nekaj vozlov, s povečanjem masnega deleža PAS na 1,0 % (m/m) oziroma na 2,0 % (m/m) pa so izdelana nanovlakna enakomernih velikosti in brez vozlov. Z večanjem masnega deleža Tweena 20 smo opazili tudi povečanje povprečnega premera nanovlaken. Kljub vsemu pa ni razvidnega jasnega trenda glede vpliva masnega deleža Tweena 20 na premer nanovlaken.
32
Slika 16: SEM-slike nanovlaken z 90-odstotnim deležem hitosana z dodatkom Tweena 20: (a) 0,1 % (m/m), (b) 1,0 % (m/m) in (c) 2,0 % (m/m).
4.5.2 Vpliv dodatka Kolliphorja HS 15
Pripravili smo tri vzorce z različnim masnim deležem Kolliphorja HS 15. Vsak posamezen vzorec smo elektrostatsko sukali pri identičnih pogojih, ki so zabeleženi v preglednici V.
Slika 17 prikazuje nanovlakna pri različnih povečavah.
33
Slika 17: SEM-slike nanovlaken z 90-odstotnim deležem hitosana z dodatkom Kolliphorja HS 15. (a) 0,5 % (m/m), (b) 1,0 % (m/m), (c) 2,0 % (m/m).
Že z dodatkom 0,5 % (m/m) PAS smo znatno zmanjšali pojavnost vozlov in opazno izboljšali kakovost nanovlaken. Na sliki 16a je razvidno, da je pojavnost vozlov minimalna, vendar je prihajalo do zlepljanja posameznih vlaken. Zlepljanje vlaken se je nekoliko zmanjšalo z dodatkom 1,0 % (m/m) PAS. Nasprotno pa se je s povečanjem masnega deleža PAS na 2,0 % (m/m) pojavnost nepravilnosti na nanovlaknih povečala.
34
4.5.3 Vpliv PAS na premer nanovlaken in pojavnost polimernih madežev
Na podlagi naših rezultatov ne moremo sklepati o vplivu masnega deleža neionskih PAS na povprečni premer nanovlaken oziroma ne moremo govoriti o trendu naraščanja ali padanja povprečnega premera. Povprečen premer nanovlaken, izdelanih iz polimerne raztopine z dodatkom 1,0 % (m/m) Tweena 20, je bil 179 ± 82 nm. Iz enake polimerne raztopine z dodatkom 1,0 % (m/m) Kolliphorja HS 15 smo izdelali nanovlakna s povprečnim premerom 96 ± 30 nm. Pričakovali smo, da bodo imela izdelana nanovlakna bolj podoben povprečen premer. V primeru Tweena 20 smo s povečevanjem masnega deleža z 0,1 % (m/m) na 1,0
% (m/m) opazili povečanje premera nanovlaken, medtem ko smo pri Kolliphorju HS 15 s povečanjem masnega deleža z 0,5 % (m/m) na 1,0 % (m/m) zaznali zmanjšanje povprečnega premera nanovlaken. Pri povečanju masnega deleža PAS na 2,0 % (m/m) nismo opazili večjega vpliva na premer nanovlaken, dodatno pa je pri Kolliphorju HS 15 celo znižal kakovost nanovlaken.
Na sliki 18, ki prikazuje opisane vzorce pri manjši povečavi, opazimo velika odstopanja v morfologiji posameznih vzorcev. Morfologija nanovlaken je zelo raznolika in vidne so vse poznane oblike nepravilnosti. Slika 18a prikazuje vzorec brez dodanih PAS, pri katerem opažamo ogromno vozlov. Število vozlov smo znatno zmanjšali že z dodatkom majhne količine PAS, kar vidimo, če primerjamo vzorec brez PAS z vzorcema na slikah 18b in 18e.
Sklepamo, da smo površinsko napetost polimerne raztopine dovolj znižali, da smo lahko stabilizirali curek, kar se odraža v nižji pojavnosti vozlov. Največ polimernih madežev smo opazili pri vzorcu z 2-odstotnim (m/m) Tweenom 20, ki ga prikazuje slika 18d, in pri vzorcu z 2-odstotnim (m/m) Kolliphorjem HS 15, prikazanim na sliki 18g. Predvidevamo, da smo z dodatkom 2 % (m/m) PAS površinsko napetost raztopine polimera preveč znižali in s tem onemogočili nastanek Taylorjevega stožca, kar je vodilo do številnih prekinitev in v kapljanje. Najbolj enotno obliko nanovlaken brez polimernih madežev smo dosegli pri vzorcu z dodatkom 1,0 % (m/m) Tweena 20, ki je prikazan na sliki 18c, kjer smo bili najbolj uspešni pri poenotenju različnih parametrov in dejavnikov elektrostatskega sukanja.
Zaželeno je, da je masni delež PAS v raztopini čim nižji, saj večina PAS deluje dražeče.
Posledično se pri izdelavi nanovlaken izogibamo ali zmanjšujemo količino potencialno dražečih spojin, ki bi lahko pri nanosu na sluznice in kožo povzročile neželene učinke.
35
Slika 18: SEM-slike nanovlaken z 90-odstotnim deležem hitosana – prikaz polimernih madežev. (a) brez PAS, (b) 0,1 % Tween 20, (c) 1,0 % Tween 20, (d) 2,0 % Tween 20, (e) 0,5 % Kolliphor HS 15, (f) 1,0 % Kolliphor HS 15, (g) 2,0 % Kolliphor HS 15.
36
5 SKLEP
Hitosan je zaradi svojih edinstvenih lastnosti izjemno perspektiven polimer za izdelavo nanovlaken, vendar je priprava le-teh iz raztopine čistega hitosana zelo zahtevna. Cilj raziskovalne naloge je bil izdelati kakovostna nanovlakna s čim višjim deležem hitosana. Na podlagi proučevanja teoretskega ozadja postopka elektrostatskega sukanja smo zasnovali poskuse, s katerimi smo poglobili naše razumevanje vpliva različnih spremenljivk na morfologijo izdelanih nanovlaken.
V raziskovalni nalogi, opravljeni v okviru diplomskega dela, smo o vplivu parametrov na tvorbo hitosanskih nanovlaken ugotovili naslednje:
− Eden izmed temeljnih dejavnikov, ki vpliva na tvorbo enakomernega curka pri procesu elektrostatskega sukanja, je delež hitosana. S povečevanjem deleža hitosana se je sorazmerno povečevala viskoznost raztopine, kar je znatno oteževalo tvorbo stabilnega in konsistentnega curka. Pri raztopinah z deležem hitosana nad 70 % smo zabeležili prekinitve, kapljanje, pršenje curka, zasušitev kapljice na konico igle in pojav več curkov hkrati. Čim višji je bil delež hitosana, tem več deformacij smo opazili. Curek smo stabilizirali s prilagajanjem lastnosti raztopine in s spremembo parametrov procesa.
− Za izdelavo kakovostnih nanovlaken enakomerne debeline in brez vozlov je bistvenega pomena izbira polimera z ustrezno molekulsko maso. Pri pripravi nanovlaken z visokim deležem hitosana smo najbolj kakovostna vlakna izdelali z uporabo visokomolekularnega PEO z molekulsko maso 4 MDa.
− Dodatek PAS v formulacijo z visokim deležem hitosana je imel značilen vpliv na stabilizacijo curka in posledično na morfologijo nastalih nanovlaken. Pri raztopinah hitosan/PEO v razmerju 80 : 20 z dodatkom 0,1-odstotnega (m/m) Tweena 20 smo opazili znatno zmanjšanje povprečnega premera nanovlaken. V primeru elektrostatskega sukanja raztopin hitosan/PEO v razmerju 90 : 10 smo z dodatkom 0,1–1,0 % (m/m) neionskih PAS uspeli izdelati nanovlakna enakomernih velikosti in praktično brez vozlov. S povečevanjem masnega deleža PAS nad 1,0 % (m/m) nismo zaznali sprememb v povprečnem premeru nanovlaken.
− Med procesnimi parametri je najpomembnejša uporabljena napetost, ki je osrednja gonilna sila celotnega postopka. S prilagajanjem napetosti smo uravnavali tvorbo Taylorjevega stožca in vzdrževali konstanten ter stabilen nitasti curek. S povečevanjem
