UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Jaka JAKIN LAZAR
ŽLAHTNJENJE PŠENICE (Triticum aestivum) NA ODPORNOST PROTI RUMENI RJI (Puccinia
striiformis) S POMOČJO MOLEKULARNIH MARKERJEV
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Jaka JAKIN LAZAR
ŽLAHTNJENJE PŠENICE (Triticum aestivum) NA ODPORNOST PROTI RUMENI RJI (Puccinia striiformis) S POMOČJO MOLEKULARNIH
MARKERJEV
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
MOLECULAR MARKER ASSISTED BREEDING OF WHEAT (Triticum aestivum) FOR STRIPE RUST RESISTANCE (Puccinia striiformis)
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Kmetijstvo – agronomija. Delo je bilo opravljeno na Katedri za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin.
Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorja diplomskega dela imenovala izr. prof.
dr. Štajner Natašo, za recenzenta pa prof. dr. Jakšeta Jerneja
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Dominik VODNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: izr. prof. dr. Nataša ŠTAJNER
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: prof. dr. Jernej JAKŠE
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum zagovora: 20.08.2021
III
ŠD Du1
DK UDK 606:631.528:632.4:631.524.86(043.2)
KG žlahtnjenje rastlin, pšenica, rumena rja, molekularni markerji, odpornost rastlin AV JAKIN LAZAR, Jaka
SA ŠTAJNER, Nataša (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Univerzitetni študijski program prve stopnje Kmetijstvo - agronomija
LI 2021
IN ŽLAHTNJENJE PŠENICE (Triticum aestivum) NA ODPORNOST PROTI RUMENI RJI (Puccinia striiformis) S POMOČJO MOLEKULARNIH MARKERJEV
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 18 str., 7 sl., 30 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Namen diplomske naloge je predstavitev molekularnih markerjev in različnih modernih tehnik žlahtnjenja rastlin z njihovo uporabo. Podrobneje je prikazana uporaba teh metod pri žlahtnjenju pšenice (Triticum aestivum) na odpornost proti rumeni rji (Puccinia striiformis). Žlahtnjenje z napredkom genomskih tehnologij in novimi dognanji zelo napreduje in je v agronomiji postopek izboljšanja rastlin, ki se izvaja že odkar smo ljudje pričeli s kmetijstvom. Z žlahtnjenjem lahko pozitivno vplivamo na različne agronomske lastnosti kmetijskih rastlin, poleg tega pa lahko tudi povečamo odpornost rastlin na povzročitelje bolezni. Pšenica je med najbolj razširjenimi gojenimi rastlinami na svetu in je zaradi svoje prehranske vrednosti izjemno pomembna. Rumena rja je bolezen pšenice, ki jo povzroča obligatni parazit Puccinia striiformis iz kraljestva gliv. Tega je možno zatirati z uporabo fitofarmacevtskih sredstev, a ta onesnažujejo okolje. Pri pšenici je bila odkrita skupina Yr genov, ki kodirajo proteine za odpornost proti rumeni rji. Proučevanje teh genov in žlahtnjenje na odpornost je s pomočjo molekularnih markerjev veliko lažje in omogoča hitrejši razvoj odpornih sort pšenice. Yr15 gen izvira iz divjega sorodnika pšenice Triticum turgidum ssp. diccocoides in je dandanes pomemben vir odpornosti velikega števila sort pšenice.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION
ND Du1
DC UDC 606:631.528:632.4:631.524.86(043.2)
CX plant breeding, wheat, yellow rust, molecular markers, plant resistance AU JAKIN LAZAR, Jaka
AA ŠTAJNER Nataša (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Academic Study Programme in Agriculture - Agronomy
PY 2021
TI MOLECULAR MARKER ASSISTED BREEDING OF WHEAT (Triticum aestivum) FOR STRIPE RUST RESISTANCE (Puccinia striiformis)
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 18 p., 7 fig., 30 ref.
LA sl AL sl/en
AB The aim of this thesis is to present molecular markers and different modern plant breeding techniques using them. The focus is on the application of these methods to the breeding of wheat (Triticum aestivum) for resistance to yellow rust (Puccinia striiformis). Plant breeding is advancing rapidly with advances in genomic technology and new knowledge and is a very important method in agronomy that has been practiced since humans began to cultivate plants. Breeding can positively influence many agronomic traits of cultivated species and can also increase the resistance of plants to pathogens. Wheat is one of the most widely cultivated crops in the world and, because of its nutritional composition, is of great importance. Yellow rust is a disease of wheat caused by the obligate fungal parasite Puccinia striiformis. It can be controlled with use of fungicides, but these pollute the environment. In wheat, a group of Yr genes has been identified that encode proteins for resistance to yellow rust. Studying these genes, as well as breeding for resistance is much easier with the help of molecular markers, which allows faster development of resistant wheat varieties. The Yr15 gene originates from a wild relative of wheat, Triticum turgidum ssp. diccocoides, and nowadays, it is an important source of resistance in a large number of wheat cultivars.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO SLIK VI
1 UVOD ... 1
2 ŽLAHTNJENJE PŠENICE ... 2
3 MOLEKULARNI MARKERJI ... 4
3.1 RFLP ... 5
3.2 PCR-RFLP / CAPS ... 5
3.3 RAPD ... 5
3.4 AFLP ... 6
3.5 SCAR ... 7
3.6 MIKROSATELITNI MARKERJI ... 7
3.7 SNP ... 8
4 UPORABA MARKERJEV PRI ŽLAHTNJENJU RASTLIN ... 8
4.1 ŽLAHTNJENJE PŠENICE NA ODPORNOST PROTI RUMENI RJI ... 9
4.2 INTROGRESIJA Yr15 GENA IZ DIVJEGA SORODNIKA Triticum turgidum ssp. dicoccoides ... 13
5 ZAKLJUČEK ... 15
6 VIRI ... 16
VI KAZALO SLIK
Str. ...
Slika 1: Evolucija pšenice. Domnevno se je razvila iz diploidne Triticum urartu, ki se je skrižala z diploidno Aegilops speltoides. Njun potomec je divji tetraploid Triticum turgidum ssp. dicoccoides. Gojena podvrsta te vrste je tetraploid Triticum turgidum ssp. dicoccon (dvozrnica). Ta se je na poljih križala z diploidom Aegilops tauschii in njun potomec je navadna pšenica Triticum aestivum (prirejeno po Anthony
in sod., 2020,). ... 3 Slika 2: Različne linije pšenice iz poskusa za pridobitev odpornosti na rumeno rjo (Liu
in sod., 2020). ... 4 Slika 3: Shema križanja: P1 x P2 -> F1a, P1 x P3 -> F1b, F1a x F1b ->F2,
F2 x F2-> F3, F3 x F3-> F4 (prirejeno po Liu in sod., 2020).……… .... 10 Slika 4: IT vrednosti (infekcijski tip – 0 brez znakov bolezni, 4 zelo občutljive rastline)
in razlike med rastlinami, ki imajo prisoten določen Yr gen in tistimi, ki ga
nimajo. Zvezdica označuje korelacijo med prisotnostjo gena in odpornostjo. Yr15, Yr62 in Yr65 kodirajo odpornost proti trenutnim sevom patogenov, ki povzročajo rumeno rjo (prirejeno po Liu in sod., 2020). ... 11 Slika 5: IT (infekcijski tip – 0 brez znakov bolezni, 4 zelo občutljive rastline) vrednosti
za kombinacije genov. Geni v kombinaciji bolje kodirajo odpornost
v primerjavi s posameznim genom v primerih označenih z zvezdico. Negativne vrednosti pa pomenijo delež povečane odpornosti rastlin z dvema genoma za odpornost, v primerjavi z rastlinami z zgolj enim genom (npr. pri c: Yr26 gen v kombinaciji z Yr48 genom znatno poviša odpornost rastline, in sicer za 35% v
primerjavi s samostojno prisotnostjo Yr26 gena.) (prirejeno po Liu in sod., 2020). ... 12 Slika 6: a – porazdelitev števila Yr genov v končni populaciji: 74% osebkov je vsebovalo
4-6 Yr genov. b – povezava med številom Yr genov in odpornostjo: več kot je genov prisotnih, večja je odpornost (nižja IT vrednost) (prirejeno po Liu in
sod., 2020). ... 13 Slika 7: Genska karta 1BS kromosoma Triticum turgidum ssp. dicoccoides. Tesno vezana
markerja Xbarc8 in Xgwm413. Na levi so označene razdalje v cM, s puščico pa
je označena lokacija centromere (Yaniv in sod., 2015). ... 14
1 1 UVOD
Trenutno je na Zemlji preko 7,5 milijard prebivalcev in to število še narašča. Srečujemo se z mnogimi izzivi, predvsem pa z zagotavljanjem človekovih osnovnih potreb, med katere zagotovo sodi tudi hrana.
Ker pa imamo površine za pridelovanje hrane omejene, in ker se z naraščanjem prebivalstva te še dodatno krčijo, je potrebno čim bolj optimalno izkoristiti dani prostor (Calicioglu in sod., 2019). Tega lahko povečamo z odbiro sort, ki nam dajo več pridelka, kvalitetnejši pridelek, so odporne na razne škodljivce...
Te lastnosti se skozi človekov proces kultiviranja in žlahtnjenja rastlin ohranjajo, nekatere pa izginjajo. V Evropi smo veliko pozitivnih lastnosti izgubili v zadnjih desetletjih, ko se je žlahtnilo predvsem za večji pridelek, pri tem pa se je zanemarjalo odpornost rastlin na bolezni in škodljivce, saj se je te zatiralo z uporabo fitofarmacevtskih sredstev. To je privedlo do velikega onesnaževanja, pojava rezistentnih vrst patogenov in imelo negativen ali celo uničujoč vpliv tudi na neciljne organizme (Ram in sod., 2012).
Danes se zaradi tega veliko žlahtni s pomočjo starih, pozabljenih sort ter divjih sorodnih vrst, in sicer tako, da z žlahtnjenjem prenesemo gene za odpornost v kultivirane sorte (Dempewolf in sod., 2017; Tóth in sod., 2004). Če bi se posluževali klasičnih žlahtniteljskih metod, bi bilo to zelo zamudno in drago delo, ki zahteva veliko časa in prostora. Alternativa so biotehnološke metode, in sicer žlahtnjenje s pomočjo molekularnih markerjev (Sivolap, 2013).
Z uporabo molekularnih markerjev v žlahtnjenju lahko v izbran kultivar dodamo želene kvantitativne fenotipske lastnosti, ki so vezane na določene gene, v veliko krajšem času in na manjšem prostoru, kot če bi to počeli z uporabo klasičnih žlahtniteljskih metod s povratnimi križanji. Pri tem pristopu se sicer tudi poslužujemo povratnih križanj, a zgolj dvakrat, na manj rastlinah, ki jih lahko odberemo že v fazi semena ali v juvenilnem obdobju (Sivolap, 2013).
Med najpomembnejše rastline, namenjene prehrani, zagotovo sodi tudi pšenica. Nekateri arheobotanični izsledki, ki temeljijo na DNA analizah, pričajo o tem, da smo s kultivacijo heksaploidne pšenice (T.
aestivum) morda pričeli že pred več kot 8000 leti, na ozemlju današnje Turčije (Bilgic in sod., 2016). Vse do danes se je gojenje navadne pšenice zelo razširilo, kar pričajo podatki, da so jo leta 2018 obdelovali na več kot 200 milijonih hektarjev, pridelka pa je bilo več kot 750 milijonov ton (FAOSTAT, 2021).Temu je tako, ker jo je možno kultivirat v zmernih geografskih pasovih, poleg tega pa nam zagotavlja pomemben vir škroba in s tem energije, vitaminov (predvsem vitaminov B), proteinov ter prehranskih vlaknin (Shewry in Hey, 2015). Poleg tega pa ima navadna pšenica edinstvene lastnosti, ki omogočajo mletje zrnja in pridobivanje moke, ki jih med drugimi vrstami pšenice ni moč zaslediti (Arendt in Zannini, 2013).
V diplomski nalogi bom povzel nekaj dognanj s področja žlahtnjenja rastlin s pomočjo markerjev in podrobneje opisal nekaj primerov na pšenici, saj menim, da je napredovanje in raziskovanje tega področja nujno za človeški obstoj na našem planetu, ne da bi s tem komu omejevali pravico do življenja zaradi pomanjkanja hrane. Poleg tega tovrstna dognanja pripomorejo k trajnostnemu kmetijstvu.
2 2 ŽLAHTNJENJE PŠENICE
Do zgodnjega 19. stoletja se pridelovalci večinoma niso ukvarjali z izboljševanjem lastnosti pšenice. Večji del takrat gojenih sort je nastal z naravno selekcijo in občasno ročno odbiro semen. Najstarejši dokumentiran poskus križanja žita je bil izveden v devetdesetih letih 18. stoletja, ko so posejali različne sorte v neposredni bližini in pričakovali medsebojno križanje. Kasneje so pri filialnih generacijah iz tega poskusa poročali o izboljšani odpornosti na ožig v primerjavi z ostalimi sortami. Sledilo je še nekaj križanj in poskusov izboljšanja lastnosti pšenice, na katere sta nedvomno imeli velik vpliv Darwinovi knjigi O izvoru vrst (1857), ter »Variation of Animals and Plants under Domestication« (1868). Čeprav so bila ta razmišljanja in poskusi korak v pravo smer sodobnega žlahtnjenja pšenice, pa je bilo vse to delo empirične narave. Omejeni so bili z variabilnostjo, katero so poskušali povečati z ustvarjanjem križancev. V začetku 20. stoletja so ponovno odkrili Mendlove zakone dedovanja, kar je sprožilo val žlahtnjenja pšenice, predvsem v Angliji, ter malo za tem še drugod po svetu (Lupton, 1987).
Navadna pšenica Triticum aestivum spada pod rod Triticum ter je naravni alopoliploid, in sicer heksaploid (AABBDD). Evolucija do heksaploidne pšenice je prikazana na sliki 1 (Anthony in sod., 2020). Poleg navadne heksaploidne pšenice, so v rodu Triticum tudi nekatere diploidne in tetraploidne vrste, a slednje, razen trde pšenice Triticum durum, niso tako razširjene (Arendt in Zannini, 2013).
Alopoliploidi vsebujejo več setov kromosomov, ki izvirajo iz različnih vrst, a morajo biti te vrste dovolj sorodne, da se lahko medsebojno oplodijo (Anthony in sod., 2020).
Na sliki 2 je prikazanih nekaj fotografij linij pšenice iz sodobnega žlahtniteljskega poskusa (Liu in sod.
2020).
3
Slika 1: Evolucija pšenice. Domnevno se je razvila iz diploidne Triticum urartu, ki se je skrižala z diploidno Aegilops speltoides.
Njun potomec je divji tetraploid Triticum turgidum ssp. dicoccoides. Gojena podvrsta te vrste je tetraploid Triticum turgidum ssp. dicoccon (dvozrnica). Ta se je na poljih križala z diploidom Aegilops tauschii in njun potomec je navadna pšenica Triticum aestivum(prirejeno po Anthony in sod., 2020).
4
Slika 2: Različne linije pšenice iz poskusa za pridobitev odpornosti na rumeno rjo (Liu in sod., 2020).
3 MOLEKULARNI MARKERJI
Molekularni markerji (v nadaljevanju »markerji«) so fragmenti DNA, s katerimi odkrivamo molekularne polimorfizme. Z njimi najpogosteje primerjamo organizme iste vrste, pri rastlinah pa lahko primerjamo celo klone iste sorte. V nasprotju z morfološkimi markerji, so ti neodvisni od okolja, razvojnega stadija, zdravstvenega stanja in načina pridelave preiskovane rastlinske vrste (Boopathi, 2013).
Z uporabo in primerjanjem markerjev lahko pridobimo informacije o genski sorodnosti med posameznimi osebki, določamo gensko sestavo in variabilnost populacije, delamo starševske analize, identificiramo sorte, lahko jih uporabimo pri genskem kartiranju ter pregledujemo prisotnost določenih genov že v zarodnem materialu (Boopathi, 2013).
Poznamo več markerskih sistemov, med najbolj razširjene uvrščamo (Henry, 2012):
• RFLP (Restricted fragment length polymorphism – polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov),
• PCR-RFLP / CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences – PCR polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov),
• RAPD (Random amplified polymorphic DNA – naključno namnožena polimorfna DNA),
• AFLP (Amplified fragment length polymorphism – polimorfizem dolžin namnoženih fragmentov),
• SCAR (Sequence characterized amplified region),
• SSR (Simple sequence repeat) in STR (Short tandem repeat) – mikrosateliti),
• SNP (Single nucleotide polymorphism – Polimorfizem posameznih nukleotidov).
5
Polimorfizem dolžin restrikcijskih encimov je bil prvi razvit markerski sistem. Temelji na razrezu DNA z restrikcijskimi encimi, in sicer endonukleazami. Prvi korak je razrez genomske DNA z uporabo restrikcijskih encimov. Sledi ločevanje fragmentov z gelsko elektroforezo, nato pa se opravi analizo po Southernu. To se naredi tako, da se iz gela odtisne razrezane fragmente DNA na nitrocelulozni filter, tega se vstavi v vrečko s hibridizacijskim pufrom in radioaktivno označenimi sondami, ki se vežejo na komplementarne »odtise« na filtru. Slabo vezane sonde se odstrani in filter postavi na rentgenski film, da ga radioaktivne sonde osvetlijo. Na ta način dobimo avtoradiogram, iz katerega se lahko odčita polimorfizme na podlagi dolžine fragmentov, ki so bili produkti razreza z restrikcijskimi encimi.
Polimorfizmi so vidni, kjer razrez ne poteče na istem mestu pri različnih osebkih iste vrste, oziroma pri različnih vzorcih poteče različno število razrezov (Jarcho, 1994).
RFLP markerji so kodominantni, zatorej se lahko razlikuje med osebki, ki so heterozigotni in posamezniki, ki so homozigotni na polimorfnem mestu. Kadar je na avtoradiogramu ena črta, govorimo o homozigotni obliki, ko pa sta dva, govorimo o heterozigotni (Boopathi, 2013).
Dobre lastnosti RFLP sistema so, da je postopek robusten, oziroma ponovljiv med laboratoriji, kodominanten in da nam sekvenc preiskovane DNA ni treba poznati. Po drugi strani pa je ta postopek precej zamuden, izdelati moramo sonde, ki so drage, potrebno je imeti veliko količino kakovostne DNA ter postopka ni mogoče avtomatizirati. Uporablja se lahko pri genskem kartiranju, fiksaciji hibridov in proučevanju genske diverzitete (Boopathi, 2013).
3.2 PCR-RFLP / CAPS
CAPS, oziroma PCR-RFLP marker prav tako deluje na principu razreza z restrikcijskimi encimi, a preden jih dodamo vzorcu, določen odsek, ki ga želimo analizirati, s PCR-jem namnožimo. Nato lahko takoj iz agarozne ali poliakrilamidne gelske elektroforeze vidimo, ali so bile na paru, oziroma skupini vzorcev kakšne spremembe v analiziranem pomnoženem zaporedju. Če so te vidne, so bodisi spremenile zaporedje DNA, kjer bi restrikcijski encim sicer cepil, bodisi nekje spremenile zaporedje DNA tako, da je nastalo novo mesto za delovanje restrikcijskega encima. Te spremembe so lahko SNPji ali indel mutacije (insercije ali delecije). S tem postopkom se v primerjavi z RFLP sistemom izognemo dolgotrajni analizi po Southernu, prav tako je tudi ta marker kodominanten (Boopathi, 2013).
3.3 RAPD
RAPD se prav tako izvaja s pomočjo PCR-ja in je najcenejši markerski sistem. Temelji na PCR namnoževanju fragmentov, ki so ustvarjeni naključno s pomočjo krajših začetnih oligonukleotidov, najpogosteje dolgih 10 baznih parov, ki imajo zaradi kratke dolžine več potencialnih mest prileganja v genomu preiskovane vrste. Predhodno poznavanje genoma preiskovane vrste/sorte ni potrebno, zato se
6
lahko enaki začetni oligonukleotidi uporabljajo za različne organizme. So dominantni markerji, zato je njihova informacijska vrednost nekoliko nižja in so zelo ne-robustni, ker je PCR reakcija zelo občutljiva na razne faktorje, kot so temperatura prileganja (ki je pri RAPD nekoliko nižja kot sicer), koncentracija DNA in koncentracija magnezijevih ionov (Boopathi, 2013).
Poteka pa tako, da damo v PCR preiskovano DNA in en krajši začetni oligonukleotid. Pustimo, da reakcija steče in v kolikor se začetni oligonukleotid prilega na dve mesti v preiskovanem genomu, ki sta dovolj blizu skupaj, se ustvari in namnoži fragment DNA. Postopek izvedemo na vseh vzorcih in produkte PCR- jev naložimo na gelsko elektroforezo. Zaznane so mutacije, če se začetni oligonukleotid ni prilegal na isto mesto pri dveh organizmih (spremembe v sekvenci na mestih prileganja začetnih oligonukleotidov), ali če namnoženi fragmenti niso enako dolgi, kar nam pove, da so bile na tem delu delecije, insercije ali oboje (Gurusubramanian in Kumar, 2016).
RAPD markerje se med drugim uporablja pri identifikaciji sort, preučevanju filogenetskih odnosov, genetskem kartiranju, razvoju genskih markerjev povezanih s kvantitativnimi lastnostmi in proučevanju genske strukture populacije (Gurusubramanian in Kumar, 2016).
3.4 AFLP
Polimorfizem dolžin namnoženih fragmentov je nekoliko manj občutljiv markerski sistem kot RAPD.
Poteka pa v štirih korakih. Prvi korak je restrikcija genomske DNA. Najpogosteje uporabljena encima za restrikcijo sta EcoR1 in Mse1 ali Pst1. EcoR1 reže na eni strani, redkeje, saj prepozna zaporedje šestih nukleotidov, Mse1 ali Pst1 na drugi, pogosteje, saj prepoznata zaporedje štirih nukleotidov. Sledi ligacija dvovijačnih linkerjev, oziroma adapterjev na restrikcijsko mesto. Na EcoR1 mesto se veže Eco linker, na Mse1 mesto Mse linker, ter na Pst1 mesto Pst1 linker. Ti se vežejo na lepljive konce, ki so jih ustvarili restrikcijski encimi, ter dodajo specifične nukleotide na konce. Začetni oligonukleotidi, ki jih izdelamo, so komplementarni uporabljenim linkerjem in se vežejo nanje; temu delu postopka pravimo predamplifikacija. Začetni oligonukleotidi so na 3' koncu podaljšani za eno selektivno bazo. Nato sledi še selektivna amplifikacija, ki je podobna kot predamplifikacija, a namesto podaljšanja za eno selektivno bazo, se podaljšuje s tremi dodatnimi selektivnimi bazami. S procesom selektivne amplifikacije zmanjšamo število namnoženih fragmentov, kar omogoča zanesljivejše vrednotenje fragmentov. Izvede se še en PCR in produkte se na koncu ločuje na poliakrilamidni ali kapilarni elektroforezi, saj imata ti dve boljšo ločljivost kot agarozna. Za lažje ločevanje in detekcijo pomnožkov, je eden od para začetnih oligonukleotidov obarvan s fluorescentnim barvilom (Meudt in Clarke, 2007; Vos in sod., 1995).
Polimorfizme lahko vidimo, če je prišlo kje do mutacij na restrikcijskih mestih, mutacij nukleotidnih zaporedij, ki so blizu restrikcijskih mest in na nukleotidih, ki se uporabljajo za prileganje začetnih oligonukleotidov (Meudt in Clarke, 2007).
7
genotipiziranje DNA in filogenetske študije. Omogoča hiter pregled celotnega genoma, vsaka kombinacija generira veliko število fragmentov, postopek je robusten in ni potrebno poznati DNA zaporedja preiskovanega organizma. Je dominanten marker. Markerji, ki jih dobimo, se pogosto nahajajo v telomerah ali centromerah, kar lahko predstavlja težavo pri kartiranju, ker markerji niso enakomerno razporejeni po celotnem genomu (Boopathi, 2013; Meudt in Clarke, 2007).
3.5 SCAR
SCAR marker je možno narediti iz RAPD fragmenta. Specifičen RAPD marker izrežemo iz agarozne elektroforeze in ga vstavimo v vektor. Nato izvedemo sekvenciranje, da lahko na osnovi pridobljenega zaporedja ustvarimo specifične začetne oligonukleotide, in na osnovi novih začetnih oligonukleotidov v PCR-ju namnožimo specifičen fragment. Na tak način dominanten RAPD marker spremenimo v kodominanten SCAR marker (Paran in Michelmore, 1993).
3.6 MIKROSATELITNI MARKERJI
Mikrosateliti so ponovljiva zaporedja kratkega osnovnega motiva, ki je sestavljen iz najmanj dveh do največ osmih baznih parov. V genomu jih je veliko, njihove mutacije pa so najpogosteje posledica nepravilnega parjenja zdrsnjenih verig med replikacijo DNA ali pa posledica neenakega prekrižanja (crossing-overja). Evolucijsko se daljšajo, večinoma pa se pojavljajo v nekodirajočih regijah genoma.
Najpogostejši mikrosateliti v rastlinah so sestavljeni iz osnovnega motiva (AT)n (Richard in sod., 2008;
Sonah in sod., 2011; Yampolsky, 2016).
Za namnoževanje mikrosatelitov izdelamo začetna oligonukleotida, ki na robovih omejujeta preiskovan mikrosatelit in produkte ločimo na poliakrilamidni ali kapilarni gelski elektroforezi, ki omogoča ločevanje za dolžino 1 baznega para, saj se dolžine mikrosatelitov lahko razlikujejo tudi le za 2 bazna para. Za boljšo vizualizacijo se lahko uporabi še fluorescentna barvila (Boopathi, 2013).
Za analizo mikrosatelitnih markerjev zadošča majhna količina DNA poleg tega jih odlikuje visok nivo polimorfizma. Je zelo pogosto uporabljen robusten markerski sistem, ker je kodominanten ter ga je mogoče avtomatizirati. Začetni oligonukleotidi so vrstno specifični, kar pomeni, da je treba mikrosatelite izolirati ali pridobiti za sekvenčnih podatkov za vsako vrsto posebej. Težave pri vrednotenju lahko povzročajo tudi ničti aleli, saj če jih v populaciji ne odkrijemo, lahko napak določimo preveliko število homozigotov (Boopathi, 2013; Callen in sod., 1993).
Mikrosateliti imajo zelo veliko uporabno vrednost; uporabljamo jih pri identifikaciji sadilnega materiala in sorodnih genotipov, analizi genetske sorodnosti, detekciji spola rastline, kartiranju, identifikaciji strukture populacije, itd. (Boopathi, 2013).
8 3.7 SNP
Polimorfizem posameznih nukleotidov je sprememba enega baznega para v zaporedju, ki se v populaciji pojavlja v signifikantnem deležu, in sicer pri več kot 1 % organizmov. Če se ta pojavlja v manj kot 1 %, govorimo o mutaciji (Karki in sod., 2015). Večinoma so SNP bialelni, torej je na določenem mestu možna zamenjava dveh različnih baz pri različnih osebkih (Casci, 2010). SNP so lahko posledice tranzicije in transverzije. Pri tranziciji govorimo o zamenjavi med bazama enake oblike; med dvoobročnimi purini (A- G) ali enoobročnimi pirimidini (C-T). Teh je v praksi več. Pri transverzijah pa gre za zamenjavo iz dvoobročnega purina v enoobročni pirimidin ali obratno. SNP se pogosto pojavljajo v metiliranem delu genoma, predvsem na 5-metilcitozinu, ko se mu odcepi NH2in se tako pretvori v timin. SNP se lahko nahajajo v intronih, eksonih, regulatornih regijah in izvengenskih regijah. V genomu jih je veliko in so zelo informativni (Edwards in sod., 2005).
Med drugim, lahko SNPje identificiramo s pomočjo konformacijskih polimorfizmov enoverižnih DNA fragmentov. Skozi ta postopek PCR produkte analiziramo na nedenaturirajočem, oziroma nativnem poliakrilamidnem gelu. Amplikone denaturiramo s pomočjo toplote in formamida, nato pa razklenjene vijačnice nanesemo na nativni gel, kjer zavzamejo nativno obliko. Zaradi te unikatne 3D oblike lahko ločimo enako dolge fragmente, saj potujejo različno hitro. Lahko jih detektiramo tudi s pomočjo heterodupleks analiz, ki delujejo na podobnem principu ločevanja amplikonov na nativni gelski eletroforezi (Costabile in sod., 2006).
4 UPORABA MARKERJEV PRI ŽLAHTNJENJU RASTLIN
Za uporabo zgoraj naštetih markerjev pa moramo sprva določiti njihovo uporabnost pri dedovanju določene fenotipske lastnosti. Pri tem delu nam pridejo prav QTL (lokusi kvantitativnih lastnosti, angl.
quantitative trait locus) analize. QTL je genomska regija, sestavljena iz enega ali več genov, ki narekujejo izražanje določenih kvantitativnih lastnosti. QTL analize pa delujejo na principu detekcije povezave med fenotipsko lastnostjo in genotipom markerja. To povezavo se določa s pomočjo statističnih metod, kot so t-test in ANOVA. V kolikor je med skupinama populacije, ki se razlikujeta v prisotnosti markerja, statistična razlika značilna glede na analizirano lastnost, to pomeni da je marker vezan na QTL, oziroma lastnost. Bližje kot sta QTL in marker, manj verjetno je, da bo med njima prišlo do rekombinacije (Boopathi, 2013).
Po identificiranju markerja, ki je vezan na lastnost, se lahko lotimo naslednjega koraka. Gre za podoben postopek kot pri klasičnem žlahtnjenju s križanjem, ko z donorsko rastlino (P2) vnašamo določeno lastnost v prejemnika (P1), oziroma elitnega starša. A za razliko od klasičnega žlahtnjenja, je postopek z uporabo markerjev mnogo krajši, ker zahteva manj povratnih križanj (Fn X P1) in je tudi cenejši, saj prek markerjev lahko potrdimo lastnost že v rastlinah v semenski obliki in zatorej ne rabimo vzgajati ter pregledovati vseh fenotipov za potrjevanje lastnosti, kar bi bilo tudi bolj zamudno in manj zanesljivo. S pomočjo markerjev
9 opazovanjem zelo zahtevno (Boopathi, 2013).
4.1 ŽLAHTNJENJE PŠENICE NA ODPORNOST PROTI RUMENI RJI
Rumena rja je glivična bolezen, ki jo povzroča Puccinia striiformis in ima na posevke pšenice po celem svetu zelo negativen vpliv, saj zelo zniža kvaliteto in količino pridelka. Puccinia striiformis je gliva iz debla Bazidiomycota (prostotrosnice), razreda Pucciniomycete, reda Uredinales, oz. Pucciniales (rje), družine Pucciniaceae ter roda Puccinia. Razdeljena je še na specializirane oblike, glede na to katere rastline okužuje. Pšenico okužuje Puccinia striiformis f.sp. triciti, sicer pa ni popolnoma omejena na pšenico in lahko okužuje tudi nekatere druge rastlinske vrste. Patogen, ki povzroča rumeno rjo, okužuje zelene dele rastlin, je obligatni parazit in rastlino lahko okuži kadarkoli tekom njenega življenja, ob pogoju, da je rastlina zelena. Simptomi se pojavijo 1 teden po okužbi, ob optimalnih temperaturnih pogojih pa se po 2 tednih prične sporulacija. Gliva oblikuje majhne rumeno rjave mehurčke, imenovane uredia, ti pa vsebujejo po tisoče urediniospor. Gliva iz rastline črpa hranilne snovi in vodo, ter jo tako oslabi (Chen, 2005).
Rumeno rjo je mogoče zatirati z uporabo fungicidov, a je veliko bolj ekonomično in okolju prijazno že preventivno odbirati odporne sorte (Chen, 2005; Liu in sod., 2020). Do sedaj je bilo na pšenici odkritih že 80 Yr genov, kateri kodirajo odpornost proti rumeni rji, a je zaradi hitre evolucije sevov Puccinie striiformis, veliko kultivarjev izgubilo odpornost (Liu in sod., 2020).
V študiji so bile uporabljen tri starševske linije pšenice, ki imajo posamezne gene za odpornost proti rumeni rji, in sicer Chuanyu12, 04G368 in Yumai35. Chuanyu12 je bila uporabljena, ker je bila v devetdesetih letih prejšnjega stoletja prevladujoča sorta na jugozahodu Kitajske in vsebuje tri gene za odpornost Yr10, Yr30 in Yr48. Linija 04G368 je bila uporabljena, ker vsebuje kar 7 Yr genov, in sicer Yr10, Yr15, Yr30, Yr48, Yr62, Yr 65 in YrSP. Yumai35, včasih poznana pod imenom Neixiang184 pa je bila uporabljena, ker je bila v devetdesetih letih prejšnjega stoletja ena izmed najbolj razširjenih sort v Kitajski provinci Henan in vsebuje gene za odpornost Yr5, Yr10, Yr17, Yr26, Yr30 ter Yr64. Chuanyu12 so sprva križali z 04G368, nato pa še z Yumai35. Oba potomca (F1) so skrižali in nato samoopraševali do F4. Shema križanja je prikazana v sliki 3 (Liu in sod., 2020).
10
Slika 3: Shema križanja: P1 x P2 -> F1a, P1 x P3 -> F1b, F1a x F1b ->F2, F2 x F2-> F3, F3 x F3-> F4 (prirejeno po Liu in sod., 2020)
Izbrali so 21 molekularnih markerjev za 11 poznanih Yr genov. Pri vseh primerih sta bila 2 markerja tesno vezana na obe strani Yr gena, razen pri YrSP, ki ima na voljo zgolj en tesno vezan marker (Liu in sod., 2020).
Selekcija s pomočjo teh markerjev je bila uporabljena od F2 do F4. Iz listov sejancev so s CTAB metodo izolirali DNA in izvedli PCR s specifičnimi začetnimi oligonukleotidi. Pomnožke so analizirali na agarozni gelski elektroforezi in na ne-denaturirajoči poliakrilamidni gelski elektroforezi. Na prvi so produkte obarvali z etidijevim bromidom, na drugi pa s srebrovim nitratom (Liu in sod., 2020).
Prisotnost genov so določali s pomočjo markerjev in okuževali rastline z aktualnimi sevi patogene glive ter beležili znake okužbe. Nato so izvedli statistični ANOVA test za preverjanje odpornosti rastlin s prisotnimi posameznimi Yr geni in prisotnimi kombinacijami Yr genov (Liu in sod., 2020).
Na sliki 4 so prikazani infekcijski tipi rastlin z genom za odpornost v primerjavi s tistimi brez, na sliki 5 pa so prikazani infekcijski tipi rastlin z dvema genoma za odpornost. Na sliki 6 pa je prikazana porazdelitev števila Yr genov v populaciji, ter vpliv več genov na odpornost, določeno z infekcijskimi tipi (Liu in sod., 2020).
11
Slika 4: IT vrednosti (infekcijski tip – 0 brez znakov bolezni, 4 zelo občutljive rastline) in razlike med rastlinami, ki imajo prisoten določen Yr gen in tistimi, ki ga nimajo. Zvezdica označuje korelacijo med prisotnostjo gena in odpornostjo. Yr15, Yr62 in Yr65 kodirajo odpornost proti trenutnim sevom patogenov, ki povzročajo rumeno rjo (prirejeno po Liu in sod., 2020).
IT IT VREDNOSTI
12
Slika 5: IT (infekcijski tip – 0 brez znakov bolezni, 4 zelo občutljive rastline) vrednosti za kombinacije genov. Geni v kombinaciji bolje kodirajo odpornost v primerjavi s posameznim genom v primerih označenih z zvezdico. Negativne vrednosti pa pomenijo delež povečane odpornosti rastlin z dvema genoma za odpornost, v primerjavi z rastlinami z zgolj enim genom (npr. pri c: Yr26 gen v kombinaciji z Yr48 genom znatno poviša odpornost rastline, in sicer za 35 % v primerjavi s samostojno prisotnostjo Yr26 gena.) (prirejeno po Liu in sod., 2020).
IT IT VREDNOSTI
IT IT VREDNOSTI
IT IT VREDNOSTI
13
Slika 6: a – porazdelitev števila Yr genov v končni populaciji: 74 % osebkov je vsebovalo 4-6 Yr genov. b – povezava med številom Yr genov in odpornostjo: več kot je genov prisotnih, večja je odpornost (nižja IT vrednost) (prirejeno po Liu in sod., 2020).
Opazovali so tudi korelacijo med številom Yr genov in agronomskimi lastnostmi, kot so višina rastline, dolžina klasa, število stebel in masa 1000 zrn, a povezave ni bilo (Liu in sod., 2020).
Ta raziskava je bila izvedena po »piramidni strategiji«, ko gre za križanje z več kot dvema staršema, v tem primeru s tremi. Vsak od teh staršev je imel nekaj unikatnih genov za odpornost in pri študiji so raziskovali, kako prisotnost večjega števila teh genov vpliva na dejansko odpornost. Ugotovili so, da nekateri geni (Yr15, Yr62 in Yr65) lahko samostojno vplivajo na povečanje odpornosti pšenice proti trenutnim sevom glive, ki povzroča rumeno rjo, nekateri pa kodirajo odpornost šele v interakciji (Yr5 + YrSP, Yr30 + Yr48, Yr30 + Yr64, Yr26 + Yr64 in Yr26 + Yr48), in samostojno ne kodirajo odpornosti na trenutne seve.
Piramidenje genov oz. žlahtnjenje v smeri genotipov z več odpornostnimi geni je pomembno tudi zato, da kultivar ni odporen samo na posamezen sev, ampak ima potencial za odpornost tudi v primeru, da sev mutira (Liu in sod., 2020).
Zaradi boljše odpornosti v primeru vključevanja večjega števila genov in zaradi odpornosti na morebitne nove seve patogenih organizmov, je dandanes piramidna strategija vključevanja več genov pri žlahtnjenju zelo aktualna in uporabna metoda selekcije s pomočjo markerjev (Liu in sod., 2020).
4.2 INTROGRESIJA YR15 GENA IZ DIVJEGA SORODNIKA Triticum turgidum ssp. dicoccoides Zanimiv je izvor omenjenega Yr15 gena. Odkrit je bil leta 1980 v rastlini Triticum turgidum ssp.
dicoccoides, kodira pa protein tandem kinaze-psevdokinaze za odpornost proti več tisoč sevom Puccinie striiformis (Klymiuk in sod., 2018). Nahaja se na 1BS kromosomu (slika 7), v mnoge današnje sorte navadne pšenice pa je bil vstavljen s pomočjo introgresije skozi postopke klasičnega žlahtnjenja, ki temeljijo na fenotipski selekciji (Yaniv in sod., 2015).
IT IT VREDNOSTI Fr FREKVENCA
Š ŠTEVILO Yr GENOV Š ŠTEVILO Yr GENOV
14
Introgresija s pomočjo markerjev je postopek vstavljanja gena v elitnega starša (P1) iz donorskega (P2) (v tem primeru Triticum turgidum ssp. dicoccoides). S to metodo obdržimo kar se da velik del genoma elitnega starša, medtem ko od donorskega starša obdržimo le lokus v katerem se nahaja Yr15 gen. P1
križamo s P2, iz F1 odberemo tiste potomce, ki imajo prisoten Yr15 gen, oziroma tarčni lokus. Nato F1
generacijo ponovno skrižamo s P1, da dobimo 1. generacijo povratnih križancev. Pri tej generaciji obdržimo le tiste, ki imajo prisoten tarčni lokus in marker iz ene strani obrobne regije. S temi osebki ponovimo križanje s P1 in pri novi generaciji izberemo tiste, ki imajo prisoten tarčni lokus ter marker na drugi strani obrobne regije, in tako dobimo genotip, ki ima pretežno prisotne gene elitnega starša z vnesenim genom za odpornost proti rumeni rji. Markerji v obrobnih regijah namreč izvirajo iz elitnega starša, markerji ki določajo tarčni lokus pa iz donorskega. Raziskava je potekala na pregledu in ocenjevanju markerjev, ki določajo tarčni lokus (Boopathi, 2013; Yaniv in sod., 2015).
Pri genu Yr15 sta bila za žlahtnjenje najpogosteje uporabljena tesno vezana markerja Xbarc8 in Xgwm413.
S pomočjo teh markerjev, se je v prvem koraku pri vsaki generaciji od F1 dalje določilo ali je posamezen lokus prisoten ali ne (Yaniv in sod., 2015).
Slika 7: Genska karta 1BS kromosoma Triticum turgidum ssp. dicoccoides. Tesno vezana markerja Xbarc8 in Xgwm413. Na levi so označene razdalje v cM, s puščico pa je označena lokacija centromere (Yaniv in sod., 2015).
Raziskava poroča, da sta pri razlikovanju med alelom segmenta, ki izvira iz donorske (Triticum turgidum ssp. dicoccoides) rastline in alelom, ki izvira iz elitne rastline (v primeru poskusa Triticum durum), markerja konsistentna. Zato sta ta dva markerja trenutno najpomembnejša pri žlahtnjenju pšenice za prisotnost Yr15. S pomočjo teh dveh markerjev in takega načina žlahtnjenja, lahko ohranimo vse do sedaj že prisotne gene v elitnem kultivarju, ob tem pa vanj vnesemo izbran gen (Yaniv in sod., 2015).
15
Planet na katerem prebivamo ima omejeno količino naravnih virov. Med te vire sodijo tudi tla, ki so za pridelovanje hrane in ostalih rastlinskih ter živalskih proizvodov ključnega pomena. Trenuten trend naraščanja števila prebivalcev na Zemlji brez dvoma negativno vpliva na količino razpoložljivih površin za obdelovanje. Poleg tega, da se ta količina krči, pa je treba zadovoljiti prehranske potrebe vedno večjega števila ljudi. Hkrati pa se kmetovalci širom sveta vseskozi srečujejo tudi z raznimi povzročitelji rastlinskih bolezni in škodljivci, ki še dodatno zmanjšujejo pridelek.
Velik del obdelovalnih površin, katerih produkti so namenjeni prehrani, dandanes prekriva pšenica.
Nekateri zanesljivi dokazi pričajo o tem, da smo ljudje pričeli gojiti navadno pšenico pred več kot 8000 leti in je še v sedanjem času, zaradi mnogih dobrih lastnosti, izjemno pomembna iz vidika globalne pridelave hrane. Zaradi krčenja obdelovalnih površin, večjih potreb po hrani in pojava novih povzročiteljev bolezni ter škode nastale zaradi škodljivcev, moramo za zadostno preskrbo s hrano na globalni ravni nedvomno ukrepati in omiliti ali izničiti te negativne dejavnike, ki izrazito vplivajo med drugim tudi na pšenico. Med temi ukrepi je žlahtnjenje zagotovo med najučinkovitejšimi in najbolj ekološko prijaznimi.
Žlahtnjenje je dolgotrajen proces, ki pa ga lahko s pomočjo molekularnih markerjev znatno skrajšamo. To seveda za seboj prinese višjo ceno in potrebno laboratorijsko opremo, a se ta cena povrne zaradi krajšega časovnega obdobja in manjše potrebe po prostoru. V primeru, ko pa želimo pri procesu žlahtnjenja vnašati večje število genov, pa je uporaba markerjev nujna. V kolikor bi se lotili klasičnega žlahtnjenja brez uporabe markerjev, bi zlahka prišlo do izgube genov, ker tega na fenotipskem nivoju ne bi opazili.
V primeru Yr genov, ki kodirajo proteine za odpornost proti rumeni rji na pšenici, ni nujno da pride do fenotipskih razlik, če imamo prisotne različne, oziroma različno število Yr genov. Precej novih odkritij prihaja na plano v povezavi z geni, ki izvirajo iz divjih sorodnih vrst ali starih, »pozabljenih« sort. Tak primer je Yr15 gen pri pšenici, ki je bil odkrit pri divjem sorodniku pšenice. Verjetno obstaja še veliko podobnih neodkritih genov pri kmetijskih rastlinskih vrstah, ki jih z uporabo markerskih sistemov lahko določimo, kar je pri žlahtnjenju ključno za razvoj novih, kompetentnih in uspešnejših sort.
16 6 VIRI
Anthony J. G., Miller H. J., Suzuki T. D., Lewontin C. R., Gelbart M. W. 2020. Introduction to genetic analysis. Principles and prenatal growth. 7. izd. New York, W.H. Freeman: 868 str.
Arendt E. K., Zannini E. 2013. Wheat and other Triticum grains. V: Cereal Grains for the Food and Beverage Industries. Cambridge, Woodhead Publishing Limited: 1-67
Bilgic H., Hakki E. E., Pandey A., Khan M. K. 2016. Ancient DNA from 8400 Year-Old Çatalhöyük Wheat : Implications for the Origin of Neolithic Agriculture, PLoS ONE, 11,3: e0151974, doi:10.1371/journal.pone.0151974: 18 str.
Boopathi N. M. 2013. Genetic mapping and marker assisted selection. Genetic mapping and marker assisted selection. Coimbatore, Springer: 293 str.
Calicioglu O., Flammini A., Bracco S., Bellù L., Sims R. 2019. The future challenges of food and agriculture: An integrated analysis of trends and solutions. Sustainability, 11, 222:
doi:10.3390/su11010222: 21 str.
Callen D. F., Thompson A. D., Shen Y., Phillips H. A., Richards R. I., Mulley J. C., Sutherland G. R.
1993. Incidence and origin of „null“ alleles in the (AC)n microsatellite markers. American Journal of Human Genetics, 52, 5: 922–927
Casci T. 2010. Population genetics: SNPs that come in threes. Nature Reviews Genetics, 11, 8:
doi:10.1534/ genetics.109.110510: 1 str.
Chen X. M. 2005. Epidemiology and control of stripe rust [Puccinia striiformis f. sp. tritici] on wheat.
Canadian Journal of Plant Pathology, 27, 3: 314–337
Dempewolf H., Baute G., Anderson J., Kilian B., Smith C., Guarino L. 2017. Past and future use of wild relatives in crop breeding. Crop Science, 57, 3: 1070–1082
Edwards D., Forster J. W., Chagné D., Batley J. 2005. Chapter 3 What are SNPs ? V: Association mapping in plants. Oraguzie C. N., Rikkerink A. H. E., Gardiner E. S., De Silva N. H. (ur.). New York, Springer-Verlag New York: 41–52
FAOSTAT. 2021. Crop statistics.
http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC (17.06.2021)
Gurusubramanian G., Kumar N. S. 2016. Random amplified polymorphic DNA ( RAPD ) markers and its applications. Mipograss, 11, 3: 116–124
Henry R. J. 2012. Molecular Markers in Plants. Brisbane, John Wiley & Sons: 169 str.
Jarcho J. 1994. Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis. Current Protocols in Human Genetics, 1, 1: https://doi.org/10.1002/0471142905.hg0207s01: 15 str.
17
of personal genomics. BMC Medical Genomics, 8, 1: 1–7
Klymiuk V., Yaniv E., Huang L., Raats D., Fatiukha A., Chen S., Feng L., Frenkel Z., Krugman T., Lidzbarsky G., Chang W., Jääskeläinen M. J., Schudoma C., Paulin L., Laine P., Bariana H., Sela H., Saleem K., Sørensen C. K., Hovmøller M. S., Distelfeld A., Chalhoub B., Dubcovsky J., Korol A. B., Schulman A. H., Fahima T. 2018. Cloning of the wheat Yr15 resistance gene sheds light on the plant tandem kinase-pseudokinase family. Nature Communications, 9, 1: doi: 10.1038/s41467- 018-06138-9: 12 str.
Liu R., Lu J., Zhou M., Zheng S., Liu Z., Zhang C., Du M., Wang M., Li Y., Wu Y., Zhang L. 2020.
Developing stripe rust resistant wheat (Triticum aestivum L.) lines with gene pyramiding strategy and marker-assisted selection. Genetic Resources and Crop Evolution, 67, 2: 381–391
Lupton F. G. H. 1987. History of wheat breeding. V: Wheat Breeding: Its scientific basis. Springer Netherlands: 51–70
Meudt H. M., Clarke A. C. 2007. Almost Forgotten or Latest Practice? AFLP applications, analyses and advances. Trends in Plant Science, 12, 3: 106–117
Miné Manuèle; Chen J., Desguerre I., Marchant D., Abitbol M., Ricquier D., Lonlay P. D., Bernard A., Fe C. 2006. RAPID COMMUNICATION A Large Genomic Deletion in the PDHX Gene Caused by the Retrotranspositional Insertion of a Full-Length LINE-1 Element. Human Mutation, 27,12:
1163–1173
Paran I., Michelmore R. W. 1993. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theoretical and Applied Genetics, 85, 8: 985–993
Ram J., Dachbrodt S., Kudsk P., Messéan A. 2012. Conventional Pesticides in Agriculture : Benefits Versus Risks Development of Community-Wide Legislation in the EU : A Path Toward a Low Pesticide-Input Farming New Measures for a Better Assessment of the Adverse Impact of Pesticides. Plant Disease, 100, 1: 10–24
Richard G.-F., Kerrest A., Dujon B. 2008. Comparative Genomics and Molecular Dynamics of DNA Repeats in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 72, 4: 686–727
Shewry P. R., Hey S. J. 2015. The contribution of wheat to human diet and health. Food and Energy Security, 4, 3: 178-202
Sivolap Y. M. 2013. Molecular markers and plant breeding. Cytology and Genetics, 47, 3: 188–195 Sonah H., Deshmukh R. K., Sharma A., Singh V. P., Gupta D. K., Gacche R. N., Rana J. C., Singh N.
K. Sharma, T. R. 2011. Genome-wide distribution and organization of Microsatellites in plants: An insight into marker development in Brachypodium. PLoS ONE, 6, 6: e21298,
10.1371/journal.pone.0021298: 9 str.
Tóth M., Kása K., Szani Z., Balikó E. 2004. Traditional old apple cultivars as new gene sources for
18 apple breeding. Acta Horticulturae, 663: 609–612
Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., Lee T., Hornes M., Friters A., Pot J., Paleman J., Kuiper M., Zabeau M. 1995. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23, 21: 4407–4414
Yampolsky L. Y. 2016. Mutation and Genome Evolution. Encyclopedia of Evolutionary Biology, 3:
77–83
Yaniv E., Raats D., Ronin Y., Korol A. B., Grama A., Bariana H., Dubcovsky J., Schulman A. H., Fahima T. 2015. Evaluation of marker-assisted selection for the stripe rust resistance gene Yr15, introgressed from wild emmer wheat. Molecular Breeding, 35, 43: doi:10.1007/s11032-015-0238- 01–12: 12 str.
