UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA
POUČEVANJE - PREDMETNO POUČEVANJE, BIOLOGIJA - KEMIJA
INES URŠNIK
PRIPRAVA UČNIH GRADIV ZA POSKUS FERMENTACIJE BOZE – PIJAČE IZ ŽIT
MAGISTRSKO DELO
LJUBLJANA, 2018
UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA
POUČEVANJE - PREDMETNO POUČEVANJE, BIOLOGIJA - KEMIJA
INES URŠNIK
PRIPRAVA UČNIH GRADIV ZA POSKUS FERMENTACIJE BOZE – PIJAČE IZ ŽIT
MAGISTRSKO DELO
Mentor: PROF. DR. MARKO KREFT Somentor: IZR. PROF. DR. DAMJAN JANEŠ
LJUBLJANA, 2018
I
Zahvala
Ob zaključnem pisanju magistrske naloge se najlepše zahvaljujem svojemu mentorju, prof.
dr. Marku Kreftu, za vso pomoč, hitro odzivnost, strokovne nasvete in spodbudne besede, ki so pripomogle h končanju te magistrske naloge. Prav tako bi se rada zahvalila somentorju,
prof. dr. Damjanu Janešu, za vso pomoč pri delu.
Velika zahvala velja tudi družini, ki me je podpirala in mi ob težkih trenutkih stala ob strani.
Hvala tudi fantu, prijateljem, sošolkam in sošolcu, ki so verjeli vame; brez vaše pomoči mi nebi uspelo.
Hvala!
II
POVZETEK
Boza je gosta pijača kiselkastega okusa. Okus vahko variira zaradi količine dodanega sladkorja, vrste žita, mikroorganizmov in dolžine fermentacije. Značilna je za Albanijo, Bolgarijo, Romunijo, Turčijo in druge balkanske države. V Turčiji se pije toplo pripravljena boza predvsem v zimskem času, saj segreje telo, zaradi česar naj bi pomagala proti sezonskim okužbam dihal. V Romuniji pijejo ohlajeno, osvežilno bozo predvsem v poletnih mesecih.
Zaradi vsebnosti vitaminov A, C, E in štirih vrst vitamina B, je dragoceno hranilo telesno dejavnih ljudi. Še posebej primerna je za vegetarijance in vegane, saj je v celoti rastlinskega izvora in je dober vir vitaminov in dober nadomestek mlečnih napitkov. V magistrski nalogi smo spremljali spremembo pH zmesi za bozo, pripravljene iz moke in bakterij, z namenom ugotoviti, kako hitro se pH v omenjeni zmesi niža. Ugotovili smo, da nižanje pH v zmeseh iz različnih mok in ob dodatku različnih bakterij ni enako hitro. Prav tako smo ugotovili, da se pH po 48 urah po dodanih bakterijah v zmes razlikuje glede na dodane bakterije. Izvedli smo tudi titracijo zmesi za bozo z namenom določiti količino nastale kisline med procesom fermentacije. Ugotovili smo, da za zmesi iz škroba od dodatku katerihkoli bakterij ni potrebno veliko baze za nevtralizacijo kisline, ki je nastala med procesom fermentacije. Zanimala nas je tudi rast bakterij v vzorcu, ki smo jo ocenili s pomočjo plošč Petrifilm®. Ugotovili smo, kakšno rastno krivuljo imajo bakterije iz kisle smetane v proseni moki. S plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo smo kvalitativno in kvantitativno določili lahkohlapne snovi v vzorcih boze v različnih časih po dodatku bakterij v zmes, z namenom ugotoviti, ali in kako se te lahkohlapne snovi med fermentacijo spreminjajo. Ugotovili smo, da se vsebnost nekaterih analiziranih spojin med fermentacijo značilno spreminja. Nazadnje smo v učnem načrtu za osnovne šole pregledali cilje, ki se nanašajo na našo temo in jih analizirali, da bi ugotovili, kako so te teme zastopane v potrjenih učbenikih. Na osnovi našega raziskovalnega dela smo razvili dva delovna lista za učence, kot alternativo dosedaj opisanim poskusom (t.j. kisanje mleka) s področja fermentacije.
Ključne besede: boza, rast bakterij, GC-MS, priprava poskusa
III
ABSTRACT
Boza is a dense beverage of sour taste. The taste may vary according to the amount of added sugar, the type of cereals and micro-organisms used, and the length of fermentation. It is a typical beverage found in Albania, Bulgaria, Romania, Turkey and other Balkan countries. In Turkey, warm boza is consumed primarily during the winter due to the effect of warming of the body and as a result it is expected to help against seasonal respiratory infections. In Romania, they drink chilled, refreshing boza, especially during the summer months. As it contains vitamins A, C, E and four types of vitamin B, it is a valuable nutrient for physically active people. It is especially suitable for vegetarians and vegans, since it is entirely plant- based, and is a good source of vitamins and a good substitute for milk drinks. In the present Master's degree thesis, a change in pH of the mixture of flour and bacteria was monitored in order to determine how quickly the pH of mixture decreases. We found that the rate of pH decrease of mixtures from various types of flour and also with the addition of different bacteria types differs. We also found that the pH of the mixtures 48 hours after the addition of bacteria differs according to the type of bacteria added. We also carried out titration of the boza mixture in order to determine the amount of acid produced during the fermentation process. We found that for a boza mixture prepared with starch, the addition of any type of bacteria does not require a lot of base in order to neutralize the acid produced during the fermentation process. We were also interested in the growth of bacteria in the sample, which was assessed with the Petrifilm® plate. We described the growth curve of bacteria obtained from sour cream in an millet flour. By means of gas chromatography and mass spectrometry, the volatile substances in the boza samples were determined qualitatively and quantitatively on several occasions, in order to evaluate if and how these volatile substances change during fermentation. We demonstrated that the content of some of the analyzed volatile substances varies significantly during fermentation. Finally, we reviewed and analyzed the objectives that pertain to our topic in the curriculum for primary schools, to assess how these topics are represented in certified textbooks. On the basis of our experimental work, we developed two worksheets for pupils, as an alternative to the previously described experiments (i.e.
acidification of milk) on the topic of fermentation.
Key words: boza, bacterial growth, GC-MS, experiment preparation
IV
KAZALO
POVZETEK ... II ABSTRACT ... III KAZALO ... IV
UVOD ... 1
1. TEORETIČNI DEL ... 2
1.1 Boza ... 2
1.2 Splošna priprava boze ... 2
1.3 Mikrobiota boze ... 5
1.4 Vitamini v bozi ... 5
1.4.1 Folat ... 6
1.4.2 Vitamin B12 ... 7
1.4.3 Drugi vitamini ... 8
1.5 Metode za določanje lahkohlapnih snovi v bozi ... 8
1.5.1 Plinska kromatografija ... 8
1.5.2 Masna spektrometrija ... 9
2 EMPIRIČNI DEL ... 10
2.1 Opredelitev raziskovalnega problema ... 10
2.2 Cilji ... 10
2.3 Raziskovalna vprašanja ... 10
2.4 Metode dela ... 11
2.4.1 Splošni postopek za pripravo boze ... 11
2.4.2 Merjenje pH zmesi za bozo pred in po dodanih bakterijah v različnih časovnih intervalih ... 13
2.4.3 Titracija zmesi za bozo v različnih časovnih intervalih ... 13
2.4.4 Ocenjevanje rasti bakterij na plošči Petrifilm® ... 15
2.4.5 Priprava vzorcev za plinsko kromatografijo ... 16
2.5 Rezultati s statistično analizo ... 20
2.5.1 Merjenje pH in titracija ... 20
2.5.2 Rast bakterij ... 26
2.5.3 Kromatografija ... 27
2.6 Pregled učbenikov in gradivo za učence ... 36
2.7 Priprava gradiv za šole ... 37
2.7.1 Merjenje pH osnove za bozo ... 37
2.7.2 Titracija zmesi moke in bakterij v določenem času ... 38
2.7.3 Ocenjevanje rasti bakterij ... 39
3. DISKUSIJA ... 42
4. SKLEP ... 45
5. SEZNAM LITERATURE ... 46
V Kazalo grafov
Graf 1: Sprememba pH posameznih zmesi v času (z označenimi standardnimi napakami).
Vsaka točka je sestavljena iz treh meritev... Napaka! Zaznamek ni definiran.
Graf 2: Sprememba pH v zmesi za bozo v času. Posamezne točke so pridobljene tako, da smo pH istovrstnih osnov za bozo združili (v eni točki so tako povprečni podatki o pH, pridobljeni pri enaki osnovi, a z različnimi bakterijskimi kulturami; označene so tudi standardne napake);
v vsaki točki je tako vključenih devet meritev. ... Napaka! Zaznamek ni definiran.
Graf 3: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline treba dodati na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz kisle smetane. ... 24 Graf 4: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline treba dodati na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz boze... 25 Graf 5: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline treba dodati na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz Ljubljanskih mlekarn. ... 25 Graf 6: Logaritemsko število bakterij v času v vzorcu iz prosene moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane. ... 26 Graf 7: Število cfu po 48 urah inkubiranja v različnih vzorcih boze. ... 27 Graf 8: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
... 28 Graf 9: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času. ... 28 Graf 10: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času. ... 29 Graf 11: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času. ... 30 Graf 12: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času. ... 30 Graf 13: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času. ... 31 Graf 14: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času. ... 31 Graf 15: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času. ... 32 Graf 16: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času. ... 32 Graf 17: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času. ... 33 Graf 18: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času. ... 33 Graf 19: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času. ... 34 Graf 20: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času. ... 34
VI
Graf 21: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času. ... 35 Graf 22: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času. .... 35
Kazalo tabel
Tabela 1 Recepti za pripravo boze, uporabljeni v pričujoči magistrski nalogi ... 11 Tabela 2: P-vrednosti Studentovega t-testa za razlike v pH med različnimi vzorci po 36 urah fermentacije zmesi za bozo. ... 22 Tabela 3: P-vrednosti Studentovega t-testa za razlike v pH med različnimi vzorci z istovrstno osnovo po 36 urah fermentacije ... 24 Tabela 4: Seznam s strani Zavoda RS za šolstvo potrjenih učbenikov za 9. razred osnovne šole ... 36
Kazalo slik
Slika 1: Postopek priprave boze. Povzeto po Tangueler (2014). ... 4 Slika 2: Označevanje lončkov. ... 12 Slika 3: Ohlajene zmesi (škrob (spodaj), koruzna (zgoraj desno) in prosena (zgoraj levo) moka), pripravljene za nacepitev z bakterijskimi kulturami. ... 13 Slika 4: Titracija zmesi za bozo ob dodatku fenolftaleina na magnetnem mešalu... 14 Slika 5: plošča Petrifilm® (plošča z rumenim karo vzorcem) s plastičnim pripomočkom, ki je položen na ploščo Petrifilm®. ... 16 Slika 6: Četrtina začetnega 100 mL vzorca boze z dodanimi bakterijami po dodatku topila dietilni eter in po centrifugiranju v 50 mL epruveti. ... 17 Slika 7: Sušenje centrifugiranega vzorca. ... 17 Slika 8: Koncentriranje vzorca na 1 mL v bučki v vodni kopeli. ... 18 Slika 9: Koncentrirani vzorci v epicah za analizo s plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo (GC-MS). ... 18
1
UVOD
Fermentacija je proces, pri katerem mikroorganizmi, kot so bakterije ali kvasovke, pretvarjajo ogljikove hidrate v alkohol ali organske kisline brez prisotnosti kisika. Poznamo dve vrsti fermentacije. Prva je alkoholna fermentacija (vrenje), pri kateri piruvat (od presnove glukoze) razpade na ogljikov dioksid in etanol s pomočjo bakterij ali kvasovk. Druga vrsta fermentacije je mlečnokislinska fermentacija (vrenje), kjer se laktoza pretvori v mlečno kislino ob delovanju bakterij (What Is Fermentation? Benefits of Fermentation + How to Ferment Foods, b.d.). Fermentacija je ena najstarejših in najbolj ekonomičnih metod uporabljenih za podaljševanje roka uporabnosti. Fermentacija povečuje dostopnost mineralov, razgradnjo proteinov in izboljša organoleptične lastnosti (Todorov idr., 2008). Fermentirana hrana je zaradi svojih prednosti pomembna za številne ljudi po svetu. Mlečnokislinske bakterije se uporabljajo v različnih fermentiranih produktih in njihov pozitiven učinek na organizem je poznan že dolgo (Uršnik, 2015). Eden izmed mnogih fermentiranih produktov je tudi boza.
Boza je fermentirana pijača izdelana na osnovi žit. Ne vsebuje mleka, pa v njej vseeno poteka mlečnokislinska fermentacija (mlečnokislinsko vrenje). Zaradi številnih koristnih lastnosti, ki jih ima boza, je zanimiva ne samo za uporabnike, temveč tudi za znanstvenike. Poleg visoke vsebnosti vitaminov vsebuje še maščobe, beljakovine, ogljikove hidrate, vlaknine, aminokisline in mlečno kislino. Nedavno je bilo dokazano tudi, da je boza vir inhibitornih peptidov ACE (ACE-inhibitorni peptidi uravnavajo krvni tlak s tem, da inhibirajo angiotenzijsko kontravertazo ter tako znižujejo krvni tlak) (Osimani, Grofalo, Aquilanti, Milanović in Clementi 2014). Ta zdrava in hranljiva pijača ima tako velik potencial v prehrambni industriji (Osimani idr., 2014). Zaradi navedenega je boza zanimiva tudi za šolski pouk. S pomočjo boze bi učenci lahko spoznali pojem fermentacije, ter se srečali z mikrobiologijo.
V magistrski nalogi smo raziskali, kako se spreminja pH pripravljene pijače glede na izbrano osnovo za bozo in dodane bakterije z namenom ugotoviti, katera kombinacija osnove in bakterij je najbolj optimalna. Vzorce pijače smo tudi titrirali za ugotavljanje količine nastale kisline med procesom fermentacije. Ker nas je zanimala rastna krivulja bakterij v zmesi moke in bakterij, smo spremljali proces rasti bakterij v vzorcih. Kvalitativno in kvantitativno smo analizirali tudi lahkohlapne snovi s pomočjo plinske kromatografije in masne spektrometrije z namenom ugotoviti, kako se količina določene spojine med fermentacijo spreminja.
Pregledali smo učni načrt, v katerem smo se osredotočili na biotehnologijo in pregledali potrjene učbenike, da bi ovrednotili, v kakšni meri je ta tema v učbenikih zastopana. Na podlagi rezultatov smo oblikovali dejavnost za učence v osnovnih in srednjih šolah na temo biotehnologija in mikrobiologija, ki predstavlja alternativo trenutno opisanim poskusom na temo biotehnologija (npr. kisanje mleka).
2
1. TEORETIČNI DEL
1.1 Boza
Začetki boze segajo osem do devet tisoč let nazaj. Bozo so poznala antična ljudstva, ki so živela v Mezopotamiji in Anatoliji. Od tod so jo Otomani razširili na vsa osvojena območja.
Antični grški pisec Ksenofont je pisal o bozi in o tem, kako je bila shranjena v glinenih posodah, ki so bile zakopane pod zemljo (History of Boza, 2015). Boza je razcvet doživela pod Turki in je postala eden od glavnih trgovskih dobrin v mestih zgodnjih turških dob (LeBlanc in Todorov, 2011). Odvisno od verske usmeritve vsakokratnega vladarja je bila boza bolj ali manj priljubljena. V času vladanja Selimana ll so vrednosti alkohola v bozi dosegale od štiri do devet odstotkov, medtem ko je za časa vladanja sultana Mehmeda lV bila kakršnakoli vsebnost alkohola v bozi prepovedana (Gamm, 2015).
Boza je gosta pijača, kislo sladkega okusa, z malo alkohola. Okus vahko variira zaradi različnih žit, mikroorganizmov, količine dodanega sladkorja in dolžine fermentacije. Značilna je za Albanijo, Bolgarijo, Romunijo, Turčijo in druge balkanske države. V Turčiji jo toplo pijejo predvsem v zimskem času, ker ogreje telo in ker naj bi pomagala v boju proti virusnim obolenjem (How to Make Boza Drink, 2018). V Romuniji pijejo osvežilno, hladno bozo predvsem v poletnih mesecih. Pitje te pijače pa je vedno manj priljubljeno, zato majhne trgovine z bozo izginjajo tako v Turčiji, kot tudi v Romuniji. Prodaja boze izginja tudi v drugih državah, kjer je bila v preteklosti priljubljena (How to Make Boza Drink, 2018).
Bolgarija in druge balkanske države prodajajo industrijsko pripravljeno bozo, vendar pa mnogi ustekleničeni izdelki zaradi dodajanja konzervansov za podaljševanje roka uporabnosti niso enakega okusa kot sveže pripravljeni (How to Make Boza Drink, 2018).
Boza vsebuje probiotične bakterije, ki pomagajo lajšati prebavo, folno kislino, ki pomaga pri laktaciji doječih mater, vsebuje štiri vrste vitaminov (A, C, E in štiri vrste vitamina B) in zato predstavlja dober vir vitaminov. Primerna je tudi za vegetarijance in vegane, saj je v celoti iz sestavin naravnega rastlinskega izvora (Uršnik, 2015).
1.2 Splošna priprava boze
Boza se pripravlja predvsem za domačo uporabo in tudi za prodajo. Čeprav je načinov proizvodnje več, so glavna sestavina vedno žita (Akpınar-Bayizit, Yılmaz-Ersan in Özcan, 2010). Bozo lahko pripravimo iz različnih vrst žit, kot so proso, koruza, pšenica ali z različnimi kombinacijami med njimi. Bozo najboljše kakovosti in okusa dobimo s proseno osnovo. Najbolj pomembni dejavniki, ki vplivajo na fizikalno-kemijske lastnosti boze, so vrsta in količina žita in žitnih proizvodov kot osnove, čas fermentacije in temperatura.
Podaljšan čas fermentacije poveča količino celokupne kisline in zniža pH (Altay, Karbancioglu-Guler, Daskaya-Dikmen in Heperkan, 2013). Akpinar-Bayizit (2010) navaja, da surovine, kot so riž, proso in pšenica še posebej vplivajo na kemijsko sestavo boze.
3
Žito mora biti očiščeno in imeti velikost zdroba med 300 in 800 µm. Po dodatku pitne vode je naslednji korak kuhanje žita od dveh do osmih ur (slika 1). Med vrenjem zmes absorbira vodo, zato je dodajanje vode nujno, vse dokler ne dobimo homogene zmesi. Tako pripravljeno zmes prenesemo v primerne posode za ohlajanje. Za odstranitev otrobov in drugih tujih snovi ohlajeno zmes precedimo. Po dodajanju sladkorja (15-20 % saharoze od celotnega volumna) v tako pripravljeno zmes nacepimo izbrano bakterijsko kulturo.
Bakterijsko kulturo lahko predstavljajo bakterije iz predhodno fermentirane boze (2-3 % fermentirane boze na celoten volumen željene boze), kislega kruha ali probiotičnega jogurta.
Količina začetne bakterijske kulture je odvisna od temperature (Arıcı in Dağlıoğlu, 2002).
Postopek fermentacije se v proizvodnji boze ne zaključi popolnoma. Po 24 urah fermentacije delno fermentirano bozo hranijo ohlajeno v hladilniku v plastičnih posodah. Tako pripravljeno bozo je treba zaužiti v 3-5 dneh (Arıcı in Dağlıoğlu, 2002).
4 Izbor žitne osnove
Izbor žitne osnove
Priprava žitne osnove: čiščenje in mletje Priprava žitne osnove: čiščenje in mletje
Dodatek vode Dodatek vode Kuhanje (2h-8h)
Kuhanje (2h-8h) Dodatek vroče vode Dodatek vroče vode Homogena zmes
Homogena zmes
Hlajenje v primernih posodah Hlajenje v primernih posodah
Dodatek sladkorja (15-20 % saharoze)
Dodatek sladkorja (15-20 % saharoze) Dodajanje začetne bakterijske kulture Dodajanje začetne bakterijske kulture Fermentacija
Fermentacija Ohlajanje Ohlajanje
Polnjenje in shranjevanje Polnjenje in shranjevanje
Slika 1: Postopek priprave boze. Povzeto po Tangueler (2014).
5
1.3 Mikrobiota boze
Boza velja za zdravo in hranljivo pijačo zaradi vsebnosti maščob, beljakovin, ogljikovih hidratov, vlaknin, vitaminov, aminokislin in mlečne kisline (Todorov in drugi, 2008). Slednja spojina je splošno priznana kot koristna za človeško mikrofloro in zdravo prebavo (Arıcı in Dağlıoğlu, 2002). Poleg tega se pri fermentaciji boze pH pijače zmanjša, s čimer se vzpostavijo optimalne razmere za encimsko razgradnjo fitata (t.j. sol ali ester fitične kisline, ki je prisotna v rastlinah, še posebej v žitnih zrnih, in ima sposobnost tvoriti netopne komplekse s kalcijem, cinkom, železom in drugimi mikrohranili in pripomore k absorpciji le- teh v telo), nizek pH boze pa bozi daje tudi tipičen okus ter preprečuje rast patogenim in kvarnim bakterijam (Osimani idr., 2014). Preprečevanje rasti patogenim in kvarnim bakterijam je okrepljeno tudi s protimikrobnimi snovi v bozi, kot so bakteriocini, ki jih sintetizirajo mlečnokislinske bakterije (LeBlanc in Todorov, 2011). Kancabaş in Karakaya (2012) sta dokazala, da je lahko boza tudi vir inhibitornih peptidov ACE (t.j. angiotenziska konvertaza; to je eksopeptidaza, peptidil-dipeptid hidrolaza, ki odceplja dipeptide s C-konca različnih proteinskih substratov). Raziskave kažejo, da je mikrobiota, ki je odgovorna za fermentacijo boze, heterogena, vključuje pa tako homo- kot heterofermentativne mlečnokislinske bakterije in kvasovke (Osimani idr., 2014).
V zadnjem desetletju je bila uporabljena vrsta molekularnih pristopov, ki temeljijo na analizi sekvenc DNA, za identifikacijo vrst in seva mikroorganizmov v hrani. Med njimi je tehnika verižne reakcije s polimerzo - denaturacijsko gradientna gelska elektrofereza (polyerase chain reaction - denaturing gradient gel electrophoresis (PCR – DGGE)), ki je pokazala velik potencial za predstavitev mikrobne raznolikosti fermentiranih živil, vključno s proizvodi na osnovi žit (Osimani idr., 2014).
Do razlike v mikrobioti po fermentaciji lahko pride zaradi uporabe različnih sestavin in različne količine uporabljenih sestavin pred fermentacijo (npr. različne količine moke, sladkorja), samega procesa fermentacije in razmer shranjevanja (Altay, Karbancioglu-Guler, Daskaya-Dikmen in Heperkan, 2013).
1.4 Vitamini v bozi
Čeprav so v raznovrstni hrani vsi vitamini, je pomanjkanje vitaminov še vedno velik problem ljudi v različnih državah po svetu. Razlog za pomanjkanje vitaminov pri posameznikih ni samo nezadosten vnos hrane, temveč tudi neuravnotežena prehrana. Čeprav je veliko mlečnokislinskih bakterij nezmožnih sinteze nekaterih vitaminov, je znano, da imajo določeni sevi zmožnost sinteze vodotopnih vitaminov, med katere spadajo tudi vitamini iz B skupine (folat, riboflavin, vitamin B12) (LeBlanc idr., 2011).
Vitamini so mikrohranila, ki so nujna (esencialna) za pravilno delovanje vseh živih organizmov. So prekurzorji intracelularnih koencimov, nujnih za uravnavanje vitalnih biokemijskih reakcij v celici. Človeško telo je nezmožno sinteze večine vitaminov, zato jih je treba pridobiti eksogeno (t.j. iz zunanjega okolja). Med vitamine skupine B (B-kompleks) uvrščamo tiamin (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), piridoksin (B6), pantotensko kislino (B5),
6
biotin (B7 ali H), folat (B11-B9 ali M) in kobalamin (B12). Vsak vitamin skupine B se kemijsko razlikuje od drugega, igrajo pa veliko vlogo v metabolnih procesih za sproščanje energije in pri nastajanju rdečih krvnih celic. Vitamine skupine B lahko najdemo v več različnih vrstah hrane, vendar jih med procesiranjem hrane lahko uničimo, zaradi česar lahko pride do nezadostnega vnosa teh vitaminov v telo (LeBlanc idr., 2011). V izogib pomanjkanju vitaminov so nekatere države sprejele zakone za bogatitev hrane z dodajanjem določenih vitaminov in mineralov. V Argentini so, denimo, sprejeli zakon za obvezno bogatitev pšenične moke z železom, folno kislino, tiaminom, riboflavinom in niacinom z namenom zmanjšanja pojavnosti anemij in okvar nevralnih cevi (LeBlanc idr., 2011). Čeprav je bogatitev hrane z vitamini pokazala pozitivne učinke, številne države dodajanja vitaminov v hrano niso predpisale zaradi možnih neželenih učinkov. Težko je namreč zadostiti zahtevi, da je količina dodanih vitaminov v obogateni hrani takšna, da ljudem z nizkim vnosom teh vitaminov pomaga doseči priporočljiv dnevni vnos, obenem pa količina dodanih vitaminov ne sme biti tako visoka, da bi ljudje, ki ne trpijo pomanjkanja vitaminov, zaradi dodatka le-teh v hrani, presegli zgornjo mejo vnosa. Težave z z vitamini obogateno hrano so tudi drugačne;
prevelik vnos folne kisline v telo lahko na primer zakrije znake pomanjkanja vitamina B12. Ocenili so, da 10-30 % ljudi starejših od 50 let trpi zaradi zmanjšanja sposobnosti naravne absorpcije vitamina B12 (Asrar in O`Connor, 2005). Rešitev tega problema je vnos naravnega folata (5-metiltetrahidrofolata), ki je prisoten v hrani, proizvajajo pa ga tudi nekateri mikroorganizmi, njegova prisotnost pa ne zakriva znakov pomanjkanja vitamina B12. Vnos te, naravne oblike folata bi bila glede na navedbe nekaterih avtorjev bolj učinkovita in varna alternativa dodajanju folne kisline v prehrano (Lamers, Prinz-Langenohl, Bramswig in Pietrzik, 2006). Uporaba mikroorganizmov, kot proizvajalcev vitaminov v prehrani, je naravnejša in ekonomsko dostopnejša alternativa bogatenju hrane s kemijsko sintetiziranimi (proto)vitamini in ima manjšo verjetnost povzročanja neželenih učinkov, kot bogatenje hrane (LeBlanc idr., 2011).
1.4.1 Folat
Folat sodeluje pri pomembnih funkcijah celičnega metabolizma, kot so replikacija, popravljanje, metilacija DNA in sinteza nukleotidov, vitaminov in nekaterih aminokislin, zato brez njega človeško življenje ne bi bilo mogoče. Motenj zaradi pomanjkanja folata je veliko.
Pomanjkanje folata so povezali z Alzheimerjevo boleznijo, koronarnimi srčnimi boleznimi, osteoporozo, povečanim tveganjem za nastanek rakavih bolezni (debelega črevesa, danke in dojk), izgubo sluha in slabimi kognitivnimi sposobnostmi (LeBlanc, Savoy de Giori, Smid, Hugenholtz in Sesma, 2007). Če upoštevamo, da mleko vsebuje med 20 in 50 µg/L folata, bi morali v povprečju popiti 6-12 L mleka dnevno, da bi zadostili dnevno priporočenemu vnosu folata, ki znaša 180 µg za otroke in 300µg za odrasle (Referečne vrednosti za energijski vnos ter vnos hranil, 2016). Veliko industrijsko pomembnih mlečnokislinskih bakterij je sposobnih sintetizirati folat, taki sta na primer Lactococcus lactis in Streptococcus thermophilus (Papastoyiannidis, Plychroniadou, Michaelidou in Alichanidis, 2006). To pojasni, zakaj vsebujejo nekateri fermentirani produkti, vključno z jogurtom, višjo količino folata v primerjavi z nefermentiranimi produkti. Raziskave so, denimo, pokazale, da lahko vsebnost folata v jogurtih preseže 200 µg/L (Wouters, Ayad, Hugenholtz in Smit, 2002). Sposobnost
7
mikrobnih kultur za proizvodnjo ali porabo folata občutno variira glede na lastnosti seva.
Večina znanstvenikov trdi, da je bakterija Streptococcus thermophilus proizvajalec folata, medtem ko je bakterija Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgarus njegov porabnik, zato je za razvoj fermentirane hrane z visoko vsebnostjo folata pomembno izbrati primerno kombinacijo sevov (LeBlanc in drugi, 2011). Folata pa ne proizvajata samo bakteriji Lactoccocus lactis in Streptococcus thermophilus, temveč tudi nekatere druge mlečnokislinske bakterije, kot so Lactobacillus acidophilus in Lactobacillus plantarum (LeBlac, Taranto, Molina in Sesma, 2010), Leuconostoc lactis, Bifidobacterium longum in Lactobacillus reuteri, ki je tudi dobro raziskan proizvajalec vitamina B12 in lahko potencialno poveča raven folata v mleku (Santos, Wegkamp, de Vos, Smid in Hugenholtz, 2008). Ti mikroorganizmi imajo zmožnost povečanja ravni folata ne samo v mleku, ampak tudi v drugi hrani. Tako fermentacijo rženega testa za proizvodnjo kruha pogosto spremlja povečana koncentracija folata. Prav tako so odkrili, da lahko z izbrano začetno kulturo bakterij bistveno povečajo vsebnost folata (tudi za dvakratno vrednost) med fermentacijo zelenjave. Drug primer uporabe mlečnokislinskih bakterij za izboljšanje vsebnosti folata v fermentiranih produktih je fermentacija koruzne moke, kjer je bil porast folata po 4 dneh fermentacije na 30 °C kar trikraten (LeBlanc idr., 2011).
1.4.2 Vitamin B
12Omenjeni vitamin sodi med vitamine, ki so topni v vodi. Je najbolj kompleksen in po molekulski masi največji vitamin. Vitamin sestavlja tetrapirolni obroč in centralni kobaltov atom (Kozyraki in Cases, 2013). Glede na molekulo, ki je vezana na centralni atom, poznamo štiri vrste oblika vitamina B12. V človeškem telesu sta aktivni obliki adenozilkobalamin in metilkobalamin. V prehranskih dopolnilih pa se uporablja neaktivna oblika cianokobalamin, saj cianid stabilizira molekulo kobalamina, ki bi nasprotnem primeru v stiku s svetlobo razpadla. Druga neaktivna oblika je hidroksikobalamin (Černe, 2017). Živali, rastline in glive niso sposobne proizvajanja kobalamina; to je edini vitamin, ki ga proizvajajo izključno mikroorganizmi, zlasti aerobi (Smith, Croft in Webb, 2007). Biokemijske in genetske raziskave so pokazale, da imajo le nekatere bakterije in arheje gen za proizvodnjo tega vitamina. Odrasle živali prežvekovalcev lahko pridobijo vitamin od specializiranih bakterij, prisotnih v vampu. Ljudje pa takšnih bakterij v tankem črevesu ne gostimo, zato je nujna absorpcija koencima B12 (koencim B12 je splošno ime za molekulo, ki nastane iz vitamina B12) iz naravnih virov ali pa iz farmacevtskih pripravkov, saj rastlinska hrana vitamina B12 ne vsebuje. Pomanjkanje vitamina B12 lahko povzroči različne patološke pojave, ki vplivajo na hematopoetske in nevrološke procese ter na srčno-žilni sistem. Ena izmed najbolj skrajnih oblik pomanjkanja vitamina B12 je slabokrvnost, ki običajno ni povezana s prehrano, pač pa s pomanjkanjem proizvodnje želodčnega glikoproteina, imenovanega intrinzični faktor, ki pospešuje absorpcijo vitamina v tankem črevesu (Beck, 2001).
8
1.4.3 Drugi vitamini
Raziskave kažejo, da tudi nekatere druge vodotopne vitamine izdelujejo mlečnokislinske bakterije. V eni izmed teh raziskav so preučevali mlečnokislinske bakterije in njihovo sposobnost za proizvodnjo kinonskih spojin, kot je vitamin K, ki se v naravi pojavlja v dveh oblikah, in sicer kot vitamin K1 (filokinon) v zelenih rastlinah in K2 (menakinon) v živalih in nekaterih bakterijah (Morishita, Tamura, Makino in Kudo, 1999). Raziskave so pokazale, da so pri proizvodnji vitamina K najuspešnejši sevi bakterij Lactococcus lactis ssp. cremoris (trije sevi), Lactococcus lactis ssp. lactis (dva seva) in Leucanostoc lactis, ki so proizvedli več kot 230 nmol kinona na gram posušenih celic (LeBlanc in drugi, 2011). Ti sevi, ki lahko rastejo v nemastnem ali v sojinem mleku, proizvedejo zadostno količino vitamina K za dodatek prehrani (proizvedejo 29-123 µg menokinona na liter fermentiranega medija) (Morishita idr., 1999). Vitamin K je esencialen kofaktor za tvorbo ostankov γ- karboksiglutaminske kisline v proteinih, ki vplivajo na koagulacijo krvi in kalcifikacijo tkiva (LeBlanc in drugi, 2011). Zaradi pomanjkanja vitamina K so zabeležili več kliničnih bolezni, kot so intrakranialna krvavitev pri novorojenčkih in možnost zlomov kosti, ki so posledica osteoporoze (LeBlanc in drugi, 2011).
1.5 Metode za določanje lahkohlapnih snovi v bozi
Plinska kromatografija, sklopljena z masno spektrometrijo (gas cromatography - mass spectrometry (GC-MS)) je metoda za identifikacijo lahkohlapnih snovi, ki je sestavljena iz dveh analiznih postopkov, ki si sledita v zaporedju. Prvi analizni postopek je plinska kromatografija (GC), ki ločuje hlapne komponente z veliko natančnostjo, vendar jih ne more identificirati. Druga tehnika je masna spektrometrija (MS), ki zagotavlja podrobne strukturne podatke o večini spojin, tako da jih je mogoče natančno identificirati, vendar jih ni mogoče zlahka ločiti. GC-MS sta kompatibilni na več področjih, uporabimo ju lahko tudi za analizo lahkohlapnih snovi v bozi. Pri obeh tehnikah je vzorec v parni fazi in obe tehniki obravnavata približno enako količino vzorca, ki je navadno manj kot 1 µl. Problem GC-MS metode je razlika v tlakih parnega vzorca, ki ju potrebujeta tehniki za svoje delovanje, zato so rešitev našli v uporabi vakuumske črpalke. Namen GC je torej ločitev več spojin v vzorcu z namenom, da dosežejo MS detektor ena za drugo (Gas Chromatography-Mass Spectroscopy, b.d.).
1.5.1 Plinska kromatografija
Plinska kromatografija sodi med fizikalne separacijske metode, pri kateri analiziramo termično stabilen, uparjen vzorec v plinski mobilni fazi, ki je najpogosteje inerten plin (helij, dušik, vodik) (Potočnik, 2016). Molekule vzorca tako ne tvorijo interakcij z mobilno fazo, temveč samo potujejo z njo vse do kolone, kjer je stacionarna faza. Komponente vzorca tvorijo interakcije s stacionarno fazo, v kateri se zato različno dolgo zadržujejo in na podlagi tega tudi ločijo. Na koncu naprave je detektor, ki zazna vzorec. Prednosti plinske
9
kromatografije so hitra ločitev komponent (min), velika občutljivost (ppm, ppb), sama ločitev komponent vzorca je nedestruktivna, kar omogoča nadaljnjo analizo vzorca, za analizo potrebujemo majhno količino vzorca (mikrolitri), je zanesljiva in dokaj preprosta metoda za uporabo ter je cenovno dostopna. Slabosti metode se kažejo v omejenosti na izključno hlapne spojine, metoda je neprimerna za termolabilne vzorce ter manj primerna za ločevanje večjih količin vzorcev (Štalcar, 2015)
1.5.2 Masna spektrometrija
Masna spektrometrija sodi med analizne tehnike, ki nam omogočajo, da z minimalno količino vzorca ugotovimo relativno molekulsko maso, molekulsko formulo ter strukturo molekul, prisotnih v vzorcu (Potočnik, 2016). V masnem spektrometru molekule ioniziramo v vakuumu z elektronskim žarkom, kar vodi do nastanka pozitivnih ali negativnih ionov. Masa iona je ekvivalenta masi originalne molekule, saj lahko maso elektrona zanemarimo. V masnem analizatorju se ioni ločijo v magnetnem oz. elektrostatskem polju glede na njihovo maso in naboj (Štalcar, 2015). Spektrometer zazna njihovo število oziroma pogostost njihovega pojavljanja. Z ustrezno računalniško opremo dobimo masni spekter molekul.
Prednosti masne spektrometrije so velika občutljivost (ppm) ter selektivnost, analiza je tako kvalitativna kot kvantitativna, potrebujemo minimalne količine snovi (mikrogrami), metoda omogoča ugotavljanje sestave in molekulske mase molekul vzorca. Slabosti metode se kažejo v nezmožnosti ločevanja izomerov ter v destruktivnosti metode, saj vzorca po analizi ne moremo več uporabiti (Potočnik, 2016).
10
2 EMPIRIČNI DEL
2.1 Opredelitev raziskovalnega problema
Raziskovalnih člankov na temo pijače boza ni veliko, obstoječi članki pa govorijo večinoma o identifikaciji mlečnokislinskih bakterij in kvasovk v bozi. Prav zaradi pomanjkljivih informacij bi bilo dobro to pijačo raziskati tudi z vidika mikrobiologije in biotehnologije.
Hitrost rasti mlečnokislinskih bakterij v različnih žitnih osnovah namreč ni znana, prav tako ni znana količina celokupne mlečne kisline, ki nastane v procesu fermentacije. Glede na vsebnost kisline in puferske kapacitete žitne osnove se med fermentacijo spreminja pH pripravljene boze. Tudi dinamika teh sprememb ni znana, zato smo navedeno preučili v naši magistrski nalogi. Glede na rezultate prvega dela naše raziskave, v kateri smo preučili navedeno, smo lahko v drugem koraku pripravili gradiva za pouk v osnovni šoli. Pripravljena gradiva na temo biotehnologije in mikrobiologije bodo učiteljem zagotovila alternativo poskusom, opisanim v obstoječih potrjenih učbenikih, t.j. kisanju mleka in pripravi kefirja.
Glede na raziskavo diplomskega dela (Uršnik, 2015) je priprava boze učencem bolj zanimiva, kot kisanje mleka).
2.2 Cilji
• pregled mikrobioloških in biotehnoloških tem v učnem načrtu in učbenikih za osnovne šole, potrjenih s strani Zavoda RS za šolstvo;
• optimizacija postopka priprave boze;
• priprava postopka za merjenje rasti bakterij na Petrifilmu®;
• priprava vzorcev boze in izvedba plinske kromatografije;
• priprava učnih gradiv o fermentaciji boze za osnovno šolo.
2.3 Raziskovalna vprašanja
• Kako in s kakšnimi primeri je predstavljena fermentacija v učbenikih za osnovno šolo, potrjenih s strani Zavoda RS za šolstvo?
• Kakšno rastno krivuljo imajo mlečnokislinske bakterije v bozi pri sobni temperaturi?
Ali se vrednost pH boze niža z enako dinamiko?
• Ali se vsebnost dišečih lahkohlapnih snovi v bozi med fermentacijo spreminja?
• Kako bi na za učence čim bolj zanimiv način v šoli predstavili fermentacijo boze?
11
2.4 Metode dela
2.4.1 Splošni postopek za pripravo boze
Pri našem delu smo uporabili zmesi iz različnih žitnih osnov. Za osnovo smo vzeli koruzno moko, proseno moko ali koruzni škrob. Vsako izmed treh različnih osnov za bozo smo pripravili samo iz enega tipa moke.
Recepti za posamezne zmesi so podani v razpredelnici 1.
Zmes za bozo 1 Zmes za bozo 2 Zmes za bozo 3 1344 mL vode
60 g koruzne moke 99 g sladkorja
1323 mL vode 78 g prosene moke 99 g sladkorja
1359 mL vode
45 g koruznega škroba 99 g sladkorja
1503 g 1500 g 1503 g
Tabela 1: Recepti za pripravo boze, uporabljeni v pričujoči magistrski nalogi.
V vsaki zmesi za bozo je bilo 7 % sladkorja glede na celotno maso zmesi (cca. 1500g). Pri pripravi zmesi smo pazili, da je bila viskoznost tako pripravljenih ohlajenih zmesi primerljiva.
Določanje viskoznosti smo opisali že v diplomskem delu (Uršnik, 2015).
V posodi smo po receptu iz razpredelnice 1 pripravili moko (60g koruzne moke) in sladkor (99 g). V večjo posodo za kuhanje smo vlili ustrezen volumen vode (v našem primeru 1344 mL). Nekaj vode smo odvzeli in dali v posodo z moko in sladkorjem. Premešali smo, da smo preprečili nastajanje grudic in da smo dobili suspenzijo. Posodo z vodo smo segreli do vretja.
Ko je voda zavrela, smo dodali suspenzijo z moko, sladkorjem in vodo). Temperaturo zmesi smo nastavili na tik pod vreliščem in kuhali ob neprestanem mešanju 10 min. Nato smo zmes odstavili, jo razdelili v 3 čaše na približno enake dele z volumnom približno 500 mL in pokrili z alu folijo, da smo preprečili kontaminacijo z bakterijami iz zraka, ter označili čaše. Čaše smo postavili na ledeno kopel, da se je zmes hitreje ohladila. Pomerili smo pH ohlajene zmesi s pH-metrom (Metrel Ma 5736). Meritve smo vedno poskušali narediti na sredini čaše, da smo zmanjšali napake pri merjenju.
V vsako čašo smo dodali eno izmed treh različnih kultur bakterij. V prvo čašo zmesi za bozo smo dodali 3 mL kisle smetane Ljubljanskih mlekarn; v drugo čašo smo dodali 0,33 mL kulture mezofilnih aromatskih bakterij (mešanica Lactococcus lactis podvrsta ceremoris, Lactococcus lactis podvrsta lactis, Leuconostoc mesenteorides podvrsta crenoris in Leuconostoc pseudomesenteorides), ki smo jih dobili v Ljubljanskih mlekarnah in jih uporabljajo za izdelavo kisle smetane; v tretjo čašo smo dodali 3 mL kulture bakterij iz boze, ki je bila prinešena iz Turčije (iz Carigrada). Dobro smo premešali, da so se bakterije porazdelile po celotnem volumnu zmesi. Pomerili smo pH in vsako zmes enakomerno porazdelili v tri sterilne lončke (z volumnom približno 120 mL), jih pokrili z alu folijo ter lončke označili (slika 2). Bakterijsko kulturo smo najprej nacepili v čaše zato, da smo čim bolj
12
optimalno nacepili bakterije, da smo torej zmanjšali razlike v končni količini bakterij v posameznem lončku.
Slika 2: Označevanje lončkov.
Enak postopek smo ponovili še za drugi dve osnovi (slika 3).
13
Slika 3: Ohlajene zmesi (škrob (spodaj), koruzna (zgoraj desno) in prosena (zgoraj levo) moka), pripravljene za nacepitev z bakterijskimi kulturami.
Ker smo uporabili 3 različne žitne osnove za bozo (koruzno moko, proseno moko in koruzni škrob), vsako izmed njih pa smo razdelili na 3 dele in v vsak del nacepili različno bakterijsko kulturo, smo dobili 9 različnih kombinacij osnov za bozo in kultur bakterij.
2.4.2 Merjenje pH zmesi za bozo pred in po dodanih bakterijah v različnih časovnih intervalih
pH zmesi za bozo smo določali z namenom, da ugotovimo, kako hitro se pH spreminja v različnih osnovah za bozo ob dodatku različnih bakterij.
Določanje pH vrednosti zmesi je potekalo s pomočjo pH-metra (Metrel Ma 5736). Merjenje je vedno potekalo v enakih razmerah (v ohlajeni zmesi, ob stalni sobni temperaturi, vedno na sredini vzorca in čas merjenja je bil eno minuto). Pri merjenju smo pazili, da je bil pH-meter po vsaki uporabi pravilno in temeljito očiščen (najprej spran z destilirano vodo nato še z 70 % etanolom), da se kulture v vzorcih niso prenašale iz lončka v lonček. pH smo merili pred dodanimi bakterijami v vzorec, tik po dodanih bakterijah, 6 ur po dodanih bakterijah, 12, 24, 36 in 48 ur po dodanih bakterijah. Tako smo za vsak vzorec zbrali 7 meritev pH.
2.4.3 Titracija zmesi za bozo v različnih časovnih intervalih
Zmesi za bozo smo titrirali z namenom, da ugotovimo, koliko kisline je nastalo med fermentacijo v različnih osnovah za bozo ob dodatku različnih bakterij.
14
Titracijo zmesi smo izvedli tik po dodanih bakterijah, nato 24 in 48 ur po dodanih bakterijah.
Zmesi smo titrirali z bazo natrijevega hidroksida (NaOH) z namenom, da ugotovimo koliko kisline je nastalo med procesom fermentacije.
Vsakokrat smo pet mililitrov zmesi dali v čašo ter jo razredčili s 25 mL destilirane vode. V čašo smo dodali magnet in zmes postavili na magnetno mešalo. V zmes smo dodali še nekaj kapljic indikatorja fenolftaleina, da smo lažje videli prehod iz kislega v bazično (slika 4). Ob počasnem mešanju smo v čašo dali pH meter in titrirali s pomočjo avtomatske pipete.
Slika 4: Titracija zmesi za bozo ob dodatku fenolftaleina na magnetnem mešalu.
15
2.4.4 Ocenjevanje rasti bakterij na plošči Petrifilm
®Ocenjevanje rasti bakterij smo izvedli z namenom, da ugotovimo, kakšno rastno krivuljo imajo te bakterije v bozi. Najprej smo pripravili zadostno količino sterilne vode, ki smo jo potrebovali za redčenje zmesi z bakterijami. To smo pripravili tako, da smo pripravili 7- odstotno raztopino sladkorja in vodovodne vode; uporabili smo torej 1500 mL vode in 105 g sladkorja. Raztopino sladkorja smo segrevali do vrelišča, nato jo še 10 minut kuhali tik pod vreliščem, da voda ni preveč izhlapevala. Nato smo raztopino pokrili z aluminijasto folijo.
Inventar, ki smo ga potrebovali za redčenje zmesi z bakterijami, smo sterilizirali s 70- odstotnim etanolom in pokrili/zavili v aluminijasto folijo.
S pomočjo sterilne avtomatske pipete smo odvzeli 1 mL zmesi za bozo z dodanimi bakterijami in ga dali v sterilno čašo. Nato smo vzorec v čaši redčili toliko časa, da smo dobili želeno redčitev. Če smo želeli vzorec razredčiti na 1:10-6, smo ob določenem času vzeli 1 mL zmesi za bozo z dodanimi bakterijami in dodali 100 mL sterilne vode (tako smo dobili razredčitev 1:10-2), nato smo 1 mL tako pripravljenega vzorca ponovno odvzeli in dali v drugo sterilno prazno čašo ter dodali 100 mL sterilne vode (tako smo dobili razredčitev 1:10-
4), 1 mL tako pripravljenega vzorca smo nato ponovno odvzeli in ga dali v prazno sterilno čašo ter dodali 100 mL sterilne vode (tako smo dobili razredčitev 1:10-6). Nato smo odvzeli 1 mL ustrezno razredčenega vzorca ter ga dali na ploščo Petrifilm® za inkubacijo in določanje števila bakterij. To smo naredili tako, da smo dvignili zgornjo folijo plošče in odpipetirali celotno količino vzorca na sredino plošče. Spustili smo folijo in pustili, da prosto pade. S plastičnim pripomočkom (slika 5) ki je priložen vsakemu kompletu Petrifilm®, smo (z grebenasto stranjo navzdol) previdno pritisnili na folijo, da se vzorec pravilno porazdeli po plošči. Nato smo aerobno inkubirali plošče tako, da smo vstavili ne več kot 20 plošč Petrifilm® s prozorno stranjo navzgor v aerobno posodo. Več takih nizov s po 20 ploščami Petrifilm® lahko inkubiramo v isti posodi, če je vsak niz od drugih ločen s trdo pregrado.
Posodo s ploščami Petrifilm® smo vstavili v inkubator in inkubirali 48 ur pri temperaturi 24
°C. Nato smo prešteli kolonije (cfu - colony forming unit).
Za zmes s proseno moko in z bakterijami iz kisle smetane Ljubljanskih mlekarn je spremljanje rasti bakterij na Petrifilm® ploščah potekalo v enakih intervalih, kot meritve pH (torej takoj po dodanih bakterijah, nato 12, 24 in 48 ur po dodanih bakterijah). 48 ur po dodanih bakterijah k zmesi za bozo smo preverili vsebnost bakterij iz vseh devetih vzorcev (vse 3 moke ob dodatku vseh 3 vrst bakterij). Ob koncu inkubacije (po 48 urah inkubiranja) smo prešteli kolonije (cfu) v kvadrantih (v rumenih karo razdelkih na plošči) ter število pomnožili s številom redčitev, ki smo jo izvedli za inkubacijo. Nato smo vrednosti pretvorili v logaritemska števila ter izrisali graf.
16
Slika 5: plošča Petrifilm® (plošča z rumenim karo vzorcem) s plastičnim pripomočkom, ki je položen na ploščo Petrifilm®.
2.4.5 Priprava vzorcev za plinsko kromatografijo
Analizo lahkohlapnih snovi smo izvedli z namenom, da ugotovimo, ali se vsebnost omenjenih snovi v vzorcih boze med fermentacijo spreminja. Analiza lahkohlapnih snovi s plinsko kromatografijo in z masnim spektrometrom je potekala na Fakulteti za farmacijo. Odmrznili smo 100 mL vzorca, ki smo ga odvzeli iz lončka takoj po dodanih bakterijah k zmesi za bozo, nato še vzorca, ki smo ju odvzeli iz lončka 24 in 48 ur po dodanih bakterijah. Vsak posamezen vzorec (100 mL) smo razdelili na štiri enake dele (po 25 mL) in jih dali v epruvete z volumnom 50 mL. Tako smo imeli štiri 50 mL epruvete s po 25 mL odmrznjenega vzorca (skupno 100 mL vzorca). V vsako epruveto smo dodali topilo (25 mL dietilnega etra) ter stresali 3 minute. Nato smo vstavili vse štiri epruvete v centrifugo ter 5 min centrifugirali na 3000 obratih in 25 °C (slika 6). Po centrifugiranju smo previdno odpipetirali zgornji (bistri) del v erlenmajerico, dodali 5 g brezvodnega natrijevega sulfata, da smo vzorec po centrifugiranju posušili, nato smo erlenmajerico zamašili in pustili 2 uri (slika 7). Nato smo pripravili aparaturo za izparevanje (koncentriranje) vzorca. V čašo smo nalili vodo, vanjo dali magnet in jo postavili na magnetno mešalo. Pripravili smo stojalo in bučko. Po dveh urah sušenja smo vzorec iz erlenmajerice previdno odpipetirali v bučko. Bučko smo postavili na vodno kopel (kopel 50 °C in 300 obratov) in tako vzorec koncentrirali (slika 8). Ko smo v bučko dodali ves vzorec iz erlenmajerice, smo sušilno sredstvo brezvodni natrijev sulfat sprali s topilom. Pri pipetiranju vzorca iz erlenmajerice v bučko smo pazili, da so trdni delci ostali v erlenmajerici. Vzorec v bučki smo izparili na 1 mL. S kapalko smo dali vzorec v vnaprej označeno posodico (epico) (slika 9). V primeru, da vzorec ni bil skoncentriran na 1 mL, smo ga prepihali še z argonom in tako pospešili izhlapevanje topila. Za čim bolj zanesljive podatke smo opravili tri vzporedne ponovitve te meritve.
17
Slika 6: Četrtina začetnega 100 mL vzorca boze z dodanimi bakterijami po dodatku topila dietilni eter in po centrifugiranju v 50 mL epruveti.
Slika 7: Sušenje centrifugiranega vzorca.
18
Slika 8: Koncentriranje vzorca na 1 mL v bučki v vodni kopeli.
Slika 9: Koncentrirani vzorci v epicah za analizo s plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo (GC- MS).
Kromatografske razmere za GC-MS, ki smo jih uporabili, so bile:
sistem: GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska)
računalniški program: GCMS Solution 4.2 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska)
podatkovni GC-MS knjižnici: NIST 14 in FFNSC 3 (obe Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska)
kolona: nepolarna kapilarna, Rxi-5Sil MS, 30 m × 0,25 mm, df = 0,25 µm, SF: 1,4- bis(dimetilsiloksi)fenilendimetilpolisiloksan (Restek, Bellefonte, Pensilvanija, ZDA)
nosilni plin: helij
pretok plina: 1 mL/min (linearna hitrost)
način injiciranja: »split« 1:20
19
temperaturni program: 50 °C (5 min), 50→200 °C (3 °C/min), 200→300 °C (20
°C/min), 300 °C (10 min)
temperatura injektorja: 250 °C
temperatura ionskega izvora: 200 °C
temperatura vmesnika: 300 °C
volumen injiciranja: 1 µL
napetost na detektorju: 1 kV
način ionizacije: EI
energija ionizacije: -70 eV
frekvenca zajemanja podatkov: 5 Hz
območje merjenja relativne molekulske mase (m/z): 35-500
začetek snemanja pri 3,0 min
vklop filamenta pri 2,8 min
celoten čas analize: 70,0 min
kolona: polarna kapilarna, Stabilwax, 30 m × 0,25 mm, df = 0,25 µm, SF:
polietilenglikol - Crossbond Carbowax (Restek, Bellefonte, Pensilvanija, ZDA)
nosilni plin: helij
pretok plina: 1 mL/min (linearna hitrost)
način injiciranja: »split« 1:20
temperaturni program: 50 °C (5 min), 50→250 °C (3 °C/min), 250 °C (5 min)
temperatura injektorja: 250 °C
temperatura ionskega izvora: 200 °C
temperatura vmesnika: 250 °C
volumen injiciranja: 1 µL
napetost na detektorju: 1 kV
način ionizacije: EI
energija ionizacije: -70 eV
frekvenca zajemanja podatkov: 5 Hz
območje merjenja relativne molekulske mase (m/z): 40-400
začetek snemanja pri 3,0 min
vklop filamenta pri 2,8 min
celoten čas analize: 76,6 min
Pri kromatografiji smo ugotavljali vsebnost 14 različnih spojin. To so: acetoin, dietilacetal, izopentilalkohol, 2,3-butandiol - izomer 1, 2,3-butandiol - izomer 2, heksanal, izovalerianska kislina, 1-heksanol, 1-okten-3-ol, heksanojska kislina, benzojska kislina, oktanojska kislina, pelargol (tetrahidrogeraniol) ter vanilin.
20
2.5 Rezultati s statistično analizo
2.5.1 Merjenje pH in titracija
Za bolj natančne rezultate smo celoten postopek izvedli trikrat. V nadaljevanju bodo predstavljena povprečja vseh treh ponovitev.
Merjenje pH
Legenda oznak v sledečih grafih:
- lj---bakterije pridobljene v Ljubljanskih mlekarnah - bo---bakterije boze
- ki---bakterije kisle smetane - p---prosena moka
- k---koruzna moka - š---škrob
21
Na osnovi podatkov o pH združenih istovrstnih osnov za bozo (glej graf 2) smo ocenili, da je v prvih 36 urah prišlo do najbolj intenzivnih sprememb v pH (t.j. do največjega naklona pH krivulje), zato smo statistično analizo podatkov naredili za čas 36 ur po dodanih bakterijah.
Graf 1: Sprememba pH posameznih zmesi v času (z označenimi standardnimi napakami). Vsaka točka je sestavljena iz treh meritev.
22
Vrednosti z zvezdico v tabeli pomenijo statistično pomembne razlike. Zaradi ponovljenih primerjav med vzorci je upoštevan Bonferronijev popravek (p < 0,001424).
p- vrednost i
k-ki š-ki p-ki k-bo š-bo p-bo k-lj p-lj š-lj
k-ki 4,0E-
11*
2,5E- 04*
5,1E- 08*
1,9E- 15*
1,7E- 11*
1,4E- 02
4,1E- 07*
1,3E- 12*
š-ki 4,0E-
11*
4,6E- 06*
1,7E- 08*
2,7E- 01
4,1E- 05*
2,0E- 07*
6,5E- 07*
7,8E-03
p-ki 2,5E-
04*
4,6E- 06*
7,4E- 01
1,0E- 07*
3,6E- 03
1,4E- 01
5,9E- 01
6,1E- 08*
k-bo 5,1E-
08*
1,7E- 08*
1,7E- 08*
7,8E- 13*
9,5E- 07*
7,9E- 02
1,4E- 01
1,5E- 10*
š-bo 1,9E-
15*
2,7E- 01
1,0E- 07*
7,8E- 13*
5,4E- 09*
3,6E- 09*
9,0E- 10*
1,3E-02
p-bo 1,7E-
11*
4,1E- 05*
3,6E- 03
9,5E- 07*
5,4E- 09*
4,0E- 05*
9,2E- 04
6,1E- 08*
k-lj 1,4E-
02
2,0E- 07*
1,4E- 01
9,8E- 02
3,6E- 09*
4,0E- 05*
2,2E- 02
4,3E- 09*
p-lj 4,1E-
07*
6,5E- 07*
5,4E- 01
1,4E- 01
9,0E- 10*
9,2E- 04*
2,2E- 02
4,7E- 09*
š-lj 1,3E-
12*
7,8E- 03
6,1E- 08*
1,5E- 10*
1,3E- 02
6,1E- 08*
4,3E- 09*
4,7E- 09*
Tabela 2: P-vrednosti Studentovega t-testa za razlike v pH med različnimi vzorci po 36 urah fermentacije zmesi za bozo.
Pri bozi narejeni iz prosene moke in z dodanimi bakterijami iz turške boze smo po 36 urah izmerili značilno višji pH, kot pri bozi narejeni iz prosene moke in z dodanimi bakterijami Ljubljanskih mlekarn.
Pri osnovi iz koruzne moke je bil pH zmesi z dodanimi bakterijami iz boze po 36 urah značilno višji kot pH boze iz koruzne moke, narejene z dodanimi bakterijami iz kisle smetane, ne pa tudi kot pH boze iz koruzne moke z dodanimi bakterijami Ljubljanskih mlekarn.
pH boze iz škroba ni pokazal statistično pomembnih razlik 36 ur po dodatku katerihkoli bakterij.
23
Graf 2 prikazuje spremembe pH treh zmesi za bozo, ki so združene glede na izhodiščno osnovo, v času. Najbolj strmo krivuljo, torej največjo spremembo v pH boze, lahko opazimo v obdobju med dvanajstimi in šestintridesetimi urami po dodanih izbranih bakterijah. pH je bil takoj po dodatku bakterij najvišji v osnovi za bozo iz koruzne moke, a po 36 urah značilno nižji kot pH osnove za bozo iz prosene moke in škroba. Po 36 urah je bil pH v bozi iz škroba značilno višji od pH boze iz prosene oz. koruzne moke.
Graf 2: Sprememba pH v zmesi za bozo v času. Posamezne točke so pridobljene tako, da smo pH istovrstnih osnov za bozo združili (v eni točki so tako povprečni podatki o pH, pridobljeni pri enaki osnovi, a z različnimi bakterijskimi kulturami; označene so tudi s standardne napake); v vsaki točki je tako vključenih devet meritev.
24
Vrednosti, ki so v tabeli 3 označene z zvezdico, pomenijo statistično pomembne razlike.
Zaradi ponovljenih primerjav med vzorci je upoštevan Bonferronijev popravek (p
<0,008512).
p-vrednosti k-ki š-ki p-ki
k-ki 3,2E-24* 1,0E-06*
š-ki 3,2E-24* 2,4E-17*
p-ki 1,0E-06* 2,4E-17*
Tabela 3: P-vrednosti Studentovega t-testa za razlike v pH med različnimi vzorci z istovrstno osnovo po 36 urah fermentacije
Titracija
Titracijo smo izvedli trikrat. Najprej ob času, ko smo v zmes za bozo dodali bakterije, nato 24 ur po dodanih bakterijah in nazadnje 48 ur po dodanih bakterijah.
Iz dobljenih podatkov smo izračunali srednje vrednosti ter preračunali, koliko milimolov baze je treba dodati na en kilogram boze za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline.
Rezultati so predstavljeni v spodnjih grafih.
Graf 3: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline treba dodati na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz kisle smetane.
25
Graf 4: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline treba dodati na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz boze.
Graf 5: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline treba dodati na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz Ljubljanskih mlekarn.
Iz grafov št. 3 4 in 5 lahko vidimo, da je bila začetna količina kisline, ki smo jo porabili za titracijo vzorca, v vseh vzorcih približno enaka. Vidimo lahko tudi, da količina kisline (in s tem baze, ki smo jo uporabili za titracijo) narašča v vzorcih z osnovo iz koruzne in prosene moke in dodanimi katerimikoli bakterijami, medtem ko pri vzorcih z osnovo iz škroba in dodanimi katerimikoli bakterijami koncentracija kisline v času ne narašča.
Največ kisline smo namerili v vzorcu z osnovo iz prosene moke ter z dodanimi bakterijami iz kisle smetane. V bozi iz prosene moke je bila količina kisline po 48 urah po dodatku bakterij najvišja v vzorcu z dodanimi bakterijami iz kisle smetane, sledi vzorec z bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn in nato vzorec z bakterijami iz boze. V bozi iz koruzne moke je bila
26
količina kisline po 48 urah po dodatku bakterij najvišja takrat, ko smo dodali bakterije iz kisle smetane, sledi vzorec z bakterijami Ljubljanskih mlekarn in nato vzorec z bakterijami iz boze.
2.5.2 Rast bakterij
Število bakterijskih kolonij (cfu) v času v zmesi za bozo iz prosene moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane smo predstavili v grafu 5.
Število bakterij v bozi iz prosene moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane se je v prvem dnevu eksponentno povečevalo.
Graf 6: Logaritemsko število bakterij v času v vzorcu iz prosene moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane.
27
Graf 7: Število cfu po 48 urah inkubiranja v različnih vzorcih boze.
Po 48 urah smo največ bakterij našteli v vzorcu, pri katerem smo za osnovo uporabili koruzni škrob ter dodali bakterije iz Ljubljanskih mlekarn.
2.5.3 Kromatografija
Stolpci na grafih, označenih z eno zvezdico (*) pomenijo statistično pomembne razlike med rezultati, pridobljenimi v času 0 in 48 ur po dodanih bakterijah. Stolpci označeni z dvema zvezdicama (**) pomenijo statistično pomembne razlike med rezultati, pridobljenimi v času 24 in 48 ur fermentacije po dodanih bakterijah. Za primerjavo smo vedno uporabili podatke enake osnove za bozo (moke) in z inokulacijo enakih bakterij.
28 Acetoin:
Graf 8: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
Graf 9: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času.
29
Statistično pomembne razlike v vsebnosti acetoina v bozi smo opazili pri bozi iz prosene moke ob dodanih bakterijah iz kisle smetane v času 0 in 48 ur. Prav tako smo opazili statistično pomembne razlike v vsebnosti acetoina v bozi pri bozi iz koruzne moke z dodanimi bakterijami iz boze v času 0 in po 48 urah, ter v času 24 ur in 48 ur po dodanih bakterijah.
Statistična obdelava ostalih podatkov za vsebnost acetoina ni pokazala drugih statistično pomembnih razlik.
Graf 10: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
30 2,3-butandiol - izomer 1
Graf 11: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
Graf 12: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času.
31
Statistično pomembne razlike v vsebnosti 2,3-butandiola - izomera 1 so se pojavile pri bozi iz prosene moke z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času 24 ur in 48 ur. Prav tako smo zaznali razliko v vsebnosti omenjene spojine v bozi iz koruzne moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času 0 in 48 ur po dodanih bakterijah. Spremembe v vsebnosti spojine 2,3-butandiol - izomer 1 smo opazili tudi v bozi iz koruzne moke in z dodanimi bakterijami iz boze v času 0 ur in 24 ur po dodanih bakterijah in v času 24 ur in 48 ur po dodanih bakterijah. Prav tako smo pomembne razlike zasledili tudi pri bozi iz koruzne moke z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času 24 ur in 48 ur ter v bozi iz koruzne moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času 0 in 24 ur.
2,3-butandiol - izomer 2
Graf 13: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
Graf 14: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
32
Statistično pomembne razlike v vsebnosti 2,3-butandiola - izomera 2 so se pojavile pri bozi iz prosene moke z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času 0 ur in 24 ur. Prav tako so se pokazale statistično pomembne razlike v vsebnosti omenjenega izomera pri bozi iz koruzne moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času 0 ur in 24 ur, ter v času 24 ur in 48 ur.
Graf 15: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času.
Graf 16: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
33 1-heksanol
Graf 17: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
Graf 18: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času.
34
Statistična obdelava je pokazala, da se je vsebnost 1-heksanola v času 0 ur in 24 ur po dodanih bakterijah pomembno razlikovala pri bozi iz prosene moke z dodanimi bakterijami iz boze ter z dodanimi bakterijami iz kisle smetane. Pri drugih primerjavah statistično pomembnih razlik v času ni bilo.
1-okten-3-ol
Graf 20: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
Graf 19: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
35
Statistična obdelava podatkov je pokazala, da so se statistično pomembne razlike pojavile samo pri bozi iz prosene moke. V zmesi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času 0 ur in 24 ur po dodanih bakterijah smo zaznali statistično pomembne razlike v vsebnosti omenjenega alkohola. Prav tako smo značilne razlike opazili pri zmesi iz prosene moke z dodanimi bakterijami iz kisle smetane ob času 0 ur in 24 ur, ter 24 ur in 48 ur po dodanih bakterijah.
Pri vsebnostih spojin: dietilacetal, izopentilalkohol, heksanal, izovalerianska kislina, heksanojska kislina, benzojska kislina, oktanojska kislina, pelargol in vanilin med fermentacijo nismo zaznali statistično pomembnih razlik.
Graf 21: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času.
Graf 22: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
