ODZIV ČLOVEŠKIH CELIC NA LISTERIOLIZIN O IN NJEGOVE MUTANTE

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE

Rebeka PODGRAJŠEK

ODZIV ČLOVEŠKIH CELIC NA LISTERIOLIZIN O IN NJEGOVE MUTANTE

MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE

Rebeka PODGRAJŠEK

ODZIV ČLOVEŠKIH CELIC NA LISTERIOLIZIN O IN NJEGOVE MUTANTE

MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja

THE RESPONSE OF HUMAN CELLS TO LISTERIOLYSIN O AND ITS MUTANTS

M. SC. THESIS Master Study Programmes

Ljubljana, 2021

(3)

Podgrajšek R. Odziv človeških celic na listeriolizin O in njegove mutante.

Mag. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij molekulske in funkcionalne biologije, 2021

II

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Molekulska in funkcionalna biologija na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Delo je bilo opravljeno na Odseku za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo na Kemijskem inštitutu.

Študijska komisija je za mentorico magistrskega dela imenovala izr. prof. dr. Marjetko Podobnik in kot somentorico dr. Apolonijo Bedina Zavec. Kot recenzentka je bila imenovana prof. dr. Kristina Sepčić.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: prof. dr. Tom TURK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Član: prof. dr. Kristina SEPČIĆ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Član: izr. prof. dr. Marjetka PODOBNIK

Kemijski inštitut, Odsek za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo

Član: dr. Apolonija BEDINA ZAVEC

Kemijski inštitut, Odsek za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo

Datum zagovora: Rebeka Podgrajšek

(4)

III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Du2

DK UDK 576(043.2)

KG celična biologija, vezikulacija, listeriolizin O (Y406A), ATP, reaktivne kisikove spojine

AV PODGRAJŠEK, Rebeka, diplomirana biologinja (UN)

SA PODOBNIK, Marjetka (mentorica), BEDINA ZAVEC, Apolonija (somentorica), SEPČIĆ, Kristina (recenzentka)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij molekulske in funkcionalne biologije, Magistrski študijski program druge stopnje

LI 2021

IN ODZIV ČLOVEŠKIH CELIC NA LISTERIOLIZIN O IN NJEGOVE MUTANTE TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja)

OP XII, 94 str., 17 pregl., 33 sl., pril., 159 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Listeriolizin O (LLO) je porotvorni protein bakterije Listeria monocytogenes.

Njegovo delovanje je odvisno od pH. Na Kemijskem inštitutu so pripravili mutanta LLO Y406A, katerega aktivnost je pri sobni temperaturi še bolj odvisna od pH kot aktivnost divjega tipa (LLO wt). LLO Y406A je zato zanimiv za biotehnološke aplikacije. Namen naše raziskave je bil opredeliti učinek LLO wt in LLO Y406A na krvnih celicah pri fiziološki temperaturi (37 °C). Primerjali smo odziv različnih rakavih krvnih celic (K-562, Jurkat, Raji) z odzivom zdravih celic, izoliranih iz krvi.

Stanje celic smo določali prek umiranja, sledenja izločenih zunajceličnih veziklov, nastajanja reaktivnih kisikovih spojin in količine ATP. Ugotovili smo, da je toksičnost LLO Y406A za krvne celice pri fiziološki vrednosti pH (7,4) zelo nizka.

Tretiranje z LLO Y406A je povzročilo 20-odstotno umrljivost celic pri 300–7000- krat višjih koncentracijah kot tretiranje z LLO wt. Poleg tega smo ugotovili, da sta LLO wt in LLO Y406A pri fizioloških pogojih bolj toksična za rakave kot za zdrave krvne celice. Tretiranje z LLO wt je povzročilo 20-odstotno umrljivost zdravih celic pri 1,7–300-krat višjih koncentracijah kot pri rakavih celicah, LLO Y406A pa pri 3–

30-krat višjih koncentracijah kot pri rakavih celicah. Z nižanjem vrednosti pH se aktivnost LLO Y406A še poveča. Pri vrednosti pH 6,5 je povzročil 20-odstotno umrljivost zdravih celic pri 4–40-krat višjih koncentracijah kot pri rakavih celicah.

Povečano vezikulacijo kot odziv na LLO wt ali LLO Y406A smo zaznali že pri 10–

100-krat nižji koncentraciji proteina kot umiranje celic. LLO wt in LLO Y406A nista povzročila povečanja reaktivnih kisikovih spojin, je pa LLO wt povzročil povišanje ATP, LLO Y406A pa ne. Pri višjih koncentracijah proteinov opazimo padec ATP.

(5)

IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Du2

DC UDC 576(043.2)

CX cell biology, vesiculation, listeriolysin O (Y406A), ATP, reactive oxygen species AU PODGRAJŠEK, Rebeka

AA PODOBNIK, Marjetka (supervisor), BEDINA ZAVEC, Apolonija (co-advisor), SEPČIĆ Kristina (reviewer)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Molecular and Functional Biology

PY 2021

TI THE RESPONSE OF HUMAN CELLS TO LISTERIOLYSIN O AND ITS MUTANTS

DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO XIII, 94 p., 17 tab., 33 fig., ann., 159 ref.

LA sl AL sl/en

AB Listeriolysin O (LLO) is a pore-forming protein of the bacteria Listeria monocytogenes. Its activity depends on pH. At the Institute of Chemistry, an LLO Y406A mutant was prepared. Its activity at room temperature is more dependent on pH than the activity of its wild-type (LLO wt). LLO Y406A is therefore interesting for biotechnological applications. The purpose of our study was to define the effects of LLO wt and LLO Y406A on blood cells at a physiological temperature (37 °C).

We compared the response of different cancer blood cells (K-562, Jurkat, Raji) with the response of healthy cells isolated from blood. Cell condition was determined through dying, tracking secreted extracellular vesicles, observing the formation of reactive oxygen species (ROS) and the amount of ATP. LLO Y406A toxicity to blood cells, at physiological pH (7.4), was found to be very low. Cell treatment with LLO Y406A resulted in 20% cell mortality at 300–7000 times higher concentrations than with LLO. In addition, we found that LLO wt and LLO Y406A are more toxic to cancerous blood cells than to healthy blood cells in physiological conditions. LLO wt treatment resulted in 20% mortality of healthy cells at 1.7–300 times higher concentrations than of cancer cells, and LLO Y406A at 3–30 times higher concentrations in healthy cells than in cancer cells. By lowering pH, the activity of LLO Y406A further increases. At pH 6.5, it causes 20% mortality of healthy cells at 4–40 times higher concentrations than of cancer cells. Increased vesiculation in response to LLO wt or LLO Y406A was detected at 10–100 times lower protein concentration than cell death. LLO wt and LLO Y406A did not cause the increase of ROS, but LLO wt caused an increase in ATP, while LLO Y406A did not. At higher concentrations, we noticed a decrease in ATP.

(6)

V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... IX KAZALO SLIK ... X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... XII

1 UVOD ... 1

1.1 NAMEN DELA ... 2

1.2 DELOVNE HIPOTEZE ... 2

2 PREGLED OBJAV ... 3

2.1 POROTVORNI PROTEINI ... 3

2.1.1 Od holesterola odvisni citolizini ... 4

2.1.1.1 Listeria monocytogenes ... 5

2.1.1.2 Mutantni protein LLO Y406A ... 8

2.2 ZUNAJCELIČNI VEZIKLI ... 9

2.2.1 Eksosomi ... 9

2.2.2 Mikrovezikli ... 11

2.2.3 Apoptotska telesca ... 11

2.2.4 Izolacija in analiza zunajceličnih veziklov ... 12

2.3 ODZIV CELIC NA POROTVORNE PROTEINE (PFP) ... 13

2.3.1 Zamašitev pore ... 13

2.3.2 Endocitoza ... 13

2.3.3 Tvorba veziklov ... 14

2.3.4 Reaktivne kisikove spojine ... 15

2.3.5 Celični ATP ... 16

3.1 MATERIAL ... 17

3.1.1 Naprave ... 17

3.1.2 Pripomočki ... 17

3.1.3 Plastični material ... 18

3.1.4 Komercialni pripravki za analize ... 19

3.1.5 Kemikalije, reagenti in komercialni pufri... 19

(7)

VI

3.1.5.1 Priprava pufrov ... 19

3.1.6 Bakterijski sevi ... 20

3.1.7 Proteini ... 20

3.1.8 Celice ... 21

3.1.8.1 K-562 ... 21

3.1.8.2 Jurkat ... 21

3.1.8.3 Raji ... 21

3.1.8.4 Mononuklearne celice periferne krvi ... 21

3.1.9 Gojišča ... 22

3.1.9.1 Bakterijska gojišča ... 22

3.1.9.2 Celična gojišča ... 22

3.2 METODE ... 24

3.2.1 Priprava proteinov LLO wt in LLO Y406A ... 24

3.2.1.1 Transformacija ... 24

3.2.1.2 Gojenje celic in indukcija ... 25

3.2.1.3 Liza celic... 25

3.2.1.4 Izolacija proteina z nikljevo afinitetno kromatografijo ... 26

3.2.1.5 Analiza vzorcev s SDS-PAGE ... 26

3.2.1.6 Dializa in cepljenje s proteazo TEV ... 27

3.2.1.7 Čiščenje proteina z nikljevo afinitetno kromatografijo ... 27

3.2.1.8 Koncentriranje proteina ... 27

3.2.1.9 Test hemolize ... 28

3.2.2 Delo s sesalskimi celicami ... 28

3.2.2.1 Odtajanje celic ... 28

3.2.2.2 Gojenje celic ... 29

3.2.2.3 Izolacija mononuklearnih celic iz periferne krvi ... 29

3.2.2.4 Zamrzovanje celic... 30

3.2.3 Določanje živosti celic in prepustnosti plazmaleme ... 30

3.2.3.1 Tripansko modrilo (TM) ... 30

3.2.3.2 Propidijev jodid (PJ) ... 31

3.2.3.3 PrestoBlue ... 31

3.2.4 Določanje celične živosti z reagentom PrestoBlue ob tretiranju celic s porotvornima proteinoma LLO wt in LLO Y406A ... 31

3.2.5 Določanje količine nastalih reaktivnih kisikovih spojin ob tretiranju celic s porotvornima proteinoma LLO wt in LLO Y406A ... 32

(8)

VII

3.2.6 Določanje količine ATP ob tretiranju celic s porotvornima proteinoma

LLO wt in LLO Y406A ... 33

3.2.7 Izolacija zunajceličnih veziklov (ZV) ... 33

3.2.7.1 Tretiranje celic z LLO wt in LLO Y406A ter izolacija ZV z diferencialnim centrifugiranjem in ultracentrifugiranjem ... 34

4 REZULTATI ... 38

4.1 PRIPRAVA REKOMBINANTNIH PROTEINOV LLO WT IN NJEGOVEGA MUTANTA LLO Y406A ... 38

4.1.1 Transformacija ... 38

4.1.2 Gojenje celic in indukcija ... 38

4.1.3 Izolacija rekombinantnih proteinov ... 38

4.1.3.1 Liza celic... 38

4.1.3.2. Afinitetna kromatografija na Ni-NTA ... 39

4.1.3.3 Rezanje s proteazo TEV in dializa ... 40

4.1.3.4 Čiščenje proteina z afinitetno kromatografijo na Ni-NTA ... 41

4.1.3.5 Koncentriranje in alikvotiranje proteina ... 43

4.1.4 Preverjanje aktivnosti proteina s testom hemolize ... 43

4.2 VPLIV LLO WT IN LLO Y406A NA UMIRANJE CELIC ... 43

4.2.1 K-562 ... 44

4.2.2 Jurkat ... 44

4.2.3 Raji... 45

4.2.4 Mononuklearne celice periferne krvi ... 46

4.2.5 Koncentracije LLO wt in LLO Y406A, ki povzročijo smrt 20 % in 50

% celic ... 47

4.3 DOLOČANJE KOLIČINE NASTALIH REAKTIVNIH KISIKOVIH SPOJIN OB TRETIRANJU CELIC S POROTVORNIMA PROTEINOMA LLO WT IN LLO Y406A ... 48

4.4 DOLOČANJE KOLIČINE ATP OB TRETIRANJU CELIC Z LLO WT IN LLO Y406A ... 49

4.5 SPROŠČANJE ZUNAJCELIČIH VEZIKLOV (ZV) ... 50

4.5.1 Določanje celične prepustnosti s tripanskim modrilom (TM) in propidijevim jodidom (PJ) ... 50

4.5.1.1 K-562 ... 50

4.5.1.2 Jurkat ... 51

4.5.1.3 Raji ... 51

(9)

VIII

4.5.2 Določanje koncentracije večjih ZV s pretočnim citometrom ... 52

4.5.2.1 K-562 ... 52

4.5.2.2 Jurkat ... 53

4.5.2.3 Raji ... 53

4.5.3 Določanje koncentracije manjših ZV z metodo dinamičnega sipanja svetlobe ... 54

4.5.3.1 K-562 ... 55

4.5.3.2 Jurkat ... 55

4.5.3.3 Raji ... 56

4.5.4 Primerjava koncentracije večjih in manjših ZV pri različnih celičnih linijah ... 57

5 RAZPRAVA ... 58

5.1 ODZIV NA LLO WT IN LLO Y406A PRI ZDRAVIH IN RAKAVIH CELICAH ... 58

5.1.1 Rakave celice se med seboj razlikujejo v odzivu na LLO wt in LLO Y406A ... 58

5.1.2 Zdrave celice so na tretiranje z LLO wt in 406 bolj odporne kot rakave celice... 59

5.2 DOLOČANJA STANJA CELIC Z RAZLIČNIMI METODAMI ... 60

5.2.1 Določanje celične živosti ... 60

5.2.2 Tretiranje celic z LLO wt in LLO Y406A pri vrednosti pH 7,4 ne vpliva na porast reaktivnih kisikovih spojin ... 61

5.2.3 Tretiranje celic z LLO wt povzroči naraščanje količine ATP v celicah ... 61

5.2.4 S količino zunajceličnih veziklov (ZV) lahko sledimo stanje celic ... 61

5.2.4.1 Stanje celic K-562 odraža količina izločenih večjih ZV, stanje celic Jurkat pa količina manjših ZV ... 61

6 SKLEPI ... 63

7 POVZETEK ... 64

8 VIRI ... 66

(10)

IX

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Uporabljene naprave ... 17

Preglednica 2: Uporabljeni pripomočki ... 17

Preglednica 3: Uporabljeni plastični material ... 18

Preglednica 4: Uporabljeni komercialni pripravki za analize ... 19

Preglednica 5: Uporabljene kemikalije, reagenti in komercialni pufri ... 19

Preglednica 6: Prikaz sestave pufrov ... 20

Preglednica 7: Uporabljeni bakterijski sevi ... 20

Preglednica 8: Uporabljeni proteini ... 20

Preglednica 9: Sestava bakterijskega gojišča TB. ... 22

Preglednica 10: Sestava rastnega in testnega gojišča pri celični liniji K-562. ... 22

Preglednica 11: Sestava rastnega in testnega gojišča pri celični liniji Jurkat ... 22

Preglednica 12: Sestava rastnega in testnega gojišča pri celični liniji Raji ... 23

Preglednica 13: Sestava rastnega in testnega gojišča pri mononuklearnih celicah periferne krvi ... 23

Preglednica 14: Sestava testnega gojišča za poskuse s PrestoBlue pri rakavih celičnih linijah in mononuklearnih celicah periferne krvi ... 23

Preglednica 15: Sestava testnega gojišča določanja količine ATP... 23

Preglednica 16: Prikaz citotoksičnih koncentracij LLO wt in LLO Y406A pri zdravih in rakavih celicah ter vpliv vrednosti pH na LLO Y406A ... 48

Preglednica 17: Vpliv celične prepustnosti in živosti na tvorbo večjih in manjših zunajceličnih veziklov. ... 57

(11)

X

KAZALO SLIK

Slika 1: Prikaz zgradbe citolizina A bakterije Escherichia coli, ki spada med α-PFP, in

zaščitnega antigena antraksa, ki spada med β-PFT ... 4

Slika 2: Nastanek pore od holesterola odvisnih citolizinov. ... 5

Slika 3: Prikaz kristalne strukture monomernega LLO.. ... 8

Slika 4: Prikaz biogeneze eksosomov, mikroveziklov in apoptotskih telesc. ... 9

Slika 5: Prikaz od THEM16F odvisnega nastanka veziklov.. ... 15

Slika 6: Genska karta plazmida pPROEX Htb z vključenim genom za LLO (WT ali Y406A) ... 24

Slika 7: LB-plošči z dodanima antibiotikoma kloramfenikolom in ampicilinom. ... 38

Slika 8: Kromatogram po prvi afinitetni kromatografiji pri izolaciji proteina LLO wt ... 39

Slika 9: Analiza SDS-PAGE po izolaciji proteina LLO wt... 40

Slika 10: Analiza SDS-PAGE po izolaciji proteina LLO Y406A. ... 40

Slika 11: Kromatogram po drugi afinitetni kromatografiji pri izolaciji proteina LLO wt .. 41

Slika 12: Analiza SDS-PAGE po čiščenju proteina LLO wt. ... 42

Slika 13: Analiza SDS-PAGE po čiščenju proteina LLO Y406A... 42

Slika 14: Test hemolize na govejih eritrocitih z LLO wt in LLO Y406A pri vrednosti pH 6,5 in sobni temperaturi ... 43

Slika 15: Citotoksičnost proteinov LLO wt in LLO Y406A za celično linijo K-562 ... 44

Slika 16: Citotoksičnost proteinov LLO wt in LLO Y406A za celično linijo Jurkat. ... 45

Slika 17: Citotoksičnost proteinov LLO wt in LLO Y406A za celično linijo Raji ... 46

Slika 18: Citotoksičnost proteinov LLO wt in LLO Y406A za mononuklearne celice periferne krvi.. ... 46

Slika 19: Določanje količine nastalih reaktivnih kisikovih spojin na celični liniji K-562. ... 48

Slika 20: Določanje količine ATP na celični liniji K-562 (LLO wt) ... 49

Slika 21: Določanje količine ATP na celični liniji K-562 (LLO Y406A)... 50

Slika 22: Prepustnost plazmaleme pri celični liniji K-562. ... 51

Slika 23: Prepustnost plazmaleme pri celični liniji Jurkat. ... 51

Slika 24: Prepustnost plazmaleme pri celični liniji Raji... 52

Slika 25: Izmerjena relativna koncentracija večjih ZV glede na kontrolo, izoliranih iz celične linije K-562.. ... 53

Slika 26: Izmerjena relativna koncentracija večjih ZV glede na kontrolo, izoliranih iz celične linije Jurkat. ... 53

Slika 27: Izmerjena relativna koncentracija večjih ZV glede na kontrolo, izoliranih iz celične linije Raji. ... 54

Slika 28: Prikaz odvisnosti med Derived Count Rate in koncentracijo veziklov ... 54

Slika 29: Izmerjena relativna koncentracija manjših ZV glede na kontrolo, izoliranih iz celične linije K-562. ... 55

Slika 30: Izmerjena relativna koncentracija manjših ZV glede na kontrolo, izoliranih iz celične linije Jurkat ... 56

Slika 31: Izmerjena relativna koncentracija manjših ZV glede na kontrolo, izoliranih iz celične linije Raji.. ... 56

(12)

XI

Slika 32: Prikaz odziva rakavih celic ... 58 Slika 33: Prikaz odziva rakavih celic in mononuklearnih celic periferne krvi ... 59

(13)

XII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

LLO listeriolizin O (angl. listeriolysin O) LLO Y406A mutant listeriolizin O Y406A

ROS reaktivne kisikove spojine (angl. reactive oxygen species) ATP adenozin trifosfat

PBMC mononuklearne celice periferne krvi (angl. peripheral blood mononuclear cells)

µ mikro

g/rcf relativna centrifugalna sila

°C stopinja Celzija, enota za temperaturo

rpm število obratov na minuto (angl. revolutions per minute) DLS dinamično sipanje svetlobe (angl. dynamic light scattering) NTA analiza sledenja nanodelcev (angl. nanoparticle tracking analysis) µl mikroliter, enota za volumen

PBS solna raztopina fosfatnega pufra (angl. phosphate-buffered saline) MES 2-(N-morfolino) etansulfonska kislina

HIFBS toplotno inaktivirani goveji serum (angl. heat inactivated bovine serum) Å angstrem, enota za razdaljo

CFSE 5-karboksilflurescein diacetat sukcimidil ester (angl. carboxyfluorescein succinimidyl ester)

nM nanomol, enota za množinsko koncentracijo nm nanometer, enota za dolžino

IPTG izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozid (angl. isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside)

SDS-PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (angl. sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis)

HPLC visoko zmogljiva tekočinska kromatografija (angl. High-performance liquid chromatography)

Ni²⁺ nikljev ion

wt divji tip (angl. wild type)

PFP porotvorni protein (angl. pore forming protein) PFT porotvorni toksin (angl. pore forming toxin) mg miligram, enota za težo

TM tripansko modrilo

PJ propidijev jodid

ZV zunajcelični vezikli

CDC od holesterola odvisni citolizini (angl. cholesterol-dependent cytolysin) MACPF/CDC domena kompleksa membranskega napada/perforina/od holesterola

odvisni citolizini (angl. Membrane Attack Complex PerForin/Cholesterol Dependent Cytolysin)

T temperatura

(14)

XIII Konc. koncentracija

RNA ribonukleinska kislina (angl. ribonucleic acid) mRNA informacijska RNA (angl. messenger RNA) miRNA mikro RNA (angl. micro RNA)

siRNA mala interferenčna RNA (angl. small interfering RNA)

MQ voda miliQ

HB snop α-vijačnic (angl. helix bundle)

D domena

NADPH nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (angl. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)

CO2 ogljikov dioksid

DTT ditiotreitol

DMSO dimetil sulfoksid TB (angl. terrific broth) ml mililiter, enota za volumen

npr. na primer

% odstotek

kDa kilodalton

min minuta

(15)

1 1 UVOD

Listeriolizin O (LLO) je porotvorni protein (PFP) znotrajcelične patogene bakterije Listeria monocytogenes. Okužba lahko pri populacijah, kot so nosečnice, alkoholiki, imunsko oslabljene osebe ali starejši, vodi do hujših bolezenskih stanj, kot so sepsa, splav in meningoencefalitis (Farber in Peterkin, 1991). Najpomembnejši virulenčni faktor L.

monocytogenes, protein LLO, spada v družino od holesterola odvisnih citolizinov (CDC).

Mehanizem delovanja proteinov te družine temelji na oligomerizaciji monomerov na lipidnih membranah in posledično tvorbi por skozi membrane, kar lahko vodi v smrt gostiteljske celice (Tweten in sod., 2005). Ker je L. monocytogenes znotrajcelični patogen in bi smrt celice predstavljala izgubo gostitelja, je tudi delovanje LLO drugačno od preostalih PFP. Aktivnost proteina LLO je odvisna od vrednosti pH okolja. Bakterija je ob vstopu v celico ujeta v fagosomu. Padec vrednosti pH omogoči aktivacijo LLO, posledica česar je sprostitev bakterije v znotrajcelični prostor (Beauregard in sod., 1997). Znotraj celičnega citosola dvig vrednosti pH na okoli 7,4 in temperatura 37 °C vodita v porušenje 3D-strukture LLO in s tem v deaktivacijo LLO. Za spremembo sta potrebna oba pogoja (Schuerch in sod., 2005). Na Odseku za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo na Kemijskem inštitutu so s tarčno mutagenezo divjega tipa LLO (LLO wt) pripravili mutanta LLO Y406A, ki ima podobno sposobnost vezave na membrane in oligomerizacije kot LLO wt, vendar je pri LLO Y406A nastanek por odvisen od vrednosti pH tudi pri sobni temperaturi, medtem ko aktivnost LLO wt pri sobni temperaturi ni odvisna od vrednosti pH.

Znižanje vrednosti pH v kislo vodi do aktivacije LLO Y406A in vstavljanja pore v membrano (Kisovec in sod., 2011). Možnost regulirane oblike LLO Y406A v biomedicini obeta kot nov način tarčnega ubijanja rakavih celic (Resnik in sod., 2021).

Celice so z zunajceličnimi vezikli (ZV), zlasti mikrovezikli, sposobne odstraniti porotvorne proteine s svoje membrane. Prek tvorbe ZV pa lahko odstranijo tudi poškodovane dele membrane (Romero in sod., 2017). S kvantifikacijo vezikulacije lahko določimo stanje celic (Bedina Zavec in sod., 2016). ZV so majhni membranski delci celičnega izvora. Vpleteni so v številne fiziološke procese, kot so koagulacija krvi, vzdrževanje imunskega sistema in popravljanje poškodb. Poleg vzdrževanja normalnih fizioloških procesov pa so vpleteni tudi v patološke spremembe, kjer je njihovo nastajanje lahko bodisi povečano ali zmanjšano (van Niel in sod., 2018). Zaradi njihove sposobnosti prenosa različnega tovora obetajo tudi kot dostavljalno sredstvo za zdravljenje številnih bolezenskih stanj, kot je rak (Liao in sod., 2019).

(16)

2 1.1 NAMEN DELA

V magistrskem delu smo želeli proučiti odziv krvnih celic na LLO wt in njegovo mutirano obliko Y406A. Preliminarni rezultati na Odseku za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo so na rakavi celični liniji K-562 pokazali povečano izločanje ZV pri citolitičnih koncentracijah LLO wt in LLO Y406A. Namen magistrskega dela je bil potrditi te preliminarne rezultate z LLO wt in LLO Y406A. Raziskavo smo razširili in natančno opredelili stanje celic ob prisotnosti obeh proteinov pri različnih vrednostih pH okolja in različnih celičnih kulturah. Raziskavo smo usmerili na sesalske krvne celice tako, da smo odziv rakavih krvnih celičnih linij K562, Jurkat in Raji primerjali z odzivom primarnih (nerakavih) krvnih celic. V raziskavi smo stanje celic ob dodatku LLO wt in LLO Y406A spremljali s sledenjem vezikulacije, merjenjem količine ATP in reaktivnih kisikovih spojin.

Osnovni cilj dela je bil opredeliti učinek LLO wt in LLO Y406A tako na rakavih krvnih celičnih linijah kot na zdravih krvnih celicah. Poleg tega pa smo želeli narediti primerjavo metod, ki bi nam lahko pokazale stanje celic.

1.2 DELOVNE HIPOTEZE

 Celice na tretiranje z LLO wt in Y406A odreagirajo z vezikulacijo, umiranjem in zmanjšanim nivojem ATP.

 Vezikulacija, umiranje in zmanjšan nivo ATP so pri LLO wt izrazitejši kot pri LLO Y406A.

 Odziv zdravih celic na LLO wt in Y406A se razlikuje od odziva rakavih celic.

(17)

3 2 PREGLED OBJAV

2.1 POROTVORNI PROTEINI

Plazemska membrana predstavlja naravno prepreko za vdor ionov in drugih molekul v in iz celice. Njena neokrnjenost je ključnega pomena za celično preživetje. Skozi evolucijo so vse skupine organizmov razvile posebne mehanizme, s katerimi so lahko vplivale na membransko prepustnost. Eden izmed mehanizmov, s katerim lahko organizmi porušijo strukturo plazemske membrane, so porotvorni proteini (Bischofberger in sod., 2009;

Bischofberger in sod., 2012). Njihovo delovanje pa ni vezano le na plazemsko membrano.

Porotvorni protein LLO poškoduje tudi fagosomalno membrano (Gedde in sod., 2000).

Porotvorni proteini (angl. pore forming proteins – PFP) oz. porotvorni toksini (angl. pore forming toxins – PFT) predstavljajo skupino monomernih, ne pa izključno monomernih, topnih proteinov, ki imajo sposobnost oligomerizacije v kompleks, katerega končni izid je tvorba transmembranske pore. PFT omogočajo kolonizacijo in razširanje bakterije (Bischofberger in sod., 2012). Najdemo jih vse od bakterij (npr. listeriolizin O, intermedilizin, streptolizin O, perfringolizin O), živali (npr. lizenin, ekvinatoksin II) in gliv (npr. ostreolizin) (Gedde in sod., 2000; Romero in sod., 2017; Yamaji-Hasegawa in sod., 2003; Maček in sod., 1994; Sepčić in sod., 2004). Tudi človeške celice so sposobne izločanja PFP. Perforin, ki ga izločajo citotoksični limfociti T in naravne celice ubijalke, ima vlogo tvorjenja por in posledično uničenja spremenjenih (rakavih) celic ali z virusom okuženih celic (Masson in Tschopp, 1985; Trapani in Smyth, 2002).

Večina PFP je zastopanih pri bakterijah, kjer imajo vlogo v patogenezi. Prek nastanka pore lahko bakterije uničijo tarčne celice. Na podlagi sekundarne strukture transmembranskega dela jih delimo na pore, ki jih sestavljajo α-vijačnice (α-PFT) in tiste, ki sestojijo iz β- sodčkov (β-PFT) (slika 1). Med α-PFP spadajo porotvorni kolicini, kolicinom podobni proteini (transolkacijska domena davičnega toksina) in proteini iz družine aktinoporinov, med katere uvrščamo npr. ekvinatoksin, stiholizin in proteine NLP (Iacovache in sod., 2010).

Med β-PFT uvrščamo družino aerolizinov (npr. aerolizin, α-toksin in enterolobin), stafilokokne PFT (npr. α-hemolizin, LukF-PV), zaščitni antigen antraksa (angl.

protective antigen – PA) in naddružino proteinov z domeno kompleksa membranskega napada/perforina/od holesterola odvisni citolizini (angl. Membrane Attack Complex PerForin/Cholesterol Dependent Cytolysin superfamily – MACPF/CDC), med katere uvrščamo proteine iz družine od holesterola odvisnih citolizinov (angl. cholesterol dependent cytolysins – CDCs), kot npr. listeriolizin O (LLO), perfringolizin O (PFO), streptolizin O (SLO) in internmedizin (ILY). V naddružino MACPF/CDC spadajo tudi proteini MACPF, med katere sodijo npr. perforin, komponente kompleksa membranskega napada (angl. Membrane Attack Complex – MAC), pleurotolizin in Plu-MACPF (Iacovache in sod., 2010; Reboul in sod., 2016).

(18)

4

Slika 1: Prikaz zgradbe citolizina A bakterije Escherichia coli, ki spada med α-PFP (levo), in zaščitnega antigena antraksa, ki spada med β-PFT (desno) (prirejeno po Omersa in sod., 2019).

2.1.1 Od holesterola odvisni citolizini

Od holesterola odvisni citolizini (CDC) predstavljajo veliko družino PFT, ki jih v največji meri izločajo različne po Gramu pozitivne bakterije. Zaradi podobnosti družin CDC in MACPF jih obravnavamo kot naddružino MACPF/CDC (Reboul in sod., 2016). Na podlagi kristalografije so namreč pokazali podobnost pri oligomerizaciji in nastanku pore (Rosado in sod., 2007). Za družino CDC je značilna visoka ohranjenost primarne strukture, enakega je 40–70 % zaporedja. Člani družine CDC imajo ohranjeno zaporedne bogato s triptofani – undekapeptidni motiv (ECTGLAWEWWR) (Parker in Feil, 2005; Tweten in sod., 2005).

Zaporedje ima vlogo pri prepoznavi holesterola in oligomerizaciji (Petrišič in sod., 2021).

Raziskava, ki sta jo izvedla Dowd in Tweten (2012), je pokazala, da substitucija arginina na poziciji 468 v alanin v undekapeptidnem zaporedju vodi do neuspešnega nastanka pornega kompleksa (Dowd in Tweten, 2012). CDC sestojijo iz štirih domen. Ob vezavi na membrano prek domene 4 monomeri oligomerizirajo v obroč, kar predstavlja zgodnjo fazo prepore.

Rotacija oz. nagnjenje domene 2 iz prvotne vertikalne pozicije za 90° povzroči približanje domen 1 in 3 k membrani, kar predstavlja pozno fazo prepore. Po šest α-heliksov oz. vijačnic tvori po dva snopa α-vijačnic (angl. helix bundle-1 and 2 – HB1, HB2). Po pet α-vijačnic vsakega snopa α-vijačnic domene 3 vsakega monomera prepore spremeni strukturo v amfifilne transmembranske β-lasnice. β-lasnice preidejo hidrofobni del membrane in v membrani tvorijo transmembranski β-sodček. Preostali dve α-vijačnici tvorita motiv TMH (angl. Helix-turn-helix), ki znotraj β-sodčka tvori α-sodček, ki uravnava premer pore (slika 2) (van Pee in sod., 2017). Pore CDC so velike, s premerom 300–350 Å in sestavljene iz 30–

50 monomerov oz. 120–200 β-lasnic. Najbolj raziskani PFP dane družine so perfringolizin O (Clostridia perfringens) listeriolizin O (Listeria monocytogenes), streptolizin O (Streptococcus pyogenes), pnevmolizin (Streptococcal pneumoniae) in intermedilizin (Streptococcus intermedius) (Reboul in sod., 2016).

(19)

5

Slika 2: Nastanek pore od holesterola odvisnih citolizinov. Za nastanek transmembranske pore je na začetku potrebna pritrditev v vodi topnih proteinskih monomerov. Vezava na membrano poteka prek domene 4 (na sliki modro). Monomeri oligomerizirajo v obliko obroča (prepora, zgodnja stopnja). Domena 2 (na sliki rumeno) zarotira za 90° (prepora, pozna stopnja). Več α-vijačnic iz dveh snopov α-vijačnic v membrani spremeni obliko v amfifilne transmembranske β-lasnice (na sliki svetlo modro), ki tvorijo transmembranski β- sodček (transmembranska pora) (prirejeno povan Pee in sod., 2017).

V primeru družine CDC je za uspešno vezavo potrebna visoka koncentracija holesterola (Parker in Feil, 2005; Tweten, 2005). Za membransko vezavo in nastanek pore CDC je potrebno 30–40 % holesterola (Heuck in sod., 2000). Vezava in tvorba pore je pri LLO največja pri koncentraciji holesterola nad 35 %. Dane koncentracije najdemo v področju lipidnih raftov. Višje koncentracije holesterola vodijo do zbliževanja monomerov na membrani, ki omogočijo stabilnejšo interakcijo pri tvorbi oligomernega kompleksa (Bavdek in sod., 2007). V raziskavi Bavdeka in sodelavcev (2007) je odsotnost holesterola onemogočila vezavo LLO.

2.1.1.1 Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes je fakultativno anaerobna, znotrajcelična, po Gramu pozitivna bakterija. Za bakterijo je značilno, da dobro prenaša nizke temperature in visoke koncentracije soli. Prva opažanja okužbe segajo že v konec 19. stoletja. Prvi pravi opis pa v leto 1926, ko je Murray izoliral bakterije iz jeter bolnih zajcev in morskih prašičkov (Gray in Killinger, 1966; Murray in sod., 1926). L. monocytogenes pri ljudeh, divjih in domačih živalih, med katerimi so najpogosteje ovce, govedo in koze, povzroča bolezen listeriozo.

Smrtnost pri ljudeh je 20–30 %. Bakterija se prenaša prek okužene hrane. V splošni populaciji je bolezen redka. Zdravi posamezniki imajo lahko blago ali hujšo obliko gastroenteritisa. Nevarna je lahko za nosečnice, diabetike, alkoholike, osebe z boleznimi srca in žilja, starejše in osebe z oslabljenim imunskim sistemom. Pri takšnih osebah so posledice lahko hude, pojavita se lahko sepsa in meningoencefalitis. Pri nosečnicah je lahko posledica okužbe splav ali mrtvorojenost ploda (Farber in Peterkin, 1991; Cossart, 2011).

(20)

6

Ob zaužitju kontaminirane hrane bakterija prek stene prebavil preide v krvni in limfni obtok.

Bakterija je zmožna prehoda čez različne biološke bariere, npr. čez krvno možgansko bariero in placento. Poleg tega ji prednost daje zmožnost vstopa v nefagocitne celice. L.

monocytogenes ima več virulenčnih faktorjev, ki ji omogočajo vstop in razmnoževanje znotraj celic (Cossart, 2011; Radoshevich in Cossart, 2017). Najbolj opisani so LLO, fosfolipazi PlcA in PlcB, protein ActA, metaloproteaza Mpl ter internalina InlA in InlB (Cossart in sod., 2011).

Prvi korak pri bakterijski okužbi predstavlja vstop bakterije v celico. Pri vstopu v nefagocitne celice sta udeležena dva internalina, ki omogočata receptorsko posredovano endocitozo (Radoshevich in Cossart, 2017). Prek InlA je bakterija zmožna vezave na gostiteljski E-kadherin (Mengaud in sod., 1996). Ob vezavi pride do njihovega združevanja in fosforilacije receptorja. Končni izid je reorganizacija aktinskega citoskeleta in prenos bakterije v celico (Radoshevich in Cossart, 2017). Princip InlB je podoben, z razliko v tarčnem receptorju, ki ga predstavlja Met (Niemann in sod., 2007). Ob vstopu v celico se bakterija nahaja v vakuoli oz. fagosomu, iz katerega je sposobna uiti. Pobeg iz fagosoma pred združitvijo z lizosomom omogočajo LLO, fosfatidilinozitol specifična fosfolipaza C PlcA (ali PI-PLC) in širokospecifična fosfolipaza C (ali PC-PLC) (Gedde in sod., 2000).

Trojna mutacija tarčnih genov (LLO, PI-PLC, PC-PLC), z alelno zamenjavo, vodi do bakterij, ki so sicer sposobne širjenja na druge celice, vendar so ujete v vakuolah z več membranami (Gedde in sod., 2000). Tudi fosfolipazi imata pomembno vlogo pri pobegu iz fagosoma (Smith in sod., 1995). Ob pobegu iz primarne vakuole (fagosom) se bakterija obda z gostiteljskimi poliaktinskimi filamenti, ki ji omogočajo prosto premikanje po celici, kjer lahko raste in se deli (Tilney in Portnoy, 1989). Pri polimerizaciji in organizaciji akinskega citoskeleta ter tvorbi aktinskega repa je vpleten protein ActA, produkt gena actA (Kocks in sod., 1992; Pistor in sod., 1994). Ob migraciji k membrani se tvori podaljšek gostiteljske membrane. Kontakt s sosednjo gostiteljsko celico omogoči fagocitozo bakterije. Ob prihodu v novo gostiteljsko celico je bakterija ujeta v sekundarno vakuolo, ki jo sestavljata dve membrani. Notranja oz. primarna membrana izvira iz prejšnje celice, medtem ko novo oz.

sekundarno tvori membrana fagosoma. Bakterija pobegne iz obeh membran in cikel se lahko ponovi (Tilney in Portnoy, 1989).

Poskusi na L. monocytogenes so pokazali, da odsotnost LLO vodi do bakterij, ki po prenosu v drugo celico ostanejo ujete v enojni membrani, medtem ko odsotnost fosfolipaz vodi do ujetosti bakterije v dvojni membrani (Alberti-Segui in sod., 2007). Bakterijski mutanti brez fosfolipaz niso bili sposobni razgraditi notranje membrane sekundarne vakuole ob prehodu v drugo celico, kljub prisotnosti LLO. Odsotnost LLO in prisotnost fosfolipaz pa je vodila do nezmožnosti razgradnje zunanje membrane (Alberti-Segui in sod., 2007). Iz tega sledi, da je za uspešen pobeg bakterije iz sekundarne vakuole potrebno vzajemno delovanje obeh fosfolipaz in LLO.

2.1.1.1.1 Mehanizem delovanja LLO

LLO je PFP iz družine CDC in glavni virulečni faktor L. monocytogenes, udeležen pri pobegu iz fagosoma. Za pobeg iz fagosoma je potrebno zorenje fagosoma (Schnupf in Portnoy, 2007). Notranjost med zorjenjem postaja vedno bolj kisla. Optimum delovanja LLO je pri vrednosti pH 5.5 (Portnoy in sod., 1992), pH zakisanega fagosoma pa se giblje

(21)

7

med 4,9 in 6,7. V takšnem okolju se LLO aktivira in začne z delovanjem (Beauregard in sod., 1997). Ko bakterija preide v gostitelja, natančneje v fagosom, se sproži sinteza LLO.

Kisel pH aktivira LLO, kot je to že bilo pokazano pri PC-PLP, kjer nižji pH v fagosomu aktivira metaloproteazo Mpl, kar vodi do spremembe proPC-PLC v aktivno obliko PC-PLC (Petrišič in sod., 2021; Schnupf in Portnoy 2007; Marquis in Hager, 2000). Pri samem poteku infekcije je pomembno, da bakterija ne ubije gostiteljske celice. LLO ima za ta namen posebno zaporedje PEST (prolin-glutamat, serin-treonin). Bakterijski LLO brez dane sekvence sproži lizo celice. Prenos sekvence na drug PFP, perfringolizin O, vodi do necitolitične oblike danega PFP, posledica česar je nadaljnja živost celice (Decatur in Portnoy, 2000). Prvotno mišljenje je bilo, da ima sekvenca vlogo pri označbi proteina za razgradnjo. Kasnejše ugotovitve navajajo vlogo pri uravnavanju produkcije LLO v celičnem citosolu (Schnupf in sod., 2005). Mutacija zaporedja vodi do kopičenja LLO na notranji strani celične membrane, kar vodi do membranskih poškodb. Sekvenca PEST je v interakciji z adapterskim proteinom Ap2a2, udeleženem pri endocitozi. Citosolni LLO se veže na membrano. Ap2a2 prepozna zaporedje in sproži endocitozo. Z odstranitvijo LLO s citosolne strani celične membrane se zmanjša citotoksični učinek LLO in poveča preživetje gostiteljske celice, kar omogoča nadaljnjo patogenezo bakterije (Chen in sod., 2018).

Delovanje LLO pa ni omejeno le na membrano fagosoma. Posledice delovanja so lahko tudi spremembe na drugih organelih. Mitohondriji lahko postanejo majhni in okrogle oblike.

LLO lahko povzroči od kalcija odvisno fragmentacijo mitohondrijev. Delecijski mutant LLO ni vodil do pojava mitohondrijske fragmentacije (Stavru in sod., 2011). Posledice so opazne tudi na endoplazmatskem retikulumu, ki lahko pride v stres (Pillich in sod., 2012).

Posledici sta zmanjšanje biosinteze proteinov in povečano izražanje šaperonov. Vpliv se kaže tudi pri lizosomih, kjer lahko LLO na membranah lizosomov epitelijskih celic, ne pa tudi fagocitnih, povzroči pore. Po nastanku pore se vsebina, v kateri so tudi proteolitični encimi, sprosti v citosol, kjer encimi začnejo s proteolitičnim delovanjem. Motnje v lizosomalnih funkcijah bi lahko nudile do sedaj neznane prednosti pri bakterijski patogenezi ali pa bi lahko bile eden od celičnih signalov za odziv proti bakterijski okužbi (Malet in sod., 2017).

Poleg citotoksičnosti je LLO tudi zelo imunogen protein, ki sproži odziv limfocitov T (CD4 in CD8). Dvojna mutacija dveh triptofanov v dva alanina na mestih 491 in 492 v undekapeptidnem motivu LLO vodi v več kot 95 % zmanjšanje citolitične aktivnosti. Kljub zmanjšani citolitičnosti je mutant enako imunogen kot divji tip proteina (Carrero in sod., 2012). Zaradi visoke imunogenosti LLO obeta pri nastanku novih cepiv, kjer naj bi imel vlogo imunomodulatornega adjuvansa. Poskusi z necitolitičnim mutantom dtLLO in proteinom ovojnice virusa denge so pokazali aktivacijo imunskega odgovora in nastanek specifičnih protiteles. DtLLO je bila pripravljena z mutacijo treh aminokislin na mestih 484, 491 in 492 v undekapeptidnem motivu domene 4. Uporaba necitolitičnih mutantov LLO nakazuje potencialno uporabo (kot adjuvansov) pri cepivih (Hernández‐Flores in sod., 2017).

Kot že navedeno v poglavju o CDC, je tudi pri LLO vsak monomer sestavljen iz štirih domen (slika 3). Enak je tudi princip nastanka pore (Tweten, 2005; van Pee in sod., 2017).

Zaznavanje pH pri LLO omogoča pH-senzor, ki ga sestavljajo trije aminokislinski ostanki (D208, E247, D320). Senzor se nahaja na domeni 3 in je pomemben pri pH odvisni

(22)

8

denaturaciji LLO. V kislem okolju LLO tvori poro. To omogoča protonacija karboksilatov v pH-senzorju, v kislem okolju. Nevtralna vrednost pH in temperatura nad 30 °C povzročita denaturacijo proteina oz. porušenje 3D-strukture proteina. Za spremembo strukture sta potrebna oba pogoja, ki sta izpolnjena v citosolu gostiteljske celice. Ob naraščanju vrednosti pH karboksilne skupine aminokislinskih ostankov pH-senzorja postanejo deprotonirani, kar vodi do odbijanja nabojev in destabilizacije domene 3. Posledici sta odvitje transmembranskih heliksov domene 3 in neaktivnost proteina (Schuerch in sod., 2005).

Izkazalo se je, da je zunajcelični LLO lahko sposoben porotvornega delovanja tudi pri fiziološki temperaturi in vrednosti pH (37 °C, pH 7,4). To potrjuje aktivnost LLO pri tretiranju eritrocitov pri 37 °C in vrednosti pH 7,4. Predhodna inkubacija proteina pri 37 °C in pH 7,4 brez prisotnih membran je vodila do inaktivacije LLO, medtem ko je pri enakih pogojih ob prisotnih membranah protein ostal aktiven, se hitro vezal na membrano in tvoril poro (Vadia in sod., 2011).

Slika 3: Prikaz kristalne strukture monomernega listeriolizina O. Struktura proteina je bila zrisana v programu PyMOL, sekvenca proteina pa je bila predhodno pridobljena v Protein Data Bank (PDB). PDB koda: 4CDB.

LLO je sestavljen iz štirih domen. Z modro je označena domena 4, z rumeno domena 2, z zeleno domena 3 in z rdečo domena 1. S črno je označena sekvenca PEST.

2.1.1.2 Mutantni protein LLO Y406A

Leta 2017 so Kisovec in sodelavci pripravili novega mutanta proteina LLO. Pri fiziološki vrednosti pH (7,4) in sobni temperaturi je protein sposoben vezave na membrano, vendar ni sposoben vstavljanja pore v celično membrano. Medtem je divja oblika (wt) LLO pri teh pogojih še vedno sposobna porotvornega delovanja. Padec vrednosti pH omogoči vstavljanje LLO Y406A v membrano in nastanek pore. Poskusi pri sobni temperaturi z velikimi unilaminarnimi zunajceličnimi vezikli (ZV), napolnjenimi s kalceinom, so pokazali, da ima mutant pri vrednosti pH nad 7,0 zelo zmanjšano aktivnost, pri vrednosti 8,0 pa je neaktiven.

V kislem okolju pod 7,0 postane citotoksičen. V zgradbi LLO Y406A je tirozin na mestu 406 spremenjen v veliko manjšo aminokislino alanin. V zgradbi pri LLO wt je Y406

(23)

9

postavljen med domeni D2 in D3, kjer stabilizira povezavo domen D2 in D3, vključno z alosteričnim vplivom na pH-senzor. Zamenjava aminokisline v alanin vodi v porušenje teh interakcij in posledično vpliva na mehanizem nastanka pore pri različnih vrednostih pH.

Torej pod vrednostjo pH 7,0 in pri sobni temperaturi vezava LLO Y406A na membrano in nastanek pore potekata podobno kot pri divji obliki LLO. Pri vrednosti pH nad 7,0 in pri sobni temperaturi pa vezava LLO Y406A na membrane poteče, saj domena D4 ni prizadeta.

Ne more pa priti do nastanka pore, ker pri dani vrednosti pH ne more priti do ustreznih konformacijskih sprememb v področju D2/D3. Dana lasnost LLO Y406A obeta kot novo potencialno sredstvo v razvoju novih protirakavih učinkovin (Kisovec in sod., 2017). Rakave celice mehurja so se izkazale za bolj občutljive na delovanje mutanta Y406A kot pripadajoče zdrave celice (Resnik in sod., 2021).

2.2 ZUNAJCELIČNI VEZIKLI

Zunajcelični vezikli (ZV) so membransko obdani delci celičnega izvora (van Niel in sod., 2018). Služijo kot pomembni prenašalci informacij med celicami, tako pri evkariontih kot tudi pri bakterijah in arhejah (Camussi in sod., 2010; Deatherage in Cookson, 2012). Kljub enotnemu izrazu ZV predstavljajo zelo heterogeno združbo, kar otežuje njihovo razlikovanje in raziskave. Najpogosteje jih uvrščamo glede na celični izvor, biološko vlogo ali biogenezo.

Glede na slednjo jih delimo na eksosome, mikrovezikle in apoptotska telesca (Andaloussi in sod., 2013).

2.2.1 Eksosomi

Eksosomi predstavljajo populacijo majhnih ZV, v velikosti 40–120 nm (Andaloussi in sod., 2013), vendar v literaturi pogosto najdemo različne velikostne kriterije eksosomov.

Najpogosteje navedene velikosti znašajo 30–100 nm, 50–100 nm ali 50–150 nm (Rashed in sod., 2017; Sedgwick in D’Souza-Schorey, 2018; Beit-Yannai in sod., 2018). V primerjavi z drugimi skupinami ZV so eksosomi najbolj proučeni (Sedgwick in D'Souza-Schorey, 2018). Nastanejo kot produkt invanginacije membrane endosoma (slika 4). Ob fuziji multivezikularnega telesca s celično membrano se eksosomi lahko sprostijo v zunajcelični prostor, od koder nadaljujejo pot do drugih celic (van Niel in sod., 2018).

Slika 4: Prikaz biogeneze eksosomov, mikroveziklov in apoptotskih telesc. Eksosomi nastanejo pri uvihanju membrane endosoma. V zunajcelični prostor se sprostijo ob zlitju multivezikularnega telesca s celično membrano (A). Druga skupina veziklov predstavljajo mikrovezikli. Nastanejo pri odcepljanju plazemske membrane (B). Tretjo skupino veziklov predstavljajo apoptotska telesca. Njihova tvorba je vezana predvsem na celično fragmentacijo pri procesu apoptoze (C) (prirejeno po Kanada in sod., 2016).

(24)

10

Ker membrane eksosomov izvirajo iz multivezikularnega telesca, je tudi lipidni in proteomski profil drugačen kot pri plazemski membrani. Membrane eksosomov vsebujejo veliko sfingomielina, glikosfingolipidov, holesterola in fosfatidilserina (Llorente in sod., 2013). Večja lipidna urejenost vodi tudi v večjo obstojnost veziklov. Študije pa so pokazale, da so v primerjavi z mikrovezikli in apoptotskimi telesci bolj odporni na vplive detergentov (Osteikoetxea in sod., 2015). Med membranskimi proteini so najbolj zastopani tetraspanini (CD63, CD9, CD81, CD82), heat shock proteini (hsp60, hsp79, hsp90), Rab proteini, adhezijske molekule (CD45, CD11b) in aneksini (Wei in sod., 2021). Eksosomi so prenašalci proteinov, lipidov in nukleinskih kislin, vendar se vsebnost tovora razlikuje od celice do celice. Pogosto so nosilci citokinov, membranskih receptorjev, citoskeletnih proteinov, šaperonov in encimov. Med lipidnim tovorom najdemo holesterol, ceramide, nasičene maščobne kisline in sfingolipide. Prenašajo tudi genetski material, med katerim izstopajo miRNA in mRNA. Prek RNA lahko vplivajo na izražanje in delovanje drugih celic (Jia in sod., 2017; Wei in sod., 2021; Pant in sod., 2012).

Danes vemo, da so vse naše celice sposobne izločati eksosome. V celici imajo vlogo pri regulaciji genske transkripcije in translacije, angiogeneze, celjenju ran, interakciji med mikrobiomom, regulaciji imunskega sistema, deljenju in rasti celic, apoptozi itd. (Kalluri in LeBleu, 2020). Najdemo jih v telesnih tekočinah, kot so urin, amnionska tekočina, slina, kri, cerebralna tekočina, mleko, semenski izločki in solze (Keller in sod., 2011; Street in sod.

2012; Admyre in sod., 2007; Madison in sod., 2014; Grigor'eva in sod., 2016). Odkritje, da so eksosomi poleg proteinov tudi nosilci mRNA in miRNA, dejstvo, da se vsebnost tovora razlikuje med zdravimi in patološko spremenjenimi celicami, in njihova lahka dostopnost preko telesnih tekočin, kot sta kri in urin, so pripomogli k ideji o njihovi potencialni uporabi kot biomarkerji v medicinski diagnostiki (Valadi in sod., 2007; Simpson in sod., 2009; Pant in sod., 2012). Trenutno najbolj raziskano področje predstavlja tumorska biologija. Veliko raziskav potrjuje, da rakave celice izločajo povečano količino eksosomov. Prek prenosa tumorskih onkogenih proteinov in molekul, kot je miRNA, lahko močno vplivajo na rast tumorja in povzročijo spremembo normalno delujoče celice v maligno. Tumorski eksosomi poleg tega stimulirajo tumorsko angiogenezo, vzpostavljajo mikrookolje, primerno za rakave celice, omogočajo hitrejšo rast tumorja, inhibirajo anti-tumorsko funkcijo imunskega sistema in ustvarjajo odpornost na zdravila (Jia in sod., 2017; Kahlert in Kalluri, 2013).

Obetajo tudi kot dostavno sredstvo različnih učinkovin. Zmožnost prenosa različnega tovora, naraven vstop eksosomov v celice in manjša odstranitev s strani imunskega sistema kažejo številne prednosti pri uporabi eksosomov kot dostavnega sredstva učinkovin (Kalluri in LeBleu, 2020; Liao in sod., 2019). Eksosome lahko napolnimo z različnim tovorom. To lahko poteka pred izolacijo eksosomov ali po njej. Pred izolacijo lahko molekule miRNA prek transfekcije prenesemo na celice, katerih eksosomi bodo imeli vključene dane miRNA.

Eksosomi se bodo nato sprostili v zunajcelični prostor, kjer jih lahko izoliramo. Dodatna metoda pred izolacijo je koinkubacija učinkovine s celicami, ki bodo nato izločile eksosome z vključenimi snovmi. Po izolaciji lahko učinkovine vstavimo v eksosome z neposrednim mešanjem eksosomov in terapevtske snovi ali pa z elektroporacijo (Liao in sod., 2019).

Napolnimo jih lahko z različnimi metaboliti, protitelesi in kemoterapevtiki, s katerimi lahko vplivamo na tarčne celice (npr. rakave ali imunske celice). Z dostavo imunomodulatornih snovi lahko prek eksosomov vplivamo na delovanje imunskega sistema (Kalluri in LeBleu, 2020).

(25)

11 2.2.2 Mikrovezikli

Mikrovezikli so večji od eksosomov. V primerjavi z eksosomi so zelo heterogeni in obsegajo velikostni razpon 50–1000 nm, lahko tudi do 1500 nm. Pri rakavih celicah jih imenujemo onkosomi, njihov premer pa je lahko tudi do 10 µm. Problem predstavlja zlasti njihovo ločevanje od eksosomov, saj so lahko majhni mikrovezikli enakih velikosti kot eksosomi. V primerjavi z eksosomi, mikrovezikli nastanejo ob odcepljanju plazemske membrane (Slika 4), zato so po biokemijski sestavi podobni kot celična membrana. Pri lipidih prevladujejo fosfatidilserin, fasfatidiletanolamin, holesterol in sfingolipidi. V membrani prevladujejo tetraspanini (CD9, CD81, CD82), adhezijske molekule (fibronektini, integrini), aneksini in Rab proteini. Enaki proteini so prisotni tudi pri eksosomih, kar otežuje iskanje specifičnih markerjev za njihovo razlikovanje. Prav tako kot eksosomi so prenašalci genetskega materiala, kot so mRNA in miRNA. Prenašajo tudi proteine, med katerimi izstopajo citoskeletne molekule (aktin, tubulin), signalne molekule in šaperoni (hps70, hsp90) (van Niel in sod., 2018; Willms in sod., 2018, Andaloussi in sod., 2013; Sedgwick in D'Souza- Schorey, 2018).

Kot nosilci molekul je njihova glavna vloga stimulacija tarčnih celic prek prenosa proteinov, receptorjev in genetskih informacij (Tetta in sod., 2011). Prav tako kot eksosomi so tudi mikrovezikli prisotni v večini bioloških tekočin (Andaloussi in sod., 2013) in so vpleteni v celično komunikacijo. Mikrovezikli so sposobni prenosa onkogenov na sosednje celice, posledica česar je širjenje bolezni. Tudi mikrovezikli obetajo kot sredstvo za zdravljenje patoloških stanj in kot markerji za določene bolezni (Bazzan in sod., 2021). Poleg tega lahko določene mikrovezikle uporabimo tudi pri zdravljenju bolezni. Velik potencial kažejo ravno pri regeneraciji poškodovanega tkiva, kar obeta v regenerativni medicini (Tetta in sod., 2011). Raziskave so potrdile, da lahko specifični mikrovezikli matičnih celic vplivajo na regeneracijo poškodovanih celic (Camussi in sod., 2013). Prav tako kot eksosomi tudi mikrovezikli obetajo kot dostavno sredstvo za prenos učinkovin. Raziskave kažejo na potencialno uporabo mikroveziklov kot dostavnih sredstev za antigene, kar bi lahko povečalo učinkovitost cepiv (Shkair in sod., 2021). Obetajo tudi kot prenosno sredstvo za terapevtike proti rakavim obolenjem. Tang in sodelavci (2012) so pokazali, da inkubacija tumorskih celic s kemoterapevtikom vodi do njihovega pakiranja v mikrovezikle, ki jih lahko nato izoliramo in uporabimo za zdravljenje rakavega obolenja (Tang in sod., 2012).

Mikrovezikli so se izkazali tudi kot uspešno prenosno sredstvo za številne molekule RNA, kot so mRNA za Cas9 in vodilna RNA pri sistemu CRISPR-Cas9. Prenos molekul RNA molekul vodil do uspešnega spreminjanja genoma pri človeških celicah in na mišjem modelu brez opaznih stranskih učinkov (Usman in sod., 2018).

2.2.3 Apoptotska telesca

Apoptotska telesca nastanejo kot odziv na apoptozo, ki predstavlja programirano celično smrt. Proces je aktiven in poteka brez odziva imunskega odgovora, kot je to v primeru nekroze (Xu in sod., 2019). Apoptoza je normalen proces v embrionalnem razvoju, kjer veliko celic načrtno preide v programirano celično smrt. Proces zaznamujejo kondenzacija in agregiranje kromatina, kondenzacija citoplazme, skrčenje celice, fragmentacija jedra in posledično DNA, nagubanje celične membrane in nastanek večjih veziklov, ki jih imenujemo apoptotska telesca. Končni izid je razpad celice. Apoptotska telesca s fagocitozo

(26)

12

odstranijo makrofagi (Wyllie in sod., 1980). Velika so 500–2000 nm (Andaloussi in sod., 2013). Kot ostali ZV tudi apoptotska telesca obetajo kot terapevtsko sredstvo. Študija, ki so jo naredili Zhao in sodelavci (2021), navaja zmožnost apoptotskih telesc pri prenosu terapevtskih sredstev na sosednje celice. Posledica uporabe apoptotskih telesc je globlje prodiranje zdravila in večje uničenje tumorske mase (Zhao in sod., 2021). Pri izolaciji ZV, zlasti mikroveziklov, lahko izoliramo tudi apoptotska telesca. Protokoli za izolacijo posamezne skupine ZV še niso dovolj standardizirani, zato je lahko vzorec kontaminiran tudi z drugimi populacijami ZV (Caruso in Poon, 2018).

2.2.4 Izolacija in analiza zunajceličnih veziklov

Še vedno najpogostejši način izolacije ZV predstavlja diferencialno ultracentrifugiranje. Za izolacijo mikroveziklov se priporočajo obrati v razponu 10.000–20.000 g, za eksosome pa obrati v razponu 100.000–120.000 g. Protokoli so v večini primerov zasnovani tako, da najprej z diferencialnim centrifugiranjem po korakih posedemo celice, v naslednjem koraku apoptotska telesca, nato mikrovezikle in nazadnje z ultracentrifugiranjem še eksosome (Witwer in sod., 2013; Yang, 2020). Pogosto se uporablja tudi ultracentrifugiranje v gostotnem gradientu. Metoda temelji na dejstvu, da se delci po centrifugiranju v gostotnem gradientu razporedijo v predel s podobno gostoto. Drugi načini izolacije so še ultrafiltracija vzorca prek membranskih filtrov z različnimi premeri nanopor, velikostno izključitvena kromatografija in imunoafinitetna izolacija (Yang in sod., 2020; Witwer in sod., 2013).

ZV so majhni in zelo heterogeni, zato njihovo sledenje oz. analiza predstavlja številne težave. Metode, ki zajemajo analizo ZV, so bile optimizirane za druge vzorce, vendar so se številne izkazale uporabne tudi pri ZV. Ena izmed njih je prenos western. Metoda je zelo razširjena in najpogosteje uporabljena tehnika pri določanju proteinov, ki so prisotni na ZV (Shao in sod., 2018). Analize proteoma eksosomov in mikroveziklov so pokazale, da je 256 enakih proteinov prisotnih pri obeh skupinah. Okoli 98 proteinov je bilo specifičnih za eksosome in 350 za mikrovezikle (Xu in sod., 2015). Tipični markerji eksosomov so različni tetraspanini (TSPAN29, TSPAN30), komponente ESCRT, PDCD6IP, TSG101, flotilin in MFGE8. Pri mikroveziklih pa so najpogostejši markerji integrini, selektini in CD40 (Andaloussi in sod., 2013).

Koncentracijo ZV lahko pomerimo z analizo sledenja nanodelcev (angl. nanoparticle tracking analysis – NTA), visoko ločljivim pretočnim citometrom, prilagodljivim uporovnim zaznavanjem impulzov (angl. Tunable Resistive Pulse Sensing – TRPS) in tudi z dinamičnim sipanjem svetlobe (angl. Dynamic light scattering – DLS) (Konoshenko in sod., 2018). Pogosto uporabljena metoda za določanje koncentracij ZV je NTA. ZV so v suspenziji, kjer so pod vplivom Brownovega gibanja. Z laserjem osvetlimo vzorec, posledica česar je sipanje svetlobe na delcih. Sipanje svetlobe se spremlja s svetlobnim mikroskopom.

Kamera ustvari posnetek in program na podlagi Brownovega gibanja delcev izračuna koncentracijo in velikost delcev (Dragovic in sod., 2011). Pri DLS s svetlobnim laserjem presvetlimo delce v suspenziji. Na podlagi nihanja intenzitete sipane svetlobe, ki je posledica naključnega Brownovega gibanja delcev, nam program lahko izračuna velikost delcev (Kaszuba in sod., 2008). Novejši DLS ultra ima že možnost merjenja koncentracije delcev (Malvern Panalytical, 2021). Pretočni citometer se najpogosteje uporablja za štetje celic in razločevanje različnih celičnih populacij. Celice se ločijo na podlagi velikosti in

(27)

13

granuliranosti. S pomočjo fluorescenčno označenih protiteles ali barvil pa jih lahko ločimo tudi glede na prisotnost specifičnih celičnih molekul. Metoda je bila sicer prvotno namenjena za celice, vendar se lahko uporablja tudi za kvantifikacijo in karakterizacijo veziklov (Nolan in Jones, 2017; Lannigan in Erdbruegger, 2017). Za določanje velikosti ZV lahko poleg NTA in DLS uporabljamo tudi presevni (transmisijski) elektronski mikroskop in krioelektronski mikroskop (Konoshenko in sod., 2018).

2.3 ODZIV CELIC NA POROTVORNE PROTEINE (PFP)

PFP vršijo svojo nalogo prek poškodbe celične membrane. Ob oligomerizaciji proteinov se na membrani tvori pora. Ionsko neravnovesje zaradi pasivnega pritekanja Ca²⁺, K⁺ in drugih molekul povzroči osmotsko lizo in posledično smrt celice. Če je poškodba manjšega obsega, jo je celica sposobna popraviti. Kot odgovor na poškodbo membrane so celice razvile številne popravljalne mehanizme, med katerimi je mnogo odvisnih od kalcija, ki je pomemben sekundarni prenašalec, vpleten v veliko signalnih poti (Bouillot in sod., 2018).

Učinki PFP se kažejo tudi na produkciji reaktivnih kisikovih spojin (ROS) in zmanjšanju količine znotrajceličnega ATP (Lam in sod., 2011; Stavru in sod., 2011). Pomembno vlogo pri popravljanju membrane ima tudi velikost pore. PFP iz družine CDC povzročajo velike pore, ki vodijo do večjega ionskega neravnovesja in povečanega pritekanje kalcija v celico.

Odziv je hiter in poškodba se lahko popravi v nekaj minutah. Večje poškodbe lahko povzročijo tudi smrt celice, zato je celici v interesu, da večje poškodbe popravi čim prej.

Manjše pore povzročijo manjše pritekanje kalcija, zato lahko popravljanje manjših poškodb traja tudi uro (Brito in sod., 2019).

2.3.1 Zamašitev pore

Eden izmed popravljalnih mehanizmov celične membrane je preprečevanje širjenja poškodbe z rekrutacijo membransko vezavnih proteinov, med katerimi imajo pomembno vlogo aneksini. Aneksini so od kalcija odvisni proteini, sposobni vezave na negativno nabite fosfolipide. Količina kalcija, potrebnega za začetek vezave na lipide, se razlikuje med različnimi aneksini (Gerke in sod., 2005). Ob poškodbi membrane se v celici poveča količina kalcija, ki povzroči migracijo aneksinov na mesto poškodbe. Aneksini stabilizirajo membrano, preprečijo širjenje poškodbe in spodbudijo zaprtje membrane (Bouter in sod., 2011). Poškodovano mesto lahko celica s fuzijo eksocitiranih veziklov (lizosomi) zamaši, kar predstavlja še enega od popravljalnih mehanizmov (McNeil in Steinhardt, 2003; Reddy in sod., 2001). Aneksini so udeleženi tudi pri popravljanju poškodb pri LLO. Utišanje aneksinov A1, A2 in A6 s siRNA vodi do povečanja poškodb v primerjavi z neutišanimi (Czuczman in sod., 2014).

2.3.2 Endocitoza

Celica je sposobna endocitirati poškodovane dele membrane. Idone in sodelavci (2008) so pokazali, da inhibicija endocitoze prepreči popravljanje poškodb. Prek endocitoze pa naj bi se celice v določeni meri znebile tudi PFP. Ob prisotnosti kalcija so fluorescenčno označen streptolizin O zaznali tudi v membrani endosoma, medtem ko je bil ob odsotnosti kalcija prisoten le na površini celice (Idone in sod., 2008). Skalman in sodelavci (2018) so pokazali, da tretiranje celične linije HeLa z LLO ne vodi v odstranjevanje LLO z endocitotskimi

(28)

14

proteini, temveč le v reorganizacijo plazemske membrane po celični poškodbi s PFP (Skalman in sod., 2018). V dani študiji so pokazali, da fluorescenčno označeni endocitotski markerji za od klatrina odvisno in neodvisno endocitozo ter marker za kaveole niso bili lokalizirani na mestu celične poškodbe. Iz tega sledi, da LLO ni odstranjen z nobenim izmed naštetih endocitotskih poti. Tretiranje celične linije HeLa s fluorescenčno označenim LLO je pokazalo, da se zunajcelični LLO zadržuje na celični membrani in ni endocitiran v notranjost celice (Skalman in sod., 2018).

2.3.3 Tvorba veziklov

Povečana tvorba ZV je lahko znak, da se s celico nekaj dogaja. Pri cianobakterijah so pokazali, da se je vezikulacija povečala, ko so bile bakterije izpostavljene stresu, kot sta prisotnost kompetitorja in sevanje (Zarantonello in sod., 2018). Poleg odgovora na stres so lahko ZV prenosno sredstvo za različne bakterijske virulenčne faktorje, med katerimi so LLO pri L. monocytogenes, toksin VacA pri Helicobacter pylori in levkotoskin pri Actinobacillus actinomycetemcomitans (Coelho in sod., 2019; Ayala in sod., 2006; Kato in sod., 2002). L. monocytogenes tvori ZV, v katere pakira virulenčne faktorje, kot sta LLO in PI-PLC. Prek njih lahko prenese dane virulenčne faktorje na druge gostiteljske celice (Coelho in sod., 2019). Povečano vezikulacijo lahko opazimo tudi pri sesalskih celicah.

Raziskave na človeških eritrocitih kažejo povečano tvorbo mikroveziklov ob prisotnosti oksidativnega stresa (Sudnitsyna in sod., 2020).

Raziskave na PFP so pokazale, da so celice prek vezikulacije sposobne odstraniti bakterijske PFP. Pnevmolizin iz bakterije Streptococcus pneumoniae je v veliki meri odstranjen prek mikroveziklov (Wolfmeier in sod., 2016). Tvorbo ZV, ki so vsebovali PFP, so pokazali tudi pri streptolizinu O (Streptococcus pyogenes), perfringolizinu O (Clostridium perfringens) in intermedilizinu (Streptococcus intermedius) (Keyel in sod., 2011; Romero in sod., 2017).

Romero in sodelavci (2017) so s študijo na streptolizinu O, perfringolizinu O in intermedilizinu potrdili, da celice prek vezikulacije PFP, vršijo popravljanje membrane. V koncentracijah, ki še ne povzročijo umiranja celic, so oligomerizirane pore, ne glede na sposobnost citotoksičnega delovanja, odstranjene z vezikulacijo mikroveziklov, medtem ko so neaktivni, monomerni porotvorni proteini odstranjeni z endocitozo (Romero in sod., 2017). Maurer in sodelavci (2018) so pokazali, da se LLO obnaša drugače kot zgoraj omenjeni pnevmolizin, perfringolizin, streptolizin O in intermedilizin. In vitro tretiranje primarnih mišjih astrocitov z LLO vodi do povečane vezikulacije, vendar na površini mikroveziklov niso prisotne molekule LLO. Verjetno je tvorba mikroveziklov bolj odziv na stres zaradi povečane koncentracije kalcija kot pa mehanizem za odstranjevanje PFP. Tvorba mikroveziklov pri LLO ni osnovni mehanizem celičnega odstranjevanja PFP, ampak popravljalni mehanizem, s katerim so te sposobne odstraniti poškodovane dele membrane (Maurer in sod., 2018). Ker je glavno delovanje LLO znotraj celice, na fagosomalni membrani, je verjetno zato tudi odziv drugačen kot pri preostalih CDC.

Pri procesu vezikulacije je vpletenih več korakov. Wu in sodelavci (2020) so opisali mehanizem delovanja od kalcija odvisne skramblaze THEM16F pri popravljanju poškodb in tvorbi mikroveziklov. Povečana koncentracija kalcija inaktivira flipazo in aktivira skramblazo, ki prenese fosfatidilserin na zunanjo stran. Ker se fosfatidilserin običajno nahaja na notranji strani, je prenos na zunanjo stran signal za membransko popravljanje.